Name: Szybka izolacja oocytów I stopnia u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę szybkiej izolacji czystych oocytów I stopnia u danio pręgowanego pozbawionych komórek ziarnistych. Ta technika umożliwia precyzyjną analizę genomową i epigenetyczną w badaniach rozwojowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32170813 i 31871449) oraz Departament Nauki i Technologii Sychuanu (2024NSFSC0651), a także projekt 1·3·5 dla dyscyplin doskonałości - Fundusz Badań Klinicznych, Szpital Zachodniochiński, Uniwersytet Sichuan (2024HXFH035). Autorzy pragną podziękować Zhao Wangowi i Yanqiu Gao z Laboratorium Chirurgii Dziecięcej za hodowlę danio pręgowanego związaną z tą pracą. Autorzy pragną również podziękować wszystkim recenzentom, którzy wzięli udział w recenzji, a także firmie MJEditor (www.mjeditor.com) za zapewnienie usług redakcji w języku angielskim podczas przygotowywania tego manuskryptu.

Wszystkie danio pręgowane były traktowane zgodnie z rygorystycznymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami, określonymi przez odpowiednie krajowe i/lub lokalne organy ds. dobrostanu zwierząt. Utrzymanie i obchodzenie się z rybami uzyskało zgodę zarówno władz lokalnych, jak i komisji etycznej ds. zwierząt Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Syczuańskiego (zatwierdzenie nr 20220422003). Jajniki danio pręgowanego zawierają mieszaninę wieloetapowych oocytów, z których każdy etap rozwojowy jest obecny w jajnikach dorosłego danio pręgowanego. Jednak młode danio pręgowane zostały wybrane do tego badania ze względu na dominację oocytów w późnym stadium (stadium II-III) w jajnikach dorosłych ryb, które są duże i nieprzezroczyste. Natomiast młode osobniki mają płaskie i wydłużone jajniki składające się głównie z oocytów w stadium I (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B) (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B). Wcześniejsze badania wykazały, że cechy morfologiczne wczesnej oogenezy u dorosłych i młodocianych ryb danio pręgowanego są bardzo spójne, co potwierdza możliwość wykorzystania młodocianych danio pręgowanych13. Procedury opisane poniżej, opisane w Rysunek 2, zawierają szczegółowy opis procesu izolacji, od sekcji do uzyskania czystych oocytów w stadium I. Dla dalszych informacji odczynniki, i sprzęt wykorzystany w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Rozwarstwienie jajników
<ol>
	<li>Wybierz kilka samic danio pręgowanego o standardowej długości (SL) od 10 mm do 15 mm. 
	UWAGA: SL, mierzony w milimetrach od pyska do podstawy ogona, służy jako wiarygodne kryterium wyboru odpowiednich ryb. Do tej procedury zaleca się stosowanie młodych ryb między 5 a 7 tygodniem po zapłodnieniu (wpf) z SL w zakresie od 10 mm do 15 mm. Jajniki młodych danio pręgowanego są głównie zajęte przez wczesne oocyty, zapewniając optymalne warunki do łatwego uzyskania oocytów w stadium I (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B).</li>
	<li>Poddaj eutanazji młode samice, umieszczając je w lodowatej wodzie (0-4 °C). 
	UWAGA: Aby zapewnić eutanazję i zminimalizować ból odczuwany przez danio pręgowanego podczas eutanazji, należy przeprowadzić następujące procedury: potwierdzić, że temperatura lodowatej wody mieści się w zakresie 0-4 °C za pomocą termometru, szybko przenieść danio pręgowanego do lodowatej wody i utrzymywać go w lodowatej wodzie przez co najmniej 10 minut po ustaniu ruchu operkularnego16, 17,18.</li>
	<li>Osusz nadmiar wody na powierzchni ryby za pomocą chłonnego papieru.</li>
	<li>Przeanalizuj danio pręgowanego pod mikroskopem stereoskopowym, wykonując następujące czynności:
	<ol>
		<li>Odetnij głowę za pomocą mikronożyczek wzdłuż tylnego brzegu pokrywy skrzelowej; odetnij ogon wzdłuż kloaki. Przenieś środkowy pień do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego 2 ml pożywki L-15 (z L-glutaminą).</li>
		<li>Rozetnij środkowy pień w podłożu L-15. Przeciąć wzdłuż środkowej osi brzucha i usunąć wnętrzności oraz pęcherz pławny. 
		UWAGA: Wnętrzności danio pręgowanego są połączone. Dlatego uszczypnij tylne jelito w pobliżu okolicy odbytu i podnieś je, aby łatwo usunąć całą masę trzewną.</li>
		<li>Odłącz obustronne jajniki od brzucha za pomocą pęsety. Usuń tkankę tłuszczową, łuski i inne tkanki ciała przyczepione do jajnika. 
		UWAGA: Jajniki pokryte są tkanką tłuszczową. Dlatego najlepiej jest usunąć je razem, aby uniknąć mechanicznego uszkodzenia oocytów. 
		UWAGA: Z pęsetą należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć obrażeń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Trawienie
<ol>
	<li>Przenieść jajniki na 6-dołkową płytkę zawierającą 2 ml roztworu do dysocjacji komórek Kingera i inkubować przez 2-3 godziny w temperaturze 28,5 °C. Wstrząsać płytką 6-dołkową co 30 minut, aby przyspieszyć dyspersję. 
	UWAGA: Użyj pęsety, aby rozdzielić jajniki na małe bloki tkankowe, aby zwiększyć skuteczność trawienia. Czas trawienia jest zmienny; regularnie monitoruj i zakończ proces, gdy znaczna liczba oocytów stadium I zostanie rozproszona pod mikroskopem stereoskopowym. Rozwiązanie dysocjacji komórek Kingera jest roztworem roboczym i może być stosowane bezpośrednio. Po zapakowaniu można go przechowywać stabilnie w temperaturze -20 °C, a przed użyciem rozmrozić w niskiej temperaturze (4 °C).</li>
	<li>Dodać pożywkę L-15 podgrzaną w temperaturze 28,5 °C do buforu wytrawiającego w celu zatrzymania trawienia.</li>
</ol>
3. Filtracja
<ol>
	<li>Umieść sitko o wielkości 100 μm w innym dołku płytki 6-dołkowej, dodaj pożywkę L-15 i upewnij się, że poziom pożywki jest wyższy niż filtr. 
	UWAGA: Teoretyczna średnica oocytów w stadium I jest mniejsza niż 140 μm. Jednak oocyty o większych średnicach mogą nadal przechodzić przez sitko komórkowe. Dlatego na tym etapie wybrano sitko do komórek o mniejszej średnicy niż cel. Rozmiary oczek można dostosować w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych.</li>
	<li>Przeciągnąć pożywkę trawienną przez sitko do komórek za pomocą pipety. Odczekaj 1-2 minuty, aż wszystkie oocyty etapu I przejdą przez sitko, a następnie wyjmij je. Upewnij się, że oocyty pozostają w płynie przez cały proces przenoszenia. 
	UWAGA: Utrzymywanie oocytów w pożywce pomaga utrzymać ich integralność i optymalną kondycję. Jeśli oocyty są wystawione na działanie powietrza przez dłuższy czas, mogą wyschnąć i ulec uszkodzeniu, co wpłynie na ostateczną skuteczność separacji. Podczas przenoszenia oocytów przez sitko komórkowe należy trzymać pipetę poniżej powierzchni cieczy, zamiast dodawać je w zawiesinie.</li>
</ol>
4. Mycie
<ol>
	<li>Usunąć nadmiar podłoża za pomocą pipety. Dodać 4 ml świeżej pożywki L-15 i delikatnie zawiesić oocyty. Odczekaj 1-2 minuty, a następnie usuń supernatant. 
	UWAGA: Używaj narzędzi o niskich właściwościach adhezyjnych, aby zapobiec uszkodzeniu oocytów.</li>
	<li>Powtórz krok 4.1 5-6 razy, aż nie będzie żadnych innych zanieczyszczeń. 
	UWAGA: Delikatne obchodzenie się z jajami podczas procesu prania ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia uszkodzenia oocytów. Pomimo uzyskania dużej ilości oocytów w stadium I (około 200-400 oocytów w stadium I od jednego danio pręgowanego) po poprzednich etapach mycia, oocyty mogą być nadal mieszane z fragmentami komórek, oocytami z innych stadiów lub małymi granulkami utworzonymi przez uszkodzone oocyty w późnym stadium. Ponadto niektóre komórki ziarniste mogą nadal przylegać do powierzchni kilku oocytów z powodu niepełnego trawienia enzymatycznego. Dlatego w przypadku zastosowań wymagających wyższego poziomu czystości, takich jak sekwencjonowanie genomu, konieczne są dodatkowe kroki, aby wybrać całkowicie czyste oocyty. Aby rozwiązać ten problem, przejdź do kroków 5 i 6.</li>
</ol>
5. Wybór do kontroli jakości
<ol>
	<li>Przenieś umyte oocyty etapu I do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego świeżą pożywkę L-15.</li>
	<li>Pod mikroskopem o powiększeniu równym lub przekraczającym 10x usuń fragmenty komórek, oocyty innego stadium i oocyty w stadium I przylegające do komórek ziarnistych za pomocą narzędzia, którym można manipulować z precyzją, takiego jak igła do wstrzykiwań. 
	UWAGA: Ten krok wymaga cierpliwości od eksperymentatora, ale zapewnia izolację czystych i nienaruszonych oocytów. 
	UWAGA: Z igłami do wstrzykiwań należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć obrażeń.</li>
</ol>
6. Potwierdzenie przez barwienie jądrowe
UWAGA: Dla dalszego udoskonalenia wyizolowanych oocytów, zastosowano barwienie za pomocą Hoechst 33342 w celu identyfikacji i usunięcia pojedynczych oocytów z komórkami ziarnistymi, które mogły zostać pominięte w poprzednim kroku.
<ol>
	<li>Dodać końcowe stężenie 5 μg/ml Hoechst 33342 do pożywki L-15 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Obserwuj fluorescencję Hoechsta przez mikroskop fluorescencyjny pod wzbudzeniem laserem UV. 
	UWAGA: Hoechst jest zwykle wzbudzany w zakresie ultrafioletu, zwykle na długościach fal od 310 do 360 nm. Podczas tego procesu zaleca się stosowanie powiększenia od 80x do 100x. Zastosuj automatyczny tryb ekspozycji. Długość fali wzbudzenia i czas ekspozycji można dostosować w zależności od konkretnego modelu mikroskopu i indywidualnych wymagań.</li>
	<li>Za pomocą igły ostrożnie wybierz oocyty, które nie spełniają pożądanych kryteriów. 
	UWAGA: Podczas wizualizacji komórek w środku oocytu znajduje się duża chromatyna jądrowa. Gdyby komórki ziarniste przylegały do oocytu, widoczne byłyby małe i jasne jądra, przylegające do krawędzi oocytu (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3). Wybierz je pod mikroskopem.</li>
	<li>Dokładnie i wielokrotnie umyj oocyty L-15 w celu usunięcia nadmiaru Hoechst.</li>
	<li>Zidentyfikowane oocyty w stadium I należy wykorzystać bezpośrednio do późniejszej ekstrakcji lub przechowywać je w temperaturze -80 °C po błyskawicznym zamrożeniu w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem i zamrażarkami o bardzo niskiej temperaturze należy nosić maskę ochronną i rękawice kriogeniczne.</li>
</ol>

Improved Procedure to Obtain Granulosa Cell-Free Stage I Zebrafish Oocytes

<ol><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanism+of+long-term+bisphenol+S+exposure+disrupted+ovarian+lipids+metabolism%2C+oocytes+maturation%2C+and+offspring+development+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish.</a> Chemosphere. 277, 130304(2021).</li>
<li>Hau, H. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Larp6+controls+oocyte+development%2C+chorion+formation+and+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation.</a> Development. 147 (4), 187385(2020).</li>
<li>Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+ski7+tunes+RNA+levels+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition.</a> PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+reveals+insights+into+the+development+and+function+of+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary.</a> Elife. 11, 76014(2022).</li>
<li>Li, C. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+expression+of+bone+morphogenetic+protein+family+ligands+and+receptors+in+the+zebrafish+ovary%3A+A+potential+paracrine-signaling+mechanism+for+oocyte-follicle+cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication.</a> Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).</li>
<li>Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+proteins+F-actin+and+tubulin+distribution+and+interaction+with+mitochondria+in+the+granulosa+cells+surrounding+stage+III+zebrafish+%28Danio+rerio%29+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes.</a> Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).</li>
<li>Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+teleosts%3A+How+eggs+are+formed%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in teleosts: How eggs are formed.</a> Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).</li>
<li>Song, Y., Hu, W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+models+expressing+fluorescence+proteins+in+the+oocytes+and+somatic+supporting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).</li>
<li>Sousa, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+hormones+affect+follicular+cells+and+ooplasm+of+stage+I+and+II+oocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish.</a> Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).</li>
<li>Yan, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+soma+controls+ovarian+follicle+proliferation+through+Gsdf+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish.</a> Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, R. A., Selman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+aspects+of+oogenesis+and+oocyte+growth+in+fish+and+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians.</a> J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).</li>
<li>Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+analysis+of+early+oogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish.</a> Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).</li>
<li>Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+oocyte+and+follicle+layer+for+gene+expression+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).</li>
<li>Zhan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explorations+of+the+optimal+method+for+isolating+oocytes+from+zebrafish+%28Danio+rerio%29+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+B+Mol+Dev+Evol%22%5BJournal%5D)">Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary.</a> J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).</li>
<li>Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals">https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals</a> (2020).</li>
<li>Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction">https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction</a> (2015).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu opracowaliśmy metodę izolowania czystych i czystych oocytów I stopnia, z wyłączeniem komórek ziarnistych, do dalszej analizy (w szczególności analiz genomowych). Porównując tę zmodyfikowaną metodę z przywołaną metodą13, oocyty I stopnia uzyskane tą metodą są morfologicznie nienaruszone, w wystarczającej liczbie i wolne od zanieczyszczenia innymi komórkami somatycznymi, co czyni je odpowiednimi do różnych późniejszych badań i analiz. Ponadto, w porównaniu z innymi metodami separacji mechanicznej14,15, ulepszona metoda jest prostsza w obsłudze, ułatwia pozyskanie większej liczby oocytów i zapobiega uszkodzeniom oocytów.
Co więcej, oprócz skutecznego izolowania oocytów danio pręgowanego w stadium I, metoda ta może być również stosowana do bocji stawowych, co wskazuje na jej szerokie zastosowanie wśród różnych gatunków ryb. W celu zbadania wpływu zanieczyszczenia komórek ziarnistych na ekspresję genów i analizę epigenetyczną przeprowadziliśmy sekwencjonowanie RNA (RNA-seq) oraz analizę CUT&Tag na oocytach uzyskanych metodą referencyjną i zmodyfikowaną. Chociaż kilka genów o zróżnicowanej ekspresji zostało zidentyfikowanych za pomocą sekwencji RNA, niektóre geny, które były specyficznie wyrażane w komórkach ziarnistych, zostały nadal zidentyfikowane (dane nie pokazane). Analiza wykazała również istotne różnice w modyfikacjach histonów między oocytami izolowanymi różnymi metodami (dane nie pokazane). Wyniki te podkreślają znaczenie tej metody w całkowitym oddzieleniu oocytów i komórek ziarnistych w celu dokładnej ekspresji genów i analizy epigenetycznej.
Podczas wdrażania proponowanej metody należy zwrócić uwagę na kilka aspektów: (1) Wybór odpowiedniej wielkości danio pręgowanego ma kluczowe znaczenie. Zapewnia to uzyskanie wystarczającej ilości oocytów i ogranicza kolejne etapy mycia. Jajniki danio pręgowanego o średnicy SL <10 mm nie zapewniają wystarczającej liczby oocytów, co wymaga większej liczby ryb, aby spełnić wymagania dotyczące pobierania próbek i zwiększa presję hodowlaną. I odwrotnie, danio pręgowany z SL większym niż 15 mm wykazuje stopniowe tworzenie oocytów w stadium II-III, których błony łatwo pękają podczas reakcji trawienia. (2) W przypadku wykorzystywania większych ryb wyciek zawartości komórek wynikający z uszkodzonych oocytów może prowadzić do zanieczyszczenia, a tym samym do pewnego stopnia zahamować reakcję trawienia. W takich przypadkach zaleca się usunięcie starego buforu trawiennego, przemycie go L-15, a następnie dodanie nowego roztworu dysocjacji komórek Kingera w celu dalszego trawienia. (3) Jeśli dostępny jest odpowiedni sprzęt, potrząsanie podczas trawienia może zwiększyć separację.
W kroku 3.1 mniejsze komórki ziarniste mogą towarzyszyć oocytom przez sitko komórkowe. Obserwacje praktyczne wskazują jednak, że końcowa próbka pobranej oocytów nie zawiera komórek ziarnistych. Z wyjątkiem przypadków, w których niepełne trawienie skutkowało obecnością resztkowych komórek ziarnistych w niektórych oocytach, w systemie nie wykryto żadnych innych komórek ziarnistych znakowanych Hoechstem. W tym przypadku postawiliśmy hipotezę, że komórki ziarniste, będąc mniejsze i lżejsze, mogą pozostać zawieszone w pożywce hodowlanej, a następnie zostały usunięte podczas wielu etapów mycia. Skuteczność izolacji określono również ilościowo, obliczając proporcję oocytów z przyłączonymi komórkami ziarnistymi i czystych oocytów po barwieniu metodą Hoechst. Odsetek czystych oocytów do 98% zaobserwowano w próbkach zawierających 1000 oocytów.
Pomimo wielu zalet, proponowane podejście miało również pewne godne uwagi ograniczenia. Po pierwsze, metoda ta została zwalidowana pod kątem ekstrakcji DNA lub RNA, sekwencjonowania i natychmiastowego wykrywania nienaruszonych żywych komórek, ale wykonalność i niezawodność rozszerzenia na inne obszary testowe nie zostały jeszcze potwierdzone. Kolejnym ograniczeniem jest to, że proponowana metoda może być stosowana tylko do izolacji oocytów pierwszego stopnia, ponieważ skuteczność izolacji dla innych etapów jest niezadowalająca. W związku z tym konieczne są dodatkowe wysiłki w celu poprawy skuteczności i możliwości zastosowania proponowanej metody. Ponadto przyszłe badania powinny koncentrować się na ustaleniu, czy proponowaną metodę można zastosować do skutecznego izolowania oocytów od innych etapów, rozszerzając tym samym jej zastosowanie.

Danio pręgowany jest jednym z najważniejszych systemów modelowych w biologii rozwojowej. W ostatnich latach w licznych badaniach wykorzystano danio pręgowanego jako model do badania ważnych zdarzeń biologicznych i procesów regulacyjnych od oocytu do zarodka. Obejmują one skomplikowane procesy rozwoju i dojrzewania oocytów1, funkcjonalność genów matczynych2, regulację przejść matczyno-jarzygotycznych3, oraz obszerne analizy omiczne4.
Komórki ziarniste, komórki somatyczne otaczające i pielęgnujące rozwijającą się komórkę jajową w pęcherzyku jajnikowym5,6, odgrywają kluczową rolę w tym procesie rozwoju. Gdy pierwotne komórki rozrodcze (PGC) ewoluują w oogonię, są otoczone przez monowarstwę komórek ziarnistych7. Wraz z zewnętrznymi komórkami osłonowymi, oocyt i otaczające go komórki ziarniste tworzą dojrzały pęcherzyk8. Biorąc pod uwagę podstawowe rozróżnienie między komórkami rozrodczymi a komórkami somatycznymi, uzyskanie czystej próbki oocytów jest konieczne, zwłaszcza w przypadku analiz związanych z genomem.
W strukturze pęcherzykowej danio pręgowanego, komórki ziarniste zazwyczaj wykazują średnicę zaledwie kilku mikronów8, podkreślając ścisłe powiązania między komórkami ziarnistymi a oocytami9. To ścisłe powiązanie stanowi wyzwanie w osiągnięciu całkowitej separacji ze względu na znaczną różnicę zarówno w liczbie, jak i objętości komórek ziarnistych w porównaniu z oocytami (setki komórek ziarnistych w porównaniu z pojedynczym oocytem)10,11. Nawet minimalne zanieczyszczenie pojedynczą komórką ziarnistą może utrudnić dalsze analizy ukierunkowane na oocyty. Dlatego w przypadku badań koncentrujących się na cechach genomowych i epigenetycznych niezbędna jest eliminacja komórek ziarnistych.
Korzystając z dobrze scharakteryzowanych kryteriów morfologicznych, oocyty na każdym etapie mogą być rozróżniane na podstawie średnicy11. Proces oogenezy u danio pręgowanego jest podzielony na pięć etapów w zależności od morfologii i kariotypu11. Oocyty stadium I (średnica 7-140 μm) obejmują oocyty od początku mejozy do wczesnego etapu mejozy I. Co najważniejsze, oocyty te są przezroczyste, co pozwala na obserwację jądra centralnego w świetle przechodzącym (<klasa silna = "xfig">Figura 1Ai). Oocyty w stadium II (średnica 140-340 μm) stopniowo stają się pieniste i półprzezroczyste. Wraz z powiększeniem pęcherzyków włosowych i proliferacją pęcherzyków korowych, pęcherzyki rozrodcze w środku stają się trudne do odróżnienia12 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Aii). Oocyty III stopnia (średnica 340-690 μm) stopniowo gromadzą witellogeninę, a świeże pęcherzyki stają się coraz bardziej nieprzezroczyste (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1Aiii). Mejoza trwa w oocytach etapu IV (średnica 690-730 μm), gdy chromosomy wchodzą w środek mejozy II, gdzie ulegają stagnacji (<silna klasa = "xfig">Figura 1Aiv). Oocyty w stadium V (średnica 730-750 μm) dojrzały i są gotowe do owulacji7,11(Rysunek 1Av).
Na podstawie unikalnych cech każdego z wyżej wymienionych etapów, zaproponowano metodę izolowania oocytów od etapów I do III poprzez trawienie jajników danio pręgowanego za pomocą roztworu trawiennego zawierającego kolagenazę I, kolagenazę II i hialuronidazę, a następnie filtrację przez sitko komórkowe o określonej wielkości13. Jednak, chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie oocytów na różnych etapach rozwoju, nie jest w stanie całkowicie oddzielić oocytów i komórek ziarnistych. Inni badacze zasugerowali również metody oddzielania komórek ziarnistych od oocytów. Jednak metody te opierają się przede wszystkim na metodach mechanicznych, które mogą powodować uszkodzenie oocytów, są czasochłonne i niewystarczające do uzyskania znacznej liczby oocytów do analizy14,15.
Biorąc pod uwagę ograniczenia istniejących metod i specyficzne wymagania badawcze, to badanie ma na celu ustalenie procedury dokładnego oddzielania oocytów i komórek ziarnistych oraz uzyskania wystarczającej liczby czystych oocytów I stopnia do analizy. Rozwijając przywołaną metodę13, stosujemy ulepszony bufor trawienny (patrz Tabela materiałów), który jest łagodniejszy i ułatwia dyspersję oocytów i dysocjację komórek ziarnistych. Następnie oocyty są przepuszczane przez sitko komórkowe, po którym następuje mycie i dalsza selekcja mikroskopowa, umożliwiająca pozyskanie dużej liczby czystych oocytów w stadium I.

<table><tbody><tr><td>Roztwór do dysocjacji komórek Kingera</td><td>PlantChemMed</td><td>PC-33689</td><td>Roztwór dysocjacji komórek Kingera może być stabilnie przechowywany w temperaturze -20 & stopni; C po zapakowaniu i może być stosowany po rozmrożeniu w niskiej temperaturze (4 &deg; C). Może być stosowany bezpośrednio do dysocjacji jajników danio pręgowanego. Optymalna temperatura to 28,5 &deg; C, przez około 2-3 godziny. Czas trwania można dostosować do konkretnych warunków dysocjacji, skrócony lub wydłużony (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).</td></tr><tr><td>Sitka do komórek (100 &mu; m )</td> <td>Mikroskop</td> fluorescencyjny Falcon <td>352360</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>Szklana igła kapilarna</td> <td>/</td><td>/</td><td>Stępiona przez spalenie zapalniczką</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Yesen</td><td>40732ES03</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o niskiej adsorpcji (10 &mu; l )</td><td>Labsellect</td><td>T-0010-LR-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 medium medium (z L-glutaminą)</td><td>Hyclon</td><td>SH30525.01</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>/</td><td>/</td><td>Lodowata woda służy do eutanazji danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>WIGGENS</td><td>WH-01</td><td></td></tr><tr><td>Młodociane ryby</td><td>/</td><td>/</td><td>5&ndash; 6 tygodni po zapłodnieniu, standardowa długość [SL] 10&ndash; </td></tr><tr><td>Naczynie plastikowe 15 mm (35 mm) Mikroskop</td><td></td> stereoskopowy <td>SORFA</td> 230101 <td></td></tr><tr><td></td><td>Motic</td><td>SMZ-161</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowych (6-dołkowa)</td><td>Nożyczki sprężynowe SORFA</td><td>0110006</td><td></td></tr><tr><td>Vannas</td><td>Fine Science Toosl</td><td>#15000-00</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka izolacja oocytów i stopnia u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych

Rapid Isolation of Stage I Oocytes in Zebrafish Devoid of Granulosa Cells

Badania nad rozwojem oocytów mają znaczące implikacje w biologii rozwoju. Danio pręgowany (Danio rerio) był szeroko wykorzystywany jako organizm modelowy do badania wczesnych procesów rozwojowych od oocytu do zarodka. U danio pręgowanego oocyty są otoczone pojedynczą warstwą somatycznych komórek ziarnistych. Jednak oddzielenie komórek ziarnistych od oocytów stanowi wyzwanie, ponieważ uzyskanie czystych oocytów ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnej analizy. Chociaż zaproponowano różne metody izolowania oocytów danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju, obecne techniki nie są w stanie całkowicie usunąć komórek ziarnistych, co ogranicza dokładność analizy genomu skoncentrowanej wyłącznie na oocytach. W tym badaniu udało nam się opracować szybki i skuteczny proces izolowania czystych oocytów etapu I u danio pręgowanego przy jednoczesnym wyeliminowaniu zanieczyszczenia komórkami ziarnistymi. Technika ta ułatwia analizę biochemiczną i molekularną, szczególnie w badaniu aspektów epigenetycznych i struktury genomu specyficznych dla oocytów. Warto zauważyć, że metoda jest przyjazna dla użytkownika, minimalizuje uszkodzenia oocytów i zapewnia praktyczne rozwiązanie do późniejszych badań i analiz.

Rycina 1 ilustruje morfologię jajników obserwowaną u dorosłych i młodocianych danio pręgowanych, przedstawiając oocyty na różnych etapach rozwoju w celu służyć jako materiał referencyjny. Rycina 1A przedstawia graficzną reprezentację morfologii i wielkości oocytu na każdym etapie rozwoju, począwszy od etapu pierwotnego wzrostu (stadium I), a kończąc na owulowanej komórce jajowej (stadium V). Ryciny 1Ai-v przedstaw średnice odpowiadające stadium I–V oocytów. Rycina 1B (lewy panel) przedstawia obrazy jajników u młodych ryb (6 tygodni po zapłodnieniu, SL = 1,5 cm). Co istotne, jajnik młodociany wykazuje wyraźny wygląd pławkowy, charakteryzujący się przede wszystkim obfitością przezroczystych oocytów stadium I, którym towarzyszy mniejsza populacja oocytów stadium II. Przewaga oocytów stadium I znacznie ułatwia ich obserwację i pobieranie. Prawy panel przedstawia morfologię jajnika dorosłej ryby (6 miesięcy), w którym można zaobserwować oocyty na różnych etapach rozwoju. W jajniku przeważają jednak nieprzezroczyste oocyty późnych stadiów (stadium II-III).
Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne etapy procesu od sekcji do uzyskania czystych oocytów w stadium I. Rysunek 3 prezentuje oocyty w stadium I uzyskane przy użyciu metody referencyjnej oraz metody zmodyfikowanej. Po barwieniu Hoechstem jądra oocytów i komórek ziarnistych wykazywały niebieską fluorescencję w świetle UV. Na obrazach uzyskanych metodą referencyjną (Rysunek 3A) powierzchnia oocytów była gęsto otoczona licznymi zabarwionymi jądrami komórek ziarnistych. W przeciwieństwie do nich, oocyty w stadium I odseparowane metodą zmodyfikowaną (Rysunek 3B) są całkowicie odsłonięte i czyste, bez obecności zabarwień jąder komórek ziarnistych.
Nasze wyniki wykazały skuteczność proponowanej metody izolacji oocytów w stadium I. Proces rozwoju oocytów u ryb kostnoszkieletowych wykazuje kilka wspólnych cech7. Aby ocenić możliwość zastosowania tej metody u różnych gatunków, przeprowadzono dalsze analizy na innych gatunkach ryb. Samice piskorza ogrodowego pozyskano z lokalnego targu, a oocyty we wczesnym stadium (średnica &lt;100 µm) izolowano zgodnie z tą samą procedurą. Skład jajników piskorza ogrodowego również wykazał obecność mieszaniny oocytów na wielu etapach rozwoju, charakteryzujących się uderzającym podobieństwem morfologii i wielkości oocytów do tych u danio pręgowanego w tym samym stadium. Jak pokazano na Rysunku 4A, w jajnikach dorosłych samic piskorza ogrodowego dominowały nieprzezroczyste oocyty późne, przemieszane z przezroczystymi oocytami wczesnymi. Na powierzchni oocytów zaobserwowano wyraźną warstwę pojedynczych komórek ziarnistych. Zgodnie z naszymi obserwacjami u danio pręgowanego, oocyty piskorza o średnicy mniejszej niż 100 µm odpowiadały stadium poprzedzającemu stadiom diplotenu. Rysunek 4B przedstawia czyste oocyty piskorza ogrodowego (Misgurnus anguillicaudatus) otrzymane za pomocą zmodyfikowanej metody. W porównaniu z jajnikami danio pręgowanego, jajniki piskorza ogrodowego są trudniejsze do dysocjacji. Po 6-7 h trawienia dysocjuje więcej oocytów we wczesnym stadium. Niemniej jednak, to dostosowane podejście pozwoliło uzyskać pożądane czyste i nagie oocyty. Danio pręgowane należą do rodziny karpiowatych (Cyprinidae), natomiast piskorze ogrodowe są klasyfikowane w rodzinie piskorzowatych (Cobitidae). Te dwie rodziny wykazują odległe pokrewieństwo taksonomiczne, ale stopień rozwoju i morfologia ich jajników są niezwykle podobne, co wskazuje, że metoda ta może być ogólnie wykorzystywana do analizy oocytów różnych gatunków ryb.
<img alt="Etapy rozwoju jajnika danio pręgowanego, obraz mikroskopowy; porównanie histologiczne jajników młodocianych i dorosłych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy jajników i oocytów danio pręgowanego na różnych etapach. (A) Morfologia i wielkość oocytów na każdym etapie rozwoju (St). i-v przedstawia obrazy i średnicę oocytów od etapu I do V. Pasek skali = 200 µm. (B) Morfologia jajników dorosłych i młodocianych osobników danio pręgowanego. Paski skali = 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces izolacji oocytów rybki zebrafish, schemat krok po kroku, obejmujący sekcję i filtrację komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy procedury izolacji, od sekcji po uzyskanie czystych oocytów stadium I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Separacja oocytów w stadium I, barwienie BF i Hoechst, obraz mikroskopowy, metoda referencyjna vs. zmodyfikowana." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Oocyty w stadium I uzyskane za pomocą dwóch metod. (A) Oocyty w stadium (St) I wyizolowane metodą referencyjną. (B) Oocyty w stadium I wyizolowane metodą zmodyfikowaną. Jądra oocytów i komórek ziarnistych zabarwiono Hoechst i wzbudzono światłem UV. Paski skali = 100 µm. BF = pole jasne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe jajnika i oocytów piskorza; pole jasne i barwienie Hoechstem, podkreślające podział komórkowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Oocyty we wczesnym stadium rozwoju u piskorza otrzymane zmodyfikowaną metodą. (A) Reprezentatywne obrazy jajnika i oocytów piskorza. i, ii przedstawiają jajniki piskorzy przy różnych powiększeniach, a iii-iv przedstawiają oocyty piskorza we wczesnym stadium rozwoju. Paski skali: i (500 µm); ii (200 µm); iii, iv (100 µm). (B) Oocyty we wczesnym stadium rozwoju wyizolowane z piskorza. Oocyty i jądra komórek ziarnistych zabarwiono Hoechstem i wzbudzono światłem UV. Paski skali = 100 µm. BF = pole jasne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje zmodyfikowaną procedurę szybkiego izolowania czystych oocytów etapu I u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych, zapewniając tym samym wygodną metodę do badań specyficznych dla oocytów.

Szybka izolacja oocytów I stopnia u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model ...

Badania te koncentrują się na ustaleniu procesu szybkiej i skutecznej izolacji czystych oocytów pierwszego stopnia u danio pręgowanego przy jednoczesnym wyeliminowaniu zanieczyszczenia komórkami ziarnistymi. Głównym celem jest opracowanie metody, która umożliwi bardziej precyzyjną analizę w obszarach badawczych specyficznych dla oocytów, w szczególności w badaniach genomowych i epigenetycznych. Oocyty danio pręgowanego są otoczone monowarstwą komórek ziarnistych.Trudno jest ostro oddzielić komórki ziarniste od oocytów ze względu na znaczną rozbieżność zarówno w liczbie, jak i objętości, co utrudnia uzyskanie czystych próbek oocytów do specyficznej analizy, zwłaszcza w badaniach związanych z genomem. Ta metoda ma kilka zalet w porównaniu z metodami mechanicznymi i wcześniejszymi podejściami do wykrywania. Po pierwsze, ulepszony bufor detekcyjny jest łagodniejszy, pomagając wyizolować oocyty i komórki ziarniste, jednocześnie minimalizując uszkodzenia tych komórek.Ponadto pozwala nam uzyskać dużo czystych oocytów etapu I. Mamy nadzieję, że te badania pomogą naukowcom lepiej przyjrzeć się szczegółom i wzrostowi oocytów ryb, w tym takim rzeczom, jak epigenetyka i struktura genomu. Ta metoda działa równie dobrze w przypadku bocji stawowych i uważamy, że można ją zastosować do badania wielu różnych rodzajów ryb.Na początek połóż na stole uśpioną samicę danio pręgowanego. Wytrzyj nadmiar wody na powierzchni ryby chłonnym papierem. Za pomocą mikronożyczek odetnij głowę ryby wzdłuż tylnego brzegu pokrywy skrzelowej, a następnie odetnij ogon kloaką.Przenieś środkowy pień do naczynia o szerokości 35 milimetrów z dwoma mililitrami pożywki L-15. Teraz przetnij środkową oś brzucha i usuń wnętrzności oraz pęcherz pławny. Użyj pęsety, aby odłączyć obustronne jajniki od brzucha.Usuń tkankę tłuszczową, łuski i inne tkanki ciała przyczepione do jajnika. Na początek przenieś wycięte jajniki danio pręgowanego na sześciodołkową płytkę zawierającą dwa mililitry roztworu do dysocjacji komórek. Inkubuj jajniki w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin.Dodaj dwa do trzech mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki L-15 do buforu, aby zatrzymać trawienie. Następnie umieść sitko o średnicy 70 mikrometrów w innym dołku na płytce sześciodołkowej. Dodaj pożywkę L-15 do studzienki, upewniając się, że poziom pożywki jest wyższy niż sitko.Teraz za pomocą pipety przeciągnij pożywkę trawienną przez sitko do komórek. Usunąć nadmiar pożywki za pomocą pipety. Dodaj cztery mililitry świeżej pożywki L-15 do studzienki i delikatnie ponownie zawieś oocyty.Po kilku minutach odpipetować supernatant. Aby wybrać oocyty do kontroli jakości, przenieś je do naczynia o szerokości 35 milimetrów zawierającego świeżą pożywkę L-15. Obserwuj oocyty pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 10X lub większym.Użyj narzędzia do wstrzykiwań, aby usunąć wszelkie fragmenty komórek, oocyty I stopnia lub oocyty w innym stadium. W celu potwierdzenia etapu wzrostu dodać Hoecsht 33342 do pożywki L-15 zawierającej oocyty i inkubować. Obserwuj oocyty pod mikroskopem fluorescencyjnym pod wpływem wzbudzenia laserem UV.Ostrożnie wybierz igłą oocyty, które nie spełniają pożądanych kryteriów. Jajnik młodzieńczy wykazywał obfitość przezroczystych oocytów pierwszego stopnia, którym towarzyszyła mniejsza populacja oocytów drugiego stopnia. Dorosłe jajniki ryb wykazywały przewagę nieprzezroczystych jajowców w późnym stadium od dwóch do trzech oocytów.W wyniku metody referencyjnej na powierzchni oocytów powstały liczne wybarwione jądra komórek ziarnistych, gęsto otaczające oocyty. Natomiast zmodyfikowana metoda pozwoliła na wydzielenie oocytów pierwszego etapu, pozbawionych barwienia jąder komórek ziarnistych.

rapid-isolation-stage-i-oocytes-zebrafish-devoid-granulosa

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Specyficzna dla danego etapu izolacja mieszków włosowych Drosophila jest przydatna do różnych celów. Takie pęcherzyki rozwijają się w hodowli, co pozwala na połączenie manipulacji genetycznych i/lub farmakologicznych z testami rozwoju in vitro i obrazowaniem na żywo. Dodatkowo pęcherzyki mogą być wykorzystywane do badań molekularnych, takich jak izolowanie mRNA i białka.

Użyteczność specyficznej dla etapu izolacji mieszków włosowych Drosophila w połowie i późności

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji jąder.

Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Zoptymalizowany protokół dojrzewania in vitro oocytów danio pręgowanego, używany do manipulacji produktami genów matki, jest prezentowany tutaj.

Funkcjonalna manipulacja matczynymi produktami genowymi z wykorzystaniem dojrzewania oocytów in vitro u danio pręgowanego

Głównym celem tego badania było dostosowanie procedury witryfikacji zanurzonej w igłach (NIV) do kriokonserwacji całych jąder danio pręgowanego. Dodatkowo przetestowano powtarzalność metody w pięciu różnych szczepach danio pręgowanego.

Kriokonserwacja spermatogonii danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle jądra

Tutaj prezentujemy prostą metodę rozdzielania komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajników danio pręgowanego, która ułatwi badania rozwoju jajników u danio pręgowanego.

Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego

Postęp w badaniach nad folikulogenezą preantralną wymaga skutecznych metod izolacji pęcherzyków z pojedynczych jajników. Przedstawiono uproszczony, mechaniczny protokół izolacji pęcherzyków z jajników bydlęcych za pomocą rozdrabniacza tkanek i homogenizatora. Metoda ta pozwala na pobranie dużej liczby żywotnych pęcherzyków przedantralnych z jednego jajnika.

Izolacja małych pęcherzyków przedantralnych z jajnika bydlęcego przy użyciu kombinacji fragmentacji, homogenizacji i filtracji szeregowej

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę natychmiastowego usuwania części kompleksów cumulus-oocyt po pobraniu komórek jajowych, aby przyspieszyć proces obserwacji IVF, skracając czas potrzebny na usunięcie komórek ziarnistych, minimalizując narażenie oocytów na czynniki zewnętrzne i nie utrudniając rozwoju zarodka, ostatecznie poprawiając efektywność procedur laboratoryjnych IVF.

Natychmiastowe częściowe usunięcie kompleksów cumulus-oocyty: wyrafinowane podejście do szybkiej obserwacji zapłodnienia in vitro

Tutaj opisujemy protokół separacji żółtka, komórek ziarnistych i komórek osłonki w ptasich pęcherzykach przedowulacyjnych. Ta precyzyjna obsługa umożliwia krytyczne badania nad rolą tych warstw w funkcjach rozrodczych, pomagając w zrozumieniu rozwoju pęcherzyków włosowych, regulacji hormonalnej i badań nad chorobami w celu zwiększenia plonów rolnych i wglądu biomedycznego.

Oddzielanie ziarnistych pęcherzyków przedowulacyjnych i warstw komórek osłonki ptasich do dalszych zastosowań

Tutaj oferujemy powtarzalną metodę badania neurogenezy u dorosłych za pomocą testu neurosfery pochodzącego z całego mózgu lub z obszaru kresomózgowia, tektalu lub móżdżku mózgu dorosłego danio pręgowanego. Dodatkowo opisujemy procedurę manipulowania ekspresją genów w neurosferach danio pręgowanego.

Izolacja i hodowla neurosfer mózgowych dorosłych danio pręgowanego

Poznaj zmodyfikowaną metodę szybkiej izolacji czystych oocytów I stopnia u danio pręgowanego pozbawionych komórek ziarnistych. Ta technika umożliwia precyzyjną analizę genomową i epigenetyczną w badaniach rozwojowych.

Szybka izolacja oocytów I stopnia u danio pręgowanego pozbawionego komórek ziarnistych

Przeglądaj więcej filmów