Name: DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj projektowanie nanomaszyn DNAzyme 10-23 do detekcji kwasów nukleinowych z wykorzystaniem darmowego oprogramowania. Metoda ta umożliwia wykrywanie fragmentów wirusa Epsteina-Barr z wysoką selektywnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Ekaterinie V. Nikitinie za uprzejme dostarczenie gDNA EBV. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya i Maria S. Rubel dziękują Ministerstwu Edukacji i Nauki Federacji Rosyjskiej (grant nr FSER-2022-0009) oraz programowi Priorytet 2030.

1. Konstrukcja DNM
<ol>
	<li>Wybierz unikalny region w genomie, który Cię interesuje. 
	UWAGA: W tej pracy wykorzystano region genomu wirusa Epsteina-Barr (EBV) w pozycjach 13972-14154 (OR652423.1).</li>
	<li>Utwórz zestaw podkładów do amplifikacji wybranego fragmentu, na przykład za pomocą narzędzia Primer3 osadzonego w Ugene26.</li>
	<li>Otwórz narzędzie internetowe UNAFold 27 (patrz Spis materiałów) i wstaw wybrany region. Zmień temperaturę fałdowania na 55 °C, a warunki jonowe na 250 mM jonów jednowartościowych i 200 mM Mg2+.
	<ol>
		<li>Otwórz powstałą strukturę drugorzędową fragmentu ssDNA i wybierz stabilną spinkę do włosów. Zlokalizuj miejsce wiązania nanomaszyn DNA w obszarach nieustrukturyzowanych lub, alternatywnie, na pętlach struktur spinki do włosów, aby uzyskać silniejsze wiązanie celu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli docelowe miejsce analitu jest złożone w strukturę trzpienia-pętli, umieść ramię 1 i 2 w następujący sposób: Upewnij się, że ramię 2 wiąże jedną stronę trzpienia, pętlę i 3-5 nt drugiej strony trzpienia; Ramię 1 wiąże fragment drugiej strony trzpienia.</li>
	<li>Otwórz narzędzie DinaMelt28 (patrz Spis materiałów) i przeanalizuj sekwencje ramion oraz ich sekwencje odwróconego dopełnienia. Użyj narzędzia DinaMelt, aby upewnić się,że TM ramion 2 i 3 jest powyżej 65 °C: co najmniej 10 °C powyżej temperatury testu (55 °C).
	<ol>
		Utrzymuj TM ramienia 1 na poziomie co najmniej 1-3 °C powyżej temperatury reakcji (55 °C), jeśli ma zostać osiągnięta wysoka selektywność rozpoznawania29.<li></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz sekwencje ramion 1 i 2 z połówkami rdzenia DNAzyme i fragmentami wiążącymi F-sub13.</li>
	<li>Przeanalizuj drugorzędową strukturę zaprojektowanych nici DNA za pomocą UNAFold27. 
	UWAGA: 55 °C (temperatura testu), 200 mM Mg2+, 250 mM jony jednowartościowe (HEPES, Na+, K+).
	<ol>
		<li>Wzoru należy używać tylko wtedy, gdy składanie ΔG jest niższe niż -4 kcal/mol. Staraj się unikać długich sekwencji bogatych w CG. Jeśli struktura drugorzędowa jest zbyt stabilna, wprowadź mutację do ramienia, aby zwiększyć składanie ΔG30. Alternatywnie, umieszczenie ramienia 3 2-3 nt z dala od ramienia 2 jest kolejną strategią zmiany sekwencji ramienia 3 w celu uniknięcia stabilnych struktur międzycząsteczkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz losową sekwencję dla fragmentu płytki DNA o długości ramienia 3. Połącz sekwencję ramienia 3 z sekwencją kafelków DNA za pomocą (dT)4-6 lub glikolu etylenowego (np. glikolu trietylenowego (TEG) lub glikolu heksaetylenowego (HEG)). Wersja DNM przedstawiona w eksperymencie wykorzystuje (dT)6.</li>
	<li>Połącz ramię 2 z sekwencją komplementarną do fragmentu płytki DNA wybranego w kroku 1.8 za pomocą łącznika.</li>
	<li>Przeanalizuj drugorzędową strukturę zaprojektowanych nici DNA za pomocą aplikacji internetowej UNAFold. Upewnij się, że energia fałdowania każdej nici DNA przekracza 4 kJ/mol w temperaturze 55 °C i unikaj długich sekwencji wzbogaconych w CG. Najlepiej zmienić sekwencję płytek DNA.</li>
	<li>Narysuj strukturę za pomocą dowolnego dostępnego oprogramowania do grafiki wektorowej. W tym artykule wykorzystano Biorender i Pixelmator Pro do wizualizacji (patrz Tabela Materiałów). Sprawdź dokładność w kierunkach 5'->3' dla każdego pasma. 
	UWAGA: Uzyskaj sekwencje od wiarygodnego komercyjnego dostawcy.</li>
</ol>
2. Test funkcjonalny DNM
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu i odczynników
	<ol>
		<li>Przygotować bufor reakcyjny składający się z 50 mM HEPES (pH 7,5-7,8), 50 mM NaCl, 150 mM KCl i 200 mM MgCl2. Napełnij wodą dejonizowaną do 50 ml.</li>
		<li>Przygotować 10 μM podwielokrotności oligonukleotydów Dzb-Tile i Tile-Arm3. Przygotować 1 μM roztwór Dza, 100 μM F-sub i 1 nM, 10 nM, 100 nM analitów w RNazie/wodzie wolnej lub sterylnej wodzie dejonizowanej. Szczegółowe informacje na temat sekwencji oligonukleotydowych znajdują się w Tabeli Materiałów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż DNM
	<ol>
		<li>Roztwory oligonukleotydów należy całkowicie rozmrozić przed użyciem. Delikatnie wymieszać stukając (nie wirować intensywnie). Odwirować (szybko, przez kilka sekund) roztwór za pomocą mikrowirówki.</li>
		<li>Wymieszać po 1 μM Dzb-Tile i Tile-Arm3 w 200 μl buforu reakcyjnego w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 0,5 ml.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj probówkę i odwiruj roztwór.</li>
		<li>Owiń wieczko zamkniętej tuby folią parafinową. Alternatywnie użyj rurki z nakrętką.</li>
		<li>Inkubować probówkę w zlewce o pojemności 500 ml z wrzącą wodą przez 2 minuty, następnie wyłączyć grzałkę i pozwolić, aby temperatura pasywnie ostygła przez noc.</li>
		<li>Przygotuj 12% natywną STRONĘ: Wymieszaj 1 ml buforu 10х TBE, 3 ml 40% AA:BA, wodę dejonizowaną do 10 ml, 50 μl APS i 5 μl TEMED (patrz Tabela materiałów). Przenieś mieszaninę do kasety z żelem i pozwól jej spolimeryzować.</li>
		<li>Wymieszaj 1 μl każdej próbki, a mianowicie zmontowanego DNM, Dzb-Tile i Tile-arm3, z 1 μl 4-krotnie obciążającego barwnika i załaduj je do żelu.</li>
		<li>Włóż kasetę do komory, napełnij ją 1x buforem TBE i pozwól żelowi pracować przez 90 minut przy napięciu 80 V.</li>
		<li>Zabarwić żel bromkiem etydyny i uwidocznić go za pomocą systemu dokumentującego żel (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test LOD
	<ol>
		<li>Przygotować 160 μl 200 nM F-sub w buforze reakcyjnym. Ma to na celu ocenę podstawowego tła stabilności podłoża.</li>
		<li>Przygotować 7 podwielokrotności po 160 μl wstępnie zmontowanych DNM, F-sub i Dza w stężeniach 20 nM DNM i Dza oraz 200 nM F-sub w buforze reakcyjnym. Spośród siedmiu probówek, utrzymuj probówkę #1 jako puste tło, aby ocenić spontaniczne składanie się rdzenia DNAzyme.</li>
		<li>Dodaj analit do probówek #2-7 przy końcowych stężeniach 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM i 1000 pM.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj, odwiruj probówki i podziel roztwory na trzy porcje po 50 μl na czarnej 96-dołkowej płytce. Uszczelnij płytkę optycznie przezroczystą folią.</li>
		<li>Inkubować płytkę w łaźni wodnej w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę. Odwirować płytkę.</li>
		<li>Zmierzyć fluorescencję przy 525 nm (λex = 495 nm). Obliczyć średnią i odchylenie standardowe dla każdego punktu.</li>
		<li>Oblicz stosunek ślepej próby do podstawowej, dzieląc sygnał lampy zawierającej F-sub i DNM przez sygnał lampy, która zawiera tylko F-sub. Upewnij się, że stosunek mieści się w zakresie 1,1-1,5.</li>
		<li>Oblicz stosunek sygnału do ślepej próby, dzieląc sygnał lampy zawierającej F-sub, DNM i analit na sygnał lampy, która zawiera tylko F-sub i DNM. Sygnał należy uznać za prawdziwie dodatni, jeśli jest wyższy niż średnia tła plus trzy odchylenia standardowe.</li>
		<li>Powtórz eksperyment dwa razy i upewnij się, że odchylenie standardowe między powtórzeniami analitycznymi jest mniejsze niż 0,5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Precision DNAzyme Nanomachines for Discriminative RNA and DNA Analysis

<ol><li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+hybridization+probes+to+DNA+machines+and+robots%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots.</a> Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).</li>
<li>Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+hybridization+probes+for+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection.</a> Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).</li>
<li>Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sides+of+the+coin%3A+affinity+and+specificity+of+nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Tr+Bioche+Sc%22%5BJournal%5D)">Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions.</a> Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+probes+for+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Binary probes for nucleic acid analysis.</a> Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).</li>
<li>Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+hybridization+probes+for+sensitive+and+selective+DNA+and+RNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection.</a> Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+16S+rRNA+using+a+molecular+beacon-based+X+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor.</a> Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).</li>
<li>Dark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+LightCycler+Septi+Fast+for+the+detection+and+identification+of+pathogens+in+the+blood+of+patients+with+suspected+sepsis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis.</a> Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).</li>
<li>Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Detection+of+Stem-Loop+Primer+Amplification+%28SPA%29+products+without+denaturation+using+peroxidase-like+DNA+machines+%28PxDM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sc%22%5BJournal%5D)">Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM).</a> Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).</li>
<li>Gorbenko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+nanomachine+for+visual+detection+of+structured+RNA+and+double+stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Comm%22%5BJournal%5D)">DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA.</a> Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).</li>
<li>Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+using+G-quadruplex+amplification+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies.</a> Methods. 64 (3), 185-198 (2013).</li>
<li>Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MNAzymes%2C+a+versatile+new+class+of+nucleic+acid+enzymes+that+can+function+as+biosensors+and+molecular+switches%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches.</a> JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+cleaving+deoxyribozyme+sensor+for+nucleic+acid+analysis%3A+the+limit+of+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection.</a> Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+16S+RNA+in+a+signal-producing+structure+for+detection+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria.</a> Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).</li>
<li>Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+M+%22Chin.+Chem+Let%22">Chin. Chem Let</a>. , 109232(2023).</li>
<li>Peeters, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+PCR-amplified+DNAzyme+activity+for+real-time+FO-SPR+detection+of+the+MCR-2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene.</a> Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).</li>
<li>Wood, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+typing+of+nontuberculous+Mycobacteria+by+use+of+deoxyribozyme+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors.</a> Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).</li>
<li>Yan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralow+background+one-pot+detection+of+Lead+%28II%29+using+a+non-enzymatic+double-cycle+system+mediated+by+a+hairpin-involved+DNAzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme.</a> Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).</li>
<li>Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subzymes%3A+Regulating+DNAzymes+for+point+of+care+nucleic+acid+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sens.+Act.+B%3A+Chem%22%5BJournal%5D)">Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing.</a> Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).</li>
<li>Safdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-only%2C+microwell-based+bioassay+for+multiplex+nucleic+acid+detection+with+single+base-pair+resolution+using+MNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes.</a> Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).</li>
<li>Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+antenna+tile-associated+deoxyribozyme+sensor+with+improved+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity.</a> Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).</li>
<li>Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+minimachine+for+selective+and+sensitive+detection+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA.</a> Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).</li>
<li>Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Nanomachine+%28DNM%29+Biplex+Assay+for+Differentiating+Bacillus+cereus+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sc%22%5BJournal%5D)">DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species.</a> Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).</li>
<li>El-Deeb, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+home+test+for+COVID-19+diagnosis%3A+DNA+machine+for+amplification-free+SARS-CoV-2+detection+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples.</a> Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).</li>
<li>Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+DNAzyme-based+fluorescent+biosensor+for+detection+of+RNA-containing+Nipah+henipavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus.</a> Biosensors. 13 (2), 252(2023).</li>
<li>Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barley+haplotyping+using+biplex+deoxyribozyme+nanomachine%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Act+Rep%22%5BJournal%5D)">Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine.</a> Sens Act Rep. 4, 100132(2022).</li>
<li>Okonechnikov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unipro+UGENE%3A+a+unified+bioinformatics+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit.</a> Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li>
<li>Markham, N. R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DINAMelt+web+server+for+nucleic+acid+melting+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction.</a> Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).</li>
<li>Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+hybridization+enables+discrimination+of+a+point+mutation+within+5-40+C%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C.</a> JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).</li>
<li>Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+dynamic+gated+and+cascaded+transient+DNAzyme+networks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks.</a> ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).</li>
<li>Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+kinetics+of+the+10-23+RNA-cleaving+DNAzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sc%22%5BJournal%5D)">Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme.</a> Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).</li>
<li>Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular-beacon-based+tricomponent+probe+for+SNP+analysis+in+folded+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem-eur+J%22%5BJournal%5D)">Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids.</a> Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).</li>
<li>MacDougall, D., Crummett, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+data+acquisition+and+data+quality+evaluation+in+environmental+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry.</a> Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expedited+quantification+of+genetically+modified+ribosomal+RNA+by+binary+deoxyribozyme+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors.</a> RNA. 10, 1834-1843 (2015).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+16S+RNA+in+a+signal-producing+structure+for+detection+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria.</a> Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).</li>
<li>GC Content Calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU">https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU</a> (2023).</li>
<li>Hussein, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAzyme+nanomachine+with+fluorogenic+substrate+delivery+function%3A+advancing+sensitivity+in+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection.</a> Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).</li>
<li>Safdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-only%2C+microwell-based+bioassay+for+multiplex+nucleic+acid+detection+with+single+base-pair+resolution+using+MNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes.</a> Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxyribozyme+cascade+for+visual+detection+of+bacterial+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA.</a> Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).</li>
<li>Eckert, K. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity+and+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Res%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction.</a> Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).</li>
<li>Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems%3A+Programmable+nuclease+revolutionizing+the+molecular+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis.</a> Mol Biotech. , (2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Konstrukcja maszyn DNA jest prosta, ale wymaga pewnego doświadczenia w projektowaniu sond hybrydyzacyjnych lub funkcjonalnych nanostruktur DNA. Właściwe jest, aby fragment analitu był jak najkrótszy, aby zmniejszyć liczbę możliwych struktur drugorzędowych i uprościć inwazję DNM na strukturę drugorzędową. Zawartość CG powinna być korzystnie poniżej 60%, aby uniknąć stabilnych struktur wewnątrzcząsteczkowych. Udany montaż DNM osiąga się przy niskich prędkościach chłodzenia. W niektórych przypadkach DNM mogą być spontanicznie montowane w rurze, a etap wyżarzania może zostać wyeliminowany. Montaż DNM można wykonać w termocyklerze o temperaturze 0,1-0,3 °C/min lub w dużych ilościach wody chłodzącej. W przypadku nieprawidłowego montażu DNM sugerujemy spowolnienie zmiany temperatury na etapie wyżarzania.
Do pomiaru LOD potrzebnych jest co najmniej siedem punktów stężenia analitu: stężenie analitu 0 pM, czyli F-sub + DNM, oraz sześć różnych stężeń analitu, na przykład w zakresie od 1 nM do 1 pM, aby zaobserwować zależność liniową (rysunek 2B). Często używano więcej niż siedmiu punktów koncentracji w celu uzyskania większej dokładności. Dla każdego punktu stężeń należy przeprowadzić trzy próby techniczne (po 50 μl każde). W związku z tym całkowita objętość dla każdego stężenia wynosiła 160 μl (10 μl nadmiaru, biorąc pod uwagę błąd pipety).
Technika DNM charakteryzuje się wyższą czułością dla SNV niż inne systemy oparte na hybrydyzacji. Wysoka selektywność wobec SNV może być istotna dla niektórych celów, takich jak identyfikacja mutacji punktowych związanych z genotypowaniem bakterii22 lub selekcja heterozygot w roślinach25. Anality niespecyficzne wymagałyby tej samej procedury eksperymentalnej. Aby uniknąć niezrozumienia SNV w odniesieniu do niskiego stężenia analitu, sugerujemy porównanie sygnału eksperymentalnego nieznanego analitu z sygnałem znanego w pełni komplementarnego analitu o tym samym stężeniu.
Metoda może być z powodzeniem stosowana do amplikonów ssDNA, miRNA, sfałdowanego RNA czy dsDNA. Długie fragmenty RNA lub dsDNA, zwłaszcza bogate w CG, mogą wymagać DNM wyposażonego w 4-6 ramion wiążących analit, podczas gdy dwa ramiona wiążące analit są wystarczające dla jednoniciowych analitów o niestabilnej strukturze drugorzędowej (fałdowanie ΔG powyżej -10 kcal / mol). Metoda może być stosowana do wykrywania amplikonów PCR, SDA lub LAMP. DNM może być stosowany do wykrywania rRNA bez amplifikacji w gotowanych próbkach kultur bakteryjnych bez izolowania całkowitego RNA 22,34,35. Technika ta może nie działać dobrze w przypadku stężeń tak niskich, jak poziom femtomolowy i fragmentów dsDNA, których zawartość CG w obszarach flankujących jest wyższa niż 65%. Zawartość CG można oszacować, na przykład za pomocą kalkulatora zawartości CG firmy Biologics36. Sugerujemy dodanie części haka37 do projektów DNM w celu zwiększenia czułości lub przekształcenia dsDNA w ssDNA w przypadku wysokiej zawartości CG. Innym ograniczeniem metody jest to, że DNM są wrażliwe na jakość próbek, więc kwasy nukleinowe muszą być dokładnie oczyszczone. To samo dotyczy jakości sekwencji oligonukleotydowych DNM. W związku z tym sugeruje się, aby sprawdzić stabilność i czystość każdego źródła oligonukleotydów. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami amplifikacji, konstrukcja DNM wymaga umiejętności, a w dniu publikacji artykułu jest prawie całkowicie ręczna. DNM wymagają wstępnych testów na syntetycznych fragmentach przed poddaniem ich rzeczywistym próbkom DNA lub RNA, co wydłuża ogólny czas rozwoju systemu testowego.
Metoda jest wszechstronna i może przyjmować różne typy sond reporterowych. Może być multipleksowany38, a technika może zostać przekształcona w wersję kolorymetryczną, jeśli F-sub zostanie zastąpiony substratem tworzącym G-quadruplex39. Obecność polimerazy wiąże się z błędami we wzroście nici; w związku z tym metoda ta jest lepsza od konwencjonalnego PCR w czasie rzeczywistym i cyfrowego PCR, a także innych technik zależnych od nukleazy, takich jak SHERLOCK i DETECTR, ze względu na brak łatwo psujących się enzymów białkowych oraz solidną i prostą procedurę wykrywania40,41.

Jedną z najwcześniejszych metod wykrywania kwasów nukleinowych jest komplementarne wiązanie selektywnych oligonukleotydów z analizowanymi sekwencjami RNA lub DNA. Metoda ta wykorzystuje fragmenty kwasów nukleinowych (sondy), które mogą tworzyć pary zasad Watsona-Cricka z docelowym analitem DNA lub RNA1. Kompleks jest następnie odróżniany od analitu i niezwiązanej sondy za pomocą różnych technik. Niektóre metody, takie jak Northern blotting, hybrydyzacja in situ lub qPCR, opierają się na zjawisku komplementarnego wiązania2. Najpopularniejsze sondy hybrydyzacyjne mają dwie istotne wady: niską czułość (mogą osiągać poziomy mikromolowe do nanomolowych), a także niską selektywność na zmiany pojedynczych nukleotydów (SNV), w tym mutacje punktowe. Problem wymaga wyrafinowanego podejścia, ponieważ rozwiązania tych wad są ze sobą w konflikcie3. Aby zapewnić najlepszą selektywność, wykrywający oligonukleotyd powinien być utrzymywany na tyle krótko, aby tworzyć niestabilne hybrydy z niedopasowanymi analitami. Tak krótkie oligonukleotydy nie są w stanie ściśle wiązać docelowych kwasów nukleinowych i rozwijać ich drugorzędowych struktur, przez co często nie są w stanie dostarczyć wykrywalnego sygnału. Szczególnie trudne jest wykrycie fragmentów bogatych w CG w biologicznym RNA lub dwuniciowym DNA (dsDNA). Z drugiej strony, długie sondy są niewrażliwe na SNV3. Aby przełamać impas, opracowano koncepcję sondy binarnej4.
Czujniki binarne dzielą pojedynczą sondę detekcyjną na dwie części i specjalizują jej fragmenty, zatrzymując jedną z nich na długo, aby rozwinąć zakręty lub zaatakować dsDNA. Drugi fragment sondy binarnej pozostaje krótki, aby był czuły na niedopasowaną zasadę, zapewniając w ten sposób sposób sposób na wykrycie SNV. Sygnał zostanie wygenerowany, jeśli dwie części czujnika binarnego zostaną ze sobą połączone4. Cały kompleks można wizualizować za pomocą FRET5, molekularnej sondy beacon6,7, lub G-quadruplexes o aktywności podobnej do peroksydazy8,9,10, lub inaczej RNA-deaving11,12,13 DNAzyme. Czujniki binarne z rdzeniem 10-23 DNAzyme zostały obszernie opisane. Zostały one przystosowane do wykrywania jednoniciowych fragmentów kwasów nukleinowych utworzonych syntetycznie11, lub jednoniciowych produktów amplifikacji14,15. Detekcja bez amplifikacji jest również możliwa, na przykład w przypadku 16S rRNA wyekstrahowanego z hodowli komórkowej, ponieważ cząsteczka ta występuje obficie w komórkach12,16. Czujniki binarne z rdzeniem 10-23 DNAzyme mogą być również przystosowane do wykrywania kwasów nienukleinowych, takich jak jony ołowiu17. Niemniej jednak niska czułość jest nadal uważana za jedną z głównych wad binarnych czujników DNAzyme 10-23 i opracowano różne podejścia, w tym cascades18 lub alternatywne metody wzmacniania sygnału19, aby rozwiązać ten problem. Niestety, powyższe techniki drastycznie zwiększają koszt i niestabilność elementów czujników, dlatego nie weszły w życie.
Eksperyment opisany w tej pracy wykorzystuje 10-23 nanosensory DNA oparte na DNAzyme, zwane nanomaszynami DNA (DNM)20,21. Struktury te obejmują czujniki binarne, a także (1) ułatwienia DNA otaczające sondę binarną, rozwijające ustrukturyzowane regiony i atakujące dwuniciowe DNA, oraz (2) płytkę DNA, która utrzymuje wszystkie części DNM razem w bliskiej odległości i zwiększa szanse na utworzenie sygnału (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Łącznie, 10-23 DNM oparte na DNAzyme obniżają granicę wykrywalności (LOD) do zakresu picomolar21; mogą być używane do wykrywania 16rRNA w lizatach komórkowych22 lub zgłaszania obecności wirusowego RNA bez amplifikacji23,24. Jednocześnie DNM pozostają wrażliwe na SNV i mogą być nawet używane do genotypowania alleli w organizmach heterozygotycznych25. Metoda DNM może być stosowana jako technika uzupełniająca dowolny rodzaj amplifikacji w celu wizualizacji produktu lub identyfikacji produktu w złożonej mieszaninie o wysokiej selektywności. DNM, w przeciwieństwie do konwencjonalnych sond TaqMan i beacon, nie wymagają podgrzewania próbki, dzięki czemu mogą być stosowane w protokołach wykrywania punktów końcowych, dzięki czemu ogólne wykrywanie jest opłacalne.
Ten artykuł opisuje rozwój in silico DNM i demonstruje procedury montażu i funkcjonalnej charakterystyki DNM. Pracę wykonano z wykorzystaniem syntetycznego fragmentu wirusa Epsteina-Barr (EBV) odpowiadającego pozycjom 13972-14154 wirusowego DNA (OR652423.1) (patrz tabela materiałów).

<table><tbody><tr><td>Probówka 1,5 ml</td><td>Biofil</td><td>CFT011015</td><td></td></tr><tr><td>100 bp+ Drabinka DNA</td><td>Evrogen</td><td>NL002</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; Pipeta L</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro1000</td><td></td></tr><tr><td>10-100 &micro; Pipeta</td><td>L Kirgen</td><td>KG-Pro100</td><td></td></tr><tr><td>1-10 &micro; Pipeta L</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro10</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro; Pipeta</td><td>L Kirgen</td><td>KG-Pro200</td><td></td></tr><tr><td>2-20 & mikro; Pipeta L</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro20</td><td></td></tr><tr><td>4x Gel Loading Dye</td><td>Evrogen</td><td>PB020</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid 4K</td><td>AppliChem</td><td>A1090,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Carl Roth</td><td>2809447</td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender</td><td></td><td>https://www.biorender.com</td></tr><tr><td>Bisacrylamid</td><td>Molekula</td><td>22797959</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>TechSnab</td><td>H-0202</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td>12003153</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96-dołkowa płytka polistyrenowa</td><td>Corning</td><td>COS3915</td><td></td></tr><tr><td>DinaMelt</td><td>RNA Institute</td><td></td><td>http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>Am-O105</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>BioLabMix</td><td>EtBr-10</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Amresco</td><td>Am-O485</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>AppliChem</td><td>131396</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658001EDU</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 10 i mikro; Końcówki L</td><td>Kirgen</td><td>KG1111-L</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 1000 &micro; Końcówki L</td><td>Kirgen</td><td>KG1636</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 200 i mikro; L końcówki</td><td>Kirgen</td><td>KG1212-L</td><td></td></tr><tr><td>Pixelmator Pro</td><td>Pixelmator Team</td><td></td><td>https://www.pixelmator.com/pro/</td></tr> <tr><td>Chlorek potasu</td><td>Carl Roth</td><td>1782751</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNAz/DNAzy/DNA</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca do płytek PCR</td><td>Sovtech</td><td>P-502</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Vekton</td><td>HCh (0,1)</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek wielomodowych Spark</td><td></td><td>Tecan Spark- 10M</td><td></td></tr><tr><td>wzmacniacz T100</td><td>BioRad</td><td>10014822</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Molekula</td><td>68604730</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Amresco</td><td>Am-O497</td><td></td></tr><tr><td>UNAFold</td><td>RNA Institute</td><td></td><td>http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>LOIP</td><td>LB-140</td><td></td></tr><tr><td>Oligos zastosowany</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analit: </td><td>Evrogen</td><td></td><td>na bezpośrednie zamówienie, standardowe oczyszczanie</td></tr> <tr><td>odsalająceGAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCCGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tile-Arm3:</td><td>Evrogen</td><td></td><td>bezpośrednie zamówienie, standardowe oczyszczanie odsalające</td></tr><tr><td>CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT</td><td>Evrogen</td><td></td><td>bezpośrednie zamówienie, standardowe oczyszczanie odsalające</td></tr><tr><td>Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA</td><td>Evrogen</td><td></td><td>bezpośrednie zamówienie, standardowe oczyszczanie</td></tr> <tr><td>odsalające< silny> sub oligonukleotyd: < / silny> AAGGTT (FAM) TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1</td><td>DNA-Syntez</td><td></td><td>bezpośredni porządek, oczyszczanie HPLC</td></tr></tbody></table>

dnazyme 10-23 - nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

Nanomaszyny (DNM) oparte na DNAzyme do wykrywania sekwencji DNA i RNA (anality) to wielofunkcyjne struktury zbudowane z oligonukleotydów. Ich funkcje obejmują ścisłe wiązanie analitu, wysoce selektywne rozpoznawanie analitu, wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego przez wielokrotne katalityczne rozszczepienia fluorogenicznego substratu reporterowego oraz przyciąganie substratu fluorogenicznego w celu zwiększenia odpowiedzi czujnika. Jednostki funkcjonalne są przyłączone do wspólnego rusztowania DNA w celu ich wspólnego działania. Jądra 10-23 DNM z rozszczepieniem RNA charakteryzują się lepszą czułością w porównaniu z sondami hybrydyzacji niekatalitycznej. Stabilność DNM i zwiększone szanse na rozpoznanie substratu zapewnia dwuniciowy fragment DNA, płytka. DNM może różnicować dwa anality z pojedynczą różnicą nukleotydów w złożonym RNA i dwuniciowym DNA oraz wykrywać anality w stężeniach ~ 1000 razy niższych niż inne sondy hybrydyzacyjne bez białek. W artykule przedstawiono koncepcję stojącą za potencjałem diagnostycznym aktywności nanomaszyn DNA oraz omówiono projektowanie, montaż i zastosowanie DNM w testach wykrywania kwasów nukleinowych.

Celem pierwszego eksperymentu było wykazanie montażu DNM przed dodaniem syntetycznego fragmentu analitycznego. Wszystkie nici konstytutywne DNM dodano do buforu reakcyjnego i zmontowano w zlewce. Zmontowany kompleks DNM oceniono pod kątem prawidłowego rozmiaru i homogeniczności za pomocą natywnej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (native PAGE). Native PAGE pokazuje zmontowany DNM z analitykiem w ścieżce 1 oraz dwie nici DNM w ścieżkach 2 i 4. Gdyby nanomaszyna DNA nie została zmontowana, zamiast pojedynczego pasma o niskiej mobilności widoczne byłyby 2 lub 3 oddzielne pasma (ścieżka 2 na Rysunku 2A).
Druga część protokołu obejmuje funkcjonalną charakterystykę wydajności DNM oraz detekcję docelowych kwasów nukleinowych. W niniejszym badaniu wykorzystano syntetyczny fragment EBV 13972-14154. W tym celu wstępnie złożone fragmenty DNM, wraz z Dza, inkubowano z różnymi stężeniami anality w temperaturze 55 °C przez 1 h. Zmierzono dwie kontrolne wartości sygnału fluorescencyjnego: wartość dla wstępnie złożonych fragmentów DNM i Dzb bez analitytów (próba ślepa) oraz wartość tła z F-sub (tło podstawowe). Wykonano trzy pomiary techniczne. W celu analizy statystycznej przeprowadzono również trzy niezależne próby. Należy zauważyć, że stężenie magnezu w tym badaniu jest wyższe niż wartości podawane w literaturze30. Wysokie poziomy jonów magnezu zwiększają sygnał we wszystkich probkach testowych, ponieważ sprzyjają one spontanicznemu rozszczepieniu F-sub31. Optymalizację składu buforu reakcyjnego przeprowadzono na wstępnych etapach rozwoju technologii i nie powtarzano tego procesu w każdym podejmowanym badaniu.
Po 1 h inkubacji zmierzono fluorescencję próbki za pomocą spektrofluorometru (patrz Tabela materiałów). Aby potwierdzić detekcję analizowanego DNA przez DNM, porównano sygnał fluorescencyjny sensora złożonego z analizowanym DNA z sygnałem kontroli negatywnej, która nie zawiera dodanego anality. Stosunek sygnału do tła (stosunek średnich względnych jednostek fluorescencji w dołkach zawierających anality do dołków bez analitytu) nie powinien być mniejszy niż 1,5, aby potwierdzić pomyślną detekcję32. Stosunek tła do podstawy (fluorescencja odpowiedzi sensora w obecności analitytu podzielona przez fluorescencję kontroli zawierającej tylko F-sub) powinna mieścić się w zakresie 1,1-1,5; stosunek ten można dostosować poprzez zmianę stężeń DNM i Dzb (typowy zakres stężeń dla każdego z nich wynosi 5-20 nM). W naszej praktyce LOD jest określana jako punkt przecięcia linii trendu z wartością o trzy odchylenia standardowe powyżej średniej wartości tła (Rysunek 2B). DNM jest skuteczny, jeśli LOD jest &lt;100 pM33. W przypadku, gdy LOD przekracza 100 pM, DNM musi zostać zaprojektowany na nowo.
<img alt="Schemat rdzenia DNAzymu, konstrukcja kafelka DNA, oddziaływanie sekwencji, proces wiązania analitycznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66461/66461fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Trójramienny DNM użyty w niniejszym badaniu. Trzy oligonukleotydy, Dza, Dzb-Tile i Tile-Arm3, są oznaczone odpowiednio kolorami zielonym, niebieskim i fioletowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66461/66461fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki analizy: rozdział DNA w elektroforezie żelowej (A) oraz wykres fluorescencji w funkcji stężenia (B)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66461/66461fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Charakterystyka DNM. (A) Montaż DNM via natywną elektroforezę w 12% żelu poliakryloamidowym, 80 V, 1 h, z użyciem markera DNA 50 bp+. (B) Granica wykrywalności syntetycznego DNA po 60 min inkubacji w 55 °C. Linia pozioma oznacza próg, a linia pionowa to LOD. Przedstawiono średnie wartości z trzech niezależnych pomiarów wraz z jednym odchyleniem standardowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66461/66461fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Największy przełom w dziedzinie sond hybrydyzacyjnych dokonało nasze laboratorium w 2007 roku za sprawą Dmitrija Kołpaszczikowa, który zaproponował ADF rozdzielający sondy hybrydyzacyjne na połówki, oceniając każdą z połówek jej własną funkcję, na przykład zwiększając selektywność na niedopasowania i zmiany pojedynczych nukleotydów, aż po rozwijanie sond złożonych. Drugi przełom nastąpił dekadę później, kiedy zasugerowano dodanie dodatkowych wielokomponentowych ramion wiążących wraz z platformą łączącą. Takie projekty były w stanie pracować nawet ze złożonymi celami, na przykład dwuniciowymi kwasami nukleinowymi i kwasami nukleinowymi o wysokiej strukturze.Największe wyzwania, przed którymi stoi obecnie nasze laboratorium, wynikają z problemu niskiej czułości nanoczujników DNA w porównaniu z konwencjonalnymi technikami amplifikacji. Do tej pory nanoczujniki DNA w teście bez amplifikacji charakteryzują się niską selektywnością, a my staramy się przezwyciężyć ten problem dzięki nowym projektom molekularnym i nowym sposobom wykrywania nanoczujników DNA. Głównymi zaletami naszych czujników DNA są ich czułość w zakresie wykrywanego przepływu, stężenia analogu oraz selektywność.Na przykład ich zdolność do wykrywania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu. Zaletą w porównaniu z innymi technikami diagnostycznymi jest to, że nasze czujniki DNA są w stanie rozwijać i wykrywać złożone struktury RNA oraz dwuniciowe DNA. Nowe pytanie naukowe, które nasze wyniki wyznaczyły kierunek rozwoju, brzmi: czy możliwe jest wiązanie dwuniciowego DNA za pomocą bezbiałkowych rekwizytów hybrydyzacyjnych?Niezależny od białek rekwizyt może być łatwo dostępny dzięki zautomatyzowanej syntezie DNA, łatwiejszy do dostarczenia do komórek i kompatybilny z modyfikacjami chemicznymi i złożonymi nanostrukturami opracowanymi przez nanotechnologię DNA. W połączeniu z DNAzymes, takimi jak DNAzymy rozszczepiające DNA. Taki rekwizyt mógłby stać się podstawą dla nukleaz bezbiałkowych, użytecznym narzędziem do edycji genów i terapii.Aby rozpocząć, otwórz narzędzie internetowe UNAFold i wstaw wybrany region genomowy, który Cię interesuje. Zmodyfikuj temperaturę fałdowania do 55 stopni Celsjusza, stężenie jonów jednowartościowych do 250 milimoli i stężenie jonów magnezu do 200 milimolowych. Następnie otwórz powstałą strukturę drugorzędową jednoniciowego fragmentu DNA i wybierz stabilną strukturę spinki do włosów.Zlokalizuj miejsce wiązania nanomaszyn DNA w obszarach nieustrukturyzowanych lub na pętlach struktur spinki do włosów, aby zwiększyć skuteczność wiązania. Jeśli docelowe miejsce analitu wykazuje strukturę pętli trzpienia, umieść ramię dwa po jednej stronie trzpienia zakrywającego pętlę i trzy do pięciu nukleotydów po drugiej stronie trzpienia. Umieść ramię pierwsze na fragmencie drugiej strony trzpienia.Teraz otwórz narzędzie DINAMelt i zbadaj sekwencje obu ramion i ich odwrotnych sekwencji dopełniacza. Połącz ramiona jedną i dwie sekwencje z połówkami rdzeni DNAzyme i fragmentami wiążącymi F-sub. Następnie skonstruuj losową sekwencję dla fragmentu płytki DNA, upewniając się, że nie jest krótsza niż długość ramienia trzeciego.Połącz tę sekwencję z sekwencją ramienia trzeciego za pomocą łącznika. Połącz ramię drugie z sekwencją, która jest komplementarna do fragmentu płytki DNA za pomocą odpowiedniego łącznika. Na koniec, korzystając z aplikacji internetowej UNA fold, przeanalizuj drugorzędową strukturę nowo zaprojektowanych nici DNA.Na początek zaprojektuj nanomaszyny oparte na DNAzyme lub DNM z rdzeniem od 10 do 23 przy użyciu bezpłatnego oprogramowania. Pozyskaj zaprojektowane sekwencje ze źródeł komercyjnych. Następnie weź 0,5 mililitra mikroprobówek wirówkowych z 200 mikrolitrami buforu reakcyjnego.Dodaj płytkę DZB i ramię płytki trzy oligonukleotydy do probówek. Delikatnie je wymieszaj i odkręć roztwór. Owiń wieczko zamkniętej tubki folią parafinową lub użyj zakręcanych tubek.Inkubować probówkę w 500-mililitrowej zlewce z wrzącą wodą przez dwie minuty. Następnie wyłącz grzejnik i pozwól, aby temperatura pasywnie ochłodziła się przez noc. Teraz przygotuj stronę 12%native przy użyciu podanych odczynników.Przenieś mieszaninę do kasety żelowej i pozwól jej spolimeryzować. Wymieszaj jeden mikrolitr każdej próbki z jednym mikrolitrem czterokrotnie obciążającego barwnika i załaduj je do żelu. Umieść kasetę w komorze.Napełnij go buforem TBE i uruchom żel na 90 minut przy napięciu od 80 do 100 woltów. Zafarbuj żel bromkiem athydu i zwizualizuj go za pomocą systemu dokumentowania żelu. Na początek zaprojektuj nanomaszyny oparte na DNA lub DNM z rdzeniem od 10 do 23 przy użyciu bezpłatnego oprogramowania.Złóż DNM i sprawdź jego rozmiar i jednorodność według strony natywnej. Następnie przygotuj 160 mikrolitrów F-sub w buforze reakcyjnym. Przygotować siedem podwielokrotności po 160 mikrolitrów wstępnie zmontowanych DNM F-sub i Dza w buforze reakcyjnym.Dodaj analit do probówek od drugiej do siódmej i delikatnie wymieszaj składniki. Następnie odwiruj probówki i podziel roztwory na trzy porcje po 50 mikrolitrów na czarnej 96-dołkowej płytce. Uszczelnij płytkę optycznie przezroczystą folią.Inkubować płytkę w łaźni wodnej w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie odkręć talerz. Następnie zmierz fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 480 nanometrów i długości fali emisji 525 nanometrów.

dnazyme-10-23-based-nanomachines-for-nucleic-acid-recognition

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Prezentujemy montaż i zastosowanie urządzenia w skali molekularnej zasilanego białkiem topoizomerazą. Konstrukcja ta stanowi biomolekularny czujnik, który znakuje dwa główne rodzaje pęknięć DNA w przekrojach tkanek poprzez przyłączenie dwóch różnych fluoroforów do ich końców.

In vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie w detekcji uszkodzeń DNA

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy protokół składania robota reagującego biologicznie z origami DNA, jego oczyszczania i barwienia ujemnego do obrazowania pod mikroskopem elektronowym transmisyjnym (TEM).

Składanie i charakterystyka bioresponsywnego robota z DNA Origami

Protokół opisany tutaj ma na celu wyjaśnienie i skrócenie licznych przeszkód na drodze skomplikowanej drogi prowadzącej do zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów. W związku z tym protokół ten ułatwia zarówno syntezę tych aktywowanych elementów budulcowych, jak i ich dostępność do praktycznych zastosowań.

Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

Pęsety optyczne były używane do badania fałdowania RNA poprzez rozciąganie pojedynczych cząsteczek od ich końców 5' i 3'. Tutaj opisano typowe procedury syntezy cząsteczek RNA do pęsety, kalibracji instrumentu i metod manipulowania pojedynczymi cząsteczkami.

Nanomanipulacja pojedynczymi cząsteczkami RNA za pomocą pęsety optycznej

Półelastyczne polimery wykazują unikalne właściwości mechaniczne, które są szeroko stosowane przez żywe systemy. Jednak systematyczne badania nad biopolimerami są ograniczone, ponieważ właściwości takie jak sztywność polimeru są niedostępne. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób to ograniczenie jest obchodzone przez programowalne nanorurki DNA, umożliwiając eksperymentalne badania wpływu sztywności włókien.

Nanorurki DNA jako wszechstronne narzędzie do badania polimerów półelastycznych

Raportujemy protokoły syntezy i oczyszczania oligomerów peptydowych kwasów nukleinowych (PNA) zawierających zmodyfikowane pozostałości. Opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Zmieniona aktywność nukleazy jest związana z różnymi schorzeniami ludzkimi, co potwierdza jej potencjał jako biomarkera. Modułowa i łatwa do wdrożenia metodologia badań przesiewowych przedstawiona w tym artykule pozwala na wybór konkretnych sond kwasów nukleinowych do wykorzystania aktywności nukleazy jako biomarkera choroby.

Kinetyczne badanie przesiewowe aktywności nukleazy za pomocą sond kwasów nukleinowych

Tutaj opisujemy protokół tworzenia dyskretnych i dokładnych nieorganicznych nanostruktur na podłożach, używając kształtów origami DNA jako szablonów prowadzących. Metoda jest demonstrowana poprzez tworzenie plazmonicznych złotych anten w kształcie muszki na przezroczystym podłożu (szafirze).

Nanowzorce substratów DNA origami struktur nieorganicznych do zastosowań detekcyjnych

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Poznaj projektowanie nanomaszyn DNAzyme 10-23 do detekcji kwasów nukleinowych z wykorzystaniem darmowego oprogramowania. Metoda ta umożliwia wykrywanie fragmentów wirusa Epsteina-Barr z wysoką selektywnością.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Przeglądaj więcej filmów