Name: Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj protokół biobankowania organoidów raka jajnika, który rozwiązuje problem zmienności między pacjentami. Metoda obejmuje przetwarzanie tkanek, nasiewanie, dostosowanie mediów i barwienie immunofluorescencyjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie jest finansowane przez Niemieckie Centrum Badań nad Rakiem DKTK, stronę partnerską Monachium, partnerstwo między DKFZ i Szpitalem Uniwersyteckim LMU w Monachium. Badanie jest również wspierane przez grant German Cancer Aid (#70113426 i #70113433). Parafinowe zatapianie tkanek i organoidów przeprowadzono w głównym obiekcie Instytutu Anatomii, Wydziału Lekarskiego, LMU Monachium, Monachium. Obrazowanie konfokalne zostało wykonane w Podstawowej placówce Bioobrazowania w Centrum Biomedycznym (BMC). Autorzy pragną podziękować Simone Hofmann, Marii Fischer, Cornelii Herbst, Sabine Fink i Martinie Rahmeh za pomoc techniczną.

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).</li>
<li>Berger, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+pan-cancer+molecular+study+of+gynecologic+and+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers.</a> Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).</li>
<li>Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biobanks%3A+addressing+the+practical+and+ethical+issues+to+deliver+a+valuable+tool+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).</li>
<li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biobanking+in+health+care%3A+evolution+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Biobanking in health care: evolution and future directions.</a> J Transl Med. 17 (1), 172(2019).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Larsen, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-cancer+organoid+platform+for+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A pan-cancer organoid platform for precision medicine.</a> Cell Rep. 36 (4), 109429(2021).</li>
<li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).</li>
<li>Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+drug+screening+of+patient-derived+tumor+organoids+using+high-content+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101407(2022).</li>
<li>Senkowski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+efficient+establishment+and+drug-response+profiling+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids.</a> Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).</li>
<li>LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Next-generation cancer organoids.</a> Nat Mater. 21 (2), 143-159 (2022).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expansion+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+organoids+requires+a+low-Wnt+environment%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment.</a> EMBO J. 39 (6), e104013(2020).</li>
<li>Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+and+Wnt+pathways+regulate+stemness+and+differentiation+in+human+fallopian+tube+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids.</a> Nat Commun. 6, 8989(2015).</li>
<li>Trillsch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+optimize+the+biobanking+of+ovarian+cancer+organoids+by+accommodating+patient-specific+differences+in+stemness+potential%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102484(2023).</li>
<li>Maenhoudt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+organoids+from+ovarian+cancer+as+experimental+and+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models.</a> Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).</li>
<li>Fuerer, C., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+to+probe+and+manipulate+the+Wnt+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway.</a> PLoS One. 5 (2), e9370(2010).</li>
<li>Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf">https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf</a> (2021).</li>
<li>Thermo Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microm+EC350+Modular+tissue+embedding+center+Instruction+manual%22">Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual</a>. , (2009).</li>
<li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Sci Rep. 10 (1), 12581(2020).</li>
</ol>

M.K. jest wymieniony jako wynalazca w patencie związanym z podłożem do organoidów raka jajnika. F.T. otrzymał fundusze na badania, radę doradczą, honoraria i pokrycie kosztów podróży od firm AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics i Tesaro/GSK. S.M. otrzymał fundusze na badania, radę doradczą, honorowe lub koszty podróży: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.

Opracowany protokół jest odpowiedzią na wcześniejsze wyzwania związane z biobankowaniem organoidów raka jajnika w odniesieniu do tworzenia organoidów i długoterminowego potencjału pasażu oraz zapewnia generowanie w pełni ekspaktoryjnych linii z większości złogów guzów litych. Chirurgiczny proces pobierania próbek guza, które mają być wykorzystane do generowania organoidów, znacząco wpływa na wydajność i potencjał ekspansji. Próbki tkanki nowotworowej można uzyskać podczas różnych zabiegów, w tym chirurgii wielowisceralnej, laparoskopii diagnostycznej lub biopsji. Doświadczony chirurg ginekoonkologiczny powinien priorytetowo traktować uzyskanie czystych próbek guza z lokalizacji otrzewnej. W szczególności zaobserwowano, że makroskopowo nekrotyczne obszary w dużych złogach nowotworowych są mniej odpowiednie do pomyślnego generowania kultur organoidowych. Ponieważ czystość próbki ma kluczowe znaczenie dla odzwierciedlenia cech molekularnych i fenotypowych dla dalszych zastosowań, konieczne są zsynchronizowane wysiłki zarówno zespołów klinicznych, jak i laboratoryjnych w celu optymalnego biobankowania, zapewniającego, że linie są tworzone z najbardziej odpowiednich regionów guza.
Chociaż protokół ten obejmuje różnice w zależnościach czynników wzrostu, które zaobserwowaliśmy w ciągu 2 lat biobankowania, jasne jest, że dodatkowe udoskonalenie jest uzasadnione w celu dalszego zwiększenia skuteczności, ponieważ nadal nie zaobserwowaliśmy żadnego wzrostu organoidów w 20% przypadków, a liczba linii, które wykazały ograniczony potencjał ekspansji, sugerowała nieoptymalne utrzymanie łodygi. Chociaż nasz biobank organoidów zawiera obecnie tylko próbki raka jajnika o surowiczej histologii (HGSOC i LGSOC), nasze doświadczenia z próbkami z różnych histologii nabłonkowego raka jajnika przed ustrukturyzowanym programem biobankowania wykazały porównywalne wskaźniki sukcesu bez szczególnych różnic. Warto zauważyć, że większość podtypów nabłonkowego raka jajnika ma podobną kolumnową morfologię pseudostratyfikowaną z tkankami, które rozwinęły się z drogi Mullera (jajowód, macica, szyjka macicy), podczas gdy sam nabłonek jajnika pochodzi rozwojowo z grzbietu narządów płciowych i śródnercza, pokryty pojedynczą warstwą nabłonka prostopadłościennego. Ponieważ szlaki rozwojowe regulujące homeostazę nabłonka odgrywają kluczową rolę w kontroli potencjału dorosłych komórek macierzystych, różnice w pochodzeniu embrionalnym powinny być brane pod uwagę przy opracowywaniu protokołów biobankowania organoidów. W związku z tym uważamy, że przodkowie z powierzchni jajnika prawdopodobnie wymagają specyficznych dla narządu warunków hodowli, aby utrzymać długotrwały stabilny wzrost.
Warto zauważyć, że w naszym laboratorium protokół okazał się skuteczny również w przypadku próbek raka jajnika po neoadiuwantach, chociaż chemioterapia neoadiuwantowa wpływa na żywotność komórek i fenotyp tkanki. Próbki te wykazują więcej szczątków i agregatów tkanki zewnątrzkomórkowej w porównaniu z próbkami pochodzącymi z nieleczonych wcześniej chemioterapią tkanek po pierwotnych operacjach odciążających, które mogą wpływać na potencjał tworzenia organoidów. W takich przypadkach przekonaliśmy się, że odpowiednia ilość tkanki chirurgicznej i ścisłe przestrzeganie zalecanych warunków transportu mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wytworzenia organoidów, ponieważ próbki po zastosowaniu neoadiuwantu mogą być bardziej wrażliwe.
Bardzo interesujące zjawisko korzystnego wpływu krótkiej ekspansji na plastik w 2D świeżo wyizolowanych przodków na późniejszy wzrost organoidów, które wielokrotnie obserwowaliśmy i dlatego włączyliśmy do standaryzowanej procedury eksperymentalnej, jest ważnym uzupełnieniem metodologii badań nad organoidami nowotworowymi, która w dużej mierze opiera się na strategiach siewu bezpośredniego. Kuszące jest spekulowanie, że wrażliwość komórek progenitorowych po trawieniu enzymatycznym i zdolność czynników wzrostu do odpowiedniego ich przygotowania mogą być mechanizmami leżącymi u podstaw tej różnicy, która w niektórych przypadkach jest decydującym czynnikiem, jeśli można ustalić linię. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby ustalić jasne zależności.
W sprostaniu wyzwaniom związanym z wysoką adhezją komórek i funkcjonalnymi połączeniami w organoidach 3D raka jajnika, które są trudne do strawienia, połączenie mechanicznej i enzymatycznej dysocjacji za pomocą igły i strzykawki może pomóc, gdy po trypsynizacji pozostaną duże grudki. Eksperymentowanie z różnymi warunkami enzymatycznymi może prowadzić do dalszych ulepszeń.
Po długotrwałym przechowywaniu linie organoidów można rozmrozić i wprowadzić do hodowli zgodnie z projektem eksperymentalnym i wykorzystać do kolejnych zastosowań. Umożliwia to dostęp w dowolnym momencie do już wygenerowanych linii organoidów w określonych celach badawczych i jest szczególnie interesujące dla badania długoterminowego zachowania niektórych linii w świetle postępu choroby pacjenta. Jednak kriokonserwacja organoidów raka jajnika pozostaje wyzwaniem. Wahania temperatury podczas cykli zamrażania i rozmrażania mogą negatywnie wpływać na żywotność, funkcjonalność i potencjał ekspansji organoidów. Długotrwałe przechowywanie jest bardziej stabilne w ciekłym azocie, gdzie bardzo niskie temperatury minimalizują ryzyko degradacji, dzięki czemu można zachować integralność organoidów. Jednak ciągła optymalizacja jest uzasadniona w celu ustanowienia spójnych procedur zamrażania, przechowywania i rozmrażania, aby jeszcze bardziej usprawnić te procesy.
Pomimo wspomnianych nierozstrzygniętych problemów, protokół ten wykazuje zdolność do konsekwentnego generowania stabilnych linii organoidowych z próbek guzów litych pacjentek z rakiem jajnika. W naszym laboratorium przetworzyliśmy do tej pory 120 próbek tkanki pierwotnego raka jajnika, osiągając sukces w około 50% przypadków, w tym w szerokim zakresie podtypów histologicznych i stadiów choroby z pierwotnym odciążeniem, nawrotami choroby i próbkami chirurgicznymi po adiuwantach. Zapewniając ustrukturyzowane ramy do generowania organoidów pochodzących z różnych próbek pobranych od pacjentów, wysiewu równoległego w różnych podłożach i wdrażania różnych strategii wysiewu, protokół ten daje możliwość oceny indywidualnych różnic w potencjale pnia, dostarczając w ten sposób dodatkowych informacji na temat biologii nowotworu. O ile nam wiadomo, zdecydowana większość badań zwykle opiera się na odwrotnym podejściu, polegającym na testowaniu składników pożywki na niewielkiej liczbie próbek i wybieraniu dla uproszczenia głównie jednego optymalnego podłoża. Nasze systematyczne badania wpływu HER1ß, wpływu suplementacji RSPO1 i FGF10 oraz wysiewu 2D/3D pokazują niezbicie, że tkanka raka jajnika ma pewien stopień zmienności między pacjentami we właściwościach łodygi, a optymalna pożywka jest rzeczywiście specyficzna dla pacjenta. Dlatego niezbędne jest systematyczne równoległe testowanie różnych składów pożywek zapewniających różne egzogenne środowiska sygnalizacji parakrynnej.
Stworzenie żywego biobanku z obszernym panelem organoidów pochodzących od różnych pacjentek z rakiem jajnika wraz z prospektywnie zebranymi informacjami klinicznymi służy jako cenne źródło dla szerokiego zakresu zastosowań badawczych i odzwierciedla niejednorodny krajobraz kliniczny, który może mieć zastosowanie do większej populacji pacjentów17. Długotrwała hodowla i kriokonserwacja umożliwiają spójność doświadczalną i powtarzalną dostępność tej samej linii organoidów w czasie, służąc jako podstawa dla podłużnych projektów eksperymentalnych o niezmienionych właściwościach komórkowych linii nowotworu.
Zachowując architekturę nabłonka i polaryzację, linie organoidów są odpowiednim modelem do badania komunikacji komórka-komórka i zależnego od kontekstu podejmowania decyzji dotyczących losu komórki, w którym pośredniczą parakrynne szlaki sygnałowe. Osadzanie organoidów w żelu histologicznym jest praktycznym i skutecznym etapem pośrednim pozwalającym uniknąć strat materiału po utrwaleniu i zapewnia, że dalsze przetwarzanie (zatapianie w parafinie i cięcie) może być przeprowadzane równolegle z próbkami tkanek. Utrata organoidów podczas procedury utrwalania jest krytycznym problemem, gdy liczba organoidów jest bardzo ograniczona. Jednak utracie tej można przeciwdziałać poprzez dokładne usunięcie organoidów z macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez przemycie w zimnej pożywce podstawowej i zebranie co najmniej dwóch w pełni wyrośniętych studzienek z 24-dołkową płytką przed utrwaleniem. Protokół barwienia immunofluorescencyjnego umożliwia obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości w celu dopasowania cech molekularnych i fenotypowych organoidów raka jajnika do macierzystej tkanki nowotworowej, ale jest również cennym narzędziem do badania odpowiedzi komórkowej na związki chemiczne lub charakterystyki linii modyfikowanych genetycznie. Metoda nadaje się również do barwienia histologicznego bez żadnych szczególnych modyfikacji. W zależności od celu badania należy rozważyć wykonanie cieńszych odcinków wyciętych mikrotomem (2-3 μm).
Co ważne, stabilna, długoterminowa hodowla jest warunkiem wstępnym eksperymentów z edycją genów i testów funkcjonalnych dotyczących odpowiedzi na lek i oporności na nowe i standardowe terapie17,21. W szczególności organoidy uzyskane z ponownych biopsji, które są wykonywane podczas progresji choroby i nawrotu, dają możliwość bezpośrednich analiz porównawczych między pierwotnym guzem nieleczonym wcześniej a nowo nabytymi cechami obserwowanymi podczas nawrotu. Identyfikacja specyficznych dla pacjenta odpowiedzi na leczenie i tworzenie oporności na terapię in vitro naprzód dziedzinę medycyny precyzyjnej w badaniach nad rakiem jajnika21.

Kliniczne postępowanie z pacjentkami z nabłonkowym rakiem jajnika pozostaje wyzwaniem ze względu na jego niejednorodny obraz kliniczny w zaawansowanych stadiach i wysokie wskaźniki nawrotów1. Lepsze zrozumienie rozwoju i zachowań biologicznych raka jajnika wymaga podejść badawczych, które uwzględniają specyficzną dla pacjenta zmienność w przebiegu choroby, odpowiedź na leczenie oraz cechy histopatologiczne i molekularne2.
Biobanking, charakteryzujący się systematycznym gromadzeniem i długotrwałym przechowywaniem próbek guzów pochodzących od pacjentek z rakiem jajnika wraz z ich informacjami klinicznymi, oferuje zachowanie dużej grupy pacjentów w różnych stadiach choroby, w tym próbek guzów z pierwotnych operacji odciążających, po chemioterapii neoadjuwantowej i z choroby nawracającej. Ma cenny potencjał dla postępu w badaniach nad rakiem, służąc jako źródło obiecujących biomarkerów prognostycznych i celów terapeutycznych3. Jednak konwencjonalne metody biobankowania, takie jak utrwalanie formaliny i zamrażanie, nie są podatne na przeprowadzanie badań funkcjonalnych na oryginalnych próbkach guza ze względu na utratę żywotności i zakłócenie natywnej trójwymiarowej architektury tkankowej4,5.
Badania mechanizmów molekularnych, w onkologii i poza nią, zależą przede wszystkim od użycia odpowiednich modeli eksperymentalnych, które wiernie odzwierciedlają biologię choroby i utrzymują właściwości in vitro tkanki obserwowanej in vivo. Organoidy pochodzące od pacjenta, oparte na zachowaniu potencjału odnowieniowego, odtwarzają w laboratorium pierwotną strukturę i funkcję nabłonka oraz umożliwiają przeprowadzanie testów w kontekście specyficznym dla pacjenta. W związku z tym okazały się bardzo obiecującymi narzędziami do badań nad rakiem i medycyny spersonalizowanej, wypełniając lukę między różnorodnością kliniczną a badaniami laboratoryjnymi6,7,8,9. Dostosowane strategie terapeutyczne oparte na indywidualnych reakcjach leków linii organoidowych i testowaniu funkcjonalnego znaczenia profili molekularnych mogą być potencjalnie bezpośrednio stosowane w opiece nad pacjentem10,11. Możliwość długoterminowej hodowli, w tym cech specyficznych dla pacjenta i gromadzenia odpowiednich prospektywnych danych klinicznych w czasie, jest bardzo obiecująca w identyfikacji nowych czynników prognostycznych i predykcyjnych zaangażowanych w postęp choroby i mechanizmy oporności3,9.
Niemniej jednak, zbudowanie biobanku, który zawiera organoidy z różnych próbek nowotworowych, wymaga połączenia ścisłego przestrzegania skomplikowanej metodologii i ustanowienia protokołów ułatwiających konserwację12. Standaryzacja procesów zapewnia, że biobank może być efektywnie tworzony i utrzymywany przez wyszkolony personel nawet przy dużej rotacji, przy jednoczesnym przestrzeganiu najwyższych standardów jakości13. W kilku badaniach wykazano pomyślne wytworzenie stabilnych linii organoidowych raka jajnika odpowiadających profilowi mutacyjnemu i fenotypowemu pierwotnego guza z różnymi wskaźnikami wydajności. Mimo to rutynowe bankowanie biologiczne pozostaje wyzwaniem w praktyce, szczególnie w przypadku długoterminowego, stabilnego wzrostu linii, co jest warunkiem wstępnym ekspansji na dużą skalę lub udanej edycji genomu.
W szczególności, kwestia rozszerzalności pozostaje niejasno zdefiniowana w tej dziedzinie, ponieważ organoidy wykazujące powolny i ograniczony potencjał wzrostu są czasami liczone jako ustalone linie. Jak początkowo wykazali Hoffmann i wsp., badanie, którego główne wyniki stanowiły podstawę dla tego dalej rozwijanego protokołu, optymalne obchodzenie się z tkanką raka jajnika wymaga unikalnej strategii dostosowania się do heterogeniczności14. Charakterystykę fenotypową organoidów otrzymanych tą metodą oraz bliskie podobieństwo do rodzicielskiej tkanki nowotworowej potwierdzono za pomocą sekwencjonowania DNA panelowego i analizy transkryptomicznej dojrzałych kultur (4-10 miesięcy hodowli), wykazując stabilność modelu8,9,12,14.
W przeciwieństwie do środowiska parakrynnego, które reguluje homeostazę w zdrowych jajowodach, warstwa nabłonkowa, która prawdopodobnie prowadzi do powstania surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości (HGSOC), potencjału regeneracji raka i zdolności do tworzenia organoidów, jest mniej zależna od egzogennej suplementacji Wnt. Co więcej, aktywna sygnalizacja białka morfogenetycznego kości (BMP), charakteryzująca się brakiem Noggin w pożywce organoidowej, okazała się korzystna dla tworzenia długoterminowych hodowli ze złogów tkanek stałych raka jajnika14,15. Podczas systematycznego biobankowania stałych złogów raka jajnika potwierdziliśmy te odkrycia i ustaliliśmy linię produkcyjną, ze szczegółami przedstawionymi w tym protokole, który w większości przypadków zapewnia długoterminową ekspansję. Stwierdziliśmy, że równoległe testowanie różnych składów pożywek i sposobów wysiewu podczas pracy z pierwotnymi izolatami jest niezbędne do poprawy tworzenia długoterminowych stabilnych linii organoidowych i zwiększenia plonów, umożliwiając solidną propagację i ekspansję do formatów wielodołkowych wymaganych w dalszych eksperymentach16.
Ponadto, czystość i jakość próbek pobranych podczas operacji ma kluczowe znaczenie dla potencjału translacyjnego organoidów raka jajnika w badaniach podstawowych i diagnostyce molekularnej. Złożoność obrazu klinicznego HGSOC wymaga ścisłej współpracy między chirurgami, onkologami i naukowcami w laboratorium, aby zapewnić, że odpowiedni materiał jest prawidłowo zidentyfikowany, warunki transportu są utrzymywane na stałym poziomie, a linie organoidów są generowane z wysoką wydajnością, reprezentując najważniejsze cechy choroby każdego pacjenta. Protokół ten zapewnia ustandaryzowane, ale możliwe do dostosowania ramy do uchwycenia pełnego potencjału organoidów raka jajnika, biorąc pod uwagę heterogeniczność charakteryzującą raka jajnika16,17. Warto zauważyć, że protokół ten umożliwia wiarygodne biobankowanie szerokiego spektrum obrazu klinicznego raka jajnika, w tym różnych typów histologicznych (rak jajnika o wysokim i niskim stopniu złośliwości, LGSOC), różnych złogów od tych samych pacjentek, które wykazują różnice w regulacji pnia, tkanek pochodzących z operacji w stanie postadiuwantowym, materiału biopsyjnego oraz próbek z operacji w nawrotowej fazie progresji choroby.

<table><tbody><tr><td>100 Sterican 26 G</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>100 Sterican 27 G</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>293T HA Rspo1-FC</td><td>R& Systemy D, Minneapolis, USA</td><td>3710-001-01</td><td>Alternatywa: linia komórkowa z ekspresją R-Spondin1, Sigma-Aldrich, SC111</td></tr><tr><td>A-83-01 (inhibitor kinazy RI TGF-B IV)</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>616454</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 Medium&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-p53 (DO1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Teksas, USA</td><td>Przeciwciało sc-126</td><td></td></tr><tr><td>anty-PAX8</td><td>Proteintech, Manchester, Wielka Brytania&nbsp;</td><td>10336-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement (50x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Butelkowy filtr próżniowy 0,2 i mikro; m</td><td>Corning, Berlin, Niemcy&nbsp;</td><td></td><td></td>430049</tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych CELLSTAR, 175 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Austria</td><td>661175</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych CELLSTAR, 25 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Austria</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych CELLSTAR, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, Austria</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well Clear Clear poddane obróbce TC&nbsp;</td><td>Corning, Berlin, Niemcy&nbsp;</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SFM</td><td>PromoCell &ndash; Nauka skoncentrowana na człowieku, Heidelberg, Niemcy</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu Cultrex, typ 2, Pathclear</td><td>R& D systems, Minneapolis, USA</td><td>3533-005-02</td><td>Alternatywa: Matrigel, matryca membrany podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu&nbsp; Corning, 356231&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anty-Mysia IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>DAKO&nbsp; Bufor cytrynianowy, pH 6,0, 10x Antigen Retriever</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty królik Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-kozi IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>A32814</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s Solanka buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>Epredia HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Polistyren 24-dołkowy Falcon&nbsp;</td><td>Corning, Berlin, Niemcy&nbsp;</td><td></td><td></td>351447</tr><tr><td>Skalpel z piór&nbsp;</td><td>Pfm medical, Kolonia, Niemcy</td><td>200130010</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Formalina 37% bezkwasowa, stabilizowana</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Niemcy</td><td>1019205000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td>156630080</tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało EpCAM/TROP-1</td><td>R& D systems, Minneapolis, USA</td><td>AF960</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka FGF10</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka rekombinowana BMP2</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHC7146</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka rekombinowana EGF</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka rekombinowana heregulina beta-1</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowe oprogramowanie LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/</td></tr> <tr><td>Leica TCS SP8 X&nbsp; Laserowy mikroskop konfokalny ze światłem białym</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplement (100x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>3570519</td><td></td></tr> Parafilm <tr><td>parafinowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Omnilab, Monachium, Niemcy</td><td>5170002</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Niemcy</td><td>1176201000</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>P4333-100</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 400 &micro; m</td><td>PluriSelect, Lipsk, Niemcy</td><td>43-50400-01</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, Tuluza, Francja</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący czerwone krwinki</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Roticlear</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>A538.5</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Cryovials</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>375418PK</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Enzym TrypLE Express&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>PanReac AppliChem, Darmstadt, Niemcy</td><td>A4974-0100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Niemcy</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>R25001</td><td></td></tr></tbody></table>

strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Chociaż utworzenie biobanku raka jajnika na podstawie organoidów pochodzących od pacjentów wraz z informacjami o ich klinicznym tle obiecuje postęp w badaniach i opiece nad pacjentem, standaryzacja pozostaje wyzwaniem ze względu na niejednorodność tego śmiertelnego nowotworu, w połączeniu z nieodłączną złożonością technologii organoidowej. Ten elastyczny protokół zapewnia systematyczne ramy do wykorzystania pełnego potencjału organoidów raka jajnika, biorąc pod uwagę specyficzną dla pacjenta zmienność komórek progenitorowych. Wdrażając ustrukturyzowany eksperymentalny przepływ pracy w celu wyboru optymalnych warunków hodowli i metod wysiewu, z równoległym testowaniem bezpośredniego siewu 3D w porównaniu z trasą 2D/3D, uzyskujemy w większości przypadków solidne, długoterminowe linie rozprężne, odpowiednie dla szerokiego zakresu dalszych zastosowań. 
Zauważalnie, protokół został przetestowany i okazał się skuteczny w dużej liczbie przypadków (N = 120) wysoce niejednorodnego materiału wyjściowego, w tym raka jajnika o wysokim i niskim stopniu złośliwości oraz etapach choroby z pierwotnym odciążeniem, nawracającą chorobą i próbkami chirurgicznymi po neoadiuwantach. W egzogennym środowisku sygnalizacyjnym o niskim Wnt i wysokim BMP zaobserwowaliśmy, że progenitorzy są różnie podatni na aktywację szlaku hereguliny 1 ß (HERß-1), przy czym HERß-1 promuje tworzenie organoidów w niektórych, jednocześnie hamując je w innych. W przypadku podzbioru próbek pacjenta optymalne tworzenie organoidów i długotrwały wzrost wymagają dodania czynnika wzrostu fibroblastów 10 i R-Spondyny 1 do pożywki. 
Ponadto, podkreślamy kluczowe etapy trawienia tkanek i izolacji progenitorów oraz wskazujemy przykłady, gdzie krótka hodowla w 2D na plastiku jest korzystna dla późniejszego tworzenia organoidów w matrycy Ekstraktu z Błony Podstawnej typu 2. Ogólnie rzecz biorąc, optymalne biobankowanie wymaga systematycznego testowania wszystkich głównych warunków równolegle w celu zidentyfikowania odpowiedniego środowiska wzrostu dla poszczególnych linii. Protokół opisuje również procedurę postępowania w celu efektywnego osadzania, dzielenia i barwienia w celu uzyskania obrazów organoidów o wysokiej rozdzielczości, co jest wymagane do kompleksowego fenotypowania.

Po wstępnej dysocjacji tkanki, filtracji i zliczeniu, komórki są wysiewane równolegle bezpośrednio w formacie 3D, zgodnie z powyższym opisem, a także w formie zawiesiny w kolbie w celu krótkotrwałej ekspansji 2D. W niektórych przypadkach przejściowa ekspansja 2D pozytywnie wpływa na formowanie organoidów i za pomocą tej drogi udaje się pomyślnie ustanowić linię długoterminową, podczas gdy porównawczy równoległy wysiew 3D może doprowadzić do zatrzymania wzrostu (Rycina 1). Dla każdej przetwarzanej tkanki dawcy komórki są testowane zgodnie z macierzą mediów. Stosując tę strategię, nasza biobanka zawiera obecnie linie reprezentatywne dla każdego standardowego warunku wzrostu, co pokazano na Rycini 2. Dzięki rygorystycznemu wdrożeniu tej miniplatformy przesiewowej do testowania różnych mediów i sposobów wysiewu, pomyślnie wygenerowaliśmy linie organoidów z różnych typów histologicznych i etapów rozwoju choroby w raku jajnika (Rycina 3) – z pierwotnego raka surowiczego wysokiego stopnia, z zabiegów interwałowych po leczeniu neoadjuwantowym oraz z choroby nawrotowej. Charakterystyka fenotypowa linii organoidów za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego głównych markerów w porównaniu z tkanką macierzystą przekonująco wykazuje, że cechy charakterystyczne dla komponentu guza nabłonkowego są zachowane w modelu organoidowym: architektura i adhezja nabłonkowa wyznaczana przez (EpCAM), tożsamość linii komórkowej (PAX8) oraz typowa mutacja punktowa TP53 charakterystyczna dla HGSOC, prowadząca do akumulacji w jądrze komórkowym (Rycina 4).
W celu efektywnego podejmowania decyzji podczas biobankowania organoidów należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii metodologicznych. Potencjał wzrostu organoidów nie jest określany wyłącznie przez zwiększenie ich średnicy. Dodatkowo potencjał ekspansji determinują cechy fenotypowe, takie jak kolor, stopień nasycenia barwy oraz integralność konturów. Powstawanie wakuol stresowych w cytoplazmie świadczy o nieoptymalnych warunkach. Początkowe problemy dotyczące wzrostu i potencjału tworzenia organoidów mogą wynikać z niewłaściwych warunków transportu oraz opóźnienia w obróbce tkanki. Ze względu na obserwowaną wysoką zmienność osobniczą potencjału ekspansji w liniach nowotworowych, zalecamy odczekanie co najmniej 14 dni przed podjęciem ostatecznej decyzji na temat potencjału wzrostu. Jeśli początkowo w różnych mediach obserwowane są podobne wzorce wzrostu, należy prowadzić ekspansję w wielu warunkach. Z naszego doświadczenia wynika, że wyraźne rozróżnienie długoterminowego, stabilnego potencjału wzrostu jest często możliwe dopiero po kilku tygodniach lub miesiącach hodowli.
<img alt="Schemat procesu hodowli komórkowej i obrazy mikroskopowe przedstawiające rozwój monowarstwy 2D i hodowli 3D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Korzyści z krótkotrwałego wysiewu w 2D izolatów pierwotnych dla późniejszej generacji organoidów. (A) Schemat układu eksperymentalnego przedstawiający dwukierunkową, równoległą strategię wysiewu: 2D/3D oraz bezpośredni wysiew 3D w czterech różnych mediach. (B) Obraz przylegających izolatów pierwotnych przed trypsynizacją i przeniesieniem do hodowli 3D. (C) Przykład depozytu pierwotnego, w którym równoległy wysiew wykazał wyraźną przewagę ścieżki 2D/3D, ponieważ długoterminowa ekspansja organoidów była możliwa tylko z progenitorów, które zostały początkowo wyizolowane na plastiku. Obraz w lewym górnym rogu przedstawia hodowlę 3D 7 dni po izolacji w pasażu 0 (oznaczonym jako P0) z niewystarczającym tworzeniem organoidów po pierwszym pasażu (oznaczonym jako P1) na obrazie w lewym dolnym rogu. Po wysiewie 2D na plastiku (patrz Rycina 1B) i następującym po nim przeniesieniu do hodowli 3D, lepsze tworzenie organoidów jest widoczne już w P0, natomiast potencjał długoterminowej ekspansji zostaje potwierdzony w pasażu 4 (P4). Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Morfologia hodowli komórkowych, obrazy mikroskopowe, porównanie OCM1 i OCM2, analiza wzrostu, skala 500 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wymagania dotyczące pożywek specyficzne dla pacjenta. Przykłady czterech różnych, długoterminowo stabilnych linii ekspandowanych, z których każda rośnie w innej pożywce. Pasek skali = 500 µm. Skróty: OCM = pożywka do raka jajnika; her = heregulina 1β; HGSO = wysokstopniowy surowiczy rak jajnika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe przedstawiające hodowle komórkowe pierwotnego i nawrotowego HGSOC oraz LGSOC; skale 500μm, 200μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Generowanie organoidów z różnych etapów choroby. Obrazy długotrwale stabilnych linii ekspansyjnych, pochodzących z wysokiego stopnia surowiczego i niskiego stopnia surowiczego raka jajnika w obrazie pierwotnym, z operacji interwałowej (po neoadjuwantowej chemioterapii) oraz z tkanki raka nawrotowego. Pasek skali = 500 µm. Skróty: HGSOC = wysokiego stopnia surowiczy rak jajnika; LGSOC = niskiego stopnia surowiczy rak jajnika; NACT = chemioterapia neoadjuwantowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza immunofluorescencyjna tkanek i organoidów; markery EPCAM, TP53, PAX8; obrazy mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Bliska zgodność fenotypu organoidów i rodzimej tkanki nowotworowej. Obrazy konfokalne barwienia immunofluorescencyjnego (A) tkanki nowotworowej oraz (B) powiązanej linii organoidów wykazują bardzo wysoką zbieżność wzoru barwienia i poziomu ekspresji wszystkich markerów: EpCAM (zielony), PAX8 (czerwony), TP53 (magenta). Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Skład pożywek i mieszaniny trawiennej użytej w tym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467_Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół oferuje systematyczne ramy do tworzenia organoidów raka jajnika z różnych stadiów choroby i rozwiązuje wyzwania związane ze zmiennością specyficzną dla pacjenta, aby zwiększyć wydajność i umożliwić solidną, długoterminową ekspansję dla kolejnych zastosowań. Zawiera szczegółowe kroki przetwarzania tkanek, wysiewu, dostosowywania wymagań dotyczących pożywek i barwienia immunofluorescencyjnego.

Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...

Najlepsze postępowanie kliniczne w najnowocześniejszych badaniach translacyjnych dla pacjentek z zaawansowanym rakiem jajnika ma najwyższy priorytet w naszej placówce. Dzięki biobankowaniu organoidów pochodzących od pacjentów osiągnęliśmy znaczny postęp w kierunku indywidualnie dostosowanego leczenia. Dzięki temu możemy ocenić cechy charakterystyczne dla pacjenta i zidentyfikować biomarkery predykcyjne.W ostatnich latach poczyniliśmy znaczne postępy w zakresie poprawy radykalnej chirurgii wielowitkowej, chemioterapii, terapii antyangiogennej, a także terapii inhibitorami PARP u pacjentek z zaawansowanym rakiem jajnika i nawet przy tym zwiększaniu przeżywalności. Kolejnym dużym krokiem byłoby lepsze przewidywanie, który pacjent odniesie korzyści z jakiego konkretnego leczenia. Obecnie decyzje dotyczące leczenia klinicznego podejmowane są na podstawie ogólnych cech histopatologicznych oraz informacji o niedoborze zaleceń homologicznych lub badanych w tkance nowotworowej zatopionej w parafinie.Modele biologiczne, które oceniają specyficzne odpowiedzi na chemioterapię i leczenie celowane, nie zostały jeszcze wdrożone do praktyki klinicznej. Zidentyfikowaliśmy kluczowe cechy tkanki raka jajnika, w szczególności wymagania dotyczące hodowli niezbędne do utrzymania jej potencjału odnawialnego in vitro, i wykorzystujemy tę wiedzę do osiągnięcia solidnego, długoterminowego wzrostu linii organoidów i utworzenia biobanku z próbek na różnych etapach choroby. Nasze codzienne doświadczenia w zakresie biobankowania organoidów raka jajnika skutecznie pokazują niezwykłą heterogeniczność w biologii tego nowotworu, co może utorować drogę do nowej klasyfikacji lub stanowić podstawę dla nowych rozwiązań terapeutycznych ukierunkowanych na potencjał macierzysty.Na początek weź świeżo wyizolowaną tkankę raka jajnika. Umyj świeżo tkankę na szalce Petriego dokładnie, używając PBS bez wapnia i magnezu. Za pomocą jednorazowych skalpeli i nożyczek rozdrobnij tkankę na szalce Petriego na małe kawałki.Zbierz tkankę w probówkach kriogenicznych. Następnie przenieś te rurki do pojemnika wypełnionego ciekłym azotem w celu szokowego zamrożenia. Następnie zbierz tkankę o wymiarach od dwóch do trzech milimetrów do pojemnika na próbkę histologiczną, a następnie utrwal tkankę w pojemniku na formalinę na 24 godziny.Użyj skalpela do homogenizacji tkanki przed trawieniem enzymatycznym, aby zmaksymalizować dysocjację mechaniczną. Następnie inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Po inkubacji wprowadzić do probówki 15 mililitrów zimnej podstawowej pożywki hodowlanej.Odwirować probówkę przez pięć minut przy sile 300 G, usunąć supernatant i dodać pięć mililitrów nowej podstawowej pożywki hodowlanej. Następnie odcedź zawiesinę komórkową za pomocą filtra 400 mikrometrów do świeżej 15-mililitrowej probówki. Aby wyeliminować erytrocyty, dodaj pięć mililitrów buforu lizującego czerwone krwinki do osadu komórkowego i inkubuj w łaźni wodnej przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji dodać pięć mililitrów podłoża podstawowego do inaktywacji lizy. Osadzać komórki przez wirowanie i dodawać trzy mililitry podstawowej pożywki hodowlanej do osadu komórkowego. Teraz przenieś wymaganą liczbę komórek zawieszonych w pożywce do hodowli bazylii do nowej probówki.Odwirować komórki, a po odrzuceniu supernatantu dokładnie wymieszać osad komórek z zimną matrycą BME 2 na lodzie. Umieść komórki w kropelkach matrycy BME 2 na wstępnie podgrzanej, pustej 48-dołkowej płytce, pipetując pomiędzy nimi, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Następnie dodaj 250 mikrolitrów każdej pożywki z rakiem jajnika do odpowiednich studzienek.Aby rozpocząć hodowlę 2D z pozostałych izolowanych komórek, należy odwirować komórki przez pięć minut w temperaturze 300 g i dodać osad komórkowy do pożywki 2D. Użyj mikroskopu z kontrastem fazowym, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy zarówno kultur 2D, jak i 3D, a także płytek do siewu bezpośredniego. Zobrazuj płytkę pod obiektywem 4x, aby uzyskać przegląd studni, oraz pod obiektywami 10x i 20x, aby udokumentować morfologię organoidów.Organizuj i przechowuj zdjęcia w folderach dedykowanych poszczególnym linię. Około 14 do 21 dni po izolacji oceń potencjał tworzenia organoidów, w tym ilość, rozmiar i fenotyp komórkowy. Zwróć uwagę na określone cechy, takie jak brak wakuoli, pęcherzenie błony, utrata przyczepności i zaokrąglanie komórek.Linie organoidowe zostały z powodzeniem wygenerowane z różnych typów histologicznych i stadiów raka jajnika, w tym pierwotnego raka surowiczego o wysokim stopniu złośliwości, operacji interwałowych po zastosowaniu neoadiuwantów i nawrotów choroby. Na początek weź organoidy raka jajnika hodowane na 24- lub 48-dołkowej płytce. Dodać lodowatą pożywkę do hodowli podstawowych i odpipetować lub zeskrobać spód płytki, aby rozbić każdą kroplę matrycy BME 2.Następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki i trzymaj ją na lodzie. Dodaj jeden mililitr lodowatej podstawowej pożywki hodowlanej. Po połączeniu dwóch lub trzech technicznych studzienek replikowanych w celu równomiernego rozprężania, należy odwirować probówkę przez pięć minut w temperaturze 300 g.Sprawdź zawieszenie pod światło, aby potwierdzić brak żelu BME 2. W celu kriokonserwacji organoidów przygotuj osad komórkowy, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze lodowatego podłoża do krioprezerwacji. Przenieś zawiesinę komórek do wstępnie oznakowanych 1,8-mililitrowych probówek kriogenicznych.Na początek weź hodowane organoidy raka jajnika i zbierz je. Dodaj trzy mililitry 4% paraformaldehydu z PBS do organoidów i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj organoidy dwa razy pięcioma mililitrami PBS.Wirować przez trzy minuty przy 300 g. Po usunięciu supernatantu dodać do osadu cztery mililitry świeżego PBS. Wymieszaj i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu osadzenia.Teraz podgrzej żel histologiczny w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby go upłynnić. Następnie zidentyfikuj utrwalone organoidy osadzone na dnie probówki i usuń supernatant. Zawiesić osad w 100 mikrolitrach ciepłego żelu przez pipetowanie.Przenieś kropelkę na kawałek folii uszczelniającej i pozwól jej zestalić się przez około 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś zestaloną kroplę żelu do kasety parafinowej tkankowej i postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami zatapiania tkanek. Za pomocą narzędzia tnącego do mikroprzekrojów pokrój osadzoną tkankę na odcinki o grubości od pięciu do 10 mikrometrów.Umieść te skrawki na szkiełkach histologicznych. Suszyć szkiełka przez godzinę w temperaturze 65 stopni Celsjusza, a następnie przechowywać je w suchym miejscu.

strategy-for-biobanking-ovarian-cancer-organoids-addressing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisujemy metodologie tworzenia heterotypowych trójwymiarowych modeli in vitro, składających się z fibroblastów jajnika oraz prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omówiono zastosowanie tych modeli do badania oddziaływań stroma-nabłonek, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) są potężnym narzędziem w translacyjnych badaniach nad rakiem, odzwierciedlając zarówno genetyczną i fenotypową heterogeniczność choroby, jak i odpowiedź na spersonalizowane terapie przeciwnowotworowe. W tym miejscu szczegółowo omówiono skonsolidowany protokół generowania PDO ludzkiego pierwotnego raka pęcherza moczowego w ramach przygotowań do oceny analiz fenotypowych i odpowiedzi na leki.

Hodowla organoidów raka pęcherza moczowego jako narzędzia medycyny precyzyjnej

Biobanki są kluczowymi zasobami dla badań biomedycznych, a Biobank dla Jednostki Medycyny Translacyjnej i Cyfrowej w Europejskim Instytucie Onkologii jest wzorem w tej dziedzinie. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis standardowych procedur operacyjnych biobanków w zakresie zarządzania różnymi rodzajami próbek biologicznych pobranych od ludzi.

Biobank medycyny translacyjnej: Standardowe procedury operacyjne dla optymalnego zarządzania próbkami

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) to trójwymiarowa (3D) hodowla, która może naśladować środowisko guza in vitro. W surowiczym raku jajnika o wysokim stopniu złośliwości PDO stanowią model do badania nowych biomarkerów i środków terapeutycznych.

Wytwarzanie i hodowla organoidów surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości pochodzących od pacjentów

Obecny protokół opisuje metody oceny białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentek. Obejmuje to kompleksowe metody galwanizacji i barwienia, a także szczegółowe, obiektywne procedury kwantyfikacji.

Wizualizacja białek naprawiających uszkodzenia DNA w organoidach raka jajnika pochodzących od pacjentki za pomocą testów immunofluorescencyjnych

Szczegółowy protokół jest tutaj podany do ustalania ludzkich organoidów piersi na podstawie resekcji guza piersi pochodzących od pacjenta lub normalnej tkanki piersi. Protokół zawiera kompleksowe instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli, zamrażania i rozmrażania organoidów piersi pochodzących od ludzkich pacjentów.

Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Przedstawiamy protokół, który może być wykorzystany do przeprowadzenia testów leków terapeutycznych z organoidami raka jajnika pochodzącymi od pacjentek.

Modele organoidowe pochodzące od pacjentek z rakiem jajnika do przedklinicznych testów leków

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Ten protokół opisuje metodę ułatwiającą pobieranie próbek z próbek po radykalnej prostatektomii. Celem jest zmapowanie, scharakteryzowanie i mikro-makro wypreparowanie próbek tkanek z próbek w oparciu o kryteria anatomopatologiczne przed przechowywaniem ich w biobanku.

Zwiększenie wiarygodności biobankowania guzów gruczołu krokowego dzięki ulepszonej technice pobierania próbek i charakterystyce histologicznej

Ten protokół opisuje tworzenie trójwymiarowych (3D) organoidów tkankowych z pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka powierzchniowego jajnika (hOSE). Protokół obejmuje izolację hOSE ze świeżo pobranych jajników, ekspansję komórkową hOSE, procedury krioprezerwacji-rozmrażania oraz wyprowadzanie organoidów. Uwzględniono immunofluorescencję, analizę ilościową i prezentację użyteczności jako platformy przesiewowej.

Organoidy nabłonka powierzchni jajników człowieka jako platforma do badania regeneracji tkanek

Protokół ten szczegółowo opisuje opracowanie wysokostopieńskich modeli mysich raka surowicy (HGSOC) in vitro oraz in vivo. Od wyprowadzenia myszych jajowodów, ich modyfikacji genetycznej w celu powtórzenia genetyki ludzkiego HGSOC, aż po ich wprowadzenie do kaletki jajnikowej myszy syngenetycznych w celu in vivo rozwoju guzów.

Rozwój linii organoidalnych pochodzących z myszy z komórek nabłonkowych jajowodów do modelowania wysokopoziomowego surowiczego raka jajnika

Poznaj protokół biobankowania organoidów raka jajnika, który rozwiązuje problem zmienności między pacjentami. Metoda obejmuje przetwarzanie tkanek, nasiewanie, dostosowanie mediów i barwienie immunofluorescencyjne.

Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby (Wideo) | JoVE Journal

Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby

Przeglądaj więcej filmów