Strategia biobankowania organoidów raka jajnika: rozwiązywanie problemów związanych z różnorodnością między pacjentami w podtypach histologicznych i stadiach choroby

Najlepsze postępowanie kliniczne w najnowocześniejszych badaniach translacyjnych dla pacjentek z zaawansowanym rakiem jajnika ma najwyższy priorytet w naszej placówce. Dzięki biobankowaniu organoidów pochodzących od pacjentów osiągnęliśmy znaczny postęp w kierunku indywidualnie dostosowanego leczenia. Dzięki temu możemy ocenić cechy charakterystyczne dla pacjenta i zidentyfikować biomarkery predykcyjne.

W ostatnich latach poczyniliśmy znaczne postępy w zakresie poprawy radykalnej chirurgii wielowitkowej, chemioterapii, terapii antyangiogennej, a także terapii inhibitorami PARP u pacjentek z zaawansowanym rakiem jajnika i nawet przy tym zwiększaniu przeżywalności. Kolejnym dużym krokiem byłoby lepsze przewidywanie, który pacjent odniesie korzyści z jakiego konkretnego leczenia. Obecnie decyzje dotyczące leczenia klinicznego podejmowane są na podstawie ogólnych cech histopatologicznych oraz informacji o niedoborze zaleceń homologicznych lub badanych w tkance nowotworowej zatopionej w parafinie.

Modele biologiczne, które oceniają specyficzne odpowiedzi na chemioterapię i leczenie celowane, nie zostały jeszcze wdrożone do praktyki klinicznej. Zidentyfikowaliśmy kluczowe cechy tkanki raka jajnika, w szczególności wymagania dotyczące hodowli niezbędne do utrzymania jej potencjału odnawialnego in vitro, i wykorzystujemy tę wiedzę do osiągnięcia solidnego, długoterminowego wzrostu linii organoidów i utworzenia biobanku z próbek na różnych etapach choroby. Nasze codzienne doświadczenia w zakresie biobankowania organoidów raka jajnika skutecznie pokazują niezwykłą heterogeniczność w biologii tego nowotworu, co może utorować drogę do nowej klasyfikacji lub stanowić podstawę dla nowych rozwiązań terapeutycznych ukierunkowanych na potencjał macierzysty

Na początek weź świeżo wyizolowaną tkankę raka jajnika. Umyj świeżo tkankę na szalce Petriego dokładnie, używając PBS bez wapnia i magnezu. Za pomocą jednorazowych skalpeli i nożyczek rozdrobnij tkankę na szalce Petriego na małe kawałki.

Zbierz tkankę w probówkach kriogenicznych. Następnie przenieś te rurki do pojemnika wypełnionego ciekłym azotem w celu szokowego zamrożenia. Następnie zbierz tkankę o wymiarach od dwóch do trzech milimetrów do pojemnika na próbkę histologiczną, a następnie utrwal tkankę w pojemniku na formalinę na 24 godziny.

Użyj skalpela do homogenizacji tkanki przed trawieniem enzymatycznym, aby zmaksymalizować dysocjację mechaniczną. Następnie inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Po inkubacji wprowadzić do probówki 15 mililitrów zimnej podstawowej pożywki hodowlanej.

Odwirować probówkę przez pięć minut przy sile 300 G, usunąć supernatant i dodać pięć mililitrów nowej podstawowej pożywki hodowlanej. Następnie odcedź zawiesinę komórkową za pomocą filtra 400 mikrometrów do świeżej 15-mililitrowej probówki. Aby wyeliminować erytrocyty, dodaj pięć mililitrów buforu lizującego czerwone krwinki do osadu komórkowego i inkubuj w łaźni wodnej przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji dodać pięć mililitrów podłoża podstawowego do inaktywacji lizy. Osadzać komórki przez wirowanie i dodawać trzy mililitry podstawowej pożywki hodowlanej do osadu komórkowego. Teraz przenieś wymaganą liczbę komórek zawieszonych w pożywce do hodowli bazylii do nowej probówki.

Odwirować komórki, a po odrzuceniu supernatantu dokładnie wymieszać osad komórek z zimną matrycą BME 2 na lodzie. Umieść komórki w kropelkach matrycy BME 2 na wstępnie podgrzanej, pustej 48-dołkowej płytce, pipetując pomiędzy nimi, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Następnie dodaj 250 mikrolitrów każdej pożywki z rakiem jajnika do odpowiednich studzienek.

Aby rozpocząć hodowlę 2D z pozostałych izolowanych komórek, należy odwirować komórki przez pięć minut w temperaturze 300 g i dodać osad komórkowy do pożywki 2D. Użyj mikroskopu z kontrastem fazowym, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy zarówno kultur 2D, jak i 3D, a także płytek do siewu bezpośredniego. Zobrazuj płytkę pod obiektywem 4x, aby uzyskać przegląd studni, oraz pod obiektywami 10x i 20x, aby udokumentować morfologię organoidów.

Organizuj i przechowuj zdjęcia w folderach dedykowanych poszczególnym linię. Około 14 do 21 dni po izolacji oceń potencjał tworzenia organoidów, w tym ilość, rozmiar i fenotyp komórkowy. Zwróć uwagę na określone cechy, takie jak brak wakuoli, pęcherzenie błony, utrata przyczepności i zaokrąglanie komórek.

Linie organoidowe zostały z powodzeniem wygenerowane z różnych typów histologicznych i stadiów raka jajnika, w tym pierwotnego raka surowiczego o wysokim stopniu złośliwości, operacji interwałowych po zastosowaniu neoadiuwantów i nawrotów choroby. Na początek weź organoidy raka jajnika hodowane na 24- lub 48-dołkowej płytce. Dodać lodowatą pożywkę do hodowli podstawowych i odpipetować lub zeskrobać spód płytki, aby rozbić każdą kroplę matrycy BME 2.

Następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki i trzymaj ją na lodzie. Dodaj jeden mililitr lodowatej podstawowej pożywki hodowlanej. Po połączeniu dwóch lub trzech technicznych studzienek replikowanych w celu równomiernego rozprężania, należy odwirować probówkę przez pięć minut w temperaturze 300 g.

Sprawdź zawieszenie pod światło, aby potwierdzić brak żelu BME 2. W celu kriokonserwacji organoidów przygotuj osad komórkowy, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze lodowatego podłoża do krioprezerwacji. Przenieś zawiesinę komórek do wstępnie oznakowanych 1,8-mililitrowych probówek kriogenicznych.

Na początek weź hodowane organoidy raka jajnika i zbierz je. Dodaj trzy mililitry 4% paraformaldehydu z PBS do organoidów i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj organoidy dwa razy pięcioma mililitrami PBS.

Wirować przez trzy minuty przy 300 g. Po usunięciu supernatantu dodać do osadu cztery mililitry świeżego PBS. Wymieszaj i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu osadzenia.

Teraz podgrzej żel histologiczny w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby go upłynnić. Następnie zidentyfikuj utrwalone organoidy osadzone na dnie probówki i usuń supernatant. Zawiesić osad w 100 mikrolitrach ciepłego żelu przez pipetowanie.

Przenieś kropelkę na kawałek folii uszczelniającej i pozwól jej zestalić się przez około 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś zestaloną kroplę żelu do kasety parafinowej tkankowej i postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami zatapiania tkanek. Za pomocą narzędzia tnącego do mikroprzekrojów pokrój osadzoną tkankę na odcinki o grubości od pięciu do 10 mikrometrów.

Umieść te skrawki na szkiełkach histologicznych. Suszyć szkiełka przez godzinę w temperaturze 65 stopni Celsjusza, a następnie przechowywać je w suchym miejscu.