Generowanie wycinków ludzkiej tkanki trzustki w celu badania fizjologii endokrynnej i zewnątrzwydzielniczej trzustki

Koncentrujemy się na badaniach nad cukrzycą typu 1, kładąc nacisk na terapie, które regulują układ odpornościowy i przywracają funkcje komórek beta alfa. Opracowaliśmy unikalną platformę badawczą, wykorzystującą żywe ludzkie wycinki trzustki pochodzące od dawców narządów, uzupełniając badania nad izolowanymi wyspami trzustkowymi. Takie podejście umożliwia szczegółową analizę interakcji i funkcji komórkowych o wartości.

Nasza współpraca z siecią dawców narządów trzustki zapewnia badaczom społecznym dostęp do rozmiarów tkanek trzustki. Jednak hodowla tych rozmiarów stanowi wyzwanie, ponieważ enzymy trawienne mogą degradować tkankę i zmniejszać żywotność. W związku z tym istnieje pilna potrzeba stworzenia warunków hodowli, które utrzymają zarówno żywotność, jak i środowisko fizjologiczne dla dokładnych badań funkcjonalnych.

Nasz protokół umożliwia gromadzenie danych funkcjonalnych na temat wszystkich komórek w trzustce, dzięki czemu badacze mogą go wykorzystać do różnych badań. Skupiamy się na modelowaniu cukrzycy typu 1 i ocenie mechanizmów działania leków. Kluczowym pytaniem dla mnie jest zajęcie się funkcją komórek alfa i ich rolą w cukrzycy typu 1.

Nasz protokół nie tylko przezwycięża efekt przetrwania związany z izolowanymi wyspami trzustkowymi, ale także w wyjątkowy sposób ułatwia badanie komórek odpornościowych, które mają kluczowe znaczenie w kontekście cukrzycy typu 1. Badając całą tkankę trzustki, możemy ocenić funkcję i reakcje, które lepiej odzwierciedlają środowisko in vivo. Zobowiązujemy się do dzielenia się z innymi postępami w zakresie platformy plastrów trzustki.

Poprzez Ampod naszym celem jest zachęcanie do współpracy, umożliwiając skuteczniejsze rozwiązywanie krytycznych pytań poprzez modelowanie mechanizmów choroby i testowanie potencjalnych leków terapeutycznych, zamierzamy znacząco przyczynić się do postępu w zakresie nowatorskich metod leczenia. Na początek umieść ludzką tkankę trzustki i bufor wyjściowy pod mikroskopem stereoskopowym, użyj kleszczy i nożyczek, aby delikatnie usunąć tkankę łączną, zwłóknieniową i tłuszczową. Nożyczkami pokrój tkankę na wiele kawałków o powierzchni około 0,5 centymetra sześciennego.

Następnie osusz kawałki na bibułce. Teraz przenieś cztery kawałki na 35-milimetrową szalkę Petriego. Napełnij naczynie 3,8% roztworem agarozy, aż wszystkie kawałki zostaną całkowicie zanurzone.

Gdy roztwór agarozy zastygnie, wytnij kawałki tkanki. Przesuń skalpel wzdłuż krawędzi naczynia, aby usunąć agarozę i ostrożnie oddziel bloki tkanki. Aby pokroić kawałki tkanki, przyklej bloki tkanki do metalowej płytki wibratomu.

Zamontuj płytkę na tacy urządzenia, a następnie napełnij tacę buforem linii bazowej. Ustaw wibratomat na automatyczne krojenie na 120 mikrometrów i dostosuj pozycję początkową i końcową. Teraz przesuń ostrze krótko nad tkankę.

Rozpocznij krojenie z małą prędkością o amplitudzie 0,8 milimetra. Użyj małego pędzla, aby zebrać plasterki w buforze bazowym zawierającym aprotyninę przez jedną godzinę. Umieść plastry na wytrząsarce orbitalnej z małą prędkością, aby wypłukać enzymy uwalniane podczas krojenia.

Aby przetestować żywotność tkanki, przenieś pojedynczy wycinek tkanki do dołka z 12-dołkową płytką wypełnioną 990 mikrolitrami buforu podstawowego. Następnie pipetę odpipetować dioctan fluoresceiny do studzienki. Dodaj 10 mikrolitrów jodku propydyny rozcieńczonego w 990 mikrolitrach PBS do wycinków tkanki.

Następnie zanurz plastry w PBS w innym dołku na jedną minutę. Na koniec zamontuj plastry na szkiełku podstawowym z szkiełkiem nakrywkowym do obrazowania. W świeżo pokrojonej tkance trzustki zaobserwowano żywotność od 80 do 90%.

Obniżoną żywotność zaobserwowano na powierzchni cięcia z powodu uszkodzenia komórek. Opóźnione cięcie skutkowało zmniejszoną żywotnością. Aby rozpocząć włączanie urządzenia do perfuzji, uruchom oprogramowanie do perfuzji, wprowadź liczbę komór, a następnie oznacz roztwory wejściowe.

Teraz podłącz rurkę doprowadzającą i odpływową ekspresu do perfuzji. Następnie umieść trzy plastry ludzkiej tkanki trzustki zanurzone w agarozie pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj pędzla i skalpela, aby przyciąć agarozę tkanek do minimum.

Dodaj kroplę buforu linii bazowej na siatkę komory na plastry. Delikatnie przenieś każdy plasterek na każdą siatkę. Zmontuj poszczególne części komory plastrów od góry do dołu.

Aby zbadać izolowane wyspy, użyj co najmniej 30 wysepek na kolumnę do wydzielania insuliny lub 100 wysepek do wykrywania glukagonu i dodaj wyspy trzustkowe do komory wypełnionej buforem podstawowym. Przykręć pokrywę od góry, aby zamknąć komorę wysepki. Następnie kliknij kartę Kroki, wprowadź liczbę wierszy, ustaw czas kroku na 90 minut i kliknij Zastosuj.

Po dodaniu kroków dla wszystkich rozwiązań naciśnij kartę Przegląd, aby wyświetlić przegląd protokołu. Naciśnij kartę Mapa płyt, aby wyświetlić wizualną reprezentację blachy. Rozpocznij zalewanie komórek roztworami ładującymi.

Podczas perfuzji należy używać pompy grzewczej i chłodzącej tacę. Monitoruj komory pod kątem dokładnego przepływu i pęcherzyków. Zmień tabliczki zbiorcze podczas protokołu.

Przechowuj tacki w temperaturze 4 stopni Celsjusza do kwantyfikacji tego samego dnia. Po zakończeniu perfuzji zdemontuj komory i delikatnie odwróć każdą część do naczynia zawierającego bufor linii podstawowej, aby zebrać plastry. Przenieś plastry do probówki w celu lizy lub utrwalenia.

Przepłucz maszynę wodą, 10% wybielaczem i kombinacją wody i powietrza, aby ją wyczyścić. Rozcieńczyć przygotowany barwnik wapniowy w 3 mililitrach podstawowego roztworu buforowego HEPES na szalce Petriego o szerokości 3 centymetrów, dodać aprotyninę do rozcieńczonego roztworu barwnika. Następnie przenieś pojedynczą plasterkę do roztworu.

Inkubuj plasterek w ciemności przez 30 minut do 1 godziny na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej. W międzyczasie podłączyć napełnione strzykawki perfuzyjne i rurkę. Włączyć grzałkę przyrządów i wyregulować przepływ pompy na poziomie 0,5 mililitra na minutę.

Teraz delikatnie umieść pojedynczą plasterkę w komorze obrazowania mikroskopu konfokalnego. Zabezpiecz plasterek harfą. Podłącz rurkę wlotową i odpływową do komory, a następnie uruchom pompę.

Zidentyfikuj obszar obrazowania przy małym powiększeniu za pomocą odbicia, a następnie przełącz się na obiektyw o większym powiększeniu i odpowiednio dostosuj pozycję. Ustaw rozdzielczość na minimum 256 na 256, interwał obrazowania między 5-10 sekundami, a zakres Z-Stack na 30-60 mikrometrów z odstępem 10 mikrometrów między płaszczyznami. Rozpocznij obrazowanie od przełącznika roztworu zgodnie z eksperymentem.

W żywotnym wycinku zaobserwowano dynamiczne wydzielanie hormonów, co skutkowało silnym wydzielaniem insuliny. Opóźnione cięcie tkanki o złej jakości skutkowało zmniejszoną lub żadną odpowiedzią na wysoki poziom glukozy i depolaryzację błony. Mapa cieplna wygenerowana przez zmiany intensywności podczas obrazowania wapnia wykazała, że komórki reagują po przełączeniu na zwiększone stężenie glukozy.