Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego

W naszym laboratorium opracowujemy nowe technologie pomiarowe dla biologii w nanoskali. W szczególności koncentrujemy się na rozwoju szybkiej mikroskopii sił atomowych do badania dynamicznych procesów biologicznych w skali nanometrowej. W tym celu opracowaliśmy niedawno nowy tryb obrazowania, który nazywamy Photothermal Off Resonance Tapping (PORT).

W tym trybie używamy dedykowanego lasera napędowego do uruchamiania wsporników bardzo kontrolowanych z dużą prędkością, co pozwala nam uzyskać dane i do dwóch rzędów wielkości szybciej niż w przypadku konwencjonalnego odczepiania poza rezonansem. Złotym standardem w szybkim AFM jest obrazowanie rezonansowe. W tym trybie wspornik jest uruchamiany z tą częstotliwością rezonansową, co oznacza, że nie można kontrolować położenia wspornika, a jedynie jego amplitudę oscylacji.

W przypadku AFM o normalnej prędkości coraz częściej stosuje się tryby off-resonance. Jednak częstotliwość aktywacji jest tutaj ograniczona, co sprawia, że ten tryb obrazowania jest dość wolny. Używając lasera wtórnego do uruchamiania wspornika, możemy osiągnąć wyższe częstotliwości aktywacji, co oznacza wyższe prędkości obrazowania.

Takie podejście pozwala nam zachować zalety związane z innymi trybami obsady poza rezonansem, co oznacza, że możemy zoptymalizować równowagę między czułością a szybkością obrazowania. Szybkość obrazowania jest nam ograniczona przez najwyższy portret. Jeśli chcemy zwiększyć portret, musimy zwiększyć moc lasera, aby utrzymać tę samą amplitudę aktywacji.

Może to prowadzić do słabej kontroli siły i uszkodzenia próbki. Zwiększenie szerokości pasma wsporników poprzez zmniejszenie ich rozmiaru i poprawę wydajności absorpcji lasera umożliwi nam osiągnięcie wyższych szybkości portów przy jednoczesnym zapewnieniu odpowiedniego odstępu próbki. Postęp ten ułatwi szybsze obrazowanie, co ma kluczowe znaczenie dla badania zawiłości dynamiki montażu.

Aby rozpocząć, wyczyść i przygotuj wsporniki. Zamontuj wsporniki na uchwycie kompatybilnym ze skaningową mikroskopią elektronową lub systemem SEM. Następnie podgrzej gaz prekursorowy, który ma być używany w systemie wtrysku gazu, aby wyhodować nową końcówkę.

Gdy podciśnienie osiągnie poniżej 10 do potęgi minus pięć milibarów, należy przepłukać przewód wtrysku gazu 10 razy przez dwie sekundy każdy, aby usunąć resztki powietrza z przewodu dyszy. Użyj SEM, aby zlokalizować koniec wspornika. Przechyl uchwyt pod kątem, aby prawidłowo ustawić wspornik do obrazowania mikroskopią sił atomowych.

Dostosuj położenie i ostrość SEM, aby uzyskać wyraźny widok końcówki wspornika, w miejscu, w którym będzie rosła końcówka nano węglowa. Następnie ustaw parametry osadzania w oprogramowaniu, aby wyhodować nową końcówkę. Zainicjuj proces osadzania, aby wyhodować końcówkę za pomocą promieniowania wiązki elektronów na końcówce wspornika podczas wstrzykiwania gazu prekursorowego i zatrzymaj wstrzykiwanie gazu po zakończeniu osadzania.

Wykonaj obrazowanie SEM po wzroście, aby ocenić jakość i cechy nowo wyrosłej końcówki, w tym jej promień i długość. Wyjmij uchwyt z komory SEM. Na początek przygotuj szybki mikroskop sił atomowych.

Użyj pęsety, aby umieścić ultra krótki wspornik pod zaciskiem sprężynowym na uchwycie wspornika. Za pomocą strzykawki dodaj 50 mikrolitrów płynu przez lewy port dostępu do płynu. Następnie użyj trzech pokręteł na głowicy AFM, aby ustawić laser odczytu na wsporniku.

Obserwuj cień wspornika na białym papierze, maksymalizując sumę. Następnie wyśrodkuj plamkę lasera na fotodiodzie za pomocą dwóch dedykowanych pokręteł. Następnie zaznacz pole włączone wzbudzenie w wzbudzeniu VI, aby włączyć i wyrównać laser napędowy, uruchamiając i oscylując wspornik.

Wyświetlanie sygnałów wzbudzenia i odchylenia wspornika na oscyloskopie. Użyj metody cienia i zmaksymalizuj amplitudę oscylacji za pomocą pokręteł regulacji lasera napędowego. Aby wyregulować amplitudę oscylacji wspornika w porcie, dodaj napięcie stałe do obwodu sterującego diody laserowej w polu konfiguracyjnym w wzbudzeniu VI i wprowadź wejście AC między szczytami dla obwodu sterującego diody laserowej.

Aby uzyskać krzywe interakcji, ustaw sterownik Z VI w trybie kontaktowym i kliknij przycisk Start, aby zbliżyć się do powierzchni próbki. Po osiągnięciu powierzchni wykonaj krzywą siły w funkcji odległości w rampie VI w celu kalibracji czułości ugięcia wspornika. Kliknij wycofaj, aby cofnąć piezoelektryczny Z z z powierzchni, do której końcówka nie może dotrzeć.

Po całkowitym wycofaniu przełącz się w tryb portu w sterowniku Z VI i włącz laser wzbudzenia w wzbudzeniu VI.Ustaw tryb portu na żądaną częstotliwość. Wyraźne krzywe oddziaływania uzyskano poprzez odjęcie drgań swobodnych od oscylacji kontaktowych, które mają kluczowe znaczenie dla nieniszczącego obrazowania próbek biologicznych. Przy szybkości portu 100 kiloherców osiągnięto dobrą jakość obrazowania.

Jednak gdy częstotliwość wzbudzenia zbliżała się do rezonansu wspornikowego, kontrola sprzężenia zwrotnego uległa pogorszeniu, co prowadziło do zaciemnienia krzywych interakcji i pogorszenia jakości obrazu. Na początek przygotuj 10-milimolowy roztwór octanu magnezu. Za pomocą strzykawki Hamiltona wstrzyknąć 50 mikrolitrów roztworu do kanału płynnego uchwytu wspornika, tworząc kroplę płynu, która otacza wspornik

Ustaw rozmiar skanowania w skanowaniu VI na 800 na 800 nanometrów, a częstotliwość linii na 100 herców. Aby zeskanować powierzchnię, kliknij strzałkę ramki, aby sprawdzić jakość. Po zeskanowaniu kliknij przycisk wycofaj w sterowniku Z VI, aby schować wspornik z powierzchni.

Za pomocą strzykawki Hamiltona usunąć roztwór buforowy z uchwytu wspornikowego. Następnie przygotuj rozcieńczony trzypunktowy roztwór gwiazdowy DNA i wstrzyknij 50 mikrolitrów tego roztworu do uchwytu wspornikowego. Wykonuj obrazowanie w obszarze o wymiarach 800 na 800 nanometrów z domyślną częstotliwością linii 100 Hz.

Po wstępnym skanowaniu dostosuj rozmiar i szybkość obrazowania i zeskanuj VI do określonych wartości w celu dalszego gromadzenia danych Utrzymuj wejście wartości zadanej w polu wartości zadanej kontrolera Z VI na najniższym poziomie niezbędnym do dokładnego śledzenia przez cały proces obrazowania. Powtórz tę czynność dla wszystkich wymaganych obszarów próbki. Korzystając z tego protokołu, szybki port AFM obserwował w czasie rzeczywistym składanie się motywów gwiazd trójpunktowych DNA w stabilne wyspy.

Wyraźne obrazy uzyskano przy szybkościach linii 100 i 200 Hz dla szybkości portu 100 kiloherców. Jednak wyższe prędkości obrazowania bez zwiększania liczby portów obniżyły jakość obrazu ze względu na szybkie zmiany topografii. Wyniki obrazowania trzypunktowej gwiazdy DNA dla najniższego sygnału wejściowego AC między szczytami wykazały nienaruszone struktury, podczas gdy najwyższy sygnał wejściowy AC między szczytami spowodował obserwowalne uszkodzenie próbki z powodu większych sił.

Podobnie, najniższe wejście z przesunięciem DC ujawniło nienaruszone struktury, podczas gdy najwyższe wejście z przesunięciem DC spowodowało uszkodzenie konstrukcji.