Name: Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę PORT do obrazowania samoorganizacji motywów DNA typu trzypunktowej gwiazdy przy użyciu szybkiej mikroskopii sił atomowych. Technika ta umożliwia kontrolowane pobudzanie dźwigników z prędkością wyższą o dwa rzędy wielkości niż konwencjonalne metody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Raphaelowi Zinggowi za pomoc w programowaniu skryptu Pythona do przetwarzania serii obrazów. GEF potwierdza finansowanie z programu ramowego UE w zakresie badań naukowych i innowacji H2020 (2014-2020); ERC-2017-CoG; InCell; Numer projektu 773091. VC przyjmuje do wiadomości, że projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy grantowej nr 754354 działania "Maria Skłodowska-Curie". Badania te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki w ramach grantu 200021_182562.

1. Próbka i
UWAGA: Płytka DNA użyta w tym badaniu to motyw 3-ramiennej gwiazdy opracowany w laboratorium Mao na Uniwersytecie Purdue19,25. Wszystkie oligonukleotydy użyte w tym badaniu zostały zakupione od Integrated DNA Technologies, Inc. Zbierz niezbędne materiały i odczynniki.
<ol>
	<li>Wymieszaj jednoniciowe DNA (ssDNA) w stosunku molowym 1:3:3 (S1 0,6 μM, 1,8 μM dla S2 i 1,8 μM dla S3) w buforze do wyżarzania (5 mM TRIS, 1 mM EDTA i 10 mM MgAc2). Końcowe stężenie motywu DNA musi wynosić 0,6 μM (49 ng/μl przy masie cząsteczkowej 3PS wynoszącej 82020,3 g/mol).</li>
	<li>Umieścić roztwór DNA w żaroodpornym pojemniku i podgrzać go do temperatury 80 °C. Powoli schładzać roztwór DNA z temperatury 80 °C do 20 °C przez okres 4 godzin. Ten proces wyżarzania pomaga oligonukleotydom ssDNA w tworzeniu pożądanego dwuniciowego motywu DNA.</li>
	<li>W celu oczyszczenia załaduj wyżarzony roztwór DNA na 3% żel agarozowy, aby usunąć nadmiar ssDNA i wszelkie niepożądane produkty uboczne. Uruchom 3% żel pod napięciem 60 V przez ok. 2,5 godziny w buforze roboczym zawierającym 0,5x Tris-Borate-EDTA (TBE) i 10 mM Mg(CH3COO)2.</li>
	<li>Zidentyfikuj i zlokalizuj opaskę na żelu, która zawiera motyw DNA. Upewnij się, że pasmo zostało przeniesione do określonej pozycji na podstawie jego rozmiaru.</li>
	<li>Ostrożnie wyciąć pasmo zawierające motyw DNA z żelu. Ekstrahować motyw DNA z wyciętego fragmentu żelu, umieszczając go w kolumnie wirowej do ekstrakcji żelu i odwirowując w temperaturze 3 000 x g i 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp bufor w wyekstrahowanym motywie DNA buforem do wyżarzania za pomocą koncentratora odśrodkowego. Odwirować przy 3000 x g w temperaturze pokojowej (lub niższej) do momentu, gdy stężony roztwór będzie mniejszy niż 100 μl. Następnie dodaj 300 μl buforu do wyżarzania i powtórz ten krok dwukrotnie, aby upewnić się, że bufor został wymieniony.</li>
	<li>Rozcieńczyć motyw DNA do 6 nM do celów obrazowania. Użyj spektrofotometru lub innych odpowiednich metod, aby dokładnie określić i dostosować stężenie. Motyw DNA jest teraz gotowy do obrazowania. 
	UWAGA: Wszystkie w protokole mają pH 8,0. Informacje o sekwencji dla trzech odpowiednich pasm są następujące: 
	S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT 
	AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC 
	S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA 
	CGGTAACG 
	S3: CGTTACCGTGTGGGGGGCATGCATAGT</li>
</ol>
2. Wzrost końcówki wspornika
<ol>
	<li>Montaż wspornika na uchwycie wspornikowym SEM: Upewnij się, że wsporniki są czyste i wolne od wszelkich zanieczyszczeń. Zamontuj wsporniki na odpowiednim uchwycie kompatybilnym z systemem SEM. Niestandardowy projekt uchwytu wspornikowego może zostać udostępniony na żądanie.</li>
	<li>Wtrysk gazu: Podgrzej gaz prekursorowy (np. prekursor fenantrenu C14H10 do końcówek z węgla amorficznego), który ma być użyty w układzie wtrysku gazu w celu wyhodowania nowej końcówki. Gdy tylko podciśnienie spadnie poniżej 10-5 mbar, przepłucz przewód wtrysku gazu 10 razy przez 2 sekundy, aby upewnić się, że w przewodzie dyszy nie ma niepożądanych resztek powietrza (należy to zrobić przy zamkniętym zaworze do komory pistoletu).</li>
	<li>Regulacja położenia końcówki: Użyj skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), aby zlokalizować koniec wspornika. Przechylić uchwyt wspornika pod kątem (np. 11° w tym przypadku) odpowiadającym kątowi, jaki wykaźnik przedstawi po umieszczeniu na uchwycie wspornika AFM w stosunku do powierzchni, tak aby wyrosła końcówka była prostopadła do powierzchni podczas obrazowania. Dostosuj położenie i ostrość SEM, aby uzyskać wyraźny widok na końcówkę wspornika, gdzie będzie rosła ostra nanokońcówka z włókna węglowego.</li>
	<li>Zogniskowane osadzanie indukowane wiązką elektronów (FEBID):
	<ol>
		<li>Ustaw parametry osadzania w wybranym oprogramowaniu (w tym przypadku SmartFIB), takie jak prąd wiązki (I) i napięcie przyspieszenia (V), odległość robocza (WD), powiększenie, naświetlony kształt, dawka/czas osadzania i czas przebywania. Następujące parametry wykorzystano do wyhodowania amorficznych końcówek węglowych, które wykazują dobre właściwości mechaniczne do obrazowania AFM, prowadząc do długości około 130 nm i promieni w zakresie 2-4 nm: 
		Wybierz punktowy/kropkę jako kształt naświetlony 
		WD = 5 mm 
		I = 78 pA, a V = 5 kV 
		Czas przebywania = 1 μs 
		Dawka = 0,05 nC, a czas osadzania = 0,64 s 
		Powiększenie = 20000x</li>
		<li>Rozpocznij proces osadzania w celu wyhodowania końcówki, napromieniowując wiązkę elektronów w miejscu na końcówkę wspornika, jednocześnie wstrzykując gaz prekursorowy, zamykając gaz po zakończeniu osadzania. W takim przypadku oprogramowanie SmartFIB robi to automatycznie po skonfigurowaniu wspomnianej receptury</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza po wzroście: Wykonaj obrazowanie SEM po wzroście, aby zbadać nowo wyrosłą końcówkę i upewnić się, że jest ona jakościowa i charakterystyczna (promień i długość końcówki). Odczekaj 1-2 minuty po wzroście końcówki, aby upewnić się, że cały gaz prekursorowy został wypompowany, aby uniknąć ponownego osadzania się podczas obrazowania SEM. Wyjąć uchwyt próbki z komory SEM.</li>
	<li>Recykling wsporników: W przypadku, gdy system SEM ma również zainstalowaną kombinowaną skupioną wiązkę jonów (FIB), usuń uszkodzoną lub brudną, wcześniej wyhodowaną końcówkę, frezując ją za pomocą systemu FIB przy użyciu niskich prądów FIB (np. 1 pA, aby uniknąć uszkodzenia wspornika). Usuń końcówkę przez frezowanie w kształcie przekroju, od końca końcówki do podstawy, aby uniknąć zapadania się końcówki. Pozwoli to na odhodowanie nowego.</li>
</ol>
3. Sprzęt HS-AFM
<ol>
	<li>Konfiguracja obrazowania składa się z niestandardowego głowicy PORT5, 26 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), szybkiego skanera26 z płytą z próbkami z miką na górze, kompatybilnego kontrolera27, wzmacniacza wysokiego napięcia o dużej przepustowości wymaganej do szybkiego obrazowania, bazy AFM i komputera PC z wymaganym oprogramowaniem do sterowania wyżej wymienionym sprzętem27. 
	UWAGA: W tym przypadku są to komponenty typu open source, dla których plany można uzyskać w Laboratorium Bio- i Nano- Instrumentacji pod adresem EPFL27, 28. Możliwe jest również wzięcie udziału w warsztatach na temat budowy głowicy i kontrolera PORT29, a także pobranie i korzystanie z oprogramowania opartego na LabView.</li>
	<li>Ostrożnie umieść ultrakrótki wspornik (np. AC10DS lub odpowiednik) pod zaciskiem sprężynowym na uchwycie wspornika za pomocą pęsety. Upewnij się, że wiór wspornikowy jest stały i stabilny.</li>
	<li>Dodać 50 μl płynu za pomocą strzykawki przez lewy port dostępu do płynu, jak pokazano na Rysunek 1B. Gdy laser wzbudzający jest nadal wyłączony, ustaw laser odczytu na wsporniku za pomocą trzech dedykowanych pokręteł na głowicy AFM pokazanych na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A. Zrób to, obserwując cień wspornika na białym papierze, maksymalizując sumę (metoda cienia). Następnie wyśrodkuj plamkę lasera na fotodiodzie za pomocą dwóch dedykowanych pokręteł.</li>
	<li>Włącz i wyrównaj laser napędowy, zaznaczając pole Włącz wzbudzenie w wzbudzeniu VI, aby uruchamiał i oscylował wspornik. Pokaż sygnał wzbudzenia wspornika i sygnał ugięcia wspornika na podłączonym oscyloskopie. Jeśli oscylacja ugięcia jest zbyt niska (lub nie występuje), może to oznaczać, że laser napędowy jest bardzo daleko od wspornika. W takim przypadku użyj metody cienia i wyłącz laser odchylający, aby ułatwić wyrównanie. Zmaksymalizuj amplitudę oscylacji za pomocą pokręteł regulacji lasera napędowego pokazanych na <silna klasa="xfig">Rysunek 1A.</li>
	<li>Aby wyregulować amplitudę oscylacji wspornika w PORT, wprowadź do odpowiedniego sterowania oprogramowania napięcie międzyszczytowe wysyłane do obwodu sterującego diody laserowej (od teraz wejście AC między szczytami) w wzbudzeniu VI. Aby utrzymać diodę laserową w reżimie przewodzenia, a tym samym laserowania, dodaj napięcie stałe do obwodu sterującego diody laserowej (od teraz wejście offsetu DC), co również odbywa się z pudełka konfiguracyjnego w wzbudzeniu VI. Oba będą miały również wpływ na moc lasera, którą można zmierzyć za pomocą miernika mocy lasera i służy do dostrajania amplitudy oscylacji wspornika.</li>
	<li>Określ maksymalną częstotliwość wzbudzenia fototermicznego, którą można przyłożyć do wspornika, która musi być poniżej częstotliwości rezonansowej wspornika. Określ częstotliwość rezonansową za pomocą strojenia termicznego lub przemiatania częstotliwości. Wsporniki użyte w tym badaniu (AC10DS), których częstotliwość rezonansowa w cieczach wynosi około 400 kHz (1 MHz w powietrzu)30, mają quasistatyczny obszar zgięcia poniżej 300 kHz5. W związku z tym należy stosować częstotliwości PORT poniżej tej granicy (około 100-200 kHz).</li>
	<li>Dostosuj parametry obrazowania i ustawienia szybkości PORT i szybkości skanowania do wymaganych wartości odpowiednio w Excitation i Scan Vis (parametry użyte w tym artykule są podane w opisach na rysunku). Po skonfigurowaniu ustawień i parametrów obrazowania wykonaj wymagane eksperymenty obrazowania, aby obserwować i śledzić interakcje molekularne. 
	UWAGA: Ponieważ wsporniki AC10DS nie są już sprzedawane, może być konieczne użycie alternatywy, takiej jak Fastscan D lub BioLever31, dopóki nie będzie dostępny ich odpowiednik.</li>
</ol>
4. Uzyskiwanie prawidłowych krzywych interakcji
<ol>
	<li>Początkowo zbliż się do powierzchni próbki w trybie kontaktowym, klikając Start na kontrolerze Z VI ustawionym na Tryb kontaktowy.
	<ol>
		<li>W tym trybie końcówka AFM wchodzi w bezpośredni kontakt z próbką. Po osiągnięciu powierzchni wykonaj krzywą siły w funkcji odległości w Rampie VI, aby uzyskać kalibrację czułości ugięcia wspornika.</li>
		<li>Należy również oszacować stałą sprężystości wspornika, albo na podstawie specyfikacji dostawcy wspornika (mniej dokładnie), uzyskanej za pomocą interferometru, albo za pomocą kalibracji opartej na dostrojeniu termicznym po kalibracji czułości ugięcia. Precyzyjna kalibracja wspornika jest niezbędna do dokładnej kontroli siły końcówka-próbka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po całkowitym schowaniu Z-piezo z powierzchni, do której końcówka nie może dosięgnąć powierzchni, klikając Up w kontrolerze Z VI, przełącz się w tryb PORT w sterowniku Z VI i włącz laser wzbudzenia w polu wyboru Wzbudzenie VI. Aby rozpocząć, ustaw tryb PORT tak, aby działał z żądaną częstotliwością w wzbudzeniu VI, która w tym eksperymentalnym przypadku wynosi 100 kHz, za pomocą wspornika AC10DS.</li>
	<li>Nagraj drgania bez wspornika blisko, ale nie dotykając powierzchni. Następnie włącz sprzężenie zwrotne w kontrolerze Z w kontakcie z powierzchnią, aby nagrywać, i kliknij Popraw, aby uzyskać oscylację wspornika, gdy wspornik styka się z powierzchnią, w obu nanometrach. Odejmij krzywą drgań swobodnych od krzywej kontaktu przerywanego, aby uzyskać rzeczywistą krzywą oddziaływania, przekształcając je na pN przy użyciu stałej sprężystości wspornikowej (w tym przypadku 0,1 N/m).</li>
</ol>
5. Obrazowanie HS-AFM
<ol>
	<li>Przygotować roztwór Mg(CH3COO)2 o stężeniu 10 mM. Za pomocą strzykawki Hamiltona wstrzyknąć 50 μl przygotowanego roztworu 10 mM Mg(CH3COO)2 do kanału płynnego uchwytu wspornika, tworząc kroplę płynu, która otacza wspornik</li>.
	<li>Stopniowo zbliżaj wspornik do powierzchni, klikając Start na sterowniku Z VI. Po wykryciu powierzchni włącz sprzężenie zwrotne i znajdź szczyt krzywej interakcji w krzywych siły ORT VI. Znajdź najniższą nastawę siły, która umożliwia prawidłowe śledzenie (poniżej 300 pN, aby uniknąć uszkodzenia delikatnych próbek biologicznych).</li>
	<li>Ustaw rozmiar skanowania w skanerze Scan VI na 800 nm na 800 nm, a częstotliwość linii na 100 Hz. Zeskanuj powierzchnię, klikając strzałkę Ramka (w dół) w Skanowaniu VI, aby sprawdzić jakość powierzchni. Jeśli zostaną wykryte jakiekolwiek zanieczyszczenia, rozwiąż problem, czyszcząc powierzchnię, wspornik i/lub uchwyt wspornikowy przed kontynuowaniem.</li>
	<li>Po zeskanowaniu wycofaj wspornik z powierzchni, klikając przycisk Wycofaj w sterowniku Z VI. Usuń roztwór buforowy z otworu w uchwycie wspornika za pomocą strzykawki Hamiltona, aby zapobiec problemom z martwą objętością.</li>
	<li>Przygotuj rozcieńczony roztwór DNA 3PS z części 1 protokołu. Wstrzyknąć 50 μl rozcieńczonego roztworu DNA 3PS do dedykowanego kanału uchwytu wspornikowego.</li>
	<li>Rozpocznij proces obrazowania, powtarzając kroki 5.2-5.3, skanując obszar o wymiarach 800 nm na 800 nm z domyślną częstotliwością linii 100 Hz (256 linii × 256 pikseli). Po wstępnym skanowaniu dostosuj rozmiar i szybkość obrazowania w programie Scan VI do określonych wartości w celu dalszego pozyskiwania danych.</li>
	<li>Utrzymuj nastawę siły wejściowej interakcji końcówka-próbka w polu nastawy Z Controller VI na najniższym poziomie wymaganym do prawidłowego śledzenia (poniżej 300 pN) przez cały proces obrazowania, aby zminimalizować uszkodzenie/zakłócenie próbki, chyba że określono inaczej. Powtórz ten proces dla wszystkich wymaganych obszarów próbki.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Skonfiguruj środowisko do uruchamiania dostosowanego kodu przetwarzania wsadowego Pygwy (Python for Gwyddion), upewniając się, że Python i wszystkie niezbędne biblioteki. Więcej informacji można znaleźć na stronie Gwyddion32 są poprawnie zainstalowane w systemie. Dzięki temu kod działa płynnie i ma dostęp do wymaganych funkcjonalności.</li>
	<li>Otwórz niestandardowy kod przetwarzania wsadowego Pygwy (dostarczony na żądanie). Zapewni to dostęp do narzędzi i funkcjonalności potrzebnych do przetwarzania i analizy obrazu.</li>
	<li>Rozpocznij przetwarzanie obrazu, wykonując korekcję poziomej linii mediany na obrazach. Ten krok ma na celu usunięcie wszelkich nieprawidłowości lub artefaktów obecnych w liniach skanowania, zapewniając, że kolejne kroki przetwarzania są oparte na dokładnych danych. Po usunięciu tła płaszczyzny zastosuj korekcję linii. Użyj usuwania blizn, aby jeszcze bardziej uwydatnić obrazy, eliminując wszelkie niechciane ślady lub niedoskonałości spowodowane czynnikami zewnętrznymi. Ten krok poprawia ogólny wygląd wizualny obrazów.</li>
	<li>Zwiększ widoczność i kontrast obrazów, dostosowując kolorową mapę wysokości. Dzięki temu interesujące nas cechy są wyraźnie wizualizowane i wyróżniają się na obrazach.</li>
	<li>Wybierz przetworzone obrazy, które mają zostać połączone w wideo. Określ żądaną liczbę klatek na sekundę dla wideo. W takim przypadku ustaw go na 7 klatek na sekundę (fps).</li>
	<li>Oblicz czas trwania każdej klatki. Użyj Fiji (ImageJ), aby połączyć przetworzone obrazy w wideo. Upewnij się, że liczba klatek na sekundę i czas trwania klatek są prawidłowo ustawione.</li>
</ol>

Improved Imaging of DNA Star Motifs by PORT High-Speed Atomic Force Microscopy

<ol><li>Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy+and+its+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy and its future prospects.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).</li>
<li>Uchihashi, T., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high-speed+atomic+force+microscopy+to+real-time+visualization+of+dynamic+biomolecular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta.+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Applications of high-speed atomic force microscopy to real-time visualization of dynamic biomolecular processes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 229-240 (2018).</li>
<li>Eghiaian, F., Rico, F., Colom, A., Casuso, I., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy%3A+Imaging+and+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy: Imaging and force spectroscopy.</a> FEBS Letters. 588 (19), 3631-3638 (2014).</li>
<li>Umeda, K., McArthur, S. J., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+resolution+in+high-speed+atomic+force+microscopy+for+studying+biological+macromolecules+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal resolution in high-speed atomic force microscopy for studying biological macromolecules in action.</a> Microscopy. 72 (2), 151-161 (2023).</li>
<li>Nievergelt, A. P., Banterle, N., Andany, S. H., Gönczy, P., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+photothermal+off-resonance+atomic+force+microscopy+reveals+assembly+routes+of+centriolar+scaffold+protein+SAS-6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">High-speed photothermal off-resonance atomic force microscopy reveals assembly routes of centriolar scaffold protein SAS-6.</a> Nature Nanotechnology. 13 (8), 696-701 (2018).</li>
<li>Heath, G. R., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+height+spectroscopy+reveals+%C2%B5s-dynamics+of+unlabeled+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules.</a> Nature Communications. 9, 4983(2018).</li>
<li>Ando, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndo%2C+T+%22High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+in+Biology%22">High-Speed Atomic Force Microscopy in Biology</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2022).</li>
<li>Fukuda, S., Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+high-speed+atomic+force+microscopy+for+imaging+of+biomolecular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes.</a> Review of Scientific Instruments. 92 (3), 033705(2021).</li>
<li>Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hierarchical+assembly+of+septins+revealed+by+high-speed+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM.</a> Nature Communications. 11 (1), 5062(2020).</li>
<li>PeakForce Tapping. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html">https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html</a> (2023).</li>
<li>Wang, S., Hao, C. Principle and application of peak force tapping mode atomic force microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+S+%22International+Conference+on+Cognitive-based+Information+Processing+and+Applications+%28CIPA+2021%29%22">International Conference on Cognitive-based Information Processing and Applications (CIPA 2021)</a>. , Springer. Singapore. 671-679 (2022).</li>
<li>Krotil, H. -U., Stifter, T., Waschipky, H., Weishaupt, K., Hild, S., Marti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+force+mode%3A+a+new+method+for+the+investigation+of+surface+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+and+Interface+Analysis%22%5BJournal%5D)">Pulsed force mode: a new method for the investigation of surface properties.</a> Surface and Interface Analysis. 27 (5-6), 336-340 (1999).</li>
<li>Rosa-Zeiser, A., Weilandt, E., Hild, S., Marti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+measurement+of+elastic%2C+electrostatic+and+adhesive+properties+by+scanning+force+microscopy%3A+pulsed-force+mode+operation%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation.</a> Measurement Science and Technology. 8 (11), 1333(1997).</li>
<li>De Pablo, P. J., Colchero, J., Gómez-Herrero, J., Baró, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumping+mode+scanning+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Jumping mode scanning force microscopy.</a> Applied Physics Letters. 73 (22), 3300-3302 (1998).</li>
<li>Umeda, N., Ishizaki, S., Uwai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+attractive+force+microscope+using+photothermal+vibration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%22%5BJournal%5D)">Scanning attractive force microscope using photothermal vibration.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B. 9 (2), 1318-1322 (1991).</li>
<li>Avakyan, N., Conway, J. W., Sleiman, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+ordering+of+blunt-ended+DNA+tiles+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Long-range ordering of blunt-ended DNA tiles on supported lipid bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (34), 12027-12034 (2017).</li>
<li>Wang, R., Kuzuya, A., Liu, W., Seeman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blunt-ended+DNA+stacking+interactions+in+a+3-helix+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Blunt-ended DNA stacking interactions in a 3-helix motif.</a> Chemical Communications. 46 (27), 4905-4907 (2010).</li>
<li>Parikka, J. M., Sokołowska, K., Markešević, N., Toppari, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+large+2D+lattices+out+of+DNA-tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Constructing large 2D lattices out of DNA-tiles.</a> Molecules. 26 (6), 1502(2021).</li>
<li>He, Y., Chen, Y., Liu, H., Ribbe, A. E., Mao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+hexagonal+DNA+two-dimensional+%282D%29+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (35), 12202-12203 (2005).</li>
<li>Lipid-DNA Method. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm">http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm</a> (2023).</li>
<li>Pyne, A. L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-pair+resolution+analysis+of+the+effect+of+supercoiling+on+DNA+flexibility+and+major+groove+recognition+by+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Base-pair resolution analysis of the effect of supercoiling on DNA flexibility and major groove recognition by triplex-forming oligonucleotides.</a> Nature Communications. 12 (1), 1053(2021).</li>
<li>Kielar, C., Zhu, S., Grundmeier, G., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tip+effects+in+single-molecule+high-speed+atomic+force+microscopy+using+DNA+origami+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tip effects in single-molecule high-speed atomic force microscopy using DNA origami substrates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (34), 14336-14341 (2020).</li>
<li>Nievergelt, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-range+HS-AFM+imaging+of+DNA+self-assembly+through+in+situ+data-driven+control%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-range HS-AFM imaging of DNA self-assembly through in situ data-driven control.</a> Small Methods. 3 (7), 1900031(2019).</li>
<li>Caroprese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+flexibility+dominates+over+binding+strength+for+supramolecular+crystallinity%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Structural flexibility dominates over binding strength for supramolecular crystallinity.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Welcome to Mao Group. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html">https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html</a> (2023).</li>
<li>Nievergelt, A. P., Andany, S. H., Adams, J. D., Hannebelle, M. T., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Components+for+high-speed+atomic+force+microscopy+optimized+for+low+phase-lag%5BTitle%5D)+AND+%222017+IEEE+International+Conference+on+Advanced+Intelligent+Mechatronics+%28AIM%29%22%5BJournal%5D)">Components for high-speed atomic force microscopy optimized for low phase-lag.</a> 2017 IEEE International Conference on Advanced Intelligent Mechatronics (AIM). , Munich, Germany. (2017).</li>
<li>SPM Controller/Software. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/</a> (2023).</li>
<li>Open Hardware. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/</a> (2023).</li>
<li>AFM head for small cantilevers with photothermal drive. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/</a> (2023).</li>
<li>AFM head for small cantilevers with photothermal drive. BioLever. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW">https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW</a> (2023).</li>
<li>BioLever. AppNano. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.appnano.com/product-page/biolever">https://www.appnano.com/product-page/biolever</a> (2023).</li>
<li>Python Scripting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html">http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html</a> (2023).</li>
<li>Stahl, S. W., Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+cantilever+actuation+for+fast+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Photothermal cantilever actuation for fast single-molecule force spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 80 (7), 073702(2009).</li>
<li>Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+feedback+performance+in+off-resonance+AFM+modes+through+pulse+train+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling.</a> arXiv. , (2023).</li>
<li>Giessibl, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Advances in atomic force microscopy.</a> Reviews of Modern Physics. 75 (3), 949-983 (2003).</li>
<li>Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy (AFM). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndo%2C+T+%22Encyclopedia+of+Biophysics%22">Encyclopedia of Biophysics</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podczas obrazowania delikatnych próbek biologicznych tryby obrazowania z opukaniem poza rezonansem w AFM są szczególnie przydatne, ponieważ mogą bezpośrednio kontrolować siły interakcji końcówka-próbka10. Wśród nich tryb PORT wyróżnia się wyższymi szybkościami oscylacji, jakie może osiągnąć, co umożliwia wyższe szybkości skanowania. Ponieważ PORT uruchamia wspornik bezpośrednio i tylko za pomocą lasera, umożliwia wzbudzenie przy znacznie wyższych częstotliwościach niż konwencjonalne tryby gwintowania poza rezonansem, szczególnie w przypadku korzystania z ultrakrótkich wsporników o wysokich częstotliwościach rezonansowych5. Jednak w przypadku korzystania z PORT dla HS-AFM należy uważać na parametry obrazowania, aby uzyskać dobrą jakość obrazowania.
Jak pokazano na rysunku 2, zwiększenie szybkości skanowania bez jednoczesnego podniesienia szybkości PORT doprowadzi do złej jakości obrazowania. Po pierwsze, szybkości PORT skutkujące mniej niż jednym cyklem oscylacji na piksel drastycznie obniżą jakość obrazu. Prędkość obrazowania jest z natury ograniczona przez szybkość, z jaką wspornik sonduje powierzchnię przy odpowiedniej kontroli siły końcówki i próbki. W PORT sterowanie sprzężeniem zwrotnym działa dyskretnie na koniec każdego cyklu oscylacji34. Ta ograniczona częstotliwość próbkowania indukuje czyste opóźnienie w pętli sprzężenia zwrotnego, ograniczając w ten sposób osiągalną szerokość pasma sprzężenia zwrotnego. Jeśli szybkość zmian topografii stanie się zbyt szybka, aby można ją było śledzić przy częstotliwości próbkowania PORT, topografia nie może być już dokładnie wykryta ani śledzona przez pętlę sprzężenia zwrotnego. W związku z tym należy zwiększyć szybkość PORT, aby wiernie rozpuścić próbkę przy wyższych prędkościach powierzchniowych. Jednak częstotliwość rezonansowa wspornika z natury ogranicza maksymalną szybkość PORT, jakiej możemy użyć. Jeśli szybkość PORT jest zbliżona do częstotliwości rezonansowej wspornika, ugięcie mierzone metodą dźwigni optycznej nie odzwierciedla już wiernie sił końcówka-próbka. Aby uzyskać właściwą krzywą interakcji końcówka-próbka, zarówno szerokość pasma mechanicznego wspornika, jak i szerokość pasma elektrycznego systemu AFM muszą być wystarczająco duże, aby wykryć składowe Fouriera krzywej ugięcia, które są kilkakrotnie większe niż częstotliwość PORT. Jeśli którekolwiek z tych pasm jest zbyt niskie, krzywa interakcji nie pokazuje już jednostronnego odcięcia (rysunek 3A), ale raczej zachowanie sinusoidalne (rysunek 3D), które zasłania rzeczywistą interakcję próbki końcówki (rysunek 3E). Prowadzi to do słabej kontroli siły w obrazowaniu (ryc. 3F). Nawet mniejsze wsporniki o wysokiej częstotliwości rezonansowej, które mają jednocześnie niskie stałe sprężystości, są zatem wymagane do dalszego zwiększenia szybkości PORT. Tak wysokie szybkości PORT i prędkości skanowania stanowią wyzwanie dla elektroniki AFM, wymagając starannego oprogramowania i konstrukcji elektronicznej, która charakteryzuje się wymaganymi wysokimi przepustowościami i zoptymalizowanymi strategiami cyfrowego przetwarzania sygnału.
Jedną z zalet PORT w porównaniu z szybkim AFM w trybie gwintowania jest to, że można dostroić prędkość próbkowania powierzchni. W trybie gwintowania AFM częstotliwość próbkowania powierzchni jest określona przez częstotliwość rezonansową wspornika. Podczas pracy w PORT znacznie poniżej częstotliwości rezonansu wspornikowego zakładamy, że każde próbkowanie powierzchni dostarcza prawidłowego punktu danych. W związku z tym szerokość pasma wykrywania PORT jest podawana przez częstotliwość Nyquista z połową szybkości PORT. W przypadku trybu podsłuchowego szerokość pasma detekcji jest określona przez f0/2Q35. Dzięki najnowszym osiągnięciom w PORT możemy stopniowo zwiększać szybkość PORT aż do częstotliwości rezonansowej. W takiej sytuacji PORT i tryb stukania stają się prawie identyczne, ponieważ przy tych częstotliwościach PORT nie jest w stanie dokładnie wykryć interakcji między wspornikiem a końcówką próbki, jak pokazano na rysunku 3E. Podczas pracy z częstotliwością rezonansową wadą staje się większa amplituda oscylacji PORT w porównaniu z trybem stukania. Celem zwiększenia szybkości obrazowania PORT pozostaje zatem zwiększenie częstotliwości rezonansowej wspornika, aby utrzymać działanie z szybkością PORT wystarczająco znacznie poniżej częstotliwości rezonansowej.
Gdy zwiększymy szybkość PORT, aby umożliwić szybsze skanowanie, napotkamy kolejny problem związany z fototermicznym wzbudzeniem wspornikowym: przy wyższych częstotliwościach amplituda oscylacji zmniejsza się z powodu spadku wydajności wzbudzenia fototermicznego, ostatecznie do punktu, w którym musimy zwiększyć moc lasera, co spowoduje wzrost temperatury próbki. Zwiększenie szybkości PORT utrudni zrównoważenie mocy lasera i amplitudy oscylacji, ponieważ wymagana jest wyższa moc wzbudzenia, aby skompensować zmniejszoną wydajność uruchamiania, która prowadzi do uszkodzenia próbki. Przy wyższych poziomach mocy lasera nie mogliśmy już obserwować próbki, pomimo użycia najniższej możliwej wartości zadanej siły (prawe panele na rysunkach 4E,F). Musimy uważać na to, w jaki sposób zwiększymy amplitudę oscylacji wspornika i zwiększymy moc lasera. Istnieją dwa parametry, które możemy dostroić, aby zwiększyć moc lasera. Po pierwsze, wejście AC między szczytami, które steruje sinusoidalnym sygnałem wysyłanym do diody laserowej w celu sinusoidalnej zmiany intensywności dostarczanej mocy lasera. Po drugie, napięcie wejściowe przesunięcia prądu stałego, które utrzymuje diodę laserową w reżimie przewodzenia, a tym samym laserowania. Wzrost pierwszego z nich musi być połączony ze wzrostem drugiego, ponieważ wzrost amplitudy sygnału AC wysyłanego do lasera wymaga wzrostu napięcia DC, aby uniknąć przekroczenia progu lasera. Jednak tylko wejście prądu przemiennego między szczytami wpływa na amplitudę drgań wspornika, jak pokazano na rysunku 4A. Napięcia prądu stałego nie prowadzą do zmian amplitudy drgań (rysunek 4B). Tak więc, jeśli chcemy uruchomić sinusoidalnie, musimy ustawić napięcie DC na minimalne napięcie, które pozwala laserowi diodowemu znajdować się w reżimie laserowym. Alternatywnie możemy zminimalizować nagrzewanie się poprzez okresowe wyłączanie i ponowne włączanie diody laserowej podczas każdego cyklu oscylacji, zamiast korzystania z pełnego napędu sinusoidalnego5. Oscylację temperatury wymaganą do uruchomienia wspornika w wzbudzeniu fototermicznym można efektywniej osiągnąć, wyłączając laser podczas części cyklu, co powoduje obniżenie temperatury wspornika, a tym samym prowadzi do wygięcia wspornika. Zminimalizuje to energię dostarczaną do wspornika i próbki, a tym samym obniży całkowitą temperaturę w otoczeniu, łagodząc uszkodzenia cieplne próbki.
W tym badaniu pokazujemy ograniczenia parametrów obrazowania w HS-PORT, które zapobiegają uszkodzeniom próbki ciepła i właściwej kontroli sprzężenia zwrotnego. Zrozumienie tych granic pomoże w jak najlepszym wykorzystaniu obecnego stanu metody PORT AFM, umożliwiając lepszą kontrolę nad interakcją końcówka-próbka i pomagając zachować natywny stan motywów DNA w tych pomiarach. Dzięki osiąganym wysokim wskaźnikom skanowania w połączeniu z dobrą kontrolą sprzężenia zwrotnego, PORT pozwolił nam uzyskać wyraźne i szczegółowe obrazy DNA 3PS i ich interakcji 7,8,36. Dzięki możliwości zwiększenia prędkości obrazowania i bezpośredniej kontroli siły końcówka-próbka23 jesteśmy w stanie dokładniej śledzić wzrost i reorganizację zespołów biomolekularnych oraz obserwować szczegółową dynamikę.

Mikroskopia sił atomowych o dużej szybkości (HS-AFM) to szybko rozwijająca się technika obrazowania1,2,3,4. Działa z prędkością, która pozwala naukowcom na wizualizację interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym5,6,7,8,9. Fototermiczne stukanie w rezonans off-resonancyjny (PORT) to tryb obrazowania off-rezonansowego podobny do tap z siłą szczytową10,11, tryb siły pulsacyjnej12,13, lub tryb skakania14. Jednak zamiast oscylować skaner w pionie, PORT oscyluje pionowo tylko wspornik za pomocą lasera wzbudzającego skupionego na wsporniku (zwykle blisko punktu mocowania). Wspornik odkształca się z powodu efektu bimorficznego: laser wzbudzający z modulacją mocy okresowo podgrzewa powlekany wspornik, który wygina się z powodu różnych współczynników rozszerzalności cieplnej wspornika i materiałów powłokowych15. Nagrzewanie się kantylantów i próbek można zminimalizować za pomocą lasera sterującego, który jest okresowo wyłączany i ponownie włączany podczas każdego cyklu oscylacji, zamiast stosowania pełnego napędu sinusoidalnego5.
DNA jest używane do tworzenia biologicznie istotnych, strukturalnie interesujących i biochemicznie użytecznych motywów od wielu lat16,17,18,19,20. Ponadto udowodniono, że struktury DNA idealnie nadają się do charakteryzowania jakości obrazowania AFM21 oraz do oceny efektu końcówki szybkiego AFM22. Trzypunktowe gwiazdy o końcu DNA (3PS) stały się praktyczne jako programowalny system modelowy do badania supramolekularnej organizacji cząsteczek o podobnej strukturze w złożonych systemach biologicznych19. Wcześniej samoorganizacja sieci utworzonych przez tępo zakończone trimeryczne monomery DNA była śledzona za pomocą HS-AFM23. W końcu organizują się one w duże sieci w porządku sześciokątnym. W tym przypadku samoorganizacja DNA 3-punktowych gwiazd19 jest obrazowana techniką PORT z prędkościami wystarczająco szybkimi, aby śledzić samoorganizację i jej mechanizmy korekcyjne24, zapewniając jednocześnie minimalne zakłócenie procesu lub uszkodzenie próbki. Podobnie jak w przypadku każdego trybu HS-AFM, istnieje kompromis między osiągalną jakością obrazowania, szybkością obrazowania i niepożądanymi zakłóceniami próbki. Wybierając odpowiedni kompromis, można lepiej zrozumieć wzorce samoorganizacji zespołów supramolekularnych. Protokół ten będzie zatem wykorzystywał podobną konfigurację z DNA 3PS jako system modelowy do optymalizacji parametrów specyficznych dla PORT. Umożliwi to pracę z dużą szybkością obrazowania przy wystarczająco dużych rozmiarach skanów przy jednoczesnej minimalizacji uszkodzeń próbki.

<table><tbody><tr><td>AC10DS</td><td>Olympus</td><td>BL-AC10FS-A2</td><td>Wycofane z produkcji&nbsp;</td></tr><tr><td>Biometra Compact XS/S</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-025-199&nbsp;</td><td>Jednostka elektroforezy&nbsp;</td></tr><tr><td>Biometra TRIO</td><td>Biometra GmbH</td><td>207072X</td><td>termocykler do wyżarzania</td></tr><tr><td>Niestandardowa konfiguracja AFM</td><td>Laboratorium oprzyrządowania Bio-Nano, Międzywydziałowy Instytut Bioinżynierii, Szkoła Inżynierii, Ecole Polytechnique F&eacute; d&eacute; rale Lozanna</td><td></td><td>Do uzyskania w Laboratorium Oprzyrządowania Bio-Nano Odczynniki</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ITW</td><td>A5097</td><td>W buforze do wyżarzania</td></tr><tr><td>Laserowy miernik mocy</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Cyfrowy ręczny optyczny&nbsp; Konsola miernika mocy i energii</td></tr><tr><td>Lively 3AP Zasilacz, MP-310</td><td>Major Science</td><td>MP-310</td><td>Zasilacz do elektroforezy</td></tr><tr><td>MgAc2</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB544692</td><td>W buforze do wyżarzania</td></tr><tr><td>TBE</td><td>Thermo Scientific</td><td>327330010</td><td>Bufor do elektroforezy</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>W buforze do wyżarzania</td></tr></tbody></table>

obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy dna za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego

High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-Point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping

Szybka mikroskopia sił atomowych (HS-AFM) jest popularną techniką obrazowania molekularnego do wizualizacji procesów biologicznych pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym ze względu na jej zdolność do obrazowania w warunkach fizjologicznych w środowisku płynnym. Tryb gwintowania fototermicznego z rezonansem off-resonansowym (PORT) wykorzystuje laser napędowy do oscylacji wspornika w kontrolowany sposób. To bezpośrednie uruchamianie wspornikowe jest skuteczne w zakresie MHz. W połączeniu z działaniem pętli sprzężenia zwrotnego na krzywej siły w dziedzinie czasu, a nie na amplitudzie rezonansowej, PORT umożliwia szybkie obrazowanie z prędkością do dziesięciu klatek na sekundę z bezpośrednią kontrolą sił między końcówką a próbką. Wykazano, że PORT umożliwia obrazowanie delikatnej dynamiki składania i precyzyjne monitorowanie wzorów tworzonych przez biomolekuły. Do tej pory technika ta była wykorzystywana w różnych dynamicznych badaniach in vitro, w tym we wzorcach składania motywu 3-punktowej gwiazdy DNA pokazanych w tej pracy. Poprzez serię eksperymentów, protokół ten systematycznie identyfikuje optymalne ustawienia parametrów obrazowania i granice ostateczności systemu obrazowania HS-PORT AFM oraz ich wpływ na procesy składania biomolekularnego. Dodatkowo bada potencjalne niepożądane efekty termiczne wywołane przez laser napędowy na próbkę i otaczającą ją ciecz, szczególnie gdy skanowanie jest ograniczone do małych obszarów. Odkrycia te dostarczają cennych informacji, które przyczynią się do rozwoju zastosowania trybu PORT w badaniu złożonych systemów biologicznych.

W niniejszym badaniu, dzięki możliwościom HS-PORT AFM, pomyślnie zaobserwowano dynamiczny proces składania motywów DNA w formie trójramiennych gwiazd w stabilne wyspy. Technika ta pozwoliła nam uchwycić proces formowania się tych struktur w czasie rzeczywistym. Na Rysunku 2A,B otrzymano wyraźne obrazy przy częstotliwości skanowania linii wynoszącej odpowiednio 100 Hz i 200 Hz, dla częstotliwości PORT 100 kHz (rozmiar skanu 800 nm na 800 nm). Odpowiada to odpowiednio 3,9 i 1,95 cyklom oscylacji na piksel. Jednak obrazowanie przy wyższych prędkościach bez jednoczesnego zwiększenia częstotliwości PORT, co pozwoliłoby na minimum jeden cykl oscylacji na piksel, drastycznie obniża jakość obrazu, co widać na Rysunku 2C (0,78 cyklu oscylacji na piksel). Prędkość obrazowania jest ograniczona szybkością, z jaką wspornik sonduje powierzchnię przy odpowiedniej kontroli siły oddziaływania końcówki z próbką, ponieważ tempo zmian topografii staje się zbyt wysokie, aby można je było śledzić przy danej częstotliwości próbkowania powierzchni.
Oprócz ustawienia odpowiednio wysokiej częstotliwości PORT, ważne jest, aby krzywe PORT zawierały informacje niezbędne do kontrolowania sił. W szczególności opór hydrodynamiczny i niska szerokość pasma detekcji mogą maskować przyłożoną siłę. Rysunek 3 przedstawia ugięcie wspornika w różnych odległościach od powierzchni próbki i przy różnych częstotliwościach wzbudzenia, wykorzystując średnią z 4096 krzywych w celu redukcji szumów. Niebieskie krzywe na Rysunku 3A (dla częstotliwości PORT 100 kHz) i Rysunku 3D (dla częstotliwości PORT 500 Hz) reprezentują ruch wspornika, gdy znajduje się on daleko od powierzchni i oscyluje swobodnie (nie dotykając powierzchni podczas jednego cyklu oscylacji). Czerwone krzywe pokazują ugięcie wspornika, gdy oscyluje on blisko powierzchni i przerywanym kontaktem dotyka powierzchni, badając próbkę. Aby uzyskać rzeczywistą krzywą oddziaływania, a tym samym oddziaływanie końcówka-próbka, odejmujemy krzywą niebieską od czerwonej, co pozwala otrzymać odpowiednio Rysunek 3B,E. Przykład wyraźnej krzywej oddziaływania, wymaganej do nieniszczącego obrazowania bio-próbek, przedstawiono na Rysunku 3B. Taka konfiguracja prowadzi do wysokiej jakości obrazowania pokazanej na Rysunku 3C, gdzie częstotliwość PORT wynosi 100 kHz. W miarę zwiększania częstotliwości wzbudzenia w stronę rezonansu wspornika, w pewnym momencie sterowanie sprzężeniem zwrotnym ulega pogorszeniu, nawet jeśli wspornik wykazuje wystarczającą amplitudę oscylacji, aby oderwać się od powierzchni po zwiększeniu mocy lasera wzbudzającego (Rysunek 3E). Jeśli częstotliwość PORT jest zbyt bliska częstotliwości rezonansowej wspornika, rezonans wspornika ogranicza czas odpowiedzi jego dynamiki. W konsekwencji wygięcie wspornika nie reprezentuje już dokładnie oddziaływania końcówka-próbka, a otrzymana krzywa oddziaływania jest zniekształcona. Prowadzi to do degradacji jakości obrazu, co przedstawiono na Rysunku 3F.
Zaburzona krzywa oddziaływania przy wyższych częstotliwościach PORT może wynikać również ze zmniejszonej wydajności wzbudzania przy wyższych częstotliwościach33, co obecnie stanowi jeden z ograniczających czynników w przypadku komercyjnych wysokoprędkościowych zwegląży AFM. Spadek ten ostatecznie osiąga poziom progowy w obszarze roll-off, przy którym prawidłowe obrazowanie jest utrudnione: amplituda oscylacji może być niewystarczająca do oderwania się od powierzchni, a końcówka pozostaje w stałym kontakcie, co prowadzi do uszkodzenia struktur próbki. Aby przeciwdziałać spadkowi amplitudy wywołanemu wyższymi częstotliwościami PORT, zbadaliśmy wpływ zwiększenia mocy lasera. Użyliśmy głowicy PORT, która pozwala na osiągnięcie wyższych mocy laserowych, aby lepiej zaobserwować ten efekt. Moc lasera wzbudzającego, zmierzoną za pomocą watometru, podzielono na składowe DC i AC. Moc całkowita jest kontrolowana poprzez regulację w oprogramowaniu napięcia szczyt-szczyt (wejście AC szczyt-szczyt) oraz napięcia DC (wejście przesunięcia DC) przesyłanego do obwodu sterowania diodą laserową. Rycina 4A przedstawia amplitudę oscylacji zwegląza szczyt-szczyt wynikającą ze zwiększonego wejścia AC szczyt-szczyt. Zgodnie z oczekiwaniami, amplituda oscylacji dobrze koreluje z wartością wejścia AC. Należy zauważyć, że te amplitudy szczyt-szczyt są wyższe niż te zazwyczaj stosowane w obrazowaniu PORT. Podczas obrazowania delikatnych próbek amplituda AC wynosi od 10-30 nm. Rycina 4B przedstawia amplitudę oscylacji zwegląza szczyt-szczyt dla zwiększonych wejść przesunięcia DC. Amplituda oscylacji szczyt-szczyt pozostaje w miarę stała w zakresie napięcia przesunięcia DC. Małe wariacje przypisujemy nieliniowościom w detekcji. Rycina 4C obrazuje wzrost składowych mocy lasera AC i DC wynikający ze zwiększania AC szczyt-szczyt. Rycina 4D obrazuje wzrost składowych mocy lasera AC i DC wynikający ze zwiększania wejścia przesunięcia DC.
Wpływ zwiększenia wejściowego napięcia zmiennego od szczytu do szczytu oraz wejściowego przesunięcia stałoprądowego badano osobno, aby określić ich odpowiedni wpływ na moc całkowitą i amplitudę oscylacji. Zwiększenie mocy lasera powoduje uszkodzenie próbki, prawdopodobnie wskutek wzrostu temperatury, natomiast zwiększenie amplitudy oscylacji prowadzi do wzrostu siły uderzenia w próbkę.5Wyłącznie zwiększenie szczytowej wartości napięcia wejściowego AC (peak-to-peak) będzie miało mniejszy wpływ na całkowity wzrost mocy lasera, co pokazano w Rycina 4Ci będzie to przede wszystkim zwiększać amplitudę oscylacji wspornika (a w konsekwencji siłę uderzenia), co pokazano w Rysunek 4AZwiększenie wejściowego przesunięcia składowej stałej (DC offset) będzie miało silniejszy wpływ na zwiększenie mocy wyjściowej lasera, co pokazano w Rycina 4D, co podgrzewa próbkę, lecz będzie miało pomijalny wpływ na amplitudę wychylenia, jak pokazano w Rysunek 4BWyniki obrazowania przedstawiono w Rysunek 4E,F. Rycina 4E przedstawia DNA 3PS dla najniższego napięcia wejściowego AC szczyt-szczyt (obraz po lewej, zakreślony na niebiesko) oraz najwyższego napięcia wejściowego AC szczyt-szczyt (obraz po prawej, zakreślony na czerwono), co prowadzi do uszkodzenia próbki, prawdopodobnie w wyniku działania większych sił. Rycina 4F wykazuje DNA 3PS dla najniższego wejściowego przesunięcia składowej stałej (obraz po lewej, zaznaczony niebieskim okręgiem) oraz najwyższego wejściowego przesunięcia składowej stałej (obraz po prawej, zaznaczony czerwonym okręgiem), gdzie struktury są uszkodzone.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Układ HS-AFM. (A) Głowica PORT na skanerze i podstawie AFM, przedstawiająca (i) pokrętło do regulacji ogniskowej lasera odczytującego na belce dwu wspornikowej, (ii) pokrętło do regulacji położenia lasera odczytującego na belce dwu wspornikowej, (iii) pokrętło do regulacji poziomego położenia lasera na fotodiodzie, (iv) pokrętło do regulacji pionowego położenia lasera na fotodiodzie oraz (v) pokrętła do regulacji położenia fototermicznego lasera wzbudzającego na belce dwu wspornikowej. (B) Zbliżenie belki dwu wspornikowej w przekroju poprzecznym głowicy ze stolikiem z próbką, gdzie (vi) oznacza zacisk sprężynowy mocujący belkę dwu wspornikową. Kanał do wstrzykiwania cieczy zaznaczono na czerwono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Obraz próbki DNA 3PS wykonany za pomocą AC10 przy częstotliwości PORT 100 kHz przy różnych prędkościach skanowania linii. (A) 100 Hz (3,9 cykli oscylacji na piksel), (B) 200 Hz (1,95 cykli oscylacji na piksel) oraz (C) 500 Hz (0,78 cykli oscylacji na piksel). Obrazy zostały wykonane przy wartościach zadanych 350 pN lub niższych. Pasek skali 200 nm. Po obrazowaniu wykonano krzywą siły w celu wyznaczenia czułości ugięcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig03v3.jpg" /> 
Rycina 3: Ugięcie wspornika, krzywa oddziaływania i jakość obrazu przy częstotliwościach PORT 100 kHz i 500 kHz. (A) Ugięcie wspornika (wolne drgania wspornika w pobliżu powierzchni, ale bez kontaktu z nią – kolor niebieski, oraz drgania wspornika podczas przerywanego kontaktu z powierzchnią – kolor czerwony), (B) krzywa oddziaływania i (C) odpowiadająca jej jakość obrazu dla częstotliwości PORT 100 kHz. (D) Ugięcie wspornika (wolne drgania wspornika w pobliżu powierzchni, ale bez kontaktu z nią – kolor niebieski, oraz drgania wspornika podczas przerywanego kontaktu z powierzchnią – kolor czerwony), (E) krzywa oddziaływania i (F) odpowiadająca jej jakość obrazu dla częstotliwości PORT 500 kHz. Obrazy wykonano przy prędkości skanowania linii 100 Hz. Pasek skali 200 nm. Krzywa siły w celu wyznaczenia czułości ugięcia została zarejestrowana po obrazowaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig03largev3.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig04.jpg" /> 
Rycina 4: Wpływ szczytowego napięcia wejściowego AC i napięcia offsetu DC. Wpływ zwiększania (A) szczytowego napięcia wejściowego AC oraz (B) napięcia offsetu DC na amplitudę oscylacji wspornika od szczytu do szczytu. Wpływ zwiększania (C) szczytowego napięcia wejściowego AC oraz (D) napięcia offsetu DC na moc lasera AC i DC. Jakość obrazowania przy minimalnym (zakreślone na niebiesko) i maksymalnym (zakreślone na czerwono) (E) szczytowym napięciu wejściowym AC oraz (F) napięciu offsetu DC. Podczas zwiększania szczytowego napięcia wejściowego AC, napięcie offsetu DC utrzymywano na poziomie 600 mV. Podczas zwiększania napięcia offsetu DC, szczytowe napięcie wejściowe AC utrzymywano na poziomie 200 mV. Integralność próbki zostaje naruszona w konfiguracji o wysokiej mocy. Częstotliwość PORT utrzymywano na poziomie 100 kHz, a częstotliwość linii na poziomie 100 Hz. Pasek skali 200 nm. Krzywa siły w celu wyznaczenia czułości ugięcia została zarejestrowana po obrazowaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Tutaj pokazujemy protokół obrazowania do obserwacji oddziaływań biomolekularnych za pomocą fototermicznego odsłuchu off-rezonansowego (PORT), gdzie zoptymalizowaliśmy parametry obrazowania, zidentyfikowaliśmy ograniczenia systemu i zbadaliśmy potencjalne ulepszenia w obrazowaniu montażu motywu DNA gwiazdy trzypunktowej.

Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego

High-speed atomic force microscopy (HS-AFM) is a popular molecular imaging technique for visualizing single-molecule biological processes in real-time due ...

W naszym laboratorium opracowujemy nowe technologie pomiarowe dla biologii w nanoskali. W szczególności koncentrujemy się na rozwoju szybkiej mikroskopii sił atomowych do badania dynamicznych procesów biologicznych w skali nanometrowej. W tym celu opracowaliśmy niedawno nowy tryb obrazowania, który nazywamy Photothermal Off Resonance Tapping (PORT).W tym trybie używamy dedykowanego lasera napędowego do uruchamiania wsporników bardzo kontrolowanych z dużą prędkością, co pozwala nam uzyskać dane i do dwóch rzędów wielkości szybciej niż w przypadku konwencjonalnego odczepiania poza rezonansem. Złotym standardem w szybkim AFM jest obrazowanie rezonansowe. W tym trybie wspornik jest uruchamiany z tą częstotliwością rezonansową, co oznacza, że nie można kontrolować położenia wspornika, a jedynie jego amplitudę oscylacji.W przypadku AFM o normalnej prędkości coraz częściej stosuje się tryby off-resonance. Jednak częstotliwość aktywacji jest tutaj ograniczona, co sprawia, że ten tryb obrazowania jest dość wolny. Używając lasera wtórnego do uruchamiania wspornika, możemy osiągnąć wyższe częstotliwości aktywacji, co oznacza wyższe prędkości obrazowania.Takie podejście pozwala nam zachować zalety związane z innymi trybami obsady poza rezonansem, co oznacza, że możemy zoptymalizować równowagę między czułością a szybkością obrazowania. Szybkość obrazowania jest nam ograniczona przez najwyższy portret. Jeśli chcemy zwiększyć portret, musimy zwiększyć moc lasera, aby utrzymać tę samą amplitudę aktywacji.Może to prowadzić do słabej kontroli siły i uszkodzenia próbki. Zwiększenie szerokości pasma wsporników poprzez zmniejszenie ich rozmiaru i poprawę wydajności absorpcji lasera umożliwi nam osiągnięcie wyższych szybkości portów przy jednoczesnym zapewnieniu odpowiedniego odstępu próbki. Postęp ten ułatwi szybsze obrazowanie, co ma kluczowe znaczenie dla badania zawiłości dynamiki montażu.Aby rozpocząć, wyczyść i przygotuj wsporniki. Zamontuj wsporniki na uchwycie kompatybilnym ze skaningową mikroskopią elektronową lub systemem SEM. Następnie podgrzej gaz prekursorowy, który ma być używany w systemie wtrysku gazu, aby wyhodować nową końcówkę.Gdy podciśnienie osiągnie poniżej 10 do potęgi minus pięć milibarów, należy przepłukać przewód wtrysku gazu 10 razy przez dwie sekundy każdy, aby usunąć resztki powietrza z przewodu dyszy. Użyj SEM, aby zlokalizować koniec wspornika. Przechyl uchwyt pod kątem, aby prawidłowo ustawić wspornik do obrazowania mikroskopią sił atomowych.Dostosuj położenie i ostrość SEM, aby uzyskać wyraźny widok końcówki wspornika, w miejscu, w którym będzie rosła końcówka nano węglowa. Następnie ustaw parametry osadzania w oprogramowaniu, aby wyhodować nową końcówkę. Zainicjuj proces osadzania, aby wyhodować końcówkę za pomocą promieniowania wiązki elektronów na końcówce wspornika podczas wstrzykiwania gazu prekursorowego i zatrzymaj wstrzykiwanie gazu po zakończeniu osadzania.Wykonaj obrazowanie SEM po wzroście, aby ocenić jakość i cechy nowo wyrosłej końcówki, w tym jej promień i długość. Wyjmij uchwyt z komory SEM. Na początek przygotuj szybki mikroskop sił atomowych.Użyj pęsety, aby umieścić ultra krótki wspornik pod zaciskiem sprężynowym na uchwycie wspornika. Za pomocą strzykawki dodaj 50 mikrolitrów płynu przez lewy port dostępu do płynu. Następnie użyj trzech pokręteł na głowicy AFM, aby ustawić laser odczytu na wsporniku.Obserwuj cień wspornika na białym papierze, maksymalizując sumę. Następnie wyśrodkuj plamkę lasera na fotodiodzie za pomocą dwóch dedykowanych pokręteł. Następnie zaznacz pole włączone wzbudzenie w wzbudzeniu VI, aby włączyć i wyrównać laser napędowy, uruchamiając i oscylując wspornik.Wyświetlanie sygnałów wzbudzenia i odchylenia wspornika na oscyloskopie. Użyj metody cienia i zmaksymalizuj amplitudę oscylacji za pomocą pokręteł regulacji lasera napędowego. Aby wyregulować amplitudę oscylacji wspornika w porcie, dodaj napięcie stałe do obwodu sterującego diody laserowej w polu konfiguracyjnym w wzbudzeniu VI i wprowadź wejście AC między szczytami dla obwodu sterującego diody laserowej.Aby uzyskać krzywe interakcji, ustaw sterownik Z VI w trybie kontaktowym i kliknij przycisk Start, aby zbliżyć się do powierzchni próbki. Po osiągnięciu powierzchni wykonaj krzywą siły w funkcji odległości w rampie VI w celu kalibracji czułości ugięcia wspornika. Kliknij wycofaj, aby cofnąć piezoelektryczny Z z z powierzchni, do której końcówka nie może dotrzeć.Po całkowitym wycofaniu przełącz się w tryb portu w sterowniku Z VI i włącz laser wzbudzenia w wzbudzeniu VI.Ustaw tryb portu na żądaną częstotliwość. Wyraźne krzywe oddziaływania uzyskano poprzez odjęcie drgań swobodnych od oscylacji kontaktowych, które mają kluczowe znaczenie dla nieniszczącego obrazowania próbek biologicznych. Przy szybkości portu 100 kiloherców osiągnięto dobrą jakość obrazowania.Jednak gdy częstotliwość wzbudzenia zbliżała się do rezonansu wspornikowego, kontrola sprzężenia zwrotnego uległa pogorszeniu, co prowadziło do zaciemnienia krzywych interakcji i pogorszenia jakości obrazu. Na początek przygotuj 10-milimolowy roztwór octanu magnezu. Za pomocą strzykawki Hamiltona wstrzyknąć 50 mikrolitrów roztworu do kanału płynnego uchwytu wspornika, tworząc kroplę płynu, która otacza wspornik.Ustaw rozmiar skanowania w skanowaniu VI na 800 na 800 nanometrów, a częstotliwość linii na 100 herców. Aby zeskanować powierzchnię, kliknij strzałkę ramki, aby sprawdzić jakość. Po zeskanowaniu kliknij przycisk wycofaj w sterowniku Z VI, aby schować wspornik z powierzchni.Za pomocą strzykawki Hamiltona usunąć roztwór buforowy z uchwytu wspornikowego. Następnie przygotuj rozcieńczony trzypunktowy roztwór gwiazdowy DNA i wstrzyknij 50 mikrolitrów tego roztworu do uchwytu wspornikowego. Wykonuj obrazowanie w obszarze o wymiarach 800 na 800 nanometrów z domyślną częstotliwością linii 100 Hz.Po wstępnym skanowaniu dostosuj rozmiar i szybkość obrazowania i zeskanuj VI do określonych wartości w celu dalszego gromadzenia danych Utrzymuj wejście wartości zadanej w polu wartości zadanej kontrolera Z VI na najniższym poziomie niezbędnym do dokładnego śledzenia przez cały proces obrazowania. Powtórz tę czynność dla wszystkich wymaganych obszarów próbki. Korzystając z tego protokołu, szybki port AFM obserwował w czasie rzeczywistym składanie się motywów gwiazd trójpunktowych DNA w stabilne wyspy.Wyraźne obrazy uzyskano przy szybkościach linii 100 i 200 Hz dla szybkości portu 100 kiloherców. Jednak wyższe prędkości obrazowania bez zwiększania liczby portów obniżyły jakość obrazu ze względu na szybkie zmiany topografii. Wyniki obrazowania trzypunktowej gwiazdy DNA dla najniższego sygnału wejściowego AC między szczytami wykazały nienaruszone struktury, podczas gdy najwyższy sygnał wejściowy AC między szczytami spowodował obserwowalne uszkodzenie próbki z powodu większych sił.Podobnie, najniższe wejście z przesunięciem DC ujawniło nienaruszone struktury, podczas gdy najwyższe wejście z przesunięciem DC spowodowało uszkodzenie konstrukcji.

high-speed-atomic-force-microscopy-imaging-dna-three-point-star-motif

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę obrazowania za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) w trybie stukowym (tapping mode) w celu wizualizacji plazmidowego DNA, białek cytoplazmatycznych oraz kompleksów DNA-białko. Metoda obejmuje alternatywne podejścia do przygotowania próbek do obrazowania AFM po przeprowadzeniu manipulacji biochemicznych. DNA zawierające specyficzne regiony oddziałujące z białkami są obserwowane w warunkach buforu zbliżonego do fizjologicznego.

Wizualizacja rekombinowanego DNA i kompleksów białkowych przy użyciu mikroskopii sił atomowych

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

W tym filmie demonstrujemy statyczną mikroskopię sił atomowych, aby zobrazować złożone nukleosomy. Ta technika obrazowania o wysokiej rozdzielczości pozwala na badanie struktury nukleosomów.

Statyczna mikroskopia sił atomowych w celu wizualizacji i scharakteryzowania złożonych nukleosomów

W tym filmie demonstrujemy szybką mikroskopię sił atomowych w czasie poklatkowym, AFM, techniki obrazowania do badania dynamiki kompleksów nukleosomów. Gdy końcówka AFM skanuje powierzchnię nukleosomu, wykrywa zmiany wysokości nukleosomu i rejestruje rozwijanie się DNA w czasie.

Szybka poklatkowa mikroskopia sił atomowych w celu uchwycenia dynamiki nukleosomów

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Półelastyczne polimery wykazują unikalne właściwości mechaniczne, które są szeroko stosowane przez żywe systemy. Jednak systematyczne badania nad biopolimerami są ograniczone, ponieważ właściwości takie jak sztywność polimeru są niedostępne. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób to ograniczenie jest obchodzone przez programowalne nanorurki DNA, umożliwiając eksperymentalne badania wpływu sztywności włókien.

Nanorurki DNA jako wszechstronne narzędzie do badania polimerów półelastycznych

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół ligacji T4 i denaturacji PAGE oczyszczania małych kolistych cząsteczek DNA, wyżarzania i natywnej analizy PAGE okrągłych płytek, montażu i obrazowania AFM nanostruktur DNA 1D i 2D, a także elektroforezy w żelu agarozowym i wirowania oczyszczania skończonych nanostruktur DNA.

Stabilne motywy DNA, nanostruktury 1D i 2D zbudowane z małych kolistych cząsteczek DNA

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą technik obrazowania statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych (AFM). Opisana metoda funkcjonalizacji powierzchni pozwala na uchwycenie struktury i dynamiki nukleosomów w wysokiej rozdzielczości w nanoskali.

Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Poznaj metodę PORT do obrazowania samoorganizacji motywów DNA typu trzypunktowej gwiazdy przy użyciu szybkiej mikroskopii sił atomowych. Technika ta umożliwia kontrolowane pobudzanie dźwigników z prędkością wyższą o dwa rzędy wielkości niż konwencjonalne metody.

Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego

Przeglądaj więcej filmów