Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią
5 stycznia 2024
Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.
Badamy wielolekooporne systemy wypływu u bakterii Gram-ujemnych. Jesteśmy zainteresowani poznaniem naturalnych funkcji tych pomp i tego, w jaki sposób mogą one być wykorzystywane jako potencjalny cel dla leków. Ekspresja wielolekowych systemów wypływowych oporności jest ściśle regulowana, co utrudnia badanie ich funkcji.
Tak więc system odciągania, który omija system regulacyjny, może być bardzo przydatny w charakterystyce tych pomp. Protokół ten pozwala na ekspresję genów na poziomach zwykle obserwowanych w warunkach naturalnych. W ten sposób aktywność produktów genów naśladuje to, co obserwuje się w naturze.
Na początek umieść wszystkie sterylne 1,5-mililitrowe probówki do mikrofug i sterylne kuwety do elektroporacji na lodzie. Następnie umieść butelkę sterylnej wody, która była przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza, na lodzie. Przenieś 1,5 mililitra nocnej kultury bakteryjnej do jednej z 1,5-mililitrowych probówek do mikrofug i odwiruj przy 13 000 G przez dwie minuty, aby granulować komórki.
Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra usuń cały supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodaj kolejne 1,5 mililitra kultury bakteryjnej do tej samej probówki do mikrofuge. Odwirować przy stężeniu 13 000 G przez dwie minuty i usunąć supernatant.
Dodaj jeden mililitr lodowatej sterylnej wody do granulki komórkowej i zawieś ją ponownie za pomocą delikatnego pipetowania, aż osadka przestanie znajdować się na dnie probówki do mikrofuge. Odwirować zawieszone komórki w temperaturze 13 000 G przez dwie minuty i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra. Delikatnie ponownie zawieś końcową osadkę komórkową w 200 mikrolitrach lodowatej sterylnej wody i przenieś 100 mikrolitrów końcowej zawiesiny komórek do drugiej lodowatej probówki mikrofuge o pojemności 1,5 mililitra.
Podgrzej jeden mililitr bulionu LB i jedną płytkę ślimakową LB plus gentamycynę dla każdej próbki i kontroluj w inkubatorze statycznym ustawionym na 37 stopni Celsjusza. W łącznej objętości pięciu mikrolitrów lub mniejszej dodać od 100 do 200 nanogramów każdego z plazmidu pomocniczego pTNS2 i plazmidu insercyjnego gentamycyny pUC18T-mini-Tn7, plazmidu insercyjnego AdeIJK do podwielokrotności komórek elektrokompetentnych. Wymieszaj delikatnym stukaniem opuszkami palców, aby zapewnić całkowite wymieszanie plazmidów z komórkami elektrokompetentnymi bez wprowadzania pęcherzyków.
Dodać równoważną objętość sterylnej wody destylowanej do podwielokrotności ujemnej komory kontrolnej i delikatnie wymieszać, jak pokazano powyżej. Próbki należy inkubować na lodzie przez 20 minut. Przenieś całą próbkę ogniwa do lodowatej kuwety do elektroporacji, a następnie umieść kuwetę z powrotem na lodzie.
Aby elektroporować próbkę ogniwa, włącz elektroporator i ustaw go na dwa kilowolty. Przetrzyj powierzchnię kuwety miękką chusteczką, aby usunąć przylegający lód lub wilgoć. Włóż kuwetę do elektroporatora i dostarcz porażenie prądem.
Natychmiast dodaj 0,9 mililitra podgrzanego bulionu LB do komórek w kuwecie i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać komórki z pożywką. Przenieś całą zawiesinę komórek do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrofuge w temperaturze pokojowej. Następnie sprawdź wartość stałej czasowej na elektroporatorze.
Aby uzyskać najlepsze wyniki, ta wartość powinna wynosić od czterech do sześciu. Inkubować elektroporowane próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę przy 250 obr./min, aby umożliwić regenerację komórek. Po godzinie rozprowadzić 100 mikrolitrów każdej próbki na wstępnie podgrzanej płytce ślimakowej LB plus gentamycyna za pomocą rozsiewacza do zaszczepiania.
Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin. Sprawdź płytki elektroporacyjne. Za pomocą sterylnych wykałaczek zbierz do 10 pojedynczych kolonii z płytek ślimaka LB plus gentamycyny i nałóż je na świeżą płytkę ślimaka LB plus gentamycyny.
Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 18 godzin. Łatanie kolonii płytek transformacyjnych na selektywnych pożywkach zachowuje przekształcony szczep i zapewnia materiał wyjściowy do badań przesiewowych PCR kolonii. Produktem PCR dla starterów przesiewowych, ABglmS2 do przodu nowego i Tn7 do tyłu, są 382 pary zasad.
Kontrole ujemne reakcji obejmują typ dziki A.baumannii ATCC 17978, AB 258 i brak matrycy.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na systemach effluxu odpowiedzialnych za wielolekooporność u bakterii gram-ujemnych, a w szczególności u Acinetobacter baumannii. Wykorzystano system ekspresyjny oparty na mini-Tn7 do jednokopiowej komplementacji chromosomowej genu pompy effluxu, co umożliwia kontrolowaną ekspresję genu w celu lepszej charakterystyki tych pomp.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Genetyka
- Farmakologia
Wstęp
- Wielolekooporność stanowi istotne wyzwanie w leczeniu infekcji bakteryjnych.
- Pompy effluksu odgrywają kluczową rolę w mechanizmach oporności bakterii.
- Badanie tych pomp jest utrudnione ze względu na ich ściśle regulowaną ekspresję.
- Istniejące metody mogą nie odzwierciedlać dokładnie naturalnych poziomów ekspresji genów.
Cel badania
- Opracowanie narzędzia genetycznego do kontrolowanego badania pomp efflux.
- Ominięcie mechanizmów regulacyjnych, które utrudniają badanie funkcji genów.
- Naśladowanie naturalnych poziomów ekspresji genów pomp efflux.
Zastosowane metody
- System ekspresyjny oparty na Mini-Tn7 do komplementacji genów.
- Inżynieria szczepu Acinetobacter baumannii z deficytem pompy efflux.
- Techniki kontrolowanej ekspresji genów.
- Charakterystyka aktywności pomp efflux.
Główne wyniki
- Skuteczna integracja genu pompy efflux do chromosomu bakteryjnego.
- Wykazanie kontrolowanej ekspresji genu w zmodyfikowanym szczepie.
- Umożliwienie charakterystyki roli pompy efflux w oporności na leki.
- Dostarczenie wiedzy na temat naturalnych funkcji systemów efflux.
Wnioski
- System mini-Tn7 jest skutecznym narzędziem do badania pomp effluxowych.
- Kontrolowana ekspresja genów zwiększa zrozumienie oporności wielolekowej.
- Podejście to może pomóc w identyfikacji nowych celów terapeutycznych przeciwko opornym patogenom.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wielolekowość oparta na mechanizmach effluxu u Acinetobacter baumannii stanowi krytyczną barierę dla rozwoju antybiotyków i interwencji klinicznych. Opisany system ekspresji pojedynczej kopii genu w szczepie z deficytem effluxu umożliwia precyzyjne badanie funkcjonalne pomp effluxu, co bezpośrednio przekłada się na walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Podejście to wspiera decyzje dotyczące portfela projektów poprzez wyjaśnienie roli pomp effluxu w oporności oraz umożliwienie rzetelnej oceny inhibitorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcjonalną genów pomp efuksu przy poziomach ekspresji zbliżonych do naturalnych.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolację aktywności pomp efuksu od zakłócających systemów tła.
- Ułatwia walidację celów dla inhibitorów pomp efuksu poprzez zapewnienie genetycznie kontrolowanego systemu.
- Zwiększa pewność predykcyjną w odniesieniu do mechanizmów oporności związanych z efuksem w celu triażu portfolio.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia standaryzowany system bakteryjny do powtarzalnego screeningu inhibitorów pomp effluxowych.
- Umożliwia ilościową ocenę aktywności effluxu oraz siły działania inhibitorów w kontrolowanym kontekście genetycznym.
- Wspiera opracowywanie testów poprzez minimalizację interferencji tła pochodzącej z endogennych systemów effluxu.
- Ułatwia skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy do oceny związków ukierunkowanych na mechanizmy effluxu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami translacyjnymi w zakresie biomarkerów poprzez wyjaśnienie roli pomp effluksu w fenotypach oporności.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia do przedklinicznej walidacji terapii ukierunkowanych na hamowanie effluksu.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów z uwzględnieniem analizy ryzyka, dostarczając dowodów mechanistycznych na hamowanie effluksu.
- Wzmacnia predykcyjną redukcję ryzyka podczas wyboru kandydatów w późnych fazach rozwoju.
Integracja potoku i przepływu pracy
System ten integruje proces odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, poprzez opracowanie testów, aż po przedkliniczną ocenę inhibitorów pomp effluksu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji pomp efflux oraz mechanizmów oporności.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny inhibitorów w zdefiniowanym genetycznie systemie.
- Analityka: Umożliwia pomiar aktywności efflux oraz statystyczne porównanie efektów działania inhibitorów.
- Badania translacyjne: Zapewnia powiązanie mechanistyczne między inhibicją efflux a fenotypami oporności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do bieżących badań nad pompami efflux i inhibitorami.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad pompami effluxowymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje tła genetyczne i warunki testowe w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie ryzyka związanego z effluxem.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów ukierunkowanych na efflux oraz awans kandydatów z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie genetyki bakteryjnej i inżynierii chromosomowej.
- Wymaga dostępu do sprzętu do elektroporacji oraz infrastruktury biologii molekularnej.
- Wymaga standaryzacji konstruktów genetycznych i protokołów analiz pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji do zastosowania w innych gatunkach bakterii lub systemach effluksu.
- Zależne od dostępności szczepów z deficytem effluksu oraz zwalidowanych wektorów ekspresyjnych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:45
Preparation of Electrocompetent Cells to Achieve Single‐Copy Gene Expression in an Efflux‐Deficient Bacterial Strain
2:01
Electroporation Procedure for the Single‐Copy Gene Expression in an Efflux‐Deficient Bacterial Strain
