Name: Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Poznaj metodę rozwarstwienia i analizy mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej przy użyciu mikroskopu i barwienia H&E. Protokół ten umożliwia precyzyjną ekstrakcję i badanie ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez NIDDK NIH pod numerem nagrody R01DK116899, USDA/ARS pod numerem nagrody 3092-51000-064-000D, oraz nagrodę pilotażową od Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. Schematy blokowe zostały wykonane przy użyciu BioRender.

Procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Baylor College of Medicine. Wszystkie zabiegi wykonano na samcach myszy C57BL/6J w wieku 3 tygodni i 3 miesięcy. Przed sekcją wszystkie myszy zostały poddane eutanazji przy użyciu zatwierdzonej procedury eutanazji dwutlenku węgla u gryzoni. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Analiza scBAT
<ol>
	<li>Umieść tuszę myszy na stole warsztatowym i wyczyść nożyczki chirurgiczne i bardzo drobne kleszcze punktowe 70% etanolem.</li>
	<li>Spryskaj brzuszną szyję myszy 70% etanolem, aby zwilżyć futro i zminimalizować zanieczyszczenie sierści.</li>
	<li>Wykonaj obustronne nacięcie, około 1,5 cm, wzdłuż obojczyków.</li>
	<li>Od końców poprzedniego nacięcia odetnij wzdłużnie w kierunku uszu, o długości około 1 cm. Spowoduje to utworzenie kwadratowego nacięcia w kształcie litery U wokół szyi (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B). 
	UWAGA: scBAT leży w warstwie pośredniej szyjki. Na tym etapie odsłaniana jest warstwa powierzchowna, składająca się ze skóry, podskórnej tkanki tłuszczowej i gruczołów ślinowych. Warstwa pośrednia, wraz z scBAT, zawiera żyły szyjne i mięśnie szyi. Głęboka warstwa szyi, zawierająca głębokie BAT szyi oraz żyły tętnicze i szyjne, jest odsłaniana poprzez usunięcie mięśni szkieletowych.</li>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym i ustaw ostrość na odsłoniętej szyjce (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: Ten dodatkowy krok znacznie zwiększa precyzję pobierania tkanek, co jest konieczne, biorąc pod uwagę niewielki rozmiar scBAT.</li>
	<li>Całkowicie odsłoń gruczoły ślinowe, odsuwając nacięte odcinki skóry kleszczami.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy odłącz tkankę łączącą gruczoły ślinowe z tkanką wokół obojczyków i ze sobą.</li>
	<li>Odsłoń magazyny scBAT, podnosząc gruczoły ślinowe. Poszukaj BAT wzdłuż zewnętrznej żyły szyjnej i ewentualnie połączonej ze spodem gruczołów ślinowych. Rozpoznaj go po pomarańczowym kolorze, który wyróżnia się na tle otaczającej tkanki.</li>
	<li>Przytrzymuj docelową tkankę tłuszczową kleszczami i delikatnie oderwij ją od gruczołów ślinowych.</li>
	<li>Po odłączeniu od gruczołów ślinowych należy kontynuować odłączanie scBAT od zewnętrznej żyły szyjnej i mięśni szyi, aż do momentu, gdy zajezdni po obu stronach szyi będą mogły zostać usunięte w całości.</li>
	<li>Sprawdź każdą wypreparowaną próbkę scBAT pod mikroskopem preparacyjnym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D, E), używając kleszczy do usunięcia pozostałej tkanki łącznej.</li>
	<li>Umieścić każdą próbkę w szklanej fiolce scyntylacyjnej zawierającej 10 ml buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS) i wyjąć mysz spod mikroskopu.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie i barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) scBAT (zilustrowane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A)
<ol>
	<li>Zastąp PBS (krok 1.12) 10 ml zimnego 4% paraformaldehydu (PFA) i umieść fiolkę na nutatorze, kołysząc się w temperaturze 4 °C przez noc, aby zamocować scBAT. 
	UWAGA: Utrwalanie perfuzji może być stosowane u myszy po urodzeniu, zwłaszcza dorosłych, gdy potrzebne jest dalsze przetwarzanie do analizy immunohistochemicznej.</li>
	<li>Następnego dnia usuń roztwór PFA z fiolki za pomocą sterylnej pipety transferowej i zastąp go 10-15 ml PBS. Umieścić fiolkę na nutatorze i rozdrabniać przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp PBS 0,85% roztworem soli fizjologicznej i kontynuuj kołysanie przez kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Roztwór soli zawiera 0,85% soli fizjologicznej (NaCl) w/v w wodzie uzdatnionej DEPC (bez RNaz). PBS można zastąpić roztworem soli w tym i następnym kroku.</li>
	<li>Usunąć 0,85% soli fizjologicznej za pomocą pipety transferowej i dodać 10 ml 70% roztworu etanolu/0,85% soli fizjologicznej do fiolki. Przechowywać fiolkę w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc lub do momentu, gdy będzie gotowa do zatopienia w parafinie. 
	UWAGA: PBS można stosować, jeśli 0,85% soli fizjologicznej nie jest dostępne. scBAT powinien być przetwarzany tak szybko, jak to możliwe, aby ułatwić cięcie i lepiej zachowaną morfologię tkanki.</li>
	<li>Przed zatopieniem parafiny należy odwodnić scBAT poprzez serię wymian etanolu w celu usunięcia wody z tkanki.
	<ol>
		<li>Na początek usuń 70% etanolu/0,85% soli fizjologicznej z fiolki za pomocą pipety transferowej i dodaj 10-15 ml 95% alkoholu odwadniającego, kołysząc fiolkę na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Powtórz ten krok jeden raz. 
		UWAGA: Etanol może być stosowany zamiast roztworów alkoholu odwadniającego.</li>
		<li>Następnie zastąp 95% Dehydrant Alcohol 10-15 ml 100% Dehydrant Alcohol i kontynuuj kołysanie na nutatorze przez 1 godzinę. Napełnij nowym 100% Dehydrant Alcohol i kontynuuj kołysanie przez kilka godzin lub przez noc, w zależności od ilości scBAT w fiolce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby usunąć scBAT do zatopienia, dodaj 10 ml toluenu do fiolki i kontynuuj kołysanie na nutatorze, aż scBAT stanie się przezroczysty, około 6-8 godz. 
	UWAGA: Czas niezbędny do uzyskania zadowalającego oczyszczenia zależy od wielkości scBAT. Zaleca się rozpoczęcie oczyszczania natychmiast rano, aby infiltracja i osadzanie mogły nastąpić po południu.</li>
	<li>Aby zatopić scBAT w wosku parafinowym, usuń toluen i dodaj 10 ml stopionego naciekającego wosku parafinowego do fiolki. Umieścić fiolkę w suszarce nagrzanej do 65 °C na 1 godzinę. Powtórz ten krok z nowym woskiem. 
	UWAGA: Rozpocznij topienie granulek wosku w piekarniku przez noc przed rozpoczęciem osadzania, aby upewnić się, że wosk jest w pełni płynny.</li>
	<li>Zastąp naciekający wosk parafinowy zatopionym woskiem parafinowym i umieść fiolkę w tej samej temperaturze na 1 godzinę. Powtórz ten krok raz. 
	UWAGA: Etap infiltracji może zostać przerwany i kontynuowany później. Wyjąć fiolkę z piekarnika i przechowywać ją w temperaturze pokojowej do momentu, gdy będzie gotowa do kontynuowania.</li>
	<li>Osadź tkankę, umieszczając ją najpierw w formie do zatapiania tkanek, dodaj stopiony wosk do zatapiania do formy i zmień orientację tkanki pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie umieść kasetę do osadzania na wosku i kontynuuj wylewanie wosku na wierzch, aż będzie pełna, a nasadka do osadzania zostanie przymocowana do bloku wosku. Przenieś blok do lodówki o temperaturze 4 °C na noc, aby wosk sztywniał i skurczył się przed wyjęciem metalowej formy.</li>
	<li>Pokrój scBAT za pomocą mikrotomu na grubość 5-6 μm18, trzy do czterech sekcji na szkiełko mikroskopowe i umieść w ciepłej kąpieli flotacyjnej sekcji parafinowej w temperaturze ~42 °C, aby umożliwić wygładzenie skrawków tkanki.</li>
	<li>Przenieś sekcje na szkiełka i umieść je pionowo na kąpieli pływackiej, aby woda mogła spływać po szkiełkach.</li>
	<li>Przenieś szkiełka na stojak do barwienia ze stali nierdzewnej i umieść ruszt na stole do suszenia szkiełek do wyschnięcia przez noc. 
	UWAGA: Szkiełka parafinowe mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze pokojowej przed dalszą obróbką.</li>
	<li>Wykonaj barwienie H&E 19. Na początek umieść szkiełka w stojaku do barwienia, a następnie umieść stojak w słoiku do barwienia z ksylenem na 40 s. Powtórz ten krok raz. 
	UWAGA: Jeśli po dwóch etapach parafina jest nadal widoczna, poczekaj, aż całkowicie się rozpuści, zanim przejdziesz dalej.</li>
	<li>Aby ponownie nawodnić tkankę, umieść stojak na szkiełka w słoiku do barwienia wypełnionym 100% alkoholem odwadniającym przez dwa 20 s etapy, następnie 15 s etap w 95% odwadniaczu i końcowe 15 s płukanie w ddH2O.</li>
	<li>Umieść szkiełka w naczyniu barwiącym wypełnionym roztworem hematoksyliny na 75 s, aby uzyskać barwienie jądrowe, a następnie przepłucz szkiełka w naczyniu barwiącym z ddH2O przez 45 s. 
	UWAGA: Czas można dostosować w zależności od pożądanego koloru bejcy.</li>
	<li>Różnicować barwienie, zanurzając szkiełka w naczyniu barwiącym wypełnionym roztworem HCl-etanolu na 15 s, a następnie przenieść szkiełka do innego płukania ddH2O przez 15 s. 
	UWAGA: Roztwór HCl-etanolu jest przygotowywany zgodnie z opublikowaną metodą19.</li>
	<li>W przypadku barwienia cytoplazmatycznego umieść szkiełko w roztworze przeciwbarwnikowym Eozyny Y na 15 sekund.</li>
	<li>Odwodnić tkankę, zanurzając szkiełka na 15 s każdy w trzech sekwencyjnych etapach roztworu 95% dehydratantu, a następnie dwóch sekwencyjnych kąpieli w 100% odwadniającym alkoholu - pierwsza przez 15 s, a druga przez 45 s - aby zakończyć odwodnienie.</li>
	<li>Na koniec przenieś szkiełka do kąpieli ksylenowej na 45 sekund, aby ponownie zaaklimatyzować tkankę do rozpuszczalników organicznych. Po tym kroku barwienie jest zakończone; Usuń tkankę z roztworu.</li>
	<li>Nałóż medium montażowe na każde szkiełko i nakryj je w dygestoriach chemicznych. Suszyć przez noc przed obrazowaniem. Wyniki obrazowania są pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2B.</li>
</ol>
3. Analiza ekspresji genów scBAT
<ol>
	<li>Pobieranie tkanek (mielenie)
	<ol>
		<li>Po wypreparowaniu scBAT, natychmiast umieść tkankę w probówce do mikrowirówki, przebij otwór w górnej części probówki sterylną igłą i zamroź w ciekłym azocie. 
		UWAGA: Główne kroki opisanego tutaj protokołu są zilustrowane na Rysunek 3A. Zrobienie otworu w górnej części rurki przed wrzuceniem jej do ciekłego azotu zapobiega pękaniu rurki z powodu nagłej zmiany ciśnienia.</li>
		<li>Napełnij plastikową zlewkę ciekłym azotem i pozostaw tłuczek i cienką szpatułkę do namoczenia. 
		UWAGA: Ważne jest, aby podczas całego zabiegu utrzymywać temperaturę wszystkich narzędzi i próbek tkanek tak niską, jak to możliwe, zbliżoną do temperatury ciekłego azotu, aby zapobiec rozmrażaniu tkanki. Rozmrożona tkanka tłuszczowa jest bardzo przylegająca i sprawia, że pudrowanie jest trudniejsze. Narzędzia i sample należy usuwać wyłącznie z kąpieli ciekłego azotu bezpośrednio przed użyciem.</li>
		<li>Pobieraj po jednej zamrożonej próbce tkanki na raz i wlewaj ją z probówki mikrowirówkowej do moździerza.</li>
		<li>Dodaj niewielką ilość ciekłego azotu do moździerza, a następnie za pomocą tłuczka zmielić zamrożoną tkankę, aż zostanie całkowicie sproszkowana. 
		UWAGA: Jeśli w dowolnym momencie tkanka zacznie stawać się miękka lub lepka, oznacza to, że topi się; Wlej więcej ciekłego azotu do zaprawy.</li>
		<li>Za pomocą cienkiej szpatułki ostrożnie zeskrob i przenieś sproszkowaną tkankę z powrotem do probówki mikrowirówkowej. Wlej ciekły azot do moździerza podczas skrobania, aby zebrać resztki tkanki przed przeniesieniem szpatułką. Powtarzaj etapy przenoszenia, aż cała tkanka zostanie usunięta z moździerza.</li>
		<li>Oczyść moździerz za pomocą lekkiej wycieraczki do tkanek i 70% etanolu przed wrzuceniem następnej próbki do zmielenia. Sproszkowaną chusteczkę należy przechowywać przez długi czas w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Całkowita izolacja RNA
	<ol>
		<li>preparat
		<ol>
			<li>Wyczyść stół warsztatowy, pipety, uchwyty końcówek i stojaki na probówki zarówno 70% etanolem, jak i odkażaniem powierzchni, aby usunąć RNazę.</li>
			<li>Uruchomić wirówkę, aby osiągnąć temperaturę 4 °C.</li>
			<li>Podgrzać roztwór elucji do temperatury 70 °C.</li>
			<li>Rozcieńczyć DNazę I, mieszając 5 μl odtworzonej DNazy I z 75 μl roztworu rozcieńczającego DNazę na próbkę. Umieścić roztwór DNazy I na lodzie do czasu użycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>procedura
		<ol>
			<li>Dla każdej próbki oznaczyć dwie probówki do mikrowirówek, dwie probówki przytrzymujące kolumnę (dwie probówki do mikrowirówek z podziałką bez nasadki) i jedną mini kolumnę wiążącą.</li>
			<li>Dodać 500 μl roztworu izolacyjnego RNA do każdej próbki i sonikować za pomocą silnika do peletów przez 30 s.</li>
			<li>Weź strzykawkę do każdej próbki i pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby dalej lizować tkankę. Upewnić się, że po wstrzyknięciu nie są widoczne żadne ciała stałe.</li>
			<li>Od czasu do czasu dodawać 250 μl chloroformu i wirować, czekając 5 minut na inkubację próbek w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Wirować przy 21 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Przenieś górną część wody do nowej probówki do mikrowirówki i dodaj równoważną ilość 70% etanolu (~500 μL). 
			UWAGA: Górna część wodna powinna być przezroczysta, dolna powinna być czerwonym roztworem izolacyjnym RNA, a pomiędzy dwiema warstwami powinny znajdować się niepożądane ciała stałe.</li>
			<li>Przenieść 500 μl nowego lizatu do kolumny wiążącej. Wirować przy 18 000 × g przez 60 s, a następnie wyrzucić filtrat.</li>
			<li>Powtórz poprzedni krok z pozostałym lizatem, aby wprowadzić cały RNA do kolumny wiążącej.</li>
			<li>Dodać 700 μl przemywania o niskiej rygorystyczności do kolumny wiążącej, odwirować przez 30 s i wyrzucić filtrat.</li>
			<li>Dodać 80 μl rozcieńczonej DNazy I do każdej kolumny wiążącej. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Dodać 700 μl płukania o wysokiej rygorystyczności, odwirować przez 30 s i wyrzucić filtrat.</li>
			<li>Dodać 700 μl płukania o niskiej rygorystyczności, odwirować przez 60 s i wyrzucić filtrat.</li>
			<li>Przenieś kolumny wiążące do drugiej nowej rurki przytrzymującej kolumnę bez nasadki i wiruj przez 2 minuty, aby upewnić się, że wszystkie płyny zostały usunięte z kolumny wiążącej.</li>
			<li>Przenieść kolumny wiążące do nowej probówki do mikrowirówki i dodać 30 μl podgrzanego roztworu elucyjnego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
			<li>Wirować przez 2 minuty, aby zebrać eluowany RNA na dnie probówki do mikrowirówki.</li>
			<li>Zmierz całkowite stężenie RNA za pomocą spektrofotometru. 
			UWAGA: Jeżeli całkowita czystość RNA jest niska, na co wskazuje wartość 260/280 poniżej 2,0 lub wartość 260/230 poniżej 1,8, to po kroku 3.2.2.12 próbki można ponownie przemyć myciem o niskiej rygorystyczności, a następnie przemyć 80% etanolem przed kontynuowaniem kroku 3.2.2.13.</li>
			<li>Przechowywać RNA w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odwrotna transkrypcja (RT)
		<ol>
			<li>W pasku probówki do PCR dodaj 0,5-1 μg całkowitego RNA rozcieńczonego w wodzie uzdatnionej DEPC, co daje łącznie 8 μl dla każdej próbki RNA do innego dołka. 
			UWAGA: Ilość RNA używanego do odwrotnej transkrypcji może być skalowana w górę lub w dół zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
			<li>Dodać 1 μl oligo dT i 1 μl dNTP do każdej próbki w probówce PCR. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 10 μl na próbkę.</li>
			<li>Umieść pasek probówki PCR w termocyklerze i ustaw go na 65 °C na 5 minut, a następnie 4 °C na czas nieokreślony.</li>
			<li>Po 5 minutach w temperaturze 65 °C wyjąć pasek probówki do PCR i umieścić probówkę na lodzie na co najmniej 2 minuty. Po inkubacji na lodzie dodać pięć odczynników: 4 μL 5x buforu pierwszej nici, 2 μL 25 mM MgCl2, 2 μL 0,1 M DTT, 1 μL inhibitora RNazy i 1 μL odwrotnej transkryptazy do każdej próbki. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi teraz 20 μl na próbkę.</li>
			<li>Umieść pasek probówki PCR z powrotem w termocyklerze i ustaw program na 50 °C na 50 minut, następnie 85 °C na 5 minut, a następnie 4 °C w nieskończoność.</li>
			<li>Gdy program osiągnie temperaturę 4 °C, wyjąć pasek i dodać 1 μl rybonukleazy H (RNazy H). 
			UWAGA: RNaza H służy do usuwania pozostałej matrycy RNA w reakcji RT; na tym etapie pożądane RNA powinno być już przekształcone w cDNA.</li>
			<li>Umieść pasek z powrotem w termocyklerze i uruchom w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie 4 °C w nieskończoność.</li>
			<li>Odwrotna transkrypcja jest zakończona; zmierz stężenie cDNA za pomocą spektrofotometru.</li>
			<li>Rozcieńczyć cDNA do 250 ng/μl; przechowywać cDNA w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ilościowy PCR (qPCR)
		<ol>
			<li>Sporządź arkusz kalkulacyjny, aby uporządkować położenie każdego startera i próbki na 96-dołkowej płytce qPCR. 
			UWAGA: Jeden ze starterów musi być genem referencyjnym, aby znormalizować ekspresję wszystkich innych interesujących genów, takich jak 36B4.</li>
			<li>Przygotuj główną mieszankę podkładu dla każdej kombinacji "podkład + próbka". Do każdej studzienki reakcji qPCR dodaj 3 μl wody klasy biologii molekularnej, 5 μl mieszaniny głównej enzymu qPCR, 0,5 μl startera do przodu i 0,5 μl startera odwrotnego, co daje 9 μl na reakcję. Dodaj 1 μl cDNA na reakcję, aby uzyskać w sumie 10 μl na dołek reakcji. 
			UWAGA: Standardem jest posiadanie trzech kontrprób technicznych dla każdej kombinacji "starter + próbka", więc każda mieszanka wzorcowa powinna być 4 razy większa od powyższych ilości.</li>
			<li>Dodać 1 μl cDNA dla każdej kontrpróby do każdej głównej mieszaniny starterów. Jeśli każda mieszanka główna ma wielkość 4x, odpipetuj 4 μl każdej próbki cDNA do ich własnej znakowanej probówki.</li>
			<li>Na koniec odpipetować 10 μl każdej mieszaniny reakcyjnej do 96-dołkowej płytki qPCR w pozycjach określonych przez arkusz kalkulacyjny.</li>
			<li>Uszczelnić płytkę grubym klejem, a następnie odwirować 96-dołkową płytkę w temperaturze 450 × g w temperaturze 20 °C przez 2 min. 
			UWAGA: Bardzo ważne jest, aby płyta była w pełni uszczelniona, aby uniknąć parowania próbek podczas termocyklingu. Użyj lekkich wycieraczek do chusteczek, aby docisnąć uszczelkę do płytki, zwłaszcza do krawędzi.</li>
			<li>Uruchom płytkę w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym. Zaprogramuj reakcję PCR zgodnie z instrukcjami producenta: 2 minuty w 50 °C, następnie kolejne 2 minuty w 95 °C, a na końcu 40 cykli po 15 s w 95 °C i 30 s w 60 °C. Wyniki analizy ekspresji genów qPCR przedstawiono w <silna klasa="xfig">Rysunek 3B.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Morphological and Molecular Characterization of the scBAT in Mice

<ol><li>Boutari, C., Mantzoros, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2022+update+on+the+epidemiology+of+obesity+and+a+call+to+action%3A+as+its+twin+COVID-19+pandemic+appears+to+be+receding%2C+the+obesity+and+dysmetabolism+pandemic+continues+to+rage+on%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on.</a> Metabolism. 133, 155217(2022).</li>
<li>Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+obesity+and+severe+obesity+among+adults%3A+United+States%2C+2017-2018%5BTitle%5D)+AND+%22NCHS+Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018.</a> NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).</li>
<li>Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+origins+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The developmental origins of adipose tissue.</a> Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).</li>
<li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brown+and+beige+fat+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of brown and beige fat development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).</li>
<li>Maliszewska, K., Kretowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+and+its+role+in+insulin+and+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 1530(2021).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+localization%2C+gene+expression+profiling+and+functional+characterization+of+adult+human+neck+brown+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat.</a> Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).</li>
<li>Leitner, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+human+brown+adipose+tissue+in+lean+and+obese+young+men%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).</li>
<li>Mo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+supraclavicular+brown+adipose+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice.</a> JCI Insight. 2 (11), e93166(2017).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Analysis+of+Environmental+Temperature+and+High-Fat+Diet-Induced+Changes+in+Mouse+Supraclavicular+Brown+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue.</a> Cells. 10 (6), 1370(2021).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li>
<li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).</li>
<li>de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stringent+validation+of+mouse+adipose+tissue+identity+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+differentiate+into+brown+adipocytes+and+contribute+to+periaortic+arch+adipose+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+mammary+gland+whole+mounts+for+lesion+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification.</a> J Vis Exp. (125), e55796(2017).</li>
<li>Berry, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging of adipose tissue.</a> Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym protokole szczegółowo przedstawiamy procedury preparacji i przetwarzania scBAT do analiz H&E i ekspresji genów. Ponieważ scBAT znajduje się w warstwie pośredniej szyjki i leży wzdłuż dużych żył, izolacja tego magazynu wymaga precyzyjnej techniki. W szczególności, aby uzyskać wyraźny widok na magazyn, zalecamy umieszczenie myszy pod mikroskopem preparacyjnym po otwarciu szyi. Używając pary bardzo cienkich kleszczyków punktowych do odklejania scBAT z gruczołu ślinowego i otaczających żył, należy zachować ostrożność, aby uniknąć przebicia żył. Nadmierne krwawienie może utrudnić zlokalizowanie scBAT. Aby przetworzyć scBAT do barwienia H&E, dostosowaliśmy użycie opublikowanego protokołu19 z niewielkimi modyfikacjami, aby uwzględnić użycie 4% PFA, alkoholi odwadniających i rozpuszczalnika organicznego, toluenu, do przetwarzania tkanek, jak pokazano w sekcji protokołu. Cała procedura trwa ~6 dni, a szkiełka barwione H&E można obrazować następnego dnia po zakończeniu barwienia.
RT-qPCR z wykorzystaniem RNA jako materiału wyjściowego jest najczęściej stosowaną metodą analizy ekspresji genów w dziedzinie biologii tkanki tłuszczowej. Ponieważ scBAT jest stosunkowo małym magazynem BAT w porównaniu z iBAT, uzyskanie wystarczającej ilości RNA do ekspresji genów może być trudne. Aby zwiększyć wydajność RNA, zalecamy stosowanie sekwencyjnych etapów przygotowania lizatu, jak opisano w sekcji protokołu, zaczynając od sproszkowania tkanki za pomocą tłuczka i moździerza podczas zamrażania. Stosując tę metodę przygotowania lizatu, udało nam się uzyskać wysokowydajną i wysokiej jakości próbkę RNA do analizy ekspresji genów scBAT od jednej dorosłej myszy. Ta metoda przygotowania lizatu może być również stosowana do otrzymywania wysokiej jakości lizatów białkowych z scBAT do western blotting z wykorzystaniem buforu do lizy białek.
Korzystając z mysiego iBAT, naukowcy zdobyli istotną wiedzę na temat funkcji BAT w termogenezie i metabolizmie. Niedawna identyfikacja kilku wcześniej nierozpoznanych magazynów BAT u myszy i ludzi, w tym scBAT, ujawniła potrzebę dalszych badań, zanim będziemy mogli w pełni zrozumieć fizjologiczny wkład BAT u myszy i dorosłych ludzi. W szczególności uzasadnione są badania rzucające światło na pochodzenie, funkcje i udział tych nowo odkrytych magazynów BAT w termogenezie i metabolizmie regionalnym lub metabolizmie całego organizmu.

Rosnące rozpowszechnienie otyłości w Stanach Zjednoczonych i na całym świecie wzbudziło duże zainteresowanie zrozumieniem jej etiologii i identyfikacją potencjalnych metod leczenia1,2. Tkanka tłuszczowa odgrywa istotną rolę w metabolizmie, a rozregulowanie tkanki tłuszczowej może prowadzić do rozwoju otyłości. Generalnie wyróżnia się dwa rodzaje tkanki tłuszczowej, białą i brunatną tkankę tłuszczową. Podczas gdy biała tkanka tłuszczowa (WAT) może magazynować energię chemiczną i wydzielać czynniki endokrynne, brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) może wykorzystywać energię chemiczną do generowania ciepła i utrzymywania temperatury ciała w niskich temperaturach3,4. Ze względu na tę unikalną zdolność, aktywacja BAT może również zwiększyć wydatek energetyczny i poprawić wrażliwość na insulinę5.
BAT pełni swoją funkcję poprzez termogenezę bez dreszczy, proces, w którym pośredniczy rozprzęganie białka 1 (UCP1)6. Ssaki, w tym myszy i ludzie, posiadają różne ilości BAT. Klasyczny pogląd BAT jest taki, że te tkanki tłuszczowe występują w większej obfitości u myszy i niemowląt niż u dorosłych ludzi. iBAT, zlokalizowany w górnej części grzbietu między łopatkami, jest najlepiej zbadanym magazynem BAT u myszy. Stosując obrazowanie radioizotopowe i biopsje, ostatnie badania pozwoliły zidentyfikować kilka składów BAT u dorosłych ludzi. Niektóre z nich, w tym magazyny znalezione w głębokiej okolicy szyi i nadobojczykowej, nie zostały wcześniej zidentyfikowane u myszy lub innych zwierząt modelowych7,8,9,10,11. Spośród tych składów BAT, scBAT jest najczęściej spotykanym składowiskiem u dorosłych ludzi. Aby lepiej zrozumieć pochodzenie i molekularny wkład tych nowo odkrytych magazynów BAT u ludzi, konieczne jest zidentyfikowanie równoważnych magazynów u myszy, które umożliwiają manipulacje genetyczne i molekularne w celu prześledzenia i przetestowania funkcjonalnej roli tych magazynów. W ten sposób my i inni zidentyfikowaliśmy kilka wcześniej nieznanych magazynów BAT w różnych lokalizacjach anatomicznych u myszy, w tym scBAT12,13, piersiowy okołonaczyniowy BAT14,15, perineral BAT16 i periaorttic BAT17. Mysz scBAT anatomicznie przypomina ludzki scBAT i morfologicznie przypomina klasyczny iBAT, wyrażając wysoki poziom UCP112.
W przeciwieństwie do mysiego iBAT, który można łatwo rozciąć, scBAT znajduje się w warstwie pośredniej szyi myszy, poniżej gruczołów ślinowych i wzdłuż żyły szyjnej zewnętrznej. Odizolowanie tego magazynu do analiz histologicznych i molekularnych może być wyzwaniem. Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę preparowania scBAT od myszy postnatalnych i dorosłych oraz przetwarzania tego magazynu do analizy histologicznej i ekspresji genów.

<table><tbody><tr><td>95% Alkohol do odwadniania (Flex 95)</td><td>Epredia</td><td>8201</td><td></td></tr><tr><td>100% Alkohol do odwadniania (Flex 100)</td><td>Epredia</td><td>8101</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Wiążąca mini kolumna</td><td>Bio-Rad</td><td>7326826</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Mycie o wysokiej rygorystyczności</td><td>Bio-Rad</td><td>7326803</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Mycie o niskiej rygorystyczności</td> Formy bazowe <td>Bio-Rad</td><td>7326804</td><td></td></tr><tr><td>(do zatapiania)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>BD Igła PrecisionGlide 21g x 1 1/2"</td> <td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1840148</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek bez nakrętki 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-453</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 96 Instrument do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>12011319</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>383760010</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 Medium montażowe o niskiej lepkości</td><td>Epredia</td><td>83104</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-Uzdatniona woda</td><td>Ambion</td><td>AM 9906</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td></td><td></td>SMZ1500</tr><tr><td>Roztwór do rozcieńczania DNazy</td><td>Bio-Rad</td><td>7326805</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Bio-Rad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>roztwór elucyjny</td><td>Bio-Rad</td><td>7326801</td><td></td></tr><tr><td>EM 400 zatapianie pożywki parafinowej</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801320</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y (0,5% w/v)</td><td>RICCA</td><td>2858-16</td><td></td></tr><tr><td>Formula R Medium infiltracyjne parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801470</td><td></td></tr><tr><td>Genemark Nutator Gyromixer 349</td><td>Bio Express</td><td>S-3200-2</td><td></td></tr><tr><td>Gill #3 Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>HCl (do HCL-etanolu)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A142212</td><td></td></tr><tr><td>IP VI Kasety do zatapiania</td><td>Leica Biosystems</td><td>39LC-550-L</td><td></td></tr><tr><td>Czysty etanol firmy Koptec - 200 Proof (dla 70% etanolu)</td><td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (25 mM)</td><td>Probówki</td> do mikrowirówek Thermo Fisher <td>Scientific R0971</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml</td><td>Avantor</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki mikrouszczelniające "B" (uszczelki adhseive)</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Biologia molekularna Klasa wody</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (dla 0,85% soli fizjologicznej)</td> <td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>NanoDrop Technologie</td><td>ND-1000 UV/Vis</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Sekcja parafinowa Kąpiel flotacyjna</td><td>Boekel Scientific</td><td>14792V</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pasek rurki PCR</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek firmy Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>Silnik do peletu Tłuczek</td><td>Kimble</td><td>749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Piec próżniowy Precision Model 19&nbsp;</td>Podkład <td>do 51221162</td><td></td> <td>Thermo Fisher Scientific</td> CAT#</tr><tr><td>: 36B4&nbsp; (do przodu) 10 &mu; M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Elementarz: 36B4 (odwrócony) 10 &mu; M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Elementarz: Fabp4 (do przodu) 10 &mu; M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Elementarz: Fabp4 (odwrócony) 10 &mu; M 5' CCA, TCT, AGG, GTT, ATG, ATG, CTC, TTC, A, TC, A, 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Elementarz: Glut 4 (starter do przodu) 10 &mu; M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT CCT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Elementarz: Glut 4 (odwrócony) 10 &mu; M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Elementarz: PPARg (do przodu) 10 &mu; M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Baza danych oligo</td></tr><tr><td>Elementarz: PPARg (rezerwa) 10 &mu; M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Elementarz: Ppargc1a (odwrócony) 10 &mu; M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Elementarz: Ppargc1a(naprzód) 10 &mu; M 5' ACG TCC CTG CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Elementarz: Ucp1 (do przodu) 10 &mu; M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo</td></tr><tr><td>database Primer: Ucp1 (odwrócony) 10 &mu; M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Baza danych Oligo</td></tr><tr><td>Roztwór do izolacji RNA (PureZol)</td><td>Bio-Rad</td><td>7326880</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away (odkażanie powierzchni)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1437535</td><td></td></tr><tr><td>RNaza H</td><td>NEB</td><td>M0297S</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor rnazy (RNaza na zewnątrz)</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka scyntylacyjna (szkło)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72632</td><td></td></tr><tr><td>Ławka do suszenia szkiełek&nbsp;</td><td>Elektrotermiczny (Cole-Parmer)</td><td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>Stojak do barwienia ze stali nierdzewnej</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>70312-54</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy (do zabudowy)</td><td>Nożyczki</td> sugiczne Olympus <td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td></td><td>McKesson</td><td>43-1-104</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne proste Superfine point</td><td>Avantor</td><td>82027-402</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny III Odwrotna transkryptaza (zawiera 5x bufor pierwszej nici i 0,1 M DTT)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka SUR-VET z igłą 25 G x 5/8", 1 ml</td><td>Terumo</td><td>100281</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (główna mieszanina enzymów qPCR)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25778</td><td></td></tr><tr><td>Manualny zestaw do barwienia szkiełek Tissue-Tek (słoiki)</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>SKU: 62540-01</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Fisher Chemical</td><td>T324-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Avantor</td><td>414004-005</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej

Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue

Termogeneza za pośrednictwem brązowej tkanki tłuszczowej (BAT) odgrywa ważną rolę w regulacji metabolizmu, a bodźce środowiskowe u myszy i ludzi mogą mieć duży wpływ na jej morfologię i funkcję. Obecnie mysi BAT międzyłopatkowy (iBAT), który znajduje się między dwiema łopatkami w górnej części grzbietowej boku myszy, jest głównym magazynem BAT wykorzystywanym przez laboratoria badawcze do badania funkcji BAT. Ostatnio u myszy zidentyfikowano kilka nieznanych wcześniej składów BAT, w tym jeden analogiczny do ludzkiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej. W przeciwieństwie do iBAT, mysia brunatna tkanka tłuszczowa nadobojczykowa (scBAT) znajduje się w warstwie pośredniej szyi i dlatego nie jest tak łatwo dostępna.
Aby ułatwić badanie nowo zidentyfikowanych myszy scBAT, poniżej przedstawiono protokół szczegółowo opisujący kroki do wypreparowania nienaruszonego scBAT od myszy po urodzeniu i dorosłych. Ze względu na niewielkie rozmiary scBAT w porównaniu z innymi magazynami tłuszczu, procedury zostały zmodyfikowane i zoptymalizowane specjalnie pod kątem przetwarzania scBAT. Wśród tych modyfikacji jest zastosowanie mikroskopu preparacyjnego podczas pobierania tkanek w celu zwiększenia precyzji i homogenizacji zamrożonych próbek scBAT w celu zwiększenia wydajności późniejszej analizy qPCR. Dzięki tym optymalizacjom można określić identyfikację, wygląd morfologiczny i charakterystykę molekularną scBAT u myszy.

W przeciwieństwie do iBAT, który znajduje się w warstwie podskórnej pleców pomiędzy łopatkami, scBAT zlokalizowany jest w warstwie pośredniej szyi, rozciągając się głęboko pomiędzy warstwami mięśni szkieletowych a gruczołem ślinowym w miarę wzrostu wzdłuż żyły szyjnej zewnętrznej (Rysunek 1A). Disekcja scBAT nie jest tak prosta jak w przypadku iBAT. Przedstawiamy tutaj szczegółową procedurę, zawierającą kluczowe etapy wyizolowania nienaruszonego scBAT od myszy postnatalnych i dorosłych (Rysunek 1B,C). Po otwarciu szyi zgodnie z dostarczonym protokołem, cienką warstwę scBAT można zidentyfikować pod mikroskopem stereotypowym i oddzielić pęsetą od przylegającego gruczołu ślinowego oraz żyły szyjnej zewnętrznej (Rysunek 1D,E). Aby ocenić morfologię zapasu, świeżo wyizolowany scBAT poddano obróbce zgodnie z dostarczoną procedurą przetwarzania w połączeniu z wcześniej opisaną procedurą barwienia H&amp;E19 (Rysunek 2A). Jak pokazano na Rysunku 2B, scBAT posiada struktury tkankowe typowe dla zapasów BAT i składa się z wielu małych, wielopustych adypocytów u zdrowych myszy postnatalnych i dorosłych. W celu oceny poziomów ekspresji genów w scBAT, RNA wyekstrahowano z wyizolowanych zapasów scBAT zgodnie z dostarczonymi procedurami (Rysunek 3A). Następnie poziomy ekspresji genów zainteresowania można ocenić za pomocą standardowych metod RT-qPCR (Rysunek 3A). Jak pokazano na Rysunku 3B, można łatwo określić różnicowe poziomy ekspresji genów zaangażowanych w funkcje scBAT, w tym Pparg, głównego regulatora rozwoju BAT; Fabp4 oraz Glut4, dwóch transporterów składników odżywczych; oraz Ucp1 i Ppargc1a, dwóch genów zaangażowanych w termogenezę. Dla porównania, RNA wyekstrahowano z wyizolowanego iBAT, a ekspresję powyższych genów oceniono również zgodnie z dostarczonymi procedurami (Rysunek 3A). Poziomy ekspresji tych genów są stosunkowo podobne pomiędzy tymi dwoma zapasami (Rysunek 3B).
<img alt="Anatomia szyi myszy i eksperyment; podskórna brunatna tkanka tłuszczowa (scBAT) u 3-miesięcznych myszy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Lokalizacja anatomiczna scBAT i proces jej wyizolowania. (A) Lokalizacja scBAT w warstwie pośredniej szyi. (B) Powierzchniowa warstwa szyi przed i po usunięciu skóry. Pasek skali = 250 μm. Żółte linie przerywane wyznaczają obszar, który powinien zostać odsłonięty po wykonaniu cięcia w kształcie litery U. (C) Obraz tułowia myszy umieszczonego pod mikroskopem sekcyjnym w celu zwiększenia przejrzystości wizualnej podczas preparacji. (D,E) Reprezentatywne obrazy warstwy pośredniej szyi przed i po usunięciu scBAT u myszy w wieku 3 tygodni i 3 miesięcy. Pasek skali = 250 μm. Żółte linie przerywane wyznaczają odsłonięte obustronne depozyty scBAT; n = 2. Skróty: scBAT = nadobojczykowata brunatna tkanka tłuszczowa; sfi = warstwa powierzchniowa; sg = ślinianka; tr = tchawica; jv = zewnętrzna żyła szyjna; sm = mięsień szkieletowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="schemat procesu zatapiania w parafinie i barwienia H&amp;E tkanek scBAT wraz z wynikami powiększenia próbek tkankowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obróbka scBAT do barwienia H&amp;E. (A) Schemat blokowy przedstawiający główne etapy obróbki scBAT do barwienia H&amp;E. Po wycięciu tkanki jest ona kolejno utrwalana, odwadniana, zatapiana, krojona i barwiona. (B) Reprezentatywne obrazy scBAT barwionego H&amp;E u myszy w wieku 3 tygodni i 3 miesięcy; n = 3 dla każdego etapu rozwoju; pasek skali = 250 µm dla obrazów o mniejszym powiększeniu; pasek skali = 50 µm dla obrazów o większym powiększeniu. Skróty: scBAT = nadobojczykowa brunatna tkanka tłuszczowa; PFA = paraformaldehyd; H&amp;E = hematoksylina i eozyna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="rozdrabnianie scBAT i analiza ekspresji genów; przygotowanie tkanki scBAT w LN2, qPCR, wykresy ekspresji mRNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przygotowanie RNA z scBAT do analizy ekspresji genów. (A) Schemat blokowy ilustrujący etapy izolacji RNA i analizy RT-qPCR ekspresji genów w scBAT. Ze względu na niewielki rozmiar i miękką strukturę, błyskawiczne zamrażanie depozytu scBAT i rozdrabnianie go w ciekłym azocie jest kluczowe dla pomyślnej izolacji RNA. (B) Względnia ekspresja genów markerowych, w tym Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 oraz Ppargc1a, w scBAT i iBAT wyizolowanych od samców myszy w wieku 3 miesięcy, n = 5. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. 36B4 posłużył jako gen housekeeping do normalizacji. Skróty: scBAT = nadobojczykowa brunatna tkanka tłuszczowa; RT-qPCR = ilościowa PCR z odwrotną transkrypcją; LN2 = ciekły azot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj oferujemy praktyczną procedurę preparowania i przeprowadzania analiz histologicznych oraz analiz ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej.

Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej

Brown adipose tissue (BAT)-mediated thermogenesis plays an important role in the regulation of metabolism, and its morphology and function can be greatly ...

Nasze laboratorium koncentruje się na ustaleniu brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej lub scBAT jako cennego magazynu do analizy brązowej tkanki tłuszczowej ze względu na jej anatomiczne podobieństwa do ludzkiej brązowej tkanki tłuszczowej. Protokół ten ma na celu zwiększenie dostępności badań scBAT. Ten magazyn może być onieśmielający ze względu na swój mały rozmiar i bliskość dużych żył na szyi, dlatego konieczne jest zapewnienie prostej metody ekstrakcji i przetwarzania scBAT.Nasza metodologia wyróżnia się przede wszystkim zastosowaniem mikroskopu preparacyjnego podczas ekstrakcji scBAT. Zwiększa to precyzję i wydajność ekstrakcji, które mają kluczowe znaczenie podczas pracy z tak małym magazynem tkanek. Po drugie, homogenizowaliśmy zamrożone próbki scBAT przed przeprowadzeniem analizy ekspresji genów, aby zwiększyć wydajność RNA, aby skompensować tak niską ilość dostępnej tkanki.Obecnie koncentrujemy się na zdefiniowaniu linii genetycznej scBAT, identyfikacji sieci transgresyjnych regulujących jego rozwój oraz opracowaniu modelu ex-vivo do badania jego funkcji fizjologicznej u ludzi. Aby rozpocząć, umieść tuszę myszy na stole roboczym. Spryskaj brzuszną szyję myszy 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierści.Wykonaj obustronne nacięcie o długości około 1,5 centymetra wzdłuż obojczyków. Od końców obustronnych nacięć przeciąć około jednego centymetra wzdłuż w kierunku uszu, tworząc kwadratowe nacięcie w kształcie litery U wokół szyi. Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym i ustaw naświetloną szyjkę w ostrości.Za pomocą kleszczy podnieś nacięte odcinki skóry, aby odsłonić gruczoły ślinowe. Teraz za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy odłącz tkankę łączącą gruczoły ślinowe z otaczającym obszarem obojczyka i ze sobą nawzajem. Podnieś gruczoły ślinowe, aby odsłonić brunatną tkankę tłuszczową nadobojczykową lub magazyny scBAT.BAT należy obserwować wzdłuż żyły szyjnej zewnętrznej, która może być połączona ze spodem gruczołów ślinowych. Przytrzymuj docelową tkankę tłuszczową kleszczami i delikatnie oderwij ją od gruczołów ślinowych. Po usunięciu tkanki tłuszczowej kontynuuj odłączanie scBAT od żyły szyjnej zewnętrznej i mięśni szyi, aż do całkowitego usunięcia zajezdni po obu stronach szyi.Sprawdź wypreparowaną próbkę scBAT i użyj kleszczy, aby usunąć pozostałą tkankę łączną. Rozpocznij od umieszczenia na stole warsztatowym szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej scBAT myszy w PBS. Zastąp PBS 10 mililitrami zimnego, 4% paraformaldehydu.Umieść fiolkę na nutaterze, kołysząc się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby zamocować scBAT. Następnego dnia zastąp roztwór paraformaldehydu 10 do 15 mililitrami PBS. Umieścić fiolkę na nutaterze i kołysać przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Zastąp PBS 0,85% soli fizjologicznej i kontynuuj kołysanie przez kolejne 30 minut. Następnie zastąp sól fizjologiczną 10 mililitrami 70% etanolu, 0,85% roztworu soli fizjologicznej. Przechowywać fiolkę w lodówce o temperaturze czterech stopni przez noc lub do momentu, gdy będzie gotowa do spożycia parafiny i ściółki.Następnego dnia usuń 70% mieszaninę soli fizjologicznej etanolu z fiolki i dodaj 10 do 15 mililitrów 95% alkoholu odwadniającego. Kołysz fiolką na nutaterze w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po drugim praniu dodaj od 10 do 15 mililitrów 100% alkoholu odwadniającego i kontynuuj kołysanie na nutaterze przez godzinę.Aby usunąć scBAT do zatopienia, dodaj 10 mililitrów toluenu do fiolki i kontynuuj kołysanie na nutaterze, aż scBAT stanie się przezroczysty. Następnie zanurz scBAT w wosku parafinowym. Przeciąć scBAT za pomocą mikrotomu i przystąpić do barwienia hematoksyliną i eozyną.Barwienie hematoksyliną i eozyną potwierdziło, że scBAT obejmuje struktury tkankowe charakterystyczne dla brunatnej tkanki tłuszczowej, w tym liczne małe adipocyty wielomiejscowe zarówno u myszy po urodzeniu, jak i u dorosłych. Po wypreparowaniu scBAT od uśpionej myszy należy natychmiast umieścić tkankę w probówce mikrowirówkowej. Zrób otwór w górnej części probówki sterylną igłą i zatrzaskowo zamroź w ciekłym azocie.Namocz tłuczek i cienką szpatułkę w ciekłym azocie. Wlać zatrzaskowo zamrożoną próbkę tkanki z probówki mikrowirówki do moździerza. Dodaj niewielką ilość ciekłego azotu do moździerza i dokładnie zmiel tkankę tłuczkiem, aż do całkowitego sproszkowania.Użyj cienkiej szpatułki, aby zeskrobać i przenieść sproszkowaną tkankę z powrotem do probówki mikrowirówkowej. Po przeniesieniu całej tkanki dodaj 500 mikrolitrów roztworu izolacyjnego RNA do probówki i sonikuj przez 30 sekund za pomocą silnika Pellet tłuczek. Następnie użyj strzykawki do pipetowania w górę i w dół 10 razy, aby jeszcze bardziej zlizować tkankę, upewniając się, że nie są widoczne żadne cząstki stałe.Dodaj 250 mikrolitrów chloroformu i od czasu do czasu wiruj podczas pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Odwirować próbki w temperaturze 21 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś górną warstwę wodną do nowej probówki i dodaj równoważną ilość 70% etanolu.Przenieść 500 mikrolitrów lizatu do kolumny wiążącej. Odwirować przy 18 000 G przez 60 sekund i wyrzucić filtrat. W przypadku odwrotnej transkrypcji dodaj 0,5 do jednego mikrograma RNA rozcieńczonego w wodzie uzdatnionej DEPC do paska probówki PCR.Następnie rozcieńczyć CDNA do 250 nanogramów na mikrolitr za pomocą wody uzdatnionej DEPC i ustawić ilościowy PCR. Poziomy ekspresji genów markerowych zaangażowanych w pośredniczenie w funkcji scBAT były stosunkowo podobne między scBAT a międzyłopatkowym BAT.

dissection-histological-processing-gene-expression-analysis-murine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokazujemy procedurę chirurgiczną polegającą na izolowaniu podskórnej białej tkanki tłuszczowej i brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami od nowonarodzonej myszy.

Kolekcja White and Brown Adipose Depot od Mouse Pup: procedura chirurgiczna mająca na celu zebranie białej tkanki tłuszczowej i brązowej tkanki tłuszczowej od szczeniaka myszy

Ze względu na drastyczny i negatywny związek między otyłością a innymi chorobami współistniejącymi, uzasadnione są badania nad rolą tłuszczu w chorobach i ogólnym zdrowiu. Przedstawiamy protokół izolacji i wycinania magazynów tłuszczowych pozwalający na badanie tkanki tłuszczowej metodami in situ i in vitro.

Lokalizacja, identyfikacja i wycięcie mysich magazynów tłuszczu

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Tutaj opisujemy protokół efektywnej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA (ChIP-seq) brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) wyizolowanej od myszy. Protokół ten nadaje się zarówno do mapowania modyfikacji histonów, jak i badania lokalizacji w całym genomie białek niehistonowych będących przedmiotem zainteresowania in vivo.

Immunoprecypitacja chromatyny mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej

Adipocyty istnieją w oddzielnych magazynach i pełnią różne role w swoich unikalnych mikrośrodowiskach. W miarę odkrywania regionalnych różnic w charakterze i funkcji adipocytów, ustandaryzowana identyfikacja i izolacja magazynów ma kluczowe znaczenie dla postępu w tej dziedzinie. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wycinki różnych magazynów tłuszczu myszy.

Identyfikacja i sekcja różnorodnych mysich magazynów tłuszczowych

Przedstawiamy protokół izolacji, hodowli i indukcji adipogennej komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej pochodzącej z grzebienia nerwowego (NCADSC) z okołoaortalnej tkanki tłuszczowej Wnt-1 Cre+/-; Myszy Rosa26RFP/+. NCADSC mogą być łatwo dostępnym źródłem ADSC do modelowania adipogenezy lub lipogenezy in vitro.

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna grzebienia nerwowego Oryginalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej okołoorciowej

Ten raport opisuje protokół jednoczesnej izolacji pierwotnych brązowych i białych preadipocytów od nowonarodzonych myszy. Wyizolowane komórki można hodować w hodowli i indukować do różnicowania się w pełni dojrzałe białe i brązowe adipocyty. Metoda umożliwia genetyczną, molekularną i funkcjonalną charakterystykę pierwotnych komórek tłuszczowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy

To badanie opisuje nową metodę izolowania mysich brązowych adipocytów do analizy ekspresji genów i białek.

Izolowanie brązowych adipocytów z mysiej brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami w celu analizy ekspresji genów i białek

Funkcjonalne obrazowanie i ilościowe określanie termogenicznych magazynów tłuszczu u myszy przy użyciu podejścia opartego na obrazowaniu mikro-PET/MR.

Wizualizacja i kwantyfikacja brązowych i beżowych tkanek tłuszczowych u myszy za pomocą obrazowania [18F]FDG Micro-PET/MR

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Poznaj metodę rozwarstwienia i analizy mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej przy użyciu mikroskopu i barwienia H&E. Protokół ten umożliwia precyzyjną ekstrakcję i badanie ekspresji genów.

Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej

Przeglądaj więcej filmów