Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej

Nasze laboratorium koncentruje się na ustaleniu brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej lub scBAT jako cennego magazynu do analizy brązowej tkanki tłuszczowej ze względu na jej anatomiczne podobieństwa do ludzkiej brązowej tkanki tłuszczowej. Protokół ten ma na celu zwiększenie dostępności badań scBAT. Ten magazyn może być onieśmielający ze względu na swój mały rozmiar i bliskość dużych żył na szyi, dlatego konieczne jest zapewnienie prostej metody ekstrakcji i przetwarzania scBAT.

Nasza metodologia wyróżnia się przede wszystkim zastosowaniem mikroskopu preparacyjnego podczas ekstrakcji scBAT. Zwiększa to precyzję i wydajność ekstrakcji, które mają kluczowe znaczenie podczas pracy z tak małym magazynem tkanek. Po drugie, homogenizowaliśmy zamrożone próbki scBAT przed przeprowadzeniem analizy ekspresji genów, aby zwiększyć wydajność RNA, aby skompensować tak niską ilość dostępnej tkanki.

Obecnie koncentrujemy się na zdefiniowaniu linii genetycznej scBAT, identyfikacji sieci transgresyjnych regulujących jego rozwój oraz opracowaniu modelu ex-vivo do badania jego funkcji fizjologicznej u ludzi. Aby rozpocząć, umieść tuszę myszy na stole roboczym. Spryskaj brzuszną szyję myszy 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierści.

Wykonaj obustronne nacięcie o długości około 1,5 centymetra wzdłuż obojczyków. Od końców obustronnych nacięć przeciąć około jednego centymetra wzdłuż w kierunku uszu, tworząc kwadratowe nacięcie w kształcie litery U wokół szyi. Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym i ustaw naświetloną szyjkę w ostrości.

Za pomocą kleszczy podnieś nacięte odcinki skóry, aby odsłonić gruczoły ślinowe. Teraz za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy odłącz tkankę łączącą gruczoły ślinowe z otaczającym obszarem obojczyka i ze sobą nawzajem. Podnieś gruczoły ślinowe, aby odsłonić brunatną tkankę tłuszczową nadobojczykową lub magazyny scBAT.

BAT należy obserwować wzdłuż żyły szyjnej zewnętrznej, która może być połączona ze spodem gruczołów ślinowych. Przytrzymuj docelową tkankę tłuszczową kleszczami i delikatnie oderwij ją od gruczołów ślinowych. Po usunięciu tkanki tłuszczowej kontynuuj odłączanie scBAT od żyły szyjnej zewnętrznej i mięśni szyi, aż do całkowitego usunięcia zajezdni po obu stronach szyi.

Sprawdź wypreparowaną próbkę scBAT i użyj kleszczy, aby usunąć pozostałą tkankę łączną. Rozpocznij od umieszczenia na stole warsztatowym szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej scBAT myszy w PBS. Zastąp PBS 10 mililitrami zimnego, 4% paraformaldehydu.

Umieść fiolkę na nutaterze, kołysząc się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby zamocować scBAT. Następnego dnia zastąp roztwór paraformaldehydu 10 do 15 mililitrami PBS. Umieścić fiolkę na nutaterze i kołysać przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Zastąp PBS 0,85% soli fizjologicznej i kontynuuj kołysanie przez kolejne 30 minut. Następnie zastąp sól fizjologiczną 10 mililitrami 70% etanolu, 0,85% roztworu soli fizjologicznej. Przechowywać fiolkę w lodówce o temperaturze czterech stopni przez noc lub do momentu, gdy będzie gotowa do spożycia parafiny i ściółki.

Następnego dnia usuń 70% mieszaninę soli fizjologicznej etanolu z fiolki i dodaj 10 do 15 mililitrów 95% alkoholu odwadniającego. Kołysz fiolką na nutaterze w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po drugim praniu dodaj od 10 do 15 mililitrów 100% alkoholu odwadniającego i kontynuuj kołysanie na nutaterze przez godzinę.

Aby usunąć scBAT do zatopienia, dodaj 10 mililitrów toluenu do fiolki i kontynuuj kołysanie na nutaterze, aż scBAT stanie się przezroczysty. Następnie zanurz scBAT w wosku parafinowym. Przeciąć scBAT za pomocą mikrotomu i przystąpić do barwienia hematoksyliną i eozyną.

Barwienie hematoksyliną i eozyną potwierdziło, że scBAT obejmuje struktury tkankowe charakterystyczne dla brunatnej tkanki tłuszczowej, w tym liczne małe adipocyty wielomiejscowe zarówno u myszy po urodzeniu, jak i u dorosłych. Po wypreparowaniu scBAT od uśpionej myszy należy natychmiast umieścić tkankę w probówce mikrowirówkowej. Zrób otwór w górnej części probówki sterylną igłą i zatrzaskowo zamroź w ciekłym azocie.

Namocz tłuczek i cienką szpatułkę w ciekłym azocie. Wlać zatrzaskowo zamrożoną próbkę tkanki z probówki mikrowirówki do moździerza. Dodaj niewielką ilość ciekłego azotu do moździerza i dokładnie zmiel tkankę tłuczkiem, aż do całkowitego sproszkowania.

Użyj cienkiej szpatułki, aby zeskrobać i przenieść sproszkowaną tkankę z powrotem do probówki mikrowirówkowej. Po przeniesieniu całej tkanki dodaj 500 mikrolitrów roztworu izolacyjnego RNA do probówki i sonikuj przez 30 sekund za pomocą silnika Pellet tłuczek. Następnie użyj strzykawki do pipetowania w górę i w dół 10 razy, aby jeszcze bardziej zlizować tkankę, upewniając się, że nie są widoczne żadne cząstki stałe.

Dodaj 250 mikrolitrów chloroformu i od czasu do czasu wiruj podczas pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Odwirować próbki w temperaturze 21 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś górną warstwę wodną do nowej probówki i dodaj równoważną ilość 70% etanolu.

Przenieść 500 mikrolitrów lizatu do kolumny wiążącej. Odwirować przy 18 000 G przez 60 sekund i wyrzucić filtrat. W przypadku odwrotnej transkrypcji dodaj 0,5 do jednego mikrograma RNA rozcieńczonego w wodzie uzdatnionej DEPC do paska probówki PCR.

Następnie rozcieńczyć CDNA do 250 nanogramów na mikrolitr za pomocą wody uzdatnionej DEPC i ustawić ilościowy PCR. Poziomy ekspresji genów markerowych zaangażowanych w pośredniczenie w funkcji scBAT były stosunkowo podobne między scBAT a międzyłopatkowym BAT.