Hemostaza rany kłutej i przygotowanie próbek do analizy w zmontowanej mikroskopii elektronowej

Jesteśmy laboratorium, które wykonuje badania strukturalne objętości EM, aby powiedzieć, w jaki sposób aktywują się płytki krwi, jak się agregują, jak tworzą skrzeplinę, która powoduje zatrzymanie krwawienia i jak, w przypadku nadmiernej stymulacji, powodują zakrzepy okluzyjne? Robiąc to, założenie jest takie, że jeśli znamy strukturę, możemy lepiej ukierunkować leki i osiągnąć lepsze wyniki. W naszych badaniach używamy modeli mysich, tak jak robi to wielu badaczy, i wszyscy stoimy przed wyzwaniem ustalenia, w jaki sposób nasze odkrycia na myszach, a w naszym przypadku, na tętnicach i żyłach myszy, przenoszą się na mechanizmy w znacznie większych tętnicach i żyłach u ludzi.

Wszyscy mamy nadzieję, że zasady są takie same u myszy i ludzi. Jeśli weźmiesz pod uwagę naszą pracę i podejście objętościowe EM, wielkie rzeczy, które wnieśliśmy, to stwierdzenie, że płytki krwi to nie tylko zamachowcy-samobójcy. Zatrzymują granulki.

Robią rzeczy w odpowiedzi na sygnalizację. Mają stany stabilne, a te stabilne stany są częścią normalnej skrzepliny, a także są częścią skrzepu okluzyjnego. Po drugie, udało nam się uzyskać poczucie, że skrzeplina, która się formuje, ma naprawdę strukturę.

To nie jest po prostu stos cegieł, ale raczej uporządkowana struktura, w której płytki krwi są uporządkowane pod względem ich aktywacji i tak dalej. I po trzecie, przynieśliśmy poczucie, że należy być w stanie zastosować i zrozumieć na podstawie struktury, co należy albo stymulować, aby uzyskać dobry wynik, albo to, co należy stłumić, aby uzyskać wynik, który ochroni ludzi przed złymi wynikami. Zbieramy sekwencyjne obrazy w skali bliskiej nanometrom na odległościach bliskich milimetrom.

Łączymy je w jeden obraz montażowy. W związku z tym możemy obserwować dowolne miejsce na obrazie w skali od bliskich nanometrów do prawie milimetra, co jest wystarczające do umieszczenia poszczególnych cech wewnątrz całej skrzepliny. Naukowcy mają teraz potężne narzędzie i mogą zadać nowe pytanie, w jaki sposób kaskady krzepnięcia i sygnały komórkowe lub leki działają przestrzennie na poziomie lokalnym i globalnym w skrzeplinach?

Na początek za pomocą nożyczek i kleszczy podnieś i przetnij skórę znieczulonej myszy nad prawą żyłą szyjną. Wytnij okrągłe okienko w skórze, wystarczająco duże, aby odsłonić żyłę szyjną i część otaczającej tkanki. Delikatnie odepchnij tkankę tłuszczową, węzły chłonne i tkankę łączną za pomocą techniki rozwarstwienia.

Następnie napełnij 20-mililitrową strzykawkę zwykłą solą fizjologiczną podgrzaną do 37 stopni Celsjusza. Załadować strzykawkę do pompy infuzyjnej strzykawki, a następnie przymocować do strzykawki igłę motylkową o rozmiarze 27 i związany z nią wężyk. Ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu 0,5 mililitra na minutę, aby zmyć krew z przebitej żyły lub tętnicy.

Umieść strumień soli fizjologicznej kilka mililitrów z boku miejsca nakłucia, a nie bezpośrednio nad nim. Po oczyszczeniu żyły szyjnej uruchom stoper. Uzyskaj igły podskórne o rozmiarze 30 i 33 odpowiednio do żyły szyjnej i tętnicy udowej.

Obróć skos do góry, a następnie ustaw igłę pod kątem 25 stopni nad żyłą szyjną lub tętnicą udową. Po zanotowaniu czasu szybko przebij górną część naczynia. Zwróć uwagę na czas potrzebny do całkowitego zatrzymania krwawienia.

Poczekaj na utworzenie się skrzepliny przed rozpoczęciem fiksacji perfuzyjnej. Po zakończeniu perfuzji należy wyciąć część żyły szyjnej z miejscem nakłucia i skrzepliną. Użyj pary ostrych nożyczek, aby wykonać ukośne cięcie w poprzek dystalnego końca segmentu naczynia i wykonaj proste cięcie w poprzek bliższego końca segmentu naczynia.

Następnie umieść utrwaloną tkankę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 godziny. Następnego dnia wlej roztwór buforowy kakodylanu sodu do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego zawierającego matę silikonową o grubości pięciu milimetrów. Ostrożnie przenieś tkankę do bufora, upewniając się, że jest zanurzona w buforze.

Za pomocą szpilek ze stali nierdzewnej i pary drobnych kleszczyków ostrożnie przypnij każdy koniec naczynia do maty. Ostrożnie oczyść żyłę szyjną. Za pomocą mikronożyczek przeciąć wzdłuż ścianę naczynia naprzeciwko miejsca nakłucia.

Delikatnie otwórz naczynie, a następnie przypnij je do maty silikonowej stroną śródświateł skierowaną do góry. Usuń roztwór buforowy z naczynia, a następnie dodaj 1% paraformaldehydu, aby zanurzyć naczynie. Natychmiast umieść pokrywkę na naczyniu, aby zapobiec wyschnięciu.