Modelowanie zdrowych i dysbiotycznych mikrośrodowisk pochwy w ludzkiej pochwie na chipie

Z powodzeniem opracowaliśmy chip do ludzkiej pochwy, który wspiera spontaniczne różnicowanie płaskiego, warstwowego nabłonka pochwy. Tworzy silną odpowiedź barierową na hormony i generuje gradienty tlenu wspierające mikrobiom. Obecnie do badania dysbiozy pochwy stosuje się kultury 2D i organoidów, ale nie są w stanie odwzorować fizjologicznej złożoności mikrośrodowiska pochwy ze względu na ich statyczny charakter.

Modele zwierzęce również nie potrafią modelować tych samych zmian hormonalnych obecnych w ludzkim cyklu menstruacyjnym, a mikrobiom pochwy u gatunków zwierząt i ludzi różni się. Postanowiliśmy zbadać, czy technologia chipów narządowych może posłużyć do opracowania przedklinicznego modelu interakcji mikrobiomu pochwy człowieka, który potencjalnie mógłby posłużyć do odkrywania i oceny potencjalnych terapii opartych na mikrobiomie. Chip pochwy umożliwia dynamiczny przepływ płynów przez nabłonek i stromę pochwy, co przedłuża współhodowlę z konsorcjami mikrobiologicznymi pochwy i utrzymuje fizjologicznie istotne mikrośrodowisko.

Ludzka pochwa na chipie to ekscytujące narzędzie, które może być wykorzystywane do badania różnych chorób kobiecego układu rozrodczego oraz weryfikacji nowych bioterapeutów. Na początek weź 70 do 90% współwysiewki ludzkich fibroblastów macicy. Aspiruj medium z kolbek.

Umyj komórki pięcioma mililitrami ciepłego wapnia i magnezu bez zapłodnienia DPBS. Po zasysaniu DPBS podaj do każdej kolby cztery mililitry ciepłej trypsyny EDTA. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut, aż komórki się odłączą.

Następnie do każdej kolby dodaj sześć mililitrów kroplówek i roztworu neutralizującego. Następnie przeniesiono zawiesinę komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 milimetrów. Użyj pipety, aby dobrze wymieszać zawiesinę, a do liczenia komórek weź aliquot o pojemności 10 mikrolitrów.

Wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny ogniwowej z 10 mikrolitrami trypan blue. Przenieś zabarwioną zawiesinę komórkową do hemocytometru do liczenia komórek. Następnie wiruj zawiesinę ogniwa w 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po aspiracji supernatantu ponownie zawiesz pellet w ciepłym medium fibroblastowym. Teraz przemyj kanał podstawowy mikrofluidycznego układu organowego 200 mikrolitrami fibroblastowego medium. Następnie przemyj kanał wierzchołkowy 200 mikrolitrami podgrzanego nabłonka pochwy.

Dodaj 200 mikrolitrów kompletnego nabłonka pochwy do wlotu kanału wierzchołkowego, zatkając gniazdko końcówką pipety. Dozuj medium, aż objętość wlotu i wylotu będzie równa. Następnie zdejmij końcówkę pipety z pipety, zostawiając końcówkę w wlocie.

Powoli pipetować 50 mikrolitrów zawiesiny komórek fibroblastu macicy do wlotu kanału podstawnego, jednocześnie zasysając z wylotu. Usuń końcówkę pipety z wlotu, gdy około dwóch mikrolitrów zawiesiny ogniwowej pozostaje w końcówce pipety. Odwróć chipy wtyczki do góry nogami na stojaku lampowym 15 mililitrów.

Sprawdź chipy po inkubacji pod kątem przyczepienia komórek. Następnie zatkaj gniazdko kanału podstawowego końcówką pipety. Następnie dodaj 200 mikrolitrów fibroblastowego medium do wlotu kanału podstawowego, nie naciskając na tłok pipety.

Zwolnij końcówkę z pipety, aby medium swobodnie przepływało przez kanał do końcówki pipety wylotowej pod wpływem przepływu grawitacyjnego. Inkubuj chipsy z fibroblastem przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z dodatkiem 5% dwutlenku węgla. Na początek należy pobrać po 50 mililitrów fibroblastu i nabłonka pochwy do oddzielnych stożkowych rurek o pojemności 50 mililitrów.

Odgazuj podgrzane medium pod sterylną próżnią przez pięć minut. Następnie dezynfekcja czystych tac CaviCide i etanolem dla modułu dynamicznego przepływu. Wyjmij kapsułki z opakowania i umieść je w tackach modułów dynamicznego przepływu.

Pipeta dwa mililitry odgazowanego ośrodka nabłonkowego pochwy do zbiornika wlotowego wierzchołkowego. I dodaj trzy mililitry odgazowanego fibroblastu do bazalnego zbiornika wlotowego. Pipeta 500 mikrolitrów odgazowanego ośrodka nabłonkowego pochwy do zbiornika wylotowego wierzchołkowego oraz 500 mikrolitrów odgazowanego medium fibroblastowego do zbiornika wylotowego podstawy.

Przesuwaj tacki z kapsułami do modułu dynamicznego przepływu. Teraz przeprowadź cykl główny dwa razy. Jeśli kropla nie powstanie po czterech cyklach głównych, należy nawiązać bezpośredni kontakt z portem wewnątrz zbiornika wylotowego kapsuły.

Pipeta 200 mikrolitrów odpowiedniego medium, aby umożliwić przepływ medium między zbiornikami w kanale i ręcznie zapełnić kapsuły. Następnie usuń końcówki pipety z ludzkich fibroblastów nasionych w macicy. Umieść kroplę odpowiedniego medium na wszystkich portach każdego układu.

Włóż chipsy do kapsułek i umieść je na tackach. Aspiruj wszelkie materiały na powierzchni chipów. Następnie przesuwaj każdą tackę do modułu dynamicznego przepływu.

Następnie w module ustaw górę i dół jako ciecz, przepływ wierzchołkowy na 15 mikrolitrów na godzinę, przepływ bazalny na 30 mikrolitrów na godzinę, rozciąganie na 0%, a częstotliwość na 0 herców. Uruchom cykl regulacji modułu i pozwól przepływać przez noc. Na urządzeniu narząd-chip zaobserwowano ciągłą warstwę komórek nabłonka pochwy, które stopniowo tworzyły wiele warstw komórkowych po różnicowaniach.

Na początek wymieszaj obliczoną ilość każdego szczepu bakterii, aby uzyskać około pięciu milionów jednostek tworzących kolonie na mililitr. Wiruj mieszankę w 7 000 G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie wyciągnij supernatant.

Ponownie zawiesz granulek w roztworze Hanks'Balanced Salt o niskiej zdolności buforowania i poziomu glukozy. Teraz dotknę odłamków organów zawierających zróżnicowane ludzkie komórki nabłonka pochwy z kapsuł. Podłącz gniazdko kanału bazalnego chipu końcówką pipety.

Dodaj 200 mikrolitrów bezantybiotykowego medium różnicującego do wlotu kanału podstawowego, nie naciskając na tłok pipety. Zdejmij końcówkę pipety z pipety, pozwalając medium swobodnie przepływać przez kanał. Następnie podaj 37 mikrolitrów szczepionki bakteryjnej do wlotu kanału wierzchołkowego chipa, jednocześnie zasysając z wylotu.

Wyciągnij końcówkę, a następnie podłącz zarówno wlot kanału apikalnego, jak i gniazdo końcówkami pipety. Dla układów sterujących pipetować 37 mikrolitrów roztworu Hank's Balanced Salt o niskiej zdolności buforowania i glukozy do wlotu kanału apikalnego. Po zasysaniu dowolnego medium na powierzchni chipu, umieść je w 150-milimetrowej szalce Petriego.

Kolonie L. crispatus i G. vaginalis wykryto w ciągu 48 godzin od nałożenia pochwy, co potwierdza, że zarówno zdrowe, jak i dysbiotyczne bakterie zostały zaszczepione w chipach pochwy. pH chipów pochwy zaszczepionych L. crispatus było podobne do nienokulowanych chipów kontrolnych, a po współhodowli z G. vaginalis osiągały one znacząco podwyższone pH.