Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych w celu zbadania bariery nabłonkowej w eozynofilowym zapaleniu przełyku
10 maja 2024
Tutaj dostępny jest protokół hodowli ludzkich organoidów przełykowych i kultury na granicy faz powietrze-ciecz. Kultura granicy faz powietrze-ciecz organoidów przełyku może być wykorzystana do badania wpływu cytokin na barierę nabłonkową przełyku.
Badamy patofizjologię eozynofilowego zapalenia przełyku i próbujemy rozwikłać kaskadę zapalną indukującą i promującą przewlekły proces zapalny EoE. Identyfikacja nowych mediatorów immunologicznych, które przyczyniają się do patogenezy choroby, koncentruje się na upośledzeniu bariery nabłonkowej i zatwierdzeniu przeciwciał terapeutycznych przeciwko wspomnianym mediatorom immunologicznym. Zidentyfikowaliśmy cytokiny podrodziny IL-20 jako mediatory stanu zapalnego, które upośledzają różnicowanie nabłonka i keratynizację, powodując upośledzenie bariery nabłonkowej poprzez szlak kinazy MAP.
Na początek pobierz próbki z biopsji przełyku zanurzone w pożywce wolnej od surowicy keratynocytów lub KSFM. Zastąp KSFM jednym mililitrem Dispase 1 i inkubuj biopsje przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, odessać Dispase bez dotykania biopsji lub osadu z resztek komórek.
Następnie przepłucz biopsje DPBS. Po odwirowaniu biopsji należy użyć pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów do odessania supernatantu. Następnie dodaj 500 mikrolitrów trypsyny-EDTA do biopsji i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 800 obr./min.
Następnie należy powtórzyć pipetowanie, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Za pomocą gumowej głowicy tłoka strzykawki tuberkulinowej przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 mikrometrów. Następnie umyj sitko dwoma do czterech mililitrów inhibitora trypsyny sojowej.
Następnie przefiltruj komórki przez 35-mikrometrowe sitko do komórek z zatrzaskową nasadką na pięciomililitrowej rurki z polistyrenu o okrągłym dnie. Po odwirowaniu zawiesiny komórek należy użyć pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów do zasysania supernatantu. Ponownie zawiesić osad komórkowy w matrycy hydrożelowej ekstraktu z błony podstawnej i uformować 40-mikrolitrowe kropelki we wstępnie podgrzanej płytce do hodowli komórek w zawiesinie.
Następnie inkubować płytkę bez pożywki przez 20 do 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zapewnić zestalenie kropelek ekstraktu z błony podstawnej. Dodaj wstępnie podgrzany KSFM uzupełniony 10 mikromolami Y-27632. Dziewiątego dnia zaobserwowano wielowarstwową strukturę przypominającą cebulę i rosnący zrogowaciały rdzeń w środku organoidu.
Na początek weź komórki wyizolowane z biopsji przełyku i ponownie zawieś je w czterech mililitrach KSFM z 10-mikromolowym Y-27632. Przenieść komórki do kolby do hodowli komórek T25. Gdy keratynocyty utworzą monowarstwę o zbiegu od 60% do 80%, komórki P1 przechodzą dalej.
Następnie wysiewaj pierwotne keratynocyty P2 na wkładkach transwell w celu hodowli na granicy faz powietrze-ciecz. Aby wykonać transport powietrzny w siódmym dniu, zastąp pożywkę w dolnej komorze KSFM o wysokiej zawartości wapnia i odessaj pożywkę z górnej komory.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli ludzkich organoidów przełyku oraz wykorzystania hodowli na granicy powietrze-ciecz do badania wpływu cytokin na barierę nabłonkową przełyku.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Immunologia
Wstęp
- Eozynofilowe zapalenie przełyku (EoE) charakteryzuje się przewlekłym stanem zapalnym.
- Upośledzenie bariery nabłonkowej odgrywa kluczową rolę w patogenezie EoE.
- Identyfikowane są nowe mediatory immunologiczne, aby zrozumieć ich rolę w EoE.
- Cytokiny z podrodziny IL-20 zostały powiązane z upośledzeniem bariery nabłonkowej.
Cel badania
- Zbadanie kaskady zapalnej w eozynofilowym zapaleniu przełyku.
- Zidentyfikowanie mediatorów odpornościowych wpływających na funkcję bariery nabłonkowej.
- Opracowanie strategii terapeutycznych nakierowanych na te mediatory.
Zastosowane metody
- Próbki biopsji przełyku hoduje się w bezzsypkowym medium dla keratynocytów.
- Do trawienia biopsji w celu dalszej analizy wykorzystuje się dyspazę 1.
- W celu zbadania wpływu cytokin stosuje się hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz.
- Badany jest szlak kinazy MAP pod kątem jego roli w uszkodzeniach nabłonka.
Główne wyniki
- Identyfikacja cytokin z podrodziny IL-20 jako kluczowych mediatorów stanu zapalnego.
- Wykazanie ich wpływu na różnicowanie nabłonka i keratynizację.
- Dowody na indukowane cytokinami upośledzenie bariery nabłonkowej.
- Wnioski dotyczące udziału szlaku kinazy MAP w EoE.
Wnioski
- Badanie to pogłębia zrozumienie patofizjologii EoE.
- Wskazuje ono potencjalne cele terapeutyczne dla interwencji.
- Przyszłe badania mogą skupić się na modulacji cytokin w celu przywrócenia funkcji barierowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Trójwymiarowe modele organoidów przełyku oraz modele interfejsu powietrze-ciecz umożliwiają mechanistyczną ocenę ryzyka w kontekście dysfunkcji bariery nabłonkowej w eozynofilowym zapaleniu przełyku. Te systemy pochodzące od pacjentów zapewniają wiarygodność prognostyczną dla walidacji celów terapeutycznych i badania szlaków sygnalizacyjnych, wspierając ciągłość translacyjną od etapu odkryć po badania przedkliniczne. Ich zastosowanie usprawnia decyzje dotyczące portfolio poprzez wyjaśnienie wpływu cytokin i szlaków sygnalizacyjnych na integralność bariery.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów zależnych od cytokin, które leżą u podstaw upośledzenia bariery nabłonkowej.
- Wspiera walidację funkcjonalną mediatorów odpornościowych i szlaków sygnałowych w tkankach istotnych dla przebiegu choroby.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie specyficznych dla pacjenta odpowiedzi nabłonkowych.
- Zapewnia platformę pozwalającą na uzyskanie przewidywalnej pewności w wyborze i selekcji celów terapeutycznych.
Przesiew i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy organoidów oraz interfejsy powietrze-ciecz do ilościowych analiz funkcji bariery.
- Umożliwia powtarzalny pomiar oporu transepitelialnego oraz przepływu makromolekuł.
- Wspiera standaryzację testów w celu późniejszego przesiewu związków chemicznych lub biologicznych.
- Pozwala na skalowalną ocenę wpływu potencjalnych interwencji na integralność nabłonka.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie modeli barier in vitro do fenotypów pacjentów istotnych dla danej choroby.
- Zachowuje specyficzne dla dawcy właściwości genetyczne i fenotypowe na potrzeby translacyjnych badań nad biomarkerami.
- Pozwala na dostosowane do ryzyka rozwijanie hipotez terapeutycznych celujących w dysfunkcje nabłonka.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po walidację przedkliniczną strategii przywracania funkcji barierowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Modele te stanowią pomost między wczesnym etapem odkrywania a badaniami przedklinicznymi, umożliwiając testowanie hipotez, ilościową ocenę barier oraz analizę szlaków w systemach pochodzących od pacjentów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie mechanizmów wpływu cytokin i szlaków sygnałowych na różnicowanie nabłonka oraz funkcję barierową.
- Przesiewowanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników, takich jak TEER i strumień makromolekuł, do analiz porównawczych.
- Analityka: Zapewnia odczyty transkryptomiczne i proteomiczne po stymulacji cytokinami w celu mapowania szlaków.
- Badania translacyjne: Zachowuje istotność w kontekście chorób i zgodność z biomarkerami dzięki zastosowaniu pierwotnych komórek pacjentów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę do ciągłej walidacji celów i badań mechanistycznych nad zaburzeniami bariery nabłonkowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i ogranicza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad dysfunkcją bariery.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje systemy modelowe pochodzące od pacjentów w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wartość strategiczna: Uzasadnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) i ogranicza ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfolio ukierunkowanym na nabłonek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów terapeutycznych ukierunkowanych na przywrócenie bariery nabłonkowej z uwzględnieniem korekty ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w izolacji pierwotnych komórek oraz w technikach hodowli 3D.
- Wymaga dostępu do specjalistycznych pożywek hodowlanych, macierzy oraz aparatury analitycznej do pomiarów TEER i testów przepływu.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Może wymagać dostosowania do różnych kohort pacjentów lub podtypów chorób.
- Wierność modelu zależy od jakości pobranych próbek biopsyjnych oraz zmienności osobniczej dawców.
