Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych w celu zbadania bariery nabłonkowej w eozynofilowym zapaleniu przełyku
May 10th, 2024
Tutaj dostępny jest protokół hodowli ludzkich organoidów przełykowych i kultury na granicy faz powietrze-ciecz. Kultura granicy faz powietrze-ciecz organoidów przełyku może być wykorzystana do badania wpływu cytokin na barierę nabłonkową przełyku.
Badamy patofizjologię eozynofilowego zapalenia przełyku i próbujemy rozwikłać kaskadę zapalną indukującą i promującą przewlekły proces zapalny EoE. Identyfikacja nowych mediatorów immunologicznych, które przyczyniają się do patogenezy choroby, koncentruje się na upośledzeniu bariery nabłonkowej i zatwierdzeniu przeciwciał terapeutycznych przeciwko wspomnianym mediatorom immunologicznym. Zidentyfikowaliśmy cytokiny podrodziny IL-20 jako mediatory stanu zapalnego, które upośledzają różnicowanie nabłonka i keratynizację, powodując upośledzenie bariery nabłonkowej poprzez szlak kinazy MAP.
Na początek pobierz próbki z biopsji przełyku zanurzone w pożywce wolnej od surowicy keratynocytów lub KSFM. Zastąp KSFM jednym mililitrem Dispase 1 i inkubuj biopsje przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, odessać Dispase bez dotykania biopsji lub osadu z resztek komórek.
Następnie przepłucz biopsje DPBS. Po odwirowaniu biopsji należy użyć pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów do odessania supernatantu. Następnie dodaj 500 mikrolitrów trypsyny-EDTA do biopsji i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, wstrząsając z prędkością 800 obr./min.
Następnie należy powtórzyć pipetowanie, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Za pomocą gumowej głowicy tłoka strzykawki tuberkulinowej przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 mikrometrów. Następnie umyj sitko dwoma do czterech mililitrów inhibitora trypsyny sojowej.
Następnie przefiltruj komórki przez 35-mikrometrowe sitko do komórek z zatrzaskową nasadką na pięciomililitrowej rurki z polistyrenu o okrągłym dnie. Po odwirowaniu zawiesiny komórek należy użyć pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów do zasysania supernatantu. Ponownie zawiesić osad komórkowy w matrycy hydrożelowej ekstraktu z błony podstawnej i uformować 40-mikrolitrowe kropelki we wstępnie podgrzanej płytce do hodowli komórek w zawiesinie.
Następnie inkubować płytkę bez pożywki przez 20 do 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zapewnić zestalenie kropelek ekstraktu z błony podstawnej. Dodaj wstępnie podgrzany KSFM uzupełniony 10 mikromolami Y-27632. Dziewiątego dnia zaobserwowano wielowarstwową strukturę przypominającą cebulę i rosnący zrogowaciały rdzeń w środku organoidu.
Na początek weź komórki wyizolowane z biopsji przełyku i ponownie zawieś je w czterech mililitrach KSFM z 10-mikromolowym Y-27632. Przenieść komórki do kolby do hodowli komórek T25. Gdy keratynocyty utworzą monowarstwę o zbiegu od 60% do 80%, komórki P1 przechodzą dalej.
Następnie wysiewaj pierwotne keratynocyty P2 na wkładkach transwell w celu hodowli na granicy faz powietrze-ciecz. Aby wykonać transport powietrzny w siódmym dniu, zastąp pożywkę w dolnej komorze KSFM o wysokiej zawartości wapnia i odessaj pożywkę z górnej komory.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli organoidów przełyku człowieka i wykorzystania kultury na interfejsie powietrze-ciecz do badania wpływu cytokin na barierę nabłonkową przełyku.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Immunologia
Tło
- Eozynofilowe zapalenie przełyku (EoE) charakteryzuje się przewlekłym zapaleniem.
- Upośledzenie bariery nabłonkowej jest centralne w patogenezie EoE.
- Nowe mediatory immunologiczne są identyfikowane w celu zrozumienia ich roli w EoE.
- Cytokiny podrodziny IL-20 zostały powiązane z upośledzeniem bariery nabłonkowej.
Cel badania
- Badanie kaskady zapalnej w eozynofilowym zapaleniu przełyku.
- Identyfikacja mediatorów immunologicznych wpływających na funkcję bariery nabłonkowej.
- Opracowanie strategii terapeutycznych ukierunkowanych na te mediatory.
Stosowane metody
- Probki biopsji przełyku są hodowane w środowisku bez surowicy keratynocytowej.
- Dispase 1 jest używany do strawienia biopsji w celu dalszej analizy.
- Kultura na interfejsie powietrze-ciecz jest zastosowana do badania wpływu cytokin.
- Ścieżka MAP kinazy jest badana pod kątem jej roli w upośledzeniu nabłonka.
Główne wyniki
- Identyfikacja cytokin podrodziny IL-20 jako kluczowych mediatorów zapalnych.
- Wykazanie ich wpływu na różnicowanie nabłonka i rogowacenie.
- Dowód upośledzenia bariery nabłonkowej wywołanego przez cytokiny.
- Wgląd w udział ścieżki MAP kinazy w EoE.
Wnioski
- Badanie poprawia rozumienie patofizjologii EoE.
- Podkreśla potencjalne cele terapeutyczne dla interwencji.
- Przyszły badania mogą skupić się na modulacjach cytokin w celu przywrócenia funkcji bariery.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Three-dimensional esophageal organoid and air-liquid interface models enable mechanistic de-risking of epithelial barrier dysfunction in eosinophilic esophagitis. These patient-derived systems provide predictive confidence for target validation and pathway interrogation, supporting translational continuity from discovery to preclinical research. Their use advances portfolio decisions by clarifying the impact of cytokines and signaling pathways on barrier integrity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cytokine-driven mechanisms underlying epithelial barrier impairment.
- Supports functional validation of immune mediators and signaling pathways in disease-relevant tissue.
- Facilitates biological de-risking by modeling patient-specific epithelial responses.
- Provides a platform for predictive confidence in target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organoid and air-liquid interface systems for quantitative barrier function assays.
- Enables reproducible measurement of transepithelial resistance and macromolecule flux.
- Supports assay standardization for downstream compound or biologic screening.
- Allows scalable evaluation of candidate interventions on epithelial integrity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro barrier models with disease-relevant patient phenotypes.
- Maintains donor-specific genetic and phenotypic properties for translational biomarker studies.
- Enables risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting epithelial dysfunction.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of barrier-restoring strategies.
Pipeline & Workflow Integration
These models bridge early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing, quantitative barrier assessment, and pathway analysis in patient-derived systems.
- Discovery Biology: Supports mechanistic testing of cytokine and pathway effects on epithelial differentiation and barrier function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs such as TEER and macromolecule flux for comparative analysis.
- Analytics: Provides transcriptomic and proteomic readouts post-cytokine stimulation for pathway mapping.
- Translational Research: Maintains disease relevance and biomarker alignment through use of primary patient cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ongoing target validation and mechanistic studies in epithelial barrier disorders.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in barrier dysfunction research.
- Operational Value: Standardizes and scales patient-derived model systems for reproducible outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in epithelial-targeted portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates targeting epithelial barrier restoration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and 3D culture techniques.
- Demands access to specialized culture media, matrices, and analytical instrumentation for TEER and flux assays.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different patient cohorts or disease subtypes.
- Dependent on biopsy sample quality and donor variability for model fidelity.
