Charakterystyka modulatorów receptorów aktywowanych proteazą za pomocą testu mobilizacji wapnia za pomocą czytnika płytek

Nasze laboratorium pracuje nad zrozumieniem, w jaki sposób modulacja receptorów aktywowanych proteazą może hamować stan zapalny. Opracowaliśmy nową klasę małych cząsteczek zwanych parmamodlinami, które modulują aktywność Par 1. Celem jest odkrycie parmadolin o ulepszonych właściwościach do potencjalnego zastosowania jako kandydaci na leki, a także zrozumienie ich sposobu działania.

W badaniach przedklinicznych z naszymi współpracownikami ustaliliśmy, że parmadoliny mogą być szczególnie obiecujące w leczeniu zaburzeń spowodowanych zapaleniem skrzeplin, w tym chorób nerek, wątroby i układu krążenia. Ich sposób działania może również umożliwić opracowanie związków o lepszym profilu bezpieczeństwa niż wcześniejsze Par 1 przeznaczone dla kandydatów na leki. Receptor Par 1 jest ważny dla aktywacji płytek krwi, ale jego sygnalizacja w komórkach śródbłonka jest również ważna i istotna w wielu patologiach.

Dlatego chcieliśmy opracować tani i wygodny protokół do badania aktywności parmadolinów i hodowanych komórek śródbłonka. Jesteśmy tutaj, aby podzielić się zaktualizowanym protokołem pomiaru mobilizacji wapnia, który wykorzystuje standardowy czytnik płytek i nie wymaga automatycznego urządzenia do obsługi cieczy. Nadaje się do badań przesiewowych ligandów Par 1 w komórkach śródbłonka, ale teoretycznie może być używany do pomiaru aktywności dowolnych związków wpływających na mobilizację wapnia.

Aby rozpocząć, ułóż wymagane materiały eksperymentalne na platformie roboczej. Dodaj 100 mikrolitrów sterylnego 0,4% roztworu żelatyny do studzienek czarnej ścianki 96-dołkowej przezroczystej płytki dolnej. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut.

Pod odwróconym mikroskopem potwierdź, że komórki śródbłonka w kolbie T75 są w 80 do 100% zlewne. Usunąć kompletną pożywkę DMEM z kolby przez aspirację. Aby umyć komórki, dodaj 10 mililitrów PBS i delikatnie potrząśnij kolbą.

Zastąp PBS pięcioma mililitrami roztworu do dysocjacji komórek. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez około 12 minut. Postukaj w kolbę po sześciu minutach, aby ułatwić dysocjację.

Dodać pięć mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki DMEM do kolby i wymieszać zawiesinę komórkową. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwirować przy 150 G przez pięć minut. W międzyczasie, za pomocą pipety pastora podłączonej do próżni, odessać roztwór żelatyny z płytki 96-dołkowej.

Po odwirowaniu komórek usunąć supernatant z probówki, nie naruszając osadu. Za pomocą pipety serologicznej dodać do probówki osiem mililitrów świeżej kompletnej pożywki DMEM i delikatnie odpipetować zawiesinę, aby rozbić osad komórkowy. Policz komórki za pomocą niebieskiego wyzwalacza na hemocytometrze.

Dodaj kompletną pożywkę DMEM, aby uzyskać gęstość 600 000 komórek na mililitr zawiesiny. Wymieszaj zawiesinę komórkową, delikatnie odwracając probówkę. Dodaj zawiesinę komórek do 50-mililitrowego zbiornika na pipety wielokanałowej.

Co 30 sekund delikatnie kołysz zbiornikiem na boki, aby wymieszać zawiesinę, i użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 100 mikrolitrów do każdej studzienki 96-dołkowej płytki pokrytej żelatyną. Załóż przezroczystą pokrywę płytki i delikatnie potrząśnij płytką, przesuwając ją po powierzchni sterylnego kaptura z północy na południe i ze wschodu na zachód. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 16 do 24 godzin.

Po wyhodowaniu komórek śródbłonka na 96-dołkowej płytce, wyjmij ją z inkubatora i potwierdź współpłynność za pomocą odwróconego mikroskopu. Wrzuć talerz do zlewu, aby usunąć cały nośnik, i osusz górną część talerza ręcznikiem papierowym. Dodaj roztwór HBSS Heaps Assay Buffer Plus Pro Benefit do 50-mililitrowego zbiornika rozpuszczalnika do pipet wielokanałowych.

Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 mikrolitrów buforu testowego do każdej studzienki i pozostaw komórki na pięć minut. Następnie przesuń płytkę, aby usunąć bufor testowy. Dodaj bufor pobierający do oddzielnego 50-mililitrowego wielokanałowego zbiornika rozpuszczalnika do pipet.

Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 mikrolitrów buforu ładującego barwnik do każdego dołka płytki testowej. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 45 minut. Po inkubacji obserwuj płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić wchłanianie barwnika.

Przesuń płytkę, aby usunąć roztwór barwnika. Umyj komórki dwukrotnie 50 mikrolitrami roztworu HBSS Heaps Assay Buffer Plus Pro Benefit Solution w każdym dołku. Przesuń płytkę, aby usunąć bufor testowy.

Dodaj 92 mikrolitry buforu testowego HBSS Heaps do każdej studzienki i ponownie obejrzyj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby upewnić się, że nadmiar barwnika został całkowicie usunięty, a komórki pozostają przylegające. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać dwa mikrolitry roztworów antagonistów i nośnik do odpowiednich studzienek. Po włączeniu czytnika płytek należy ustawić temperaturę na 37 stopni Celsjusza i inkubować płytkę przez 15 minut.

Zmierz fluorescencję tła w kolumnach pierwszej i drugiej, wykonując pięć skanów na studzienkę. Wysunąć płytkę z czytnika płytek. Następnie z 8-probówkowego paska PCR szybko dodaj sześć mikrolitrów roztworu agonisty za pomocą wielokanałowej pipety do każdej studzienki w kolumnach pierwszej i drugiej.

Zmierz zmianę fluorescencji, gdy w komórkach zachodzi mobilizacja wapnia. Wykonaj 20 skanów każdej studni. Test mobilizacji wapnia z komórkami śródbłonka wykazał, że studzienki kontroli pozytywnej bez antagonisty wykazywały szybki wzrost fluorescencji.

Studzienki o wysokich stężeniach antagonistów wykazywały minimalną zmianę fluorescencji, podobnie jak studzienki kontroli ujemnej bez agonisty.