Name: Charakterystyka modulatorów receptorów aktywowanych proteazą za pomocą testu mobilizacji wapnia za pomocą czytnika płytek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Naucz się testu mobilizacji wapnia w komórkach śródbłonka do badania receptorów aktywowanych proteazą. Ta metoda skraca czas analizy i poprawia powtarzalność wyników w badaniach nad parmamodlinami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) i Dr. Leggy Arnold (University of Wisconsin-Milwaukee) za zapewnienie przestrzeni i pośrednie wsparcie dla tego projektu, oraz Dr. Johnowi McCorvy'emu (Medical College of Wisconsin) za odpowiednie porady. Dziękujemy Narodowemu Instytutowi Serca, Płuc i Krwi (R15HL127636), Departamentowi Obrony Stanów Zjednoczonych (W81XWH22101) oraz Narodowej Fundacji Nauki (2223225) za wsparcie w postaci grantów.

Wszystkie wymiany/dodatki mediów wykonane w krokach 1 i 2 poniższego protokołu są wykonywane w sterylnym kapturze. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie plastikowe naczynia używane w sterylnym kapturze muszą być zakupione, wysterylizowane i zapieczętowane lub odpowiednio wysterylizowane w autoklawie.
1. Inicjacja linii komórkowej EA.hy926
<ol>
	<li>Zdobądź komórki EA.hy926.</li>
	<li>Przechowywać fiolkę (fiolki) komórek w fazie gazowej zbiornika z ciekłym azotem.</li>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę DMEM, najpierw podgrzewając DMEM, FBS i wstrzykiwacz/paciorkowca (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15-30 minut. Dodaj 50 ml FBS i 1 ml wstrzykiwacza/paciorkowca do 500 ml DMEM. Delikatnie wymieszaj roztwór przez inwersję. 
	UWAGA: Zbyt energiczne mieszanie powoduje nadmierną ilość pęcherzyków.</li>
	<li>Wyjąć jedną fiolkę z komórkami z ciekłego azotu i ogrzewać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Wysterylizuj fiolkę z komórkami i butelkę kompletnego podłoża DMEM, spryskując je alkoholem, a następnie przenieś do sterylnego kaptura.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl ostrożnie przenieś komórki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 1 ml DMEM do fiolki w celu przepłukania i dodania do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Przygotować osad komórek za pomocą wirówki (150 × g, 5 min, 22 °C). Usunąć pożywkę z probówki wirówkowej przez aspirację; Uważaj, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
	<li>Dodać 3 ml kompletnej pożywki DMEM do probówki wirówkowej i delikatnie rozbić osad, mieszając zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. 
	UWAGA: Należy unikać powodowania pęcherzyków poprzez zbyt energiczne mieszanie, ponieważ może to aktywować lub uszkodzić komórki.</li>
	<li>Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego w probówce mikrowirówkowej za pomocą pipety z końcówkami o pojemności 20 μl lub 200 μl. Dodać 10 μl mieszaniny zawiesiny komórkowej i błękitu trypanowego do hemocytometru i policzyć komórki. 
	UWAGA: Użycie końcówek do pipet o pojemności 0,1-10 μl może spowodować ścinanie komórek. Końcówki tego rozmiaru nie powinny być używane podczas obchodzenia się z zawiesiną ogniw.</li>
	<li>Dodać kompletną pożywkę DMEM do zawiesiny komórek, aby uzyskać gęstość 66 000 komórek/ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 lub 25 ml. Odpipetować 15 ml zawiesiny komórek do kolby(-i) hodowlanej(-ych) T-75. Zapewnić równomierne rozproszenie zawiesiny komórek, przesuwając kolbę z północy na południe i ze wschodu na zachód.</li>
	<li>Inkubuj komórki, aż osiągną zbieg (zwykle po 4-6 dniach), zgodnie z oszacowaniem badania pod mikroskopem. W tym momencie należy użyć komórek w eksperymencie (zaczynając od sekcji 2) lub zasiać je w nowych kolbach w celu rozprężenia w celu przygotowania zamrożonych wywarów (przy zalecanej gęstości wysiewu 1 000 000 komórek w 15 ml kompletnej pożywki na kolbę T-75). 
	UWAGA: Komórki można hodować w kolbach hodowlanych nawet przez 3 tygodnie bez zauważalnej różnicy w kształcie, zdrowiu lub wydajności testu. Kompletne podłoże należy wymieniać co 3-4 dni.</li>
</ol>
2. Dodanie komórek EA.hy926 do płytek 96-dołkowych
UWAGA: Komórki z jednej zlewającej się kolby hodowlanej T-75 mogą być użyte do przygotowania dwóch lub trzech płytek testowych lub opcjonalnie rozszerzone do aż 15 świeżych kolb T-75. Co najmniej pięć płytek testowych można przebadać przy użyciu protokołu w sekcjach 4 i 5 w normalnym dniu roboczym. Poniższe instrukcje opisują przygotowanie i testowanie jednej płytki testowej, ale dodatkowe płytki można przygotować, powtarzając kroki 2.2, 2.7, 2.12 i 3.2 w celu przygotowania żądanej liczby płytek testowych. Najczęściej przygotowuje się cztery płytki testowe dziennie w celu pomiaru stężenia-odpowiedzi z maksymalnie 16 związkami, co wymaga dwóch kolb T-75 z zlewającymi się komórkami.
<ol>
	<li>Ciepłe kompletne podłoże DMEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15-30 min. Wysterylizuj butelkę kompletnej pożywki DMEM, spryskując ją alkoholem, a następnie przenieś do sterylnego kaptura.</li>
	<li>Dodać 100 μl wysterylizowanego 0,4% roztworu żelatyny do wszystkich studzienek czarnościennej, 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem z pokrywką. Inkubować płytkę z roztworem żelatyny w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) przez 30 minut.</li>
	<li>Potwierdź, że komórki w kolbie hodowlanej T-75 są w 80-100% zlewające się za pomocą odwróconego mikroskopu. Usunąć kompletną pożywkę DMEM z kolby T-75 przez aspirację.</li>
	<li>Przemyć komórki w kolbie 10 ml PBS i delikatnie przesunąć kolbę z północy na południe i ze wschodu na zachód. Wyjąć PBS z kolby przez aspirację.</li>
	<li>Dodać 5 ml roztworu do dysocjacji komórek do kolby i inkubować kolbę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez ~12 min. Postukać w kolbę po 6 minutach, aby ułatwić dysocjację. 
	UWAGA: Inkubacja komórek przez okres dłuższy niż 15 minut z referencyjnym środkiem dysocjacji komórek powoduje, że komórki zaczynają się zlepiać, co utrudnia uzyskanie dokładnej liczby komórek i może zakłócać test.</li>
	<li>Dodać 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM do kolby i delikatnie wymieszać z roztworem dysocjacyjnym/zawiesiną komórkową. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodać zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przygotować osad z komórek za pomocą wirówki (150 × g, 5 min, 22 °C).</li>
	<li>Podczas formowania się osadu należy usunąć roztwór żelatyny z płytki 96-dołkowej poprzez aspirację za pomocą pipety Pasteura podłączonej do próżni. Zdjąć pokrywkę płytki od momentu wyjęcia żelatyny do momentu, gdy roztwór będzie gotowy do powlekania. 
	UWAGA: Opcjonalnie można użyć pipety wielokanałowej lub sterylnego kolektora podłączonego do próżni.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z probówki wirówkowej przez aspirację za pomocą pipety Pasteura podłączonej do próżni lub pipety serologicznej; należy uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
	<li>Dodać świeżą kompletną pożywkę DMEM do probówki wirówkowej za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 lub 10 ml. Delikatnie rozdrobnić osad komórkowy, mieszając kompletną pożywkę DMEM z pipetą 1 000 μl lub pipetą serologiczną 5 ml. 
	UWAGA: Zwykle stosuje się osiem mililitrów DMEM, ale można dodać większe objętości, aby ułatwić liczenie komórek.</li>
	<li>Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego w probówce mikrowirówkowej za pomocą pipety z końcówkami o pojemności 20 μl lub 200 μl. Dodać 10 μl mieszaniny zawiesiny komórkowej i błękitu trypanowego do hemocytometru i policzyć komórki.</li>
	<li>Dodaj kompletną pożywkę DMEM do zawiesiny komórek, aby uzyskać gęstość 600 000 komórek/ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 lub 25 ml. Da to końcową gęstość 60 000 komórek/basenik na 96-dołkowej płytce (określonej jako optymalna gęstość przez eksperymenty). 
	UWAGA: Normalna, udana hodowla komórkowa da od 12 000 000 do 15 000 000 komórek, które mogą zasiać od dwóch do trzech 96-dołkowych płytek.</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę komórkową, delikatnie odwracając probówkę wirówkową i dodaj ją do zbiornika na pipety wielokanałowej o pojemności 50 ml. Mieszając zawiesinę w zbiorniku co 30 s, delikatnie kołysząc zbiornikiem na boki, dodaj 100 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. Załóż przezroczystą pokrywę płytki i delikatnie potrząśnij płytką, przesuwając ją po powierzchni sterylnego kaptura z północy na południe i ze wschodu na zachód, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubować płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez 16-24 h. 
	UWAGA: Do przygotowania dodatkowych płytek można użyć dodatkowej zawiesiny komórek lub powtórzyć kroki 1.10-1.11, aby kontynuować linię komórkową.</li>
</ol>
3. Przygotowanie testu mobilizacji wapnia
<ol>
	<li>Przygotować odczynniki do oznaczania.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór probenecydu (250 mM, roztwór wodny), dodając 36 mg probenecydu do probówki mikrowirówkowej i rozpuszczając go w 0,6 M NaOH (500 μl). Odwiruj roztwór. 
		UWAGA: Probenecyd poprawia retencję barwnika w komórce poprzez hamowanie transporterów jonów organicznych75,76,77.</li>
		<li>Aby przygotować bufor testowy HBSS-HEPES, dodaj HEPES (1,19 g) do 500 ml butelki HBSS bez czerwieni Ca/Mg/fenolu (tworząc 10 mM roztwór HEPES). Uzupełnić bufor MgCl2 (1 M roztwór wodny, 500 μL) i CaCl2 (1 M roztwór wodny, 500 μL). Wymieszać roztwór i przechowywać w lodówce w temperaturze 5 °C, gdy nie jest używany.
		<ol>
			<li>Na każdą 96-dołkową płytkę dodać 50 ml buforu testowego HBSS-HEPES do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, uzupełnić 500 μl roztworu probenecydu i dobrze wymieszać. Przed użyciem podgrzej bufor do temperatury pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować 10% roztwór Pluronic F-127 w DMSO, dodając Pluronic F-127 (20 mg) do probówki do mikrowirówki lub fiolki HPLC i rozpuszczając ją w 200 μl DMSO. 
		UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej i wystarcza na około 30 płytek. Pluronic F-127 rozpuszcza się bardzo wolno w temperaturze pokojowej i należy go delikatnie podgrzać, aby ułatwić rozpuszczenie.</li>
		<li>Przygotować bufor ładujący barwnik, dodając najpierw 24 μl DMSO do fiolki Fluo-4/AM (50 μg) w celu rozpuszczenia barwnika. W owiniętej folią probówce wirówkowej o pojemności 15 ml dodać 6 ml buforu testowego HBSS-HEPES i uzupełnić 6 μl 10% Pluronic F-127 i 6 μl roztworu Fluo-4/AM. Krótko rozmieszać roztwór i pozostawić w temperaturze pokojowej, z dala od światła, przez 10 min. 
		UWAGA: Aby zapobiec fotowybielaniu Fluo-4, należy trzymać barwnik z dala od światła, owijając folią aluminiową probówkę wirówkową zawierającą roztwór barwnika i pokrywkę płytki testowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować płytki testowe.
	<ol>
		<li>Wyjąć płytkę testową z inkubatora i potwierdzić zbieżność za pomocą odwróconego mikroskopu. Ręcznie wyjmij kompletny nośnik DMEM, wrzucając go do zlewu i osuszając górną część talerza ręcznikiem papierowym. 
		UWAGA: Medium jest wystarczająco usuwane, trzymając płytkę poziomo i przesuwając, a następnie obracając płytkę o 180° i powtarzając.</li>
		<li>Dodać bufor do oznaczania HBSS-HEPES oraz roztwór probenecydu do zbiornika rozpuszczalnika do pipet wielokanałowych o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Ten roztwór będzie używany do późniejszych etapów prania i należy go odłożyć na bok i przykryć folią aluminiową do czasu, aż będzie potrzebny.</li>
		<li>Dodać 100 μl buforu do oznaczania HBSS-HEPES wraz z roztworem probenecydu do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej i pozostawić komórki w obecności probenecydu na 5 minut. Usunąć bufor testowy HBSS-HEPES, wrzucając go do zlewu w taki sam sposób, jak w kroku 3.2.1.</li>
		<li>Dodać bufor do ładowania barwnika do oddzielnego zbiornika rozpuszczalnika do pipet wielokanałowych o pojemności 50 ml. Dodać 50 μl buforu ładującego barwnik do każdego dołka na płytce testowej za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę przez 45 minut (37 °C, 5% CO2 ).</li>
		<li>Gdy płytka znajduje się w inkubatorze, należy przygotować roztwory agonisty/antagonisty.
		<ol>
			<li>Roztwory antagonistów są przechowywane w DMSO jako roztwory o pojemności 31,6 mM. W probówce do PCR rozcieńczyć 2 μl roztworu podstawowego 38 μl 0,1% BSA/wody, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1,58 mM. 2 μl tego roztworu da końcowe stężenie 31,6 μM na płytce testowej. Rozcieńczyć 4 μl 1,58 mM roztworu antagonisty 36 μl 5% DMSO/wody (bez dodatku BSA) i przygotować pozostałe stężenia przez seryjne rozcieńczenia.</li>
			<li>Przygotować 108,3 μM (16,7x) roztwór TFLLRN-NH2 w buforze testowym HBSS-HEPES, który da końcowe stężenie 6,5 μM po dodaniu 6 μL do każdego dołka płytki testowej. Na przykład rozpuść 2 mg podwielokrotności TFLLRN-NH2 w 5,244 ml buforu testowego HBSS-HEPES, aby uzyskać 0,5 mM roztworu podstawowego. Zmieszaj 1,083 ml tego roztworu z 3,917 ml buforu testowego HBSS-HEPES, aby uzyskać roztwór 108,3 μM. 
			UWAGA: Roztwory TFLLRN-NH2 należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C, gdy nie są używane.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i upewnić się, że barwnik jest wychwytywany za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w odpowiednim ustawieniu (zazwyczaj dla białka zielonej fluorescencji, patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 dla przykładu Fluo-4 pomyślnie załadowanego do komórek). Usuń bufor ładujący barwnik, przesuwając płytkę w taki sam sposób, jak w kroku 3.2.1.</li>
		<li>Przemyć komórki 2x 50 μl buforu do oznaczania HBSS-HEPES plus roztwór probenecydu (z kroku 3.2.3) w każdej studzience (usunąć przez wciśnięcie pożywki do zlewu).</li>
		<li>Dodaj 92 μl buforu testowego HBSS-HEPES do każdej studzienki i ponownie obejrzyj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby upewnić się, że nadmiar barwnika został całkowicie usunięty, a komórki pozostają przylegające.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 2 μl roztworów antagonistów i nośnika do odpowiednich studzienek (patrz tabela 1 w celu uzyskania reprezentatywnej mapy płytek).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przeprowadzanie testu mobilizacji wapnia
<ol>
	<li>Ustawić czytnik płytek w następujący sposób: temperatura: 37 °C; długość fali wzbudzenia: 485 nm; długość fali emisji: 525 nm; wysokość pomiaru: 7,8 mm (zoptymalizowana); liczba błysków: 100; liczba powtórzeń: 20.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 15 minut w czytniku płytek w temperaturze 37 °C. Zmierzyć fluorescencję tła w kolumnach 1 i 2 (pięć skanów na studzienkę).</li>
	<li>Wysunąć płytkę z czytnika płytek i szybko dodać 6 μl roztworu agonisty do każdej studzienki w kolumnach 1 i 2 z 8-probówkowego paska PCR za pomocą pipety wielokanałowej. 
	UWAGA: Na tym etapie używamy elektronicznej pipety 8-kanałowej z końcówkami do pipet 0,1-10 μl.</li>
	<li>Zmierz zmianę fluorescencji, gdy w komórkach zachodzi mobilizacja wapnia. Wykonaj 20 skanów każdej studzienki zgodnie z powyższymi ustawieniami. 
	UWAGA: Skanowanie każdej studzienki w dwóch kolumnach po 20x każda zajmuje około 5 minut (tj. ~15 s między skanami każdej studzienki).</li>
	<li>Powtórz kroki 4.2-4.4 dla kolumn 3-12 w odstępach co dwie kolumny.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Eksportuj dane z testu jako osobne arkusze kalkulacyjne dla każdej grupy dwukolumnowej.</li>
	<li>Znajdź średnią odczytów fluorescencji podstawowej za pomocą funkcji AVG (pierwsze skanowanie: ostatnie skanowanie). Zrób to dla każdego dołka w obu kolumnach.</li>
	<li>Znajdź maksymalną fluorescencję po dodaniu agonisty za pomocą funkcji MAX(pierwsze skanowanie: ostatnie skanowanie).</li>
	<li>Oblicz zmianę fluorescencji, odejmując fluorescencję podstawową od fluorescencji maksymalnej.</li>
	<li>Odjąć zmianę fluorescencji obliczoną dla kontroli ujemnej (dodanie nośnika bez agonisty) od każdej studzienki w tej samej kolumnie.</li>
	<li>Znajdź względną (znormalizowaną) zmianę fluorescencji, dzieląc zmianę fluorescencji w każdym basenie przez zmianę fluorescencji w nośniku (0,1% DMSO/woda) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 studzienka.</li>
	<li>Skopiuj wartości niekontrolne, jako procenty, do programu statystycznego i do tworzenia wykresów. Jeśli korzystasz z oprogramowania, do którego się odwołuje, wybierz opcję tabeli XY, z liczbami wybranymi jako oś X i replikuj wartości w podkolumnach obok siebie jako oś Y.</li>
	<li>Użyj programu, aby wykreślić krzywe stężenie-odpowiedź (CRC) na podstawie danych. W przypadku korzystania z oprogramowania, do którego się odwołuje, należy wybrać opcję logarytmu (inhibitora) a odpowiedzi - Zmienne nachylenie (cztery parametry).</li>
</ol>

Studying Protease-Activated Receptor Ligands in Endothelial Cells

C.D. jest wynalazcą patentów dotyczących parmodulin oraz założycielem i udziałowcem firmy Function Therapeutics, Inc., która opracowuje parmoduliny do użytku klinicznego.

Podczas gdy poprzednio zgłoszony protokół72 był ogólnie niezawodny i pozwolił nam zidentyfikować nową parmodulinę ołowiową, NRD-21,62 pożądany był bardziej wydajny protokół. Test został dodatkowo naruszony w czasie niedoboru dostaw spowodowanego pandemią COVID-19. Zdobycie końcówek do zautomatyzowanej maszyny do obsługi cieczy stało się trudne, a próba umycia, sterylizacji i ponownego użycia końcówek spowodowała powstanie CRC ze znaczną zmiennością. Ułatwiło to przeprowadzenie pilnej serii eksperymentów mających na celu usprawnienie ulepszonego testu mobilizacji wapnia sterowanego przez PAR.
Głównym priorytetem w tym badaniu było zidentyfikowanie odpowiedniej alternatywy dla stosowania automatycznego urządzenia do obsługi cieczy na etapach mycia. Podczas wcześniejszego opracowywania testów zastosowanie zrobotyzowanej maszyny do obsługi cieczy zmniejszyło liczbę błędów spowodowanych ręczną wymianą pożywki. Wydłużyło to jednak czas testu, ponieważ wymiana pożywek z 8-kanałowym urządzeniem do obsługi cieczy wydłużyła całkowity czas każdej płytki testowej o 30-45 minut. Chociaż wcześniej próbowano metody wymiany pożywki "miażdżącej", eksperymenty te przeprowadzono bez powlekania płytek testowych żelatyną przed wysiewem komórek. Dzięki wstępnej obróbce płytek żelatyną, komórki pozostały na swoim miejscu niezależnie od siły użytej do ręcznego usunięcia podłoża. CRC wygenerowane w teście przy użyciu pokrytych żelatyną, potrząsanych płytek miały lepsze wyniki dopasowania i mniejsze słupki błędów w wielu punktach danych niż krzywe, w których zastosowano zautomatyzowaną obsługę cieczy (Rysunek 4). Wartości błędu średniokwadratowego (RMSE) dla płytki przy użyciu automatycznego urządzenia do obsługi cieczy wynosiły 9,687 dla krzywej ML161 i 10,690 dla krzywej NRD-21, podczas gdy wartości RMSE dla płytki z użyciem żelatyny i ręcznej wymiany pożywki wynosiły 7,658 dla krzywej ML161 i 6,408 dla krzywej NRD-21. Niższe wartości RMSE wskazują krzywą, która lepiej pasuje do podanych danych. Ta zmiana również znacznie skraca całkowity czas testu. Alternatywnie można zastosować wielokanałową automatyczną myjkę do płyt.
Dodatkowym badanym czynnikiem była metoda dodawania agonistów. Wykonano to, aby ustalić, czy agonista może być dodany do wszystkich studzienek płytki jednocześnie, a następnie skan całej płytki jednocześnie; Wyeliminowałoby to konieczność pozostawania badaczy w pobliżu czytnika płytek przez cały czas trwania testu wrażliwego na czas dla wielu oddzielnych dodatków agonistów, co mogłoby znacznie zwiększyć przepustowość. Niestety, dodanie agonisty do wszystkich studzienek i przeskanowanie całej płytki było problematyczne, ponieważ odpowiedź jest zbyt szybka, aby wiarygodnie zmierzyć przejściowe maksymalne stężenie wapnia w każdym dołku, co daje bardzo zmienne CRC. Zmniejszenie liczby skanowanych kolumn z 12 do 6 nieznacznie poprawiło wyniki, ale najlepsze wyniki uzyskano skanując tylko dwie kolumny (16 dołków) jednocześnie. Można postawić hipotezę, że obniżenie temperatury testu z 37 °C do temperatury pokojowej może spowolnić zmianę stężenia wapnia na tyle, aby umożliwić wiarygodne pomiary. Chociaż wiele protokołów mobilizacji wapnia z różnymi barwnikami lub liniami komórkowymi zostało zwalidowanych w temperaturze pokojowej78,79, w tym konkretnym teście zaobserwowano poprawę wyników w temperaturze 37 °C. Zmierzone krzywe stężenie-odpowiedź antagonisty w temperaturze pokojowej (~23°C) nie były tak jednolite jak w temperaturze 37 °C (Figura 5A w porównaniu z Figurą 5B). Na podstawie tych wyników stwierdzono, że skanowanie dwóch kolumn jednocześnie w temperaturze 37 °C jest optymalne.
Inną zmienną, która została zbadana w celu skrócenia czasu testu, był czas inkubacji antagonisty. W poprzednim protokole antagoniści byli inkubowani przez 40 minut przed dodaniem agonisty, ale tutaj ustalono, że 15 minut to wystarczający czas, aby parmoduliny oddziaływały z PAR1. Testowano to, dodając roztwory parmoduliny do wielu kolumn w tym samym czasie, a następnie dodając agonistę w różnych punktach czasowych (agonista dodawano w t = 15 min, 30 min i 45 min). Aktywność parmodulin została zachowana, ale nie uległa poprawie, dzięki dłuższej inkubacji antagonistów. W wyniku tego odkrycia, w nowym protokole, roztwory antagonistów są dodawane jednorazowo do całej płytki, a roztwory agonistów są dodawane do pierwszych kolumn po inkubacji trwającej 15 minut. Ta zmiana jeszcze bardziej skraca całkowity czas eksperymentu o 30 minut. Należy zauważyć, że antagoniści o powolnej kinetyce wiązania, tacy jak worapaksar, mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji80,81.
Podczas gdy skrócenie czasu testu i wyeliminowanie polegania na urządzeniu do obsługi płynów były głównymi czynnikami wymagającymi aktualizacji protokołu testu, przetestowano również alternatywną metodę hodowli komórek. Wcześniej talerze wysiewano komórkami bezpośrednio z zamrożonych zapasów i pozostawiano do wzrostu w talerzach przez 40-48 godzin po wysianiu. Jednak wydłużony czas między płytkami wysiewającymi a wykonywaniem testów ograniczał liczbę eksperymentów, które można było przeprowadzić każdego tygodnia. Korzystanie z komórek hodowanych w kolbach hodowlanych drastycznie skraca ten czas. Komórki hodowano w kolbach T-75 poddanych hodowli tkankowej i usunięto z powierzchni kolby za pomocą nieenzymatycznego środka dysocjacji komórek. Może to być ważne, aby uniknąć uszkodzenia niektórych receptorów powierzchniowych komórek, w szczególności PAR2, za pomocą trypsyny. Po dodaniu do płytki testowej komórki potrzebują odpowiedniego czasu, aby się uspokoić i przykleić do żelatyny. Ponieważ metoda usuwania pożywki może również przemieścić komórki, potrzeba wystarczająco dużo czasu, aby komórki mogły zostać osadzone w żelatynie. Eksperyment, w którym komórki mogły się uspokoić przez dwie godziny, spowodował znaczną utratę komórek, co spowodowało, że test nie nadawał się do użytku (dane nie pokazane). Czas osiadania od 2 h do 12 h ogranicza liczbę płytek, które można przeanalizować w ciągu jednego dnia, dlatego preferowana jest dłuższa inkubacja przez noc. Stwierdzono, że inkubacja nowo wyhodowanych komórek w dowolnym miejscu od 16 do 24 godzin pozwoliła komórkom w pełni przykleić się do żelatyny i można uzyskać powtarzalne dane.
Przejście z komórek zamrożonych na komórki wyhodowane w kolbach hodowlanych również zmieniło optymalną gęstość wysiewu komórek. Jak można było przewidzieć, wysiewanie studzienek przy gęstości 25 000 komórek/studzienkę, która była standardem w poprzednim protokole, nie pozwalało komórkom na osiągnięcie konfluencji przy krótszym czasie inkubacji. Agonistyczne CRC zostały wygenerowane z ośmioma oddzielnymi gęstościami komórek w celu określenia optymalnych warunków (Figura 6). Wcześniej TFLLRN-NH2 był stosowany jako agonista PAR1 w dawce 5 μM, ponieważ pozwalało to na rozsądny antagonizm z parmodulinami o niższej rozpuszczalności. Nie ma znaczącej różnicy w tle lub maksymalnym sygnale podczas wysiewu z 45 000-65 000 komórek / studzienkę, ale następuje spadek zmienności przy 5 μM TFLLRN-NH2 po dodaniu 60 000 komórek / studzienkę. Co ciekawe, nie ma znaczącego wzrostu maksymalnej fluorescencji przy większej liczbie komórek, więc 60 000 komórek/studzienkę wybrano jako optymalną gęstość ze względu na zmniejszoną zmienność. Agonistyczne CRC wytwarzały również EC50 o wartości 6,5 μM dla TFLLRN-NH2, więc wybrano je jako nowe standardowe stężenie agonistów.
Kolejnym czynnikiem, który został przeanalizowany, były objętości użyte w teście. W poprzednim protokole do każdej studzienki dodano 2 μl agonisty, aby uzyskać końcową objętość testu 200 μl. Postawiono hipotezę, że dodanie większych objętości roztworu agonisty - ale przy utrzymaniu stałego stężenia końcowego - może pomóc w mieszaniu, powodując szybszy i bardziej wiarygodny sygnał. Aby przetestować tę hipotezę, porównano dodanie 2 μl, 6 μl i 10 μL TFLLRN-NH2 do 100 μl lub 200 μl HEPES-HBSS na płytce testowej zawierającej różne stężenia NRD-21. Wygenerowano CRC NRD-21 z każdego stanu, aby określić, która kombinacja objętości agonisty i końcowej objętości testu dała najbardziej spójne dane. Podczas gdy zarówno dodanie 2 μL, jak i 6 μL spowodowało wygenerowanie CRC o niewielkiej zmienności, tego samego nie można powiedzieć o krzywych uzyskanych z dodania 10 μL TFLLRN-NH2 (dane nie pokazane); wzrost fluorescencji nie był spójny w tych studniach ani pod względem wielkości, ani czasu, co powoduje powstawanie CRC, które powinny być identyczne, ale zamiast tego drastycznie się różnią. Chociaż dodanie 2 μl i 6 μl dało podobne wyniki, zmiana fluorescencji nastąpiła znacznie szybciej po dodaniu 6 μl TFLLRN-NH2, co pozwoliło na zmniejszenie całkowitej liczby skanów w każdym studzience o połowę, z 40 skanów do 20 skanów. Ustalono również, że użycie końcowej objętości 100 μL daje bardziej jednorodne CRC w porównaniu z tymi generowanymi przy końcowej objętości 200 μL (ryc. 7).
Aby określić, czy nowy protokół jest odpowiedni dla testów o wyższej przepustowości, obliczono współczynniki Z' dla testu (ryc. 8). Współczynnik Z' jest metodą statystyczną mierzącą jakość testu przesiewowego i określającą, czy test wiarygodnie rozróżni związki aktywne i nieaktywne82. Współczynniki Z' obliczono dla testów wykonanych między 16 a 24 godzinami po wysiewie płytek i przy różnych przejściach komórkowych. We wszystkich przypadkach - zarówno dla samych trybów agonisty, jak i agonisty plus antagonisty - obliczone współczynniki Z' były większe niż 0,5, co wskazuje na doskonały test82. Obliczone współczynniki Z' były również podobne do tych obliczonych dla poprzedniego testu, co wskazuje, że zmiany wprowadzone do protokołu w celu uzyskania szybszego testu nie wpłynęły negatywnie na jakość.
Protokół mobilizacji wapnia sterowanej przez PAR został zaktualizowany poprzez eksperymenty generujące wartości IC50 z CRC, ale test może być również wykorzystany do pomiaru skuteczności antagonistów PAR1 w pojedynczych stężeniach. Test może być również stosowany do pomiaru aktywności ligandów PAR2; na przykład agonista PAR2 SLIGKV-NH2 może zastąpić TFLLRN-NH2 w zaktualizowanym protokole (ryc. 9); poprzedni protokół był również stosowany z agonistami i antagonistami PAR283. Chociaż nie został tutaj wyraźnie przetestowany, protokół ten powinien mieć również zastosowanie do ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), które były używane w poprzednim protokole, i potencjalnie innych przylegających linii komórkowych. Ograniczeniem w korzystaniu z czytnika płyt skanujących z protokołami takimi jak ten jest to, że nie nadają się one do badania szybkich (subsekundowych) reakcji, a przynajmniej nie równolegle, jak jest to możliwe w przypadku imagera płytowego.
Podsumowując, opisano tutaj szybszy i prostszy protokół testu mobilizacji wapnia sterowanego śródbłonkiem przez PAR przy użyciu czytnika płytek. Eliminując potrzebę stosowania zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy, skracając czas inkubacji antagonistów i zmniejszając liczbę skanów dla każdej studzienki, całkowity czas testu został skrócony o co najmniej 90-120 minut, a koszty testów zostały zmniejszone (w celu porównania między poprzednio zgłoszonymi a obecnymi protokołami, patrz tabela 2). Pozwoli to nie tylko na badanie przesiewowe większej liczby związków każdego dnia, ale także wyeliminuje ryzyko zmniejszenia okna testowego z powodu wypływu barwnika, co może prowadzić do niewiarygodnych wyników. Nowo zoptymalizowany test pozwala na szybsze badanie przesiewowe w komórkach śródbłonka ligandów PAR1 lub PAR2 lub potencjalnie innych ligandów GPCR, które aktywują wewnątrzkomórkową mobilizację wapnia, w laboratoriach ograniczonych do stosowania czytników płytkowych.

Receptory aktywowane proteazą (PAR)1,2,3 są podrodziną receptorów sprzężonych z białkiem G klasy A (GPCR), które ulegają ekspresji w różnych typach komórek, w tym w płytkach krwi i komórkach śródbłonka4,5,6,7. W przeciwieństwie do większości GPCR, PAR mają unikalny wewnątrzcząsteczkowy tryb aktywacji. Większość GPCR jest aktywowana przez rozpuszczalne ligandy oddziałujące z wyraźną kieszenią wiążącą, ale PAR są aktywowane przez proteolityczne rozszczepienie N-końca, co skutkuje nowym ligandem na uwięzi, który może wchodzić w interakcje z domeną pętli zewnątrzkomórkowej 2 na powierzchni komórki6,8,9. Ta interakcja aktywuje receptor i może zainicjować kilka szlaków sygnałowych, promując takie efekty, jak stan zapalny i aktywacja płytek krwi4,10,11,12. Różne proteazy mogą aktywować PAR poprzez rozszczepienie w unikalnych miejscach na N-końcu, ujawniając różne ligandy na uwięzi (TL), które stabilizują konformacje receptorów, które inicjują różne szlaki sygnałowe9,13,14,15. Na przykład u najlepiej zbadanego członka podrodziny, PAR1, rozszczepienie przez trombinę jest wykorzystywane do wspierania wielu procesów biologicznych, w tym aktywacji płytek krwi i rekrutacji leukocytów do śródbłonka, ale może prowadzić do szkodliwych skutków, gdy receptor jest nadmiernie eksprymowany lub nadmiernie aktywowany4,16,17,18,19,20,21. I odwrotnie, rozszczepienie przez aktywowane białko C (aPC) może sprzyjać działaniu przeciwzapalnemu i utrzymaniu barier śródbłonka15,22,23,24,25,26,27,28,29. PAR mogą być również aktywowane przez analogi peptydowe TL w sposób międzycząsteczkowy13,30,31. Peptydy te są rutynowo stosowane do pomiaru hamowania (modulacji) PAR zamiast proteaz ukierunkowanych na PAR i są stosowane w tym protokole.
Liczne zaburzenia są związane z patologiczną sygnalizacją PAR1, w tym sepsa22,32, choroby sercowo-naczyniowe33,34,35,36,37,38, choroba nerek39, 40,41,42, niedokrwistość sierpowatokrwinkowa43, zwłóknienie44, osteoporoza i choroba zwyrodnieniowa stawów45,46, neurodegeneracja47,48,49,50, 51, and cancer52,53,54,55,56,57,58,59. Antagoniści PAR1 są badani od lat 90. XX wieku jako leki przeciwpłytkowe w chorobach sercowo-naczyniowych, a rosnąca lista chorób związanych z receptorem wymaga identyfikacji nowych ligandów do stosowania jako sondy biologiczne (związki narzędziowe) lub jako potencjalne środki terapeutyczne. Obecnie istnieje tylko jeden zatwierdzony przez FDA antagonista PAR1, worapaksar, który jest stosowany w leczeniu choroby wieńcowej u pacjentów wysokiego ryzyka34,36,37,60. Alternatywny antagonista PAR1, pepducyna PZ-128, zakończył udane badanie II fazy mające na celu zapobieganie zakrzepicy u pacjentów po cewnikowaniu serca38. Grupa Dockendorffa skupiła się na chemii medycznej i farmakologii odrębnej klasy małych cząsteczek, ligandów PAR1 znanych jako parmoduliny61,62. W przeciwieństwie do zgłaszanych antagonistów PAR1, takich jak worapaksar, parmoduliny są allosterycznymi, stronniczymi modulatorami PAR1, które selektywnie blokują szlak Gαq, jednocześnie promując działanie cytoprotekcyjne podobne do aPC. W przeciwieństwie do silnych ortosterycznych antagonistów PAR1, takich jak worapaksar, opublikowane parmoduliny są również odwracalne63,64,65.
Początkowo, parmoduliny zostały zidentyfikowane przez Flaumenhafta i współpracowników ze względu na ich zdolność do hamowania ekspresji selektoryny P lub wydzielania granulek w płytkach krwi61,66. Potrzebna była jednak alternatywna metoda, aby zbadać wpływ parmodulin na komórki śródbłonka. Jedną z powszechnych metod monitorowania sygnalizacji związanej z GPCR jest pomiar wewnątrzkomórkowej mobilizacji Ca2 +, ważnego wtórnego przekaźnika, który można zmierzyć za pomocą odpowiedniego wewnątrzkomórkowego barwnika wiążącego wapń 67,68. Dostarczono istotnych dowodów wskazujących, że mobilizacja wapnia indukowana przez PAR1 odbywa się poprzez aktywację Gαq69,70. Po aktywacji przez swój ligand na uwięzi (lub odpowiedni ligand egzogenny), PAR1 ulega zmianie konformacyjnej, która powoduje, że difosforan guanozyny (GDP) związany z podjednostką Gαq jest zastępowany trifosforanem guanozyny (GTP)<klasa sup = "xref">68. Podjednostka Gαq następnie aktywuje fosfolipazę Cβ (PLC-β), która katalizuje hydrolizę 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu (PIP2), tworząc trifosforan 1,4,5-inozytolu (IP3) i diacyloglicerol (DAG). Wreszcie, IP3 wiąże się z wrażliwymi na IP3 kanałami Ca2 + w błonie retikulum endoplazmatycznego, umożliwiając uwolnienie Ca2 + do cytoplazmy, gdzie może wiązać się z zależnymi od Ca2 + barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak Fluo-4, które są dodawane do komórek71. Proces ten zachodzi w ciągu kilku sekund i może zwiększyć stężenie Ca2+ 100-krotnie, co prowadzi do drastycznej zmiany ilości barwnika związanego z wapniem i silnego sygnału fluorescencji.
W 2018 roku grupa Dockendorffa ujawniła test mobilizacji Ca2+ o średniej przepustowości, który może być wykorzystany do identyfikacji antagonistów szlaku Gαq klasy PAR1<sup="xref">72. W teście wykorzystano EA.hy92673, hybrydową linię komórek ludzkiego śródbłonka, która może być używana do wielu pasaży bez zauważalnej zmiany ekspresji PAR1 i jest przeznaczona do pomiarów in vitro efektów cytoprotekcyjnych. 
Oryginalny protokół używał komórek EA.hy926 w 96-dołkowych płytkach i załadowanych barwnikiem Fluo-4/AM, który został wybrany ze względu na jego intensywną fluorescencję przy 488 nm i wysoką przepuszczalność komórek. Po załadowaniu barwnika do komórek przeprowadzano długie etapy mycia za pomocą zautomatyzowanego 8-kanałowego urządzenia do obsługi cieczy (szybsze metody obsługi cieczy, takie jak myjka 96-kanałowa, były niedostępne). Powtarzalność tego testu była lepsza niż w przypadku braku starannej, zautomatyzowanej zmiany pożywek za pomocą robota. Antagoniści byli następnie inkubowani z komórkami, PAR1 był aktywowany poprzez sekwencyjne dodawanie selektywnego agonisty (16 dołków na raz), a zmiany fluorescencji wynikające z mobilizacji wapnia i wiązania barwnika mierzono w celu określenia aktywności.
Chociaż ten protokół pozwala na pomiar mobilizacji wapnia za pośrednictwem PAR1, jest on ograniczony przez czas potrzebny do zbadania każdej płytki 96-dołkowej. Długi czas eksperymentu jest problematyczny nie tylko dlatego, że liczba związków, które można badać przesiewowo każdego dnia, jest ograniczona, ale także dlatego, że wypływ barwnika następuje z czasem, zawężając okno testowe poprzez zwiększenie podstawowej fluorescencji. Jednym z czynników przyczyniających się do długiego czasu eksperymentu jest użycie 8-kanałowego płynu do mycia płyt, co wydłuża każdy eksperyment o ponad 30 minut. Wymagane napiwki stały się również trudne do uzyskania ze względu na problemy z łańcuchem dostaw. W tym miejscu przedstawiono zaktualizowany protokół testu mobilizacji wapnia za pośrednictwem PAR, który nie wymaga obsługi cieczy, a zatem może być uruchamiany z większą przepustowością. Protokół ten powinien być również odpowiedni do pomiaru sygnalizacji za pomocą innych GPCR, które prowadzą do wewnątrzkomórkowej mobilizacji wapnia. Ten zaktualizowany protokół czytnika płytek jest idealny dla laboratoriów akademickich i małych laboratoriów przemysłowych, które nie mają zasobów na drogie instrumenty do obrazowania komórek, ale mają potrzebę szybkiego badania przesiewowego wielu związków. Przykład testu mobilizacji wapnia przy użyciu obrazowania płytkowego można znaleźć w Caers et al.74.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki do hodowli komórkowych Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adherent EA.hy926 cells</td><td></td><td>ATCC CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper Odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>Trypsyna może być opcjonalnie stosowana, ale zdecydowanie należy jej unikać w testach PAR2.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z czerwienią fenolową</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Avantor</td><td>97068-091</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni</td><td>MilliporeSigma</td><td>G2500</td><td>Służy do przygotowania wodnego roztworu 0,4% (w/v) z wodą dejonizowaną. Autoklaw przed użyciem do sterylizacji.</td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy (0,4% w/v)</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Odczynniki do mobilizacji wapnia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy kwas (HEPES)</td><td>Thermo</td><td>172571000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Avantor</td><td>97061-420</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Thermo</td><td>42352-0250</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Thermo</td><td>J66650-AD</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (bez Ca/Mg/czerwieni fenolowej)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (Poloxamer 407)</td><td>Spectrum Chemical</td><td>P1166</td><td></td></tr><tr><td>Probenecyd</td><td>TCI America</td><td>P1975</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>VWR International</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>TFLLRN-NH2 (sól TFA)</td><td></td><td></td><td>Przygotowane przez Trudy Holyst w Versiti Blood Instytut Badawczy</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well z kulturą poddawaną obróbce kulturowej, czarnościenna, przezroczysta dolna płytka testowa</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>z przezroczystymi pokrywkami</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa, 15 ml</td><td>Avantor</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa, 50 ml</td><td>Avantor</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Kolba hodowlana, T-75</td><td>Corning</td><td>353136</td><td>kultura tkankowa poddana działaniu</td></tr><tr><td>Jednorazowy zbiornik na odczynniki, 50 ml</td><td>Corning</td><td>RES-V-50-S</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek Enspire</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Wycofane</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek, 1,5 ml</td><td>Avantor</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura, 9"</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td>musi być wysterylizowana</td></tr><tr><td>Pasek probówki PCR z oddzielnym płaskim Paski z nakrętkami</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 20 i mikro; L</td><td>Biotix</td><td>63300042</td><td>sterylne, filtrowane końcówki</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 200 i mikro; L</td><td>Biotix</td><td>63300044</td><td>sterylne, filtrowane końcówki</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 1250 i mikro; L</td><td>Biotix</td><td>63300047</td><td>sterylne, filtrowane końcówki</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>objętość 6 używana</td></tr><tr><td>pipeta serologiczna, 5 ml</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5005</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna, 10 ml</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5010</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna, 25 ml</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; Numer katalogowy: 07-5025</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka modulatorów receptorów aktywowanych proteazą za pomocą testu mobilizacji wapnia za pomocą czytnika płytek

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader

Zmiany w stężeniu wapnia w komórkach są szybko monitorowane w sposób wysokoprzepustowy za pomocą wewnątrzkomórkowych, fluorescencyjnych, wiążących wapń barwników i przyrządów do obrazowania, które mogą mierzyć emisje fluorescencyjne z maksymalnie 1 536 odwiertów jednocześnie. Jednak instrumenty te są znacznie droższe i mogą być trudne w utrzymaniu w porównaniu z powszechnie dostępnymi czytnikami płytek, które skanują studnie indywidualnie. Opisano tutaj zoptymalizowany test czytnika płytek do stosowania z linią komórek śródbłonka (EA.hy926) w celu pomiaru aktywacji sygnalizacji Gαq za pomocą receptora aktywowanego proteazą (PAR) i późniejszej mobilizacji wapnia przy użyciu barwnika wiążącego wapń Fluo-4. Test ten został wykorzystany do scharakteryzowania szeregu ligandów PAR, w tym allosterycznych ligandów przeciwzapalnych "parmoduliny" ukierunkowanych na PAR1, zidentyfikowanych w laboratorium Dockendorffa. Protokół ten eliminuje potrzebę stosowania zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy i umożliwia średnioprzepustowe badania przesiewowe ligandów PAR w 96-dołkowych płytkach i powinien mieć zastosowanie do badania innych receptorów, które inicjują mobilizację wapnia.

Celem tego testu jest zazwyczaj wyznaczenie krzywych zależności dawka-odpowiedź (CRCs) dla trzech do czterech nowych parmodulin. Na każdej płytce testowej często generuje się dodatkową krzywą CRC dla znanego związku, takiego jak NRD-21, który dzięki znanej wartości IC50 służy jako kontrola jakości eksperymentu. W celu wygenerowania krzywych CRC należy zaplanować mapę płytki, taką jak ta przedstawiona w Tabeli 1. Jeśli zamiast tego pożądane są odpowiedzi stężeniowe dla pojedynczych punktów, związki o stężeniu końcowym 10 µM (lub innych preferowanych stężeniach) należy dodać do co najmniej trzech dołków.
Podczas przeprowadzania testu, czytnik płytek powinien wykazać szybki wzrost fluorescencji (wzrost powinien rozpocząć się w ciągu pierwszych 3-4 pomiarów; przykład prawidłowego wyniku w porównaniu z wynikiem błędnym przedstawiono na Rysunku 2A i Rysunku 2B). Należy pamiętać, że agonistę należy dodać szybko (w ciągu 15 s), aby czytnik płytek mógł dokładnie zarejestrować wzrost fluorescencji. W prawidłowo przebiegającym eksperymencie sygnał fluorescencji w studni z nośnikiem powinien pozostać płaski, natomiast sygnał fluorescencji w studniach kontroli dodatniej (nośnik + 6,5 µM TFLLRN-NH2) powinien zacząć wzrastać po trzech lub czterech pomiarach. Po osiągnięciu wartości maksymalnej (po ok. 10 pomiarach), sygnał fluorescencji powinien zacząć powoli spadać. W eksperymentach z antagonistami o wysokiej skuteczności, studnie z najwyższymi stężeniami antagonisty powinny wykazywać sygnał pozostający stosunkowo płaski, podobnie jak w kontroli ujemnej. Różnica między sygnałem w studniach kontroli dodatniej a studniami z niskimi stężeniami antagonisty powinna być również niewielka (Rysunek 2C). Jeśli najniższe stężenia antagonisty nadal hamują mobilizację wapnia, należy dostosować zakres stężeń do badania, aby objął on niższe wartości. Wygenerowane krzywe dawka-odpowiedź (CRC) powinny posiadać przynajmniej jeden punkt danych na poziomie ~100%, aby w pełni ukazać sigmoidalny charakter krzywej.
Najbardziej powszechną oznaką niepowodzenia eksperymentu jest brak znacznego wzrostu fluorescencji w studni kontroli pozytywnej (nośnik + 6.5 µM TFLLRN-NH2) (Rysunek 2B). Może to wynikać z różnych przyczyn: liczba komórek może być zbyt niska (jeśli nie potwierdzono stopnia konfluencji), roztwór agonisty może być zanieczyszczony lub uszkodzony, albo komórki mogły pobrać niewystarczającą ilość barwnika. Istnieje również możliwość przypadkowego pominięcia dodania agonisty do niektórych studni.
Przy zastosowaniu zaprogramowanej metody dane są eksportowane do sześciu oddzielnych arkuszy kalkulacyjnych, z których każdy zawiera dane dla dwóch kolumn. Pięć skanów fluorescencji bazowej znajduje się we własnym wierszu, a 20 skanów wykonanych po dodaniu agonisty w wierszu bezpośrednio poniżej (reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunku 3). Jako przykład obliczeń wykorzystano kolumnę z eksperymentu z użyciem NRD-21. W wyeksportowanym pliku (rysunek 3) fluorescencja bazowa z każdej studni jest przypisana do kolumn od C do G, a dane z pomiarów po dodaniu agonisty (kolejne 20 skanów) do kolumn od C do V w następnym wierszu. Wiersze 14-17 w pliku zawierają kontrolę pozytywną dla dwóch oddzielnych kolumn. Średnią z wiersza bazowego dla jednej ze studni kontroli pozytywnej obliczono za pomocą polecenia „=AVERAGE(C16:G16)”, co dało wartość 1,039.8. Polecenie to powtórzono dla dodatkowych pomiarów bazowych w każdej studni. Wartość maksymalną skanów eksperymentalnych obliczono za pomocą polecenia „=MAX(C16:V16)”, co dało wartość 2,629. Ponownie polecenie to powtórzono dla wszystkich studni. Następnie od wartości maksymalnej odjęto fluorescencję bazową dla każdej studni. W tym eksperymentcie dane znormalizowano poprzez odjęcie zmiany fluorescencji w kontroli negatywnej od każdej studni (co w kolumnie przykładu wynosiło 142.6). Wartości te podzielono następnie przez analogicznie obliczoną wartość kontroli pozytywnej. W tej kolumnie wartość maksymalna wynosiła 2,629, średni pomiar bazowy 1,039.8, a wartość odjęta dla próby ślepej wynosiła 142.6. Skorygowana wartość kontroli pozytywnej wynosi zatem 1,446.6 (obliczona na podstawie równania). Równanie to powtórzono dla każdej studni w kolumnie, a obliczone wartości podzielono przez 1,446.6, aby uzyskać ich względną zmianę fluorescencji. Stosunki te przekształcono następnie w wartości procentowe i skopiowano do oprogramowania analitycznego. Proces ten powtórzono dla pozostałych 11 kolumn.
Aby przetworzyć dane za pomocą wskazanego oprogramowania, należy wybrać tabelę XY z opcją trzech powtórzeń pomiarów w sąsiadujących kolumnach. Wartości -log każdego stężenia należy wprowadzić jako wartości x, a obliczone wartości procentowe jako wartości y. Następnie należy przeprowadzić nieliniową analizę regresji danych, co pozwoli na wygenerowanie czterech krzywych zależności odpowiedź-stężenie. Program generuje również wartości IC50, statystyki błędu ilościowego oraz statystyki dopasowania modelu.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek zabarwionych na zielono, obraz mikroskopowy, analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Fluo-4/AM wprowadzony do komórek EA.hy926. Fluo-4 selektywnie wprowadzony do komórek EA.hy926 po etapach inkubacji z barwnikiem i przemywania. Cała fluorescencja znajduje się wewnątrz komórek, bez wycieku barwnika. Obraz uzyskany przy użyciu ustawienia GTP w obrazowniku komórkowym EVOS i 20-krotnym powiększeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza danych testu fluorescencyjnego; wynik z czytnika płytek i wykres RFU przedstawiający wpływ agonisty." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Potencjalny wynik testu. (A) Reprezentatywny wynik z czytnika płytek dla prawidłowo przeprowadzonego testu. Rząd A stanowi kontrolę negatywną i nie wykazuje zmian fluorescencji. Rząd B stanowi kontrolę pozytywną i wykazuje szybki wzrost fluorescencji. Rzędy C-H to studzienki eksperymentalne, w których wyższe stężenia parmoduliny znajdują się w dolnej części płytki. (B) Przykład wyniku nieudanego eksperymentu. W rzędzie B, będącym kontrolą pozytywną, nie obserwuje się wzrostu fluorescencji. (C) Zmiana fluorescencji w czasie indukowana przez agonistę PAR1 TFLLRN-NH2. Skanowanie dwóch kolumn płytki 96-dołkowej przy użyciu podanych ustawień trwa ok. 5 min na czytniku płytek PerkinElmer EnSpire (tj. ok. 15 s pomiędzy skanowaniami poszczególnych studzienek). Różne roztwory NRD-21 są oznaczone zgodnie z opisem, „Agonist” to 6,5 µM TFLLRN-NH2, n = 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tabela danych z płytki do analizy eksperymentu; zawiera pomiary, temperatury komór oraz temperaturę otoczenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykład wyników w programie Excel dla sprawnego testu. Fluorescencja bazalna jest wyprowadzana do wierszy o numerach parzystych, zaczynając od wiersza 10, natomiast wyniki z pierwszych 10 skanów po dodaniu agonisty są przedstawione w kolejnych wierszach o numerach nieparzystych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywe dawka-odpowiedź dla efektów antagonistycznych; analiza wykresów ML161 i NRD-21 w stymulacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Robotyczne dozowanie cieczy a metoda „strzepywania” (flicking). Wstępne pokrycie płytek testowych żelatyną i ręczne przeprowadzanie wymian mediów poprzez strzepywanie płytki i osuszanie jej dotykowo pozwala uzyskać krzywe stężenie-odpowiedź o niższej zmienności. (A) Krzywe stężenie-odpowiedź dla parmodulin ML161 i NRD-21 oraz 5 µM TFLLRN-NH2, n = 3 (zautomatyzowane dozowanie cieczy). (B) Krzywe stężenie-odpowiedź dla parmodulin ML161 i NRD-21 oraz 5 µM TFLLRN-NH2, n = 3 (płytki pokryte żelatyną, strzepywane). Dane przedstawiono jako średnie ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywe zależności dawka-odpowiedź dla ML161 w temperaturze pokojowej i 37°C; wykres przedstawiający %stymulacji względem log[ML161, M]." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Badania nad wpływem temperatury. Przeprowadzenie analizy w temperaturze 37 °C generuje bardziej powtarzalne dane niż w temperaturze pokojowej. (A) Krzywe zależności stężenie-odpowiedź dla ML161 i 5 µM TFLLRN-NH2, n = 3 (temperatura pokojowa). (B) Krzywe zależności stężenie-odpowiedź dla ML161 i 5 µM TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C). Dane przedstawiono jako średnie ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywe dawka-odpowiedź; log [TFLLRN-NH2] względem krotności zmiany; EC50 6,5µM; wykres; testy komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Badania gęstości komórek. Optymalna gęstość komórek wynosi 60 000 komórek/dołek przy wysiewie na 16–24 h przed rozpoczęciem testu. (A) Krzywe koncentracja-odpowiedź TFLLRN-NH2 przy różnych gęstościach komórek, n = 3. (B) Krzywa koncentracja-odpowiedź TFLLRN-NH2 przy optymalnej gęstości komórek wynoszącej 60 000 komórek/dołek. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres zależności dawka-odpowiedź %stymulacji w funkcji log[ML161, M]; porównanie objętości 100 µL i 200 µL." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Objętość testu. Zastosowanie objętości testu 100 µL pozwala na uzyskanie bardziej powtarzalnych krzywych zależności stężenie-odpowiedź niż w testach z objętością końcową 200 µL. (A) Krzywe zależności stężenie-odpowiedź dla ML161 i 5 µM TFLLRN-NH2, n = 3 (objętość końcowa 200 µL). (B) Krzywe zależności stężenie-odpowiedź dla ML161 i 5 µM TFLLRN-NH2, n = 3 (objętość końcowa 100 µL). Dane przedstawiono jako średnie ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki RFU inkubacji komórek; wykres przedstawiający RFU po 16 h/24 h dla różnych zabiegów chemicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Wyznaczanie czynników Z' w celu określenia zdolności testu do wykrywania związków hitowych. Odpowiedzi mobilizacji wapnia po podaniu 6,5 µM TFLLRN-NH2 (kolumna B) oraz opcjonalnych antagonistów PAR1: 10 µM NRD-21 (kolumna C) lub 0,316 µM vorapaksaru (kolumna D). (A) Test zakończony 16 h po wysianiu komórek. (B) Test zakończony 24 h po wysianiu komórek. (C) Tabela obliczonych czynników Z' przy użyciu następującego równania: <img alt="Równanie czynnika Z (Z') dla jakości testu; wzór matematyczny do analizy spójności." src="/files/ftp_upload/66507/66507eq01v5.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">, gdzie σp to odchylenie standardowe kontroli pozytywnej, σn to odchylenie standardowe kontroli negatywnej lub próbki, μp to średnia kontroli pozytywnej, a μn to średnia kontroli negatywnej lub próbki. Każda wartość została obliczona poprzez wyznaczenie roztworu nośnika + 6,5 μM TFLLRN-NH2 jako kontroli pozytywnej i porównanie jej z wskazanym warunkiem jako kontrolą negatywną (nośnik) lub próbką (NRD-21 i vorapaksar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres RFU w funkcji skanów pokazujący wzrost fluorescencji; analiza wyników potencjalnego testu fluorescencyjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Mobilizacja wapnia indukowana agonistą PAR2. Zmiana fluorescencji w czasie indukowana 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4. Dane przedstawiono jako średnie ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Przykładowy schemat płytki 96-dołkowej do przesiewania związków. Każde stężenie jest mierzone w trzech powtórzeniach. Wiersz A zawiera kontrole negatywne (brak antagonisty; brak agonisty), a wiersz B zawiera kontrole pozytywne (brak antagonisty; obecny agonista). Kolumny od 1 do 3 zawierają sześć stężeń parmoduliny NRD-21 w odstępach półlogarytmicznych, które mogą być opcjonalnie wykorzystane do kontroli jakości. PM-A, PM-B, PM-C to nienazwane parmoduliny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507_Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Porównanie wcześniej opublikowanego protokołu z nowym, zoptymalizowanym protokołem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507_Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Opracowano ulepszony protokół testu mobilizacji wapnia z komórkami śródbłonka, używanego do identyfikacji ligandów receptorów aktywowanych proteazą (PAR). Nowy protokół skraca całkowity czas oznaczania o 90-120 minut i pozwala uzyskać powtarzalne krzywe stężenie-odpowiedź.

Charakterystyka modulatorów receptorów aktywowanych proteazą za pomocą testu mobilizacji wapnia za pomocą czytnika płytek

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding ...

Nasze laboratorium pracuje nad zrozumieniem, w jaki sposób modulacja receptorów aktywowanych proteazą może hamować stan zapalny. Opracowaliśmy nową klasę małych cząsteczek zwanych parmamodlinami, które modulują aktywność Par 1. Celem jest odkrycie parmadolin o ulepszonych właściwościach do potencjalnego zastosowania jako kandydaci na leki, a także zrozumienie ich sposobu działania.W badaniach przedklinicznych z naszymi współpracownikami ustaliliśmy, że parmadoliny mogą być szczególnie obiecujące w leczeniu zaburzeń spowodowanych zapaleniem skrzeplin, w tym chorób nerek, wątroby i układu krążenia. Ich sposób działania może również umożliwić opracowanie związków o lepszym profilu bezpieczeństwa niż wcześniejsze Par 1 przeznaczone dla kandydatów na leki. Receptor Par 1 jest ważny dla aktywacji płytek krwi, ale jego sygnalizacja w komórkach śródbłonka jest również ważna i istotna w wielu patologiach.Dlatego chcieliśmy opracować tani i wygodny protokół do badania aktywności parmadolinów i hodowanych komórek śródbłonka. Jesteśmy tutaj, aby podzielić się zaktualizowanym protokołem pomiaru mobilizacji wapnia, który wykorzystuje standardowy czytnik płytek i nie wymaga automatycznego urządzenia do obsługi cieczy. Nadaje się do badań przesiewowych ligandów Par 1 w komórkach śródbłonka, ale teoretycznie może być używany do pomiaru aktywności dowolnych związków wpływających na mobilizację wapnia.Aby rozpocząć, ułóż wymagane materiały eksperymentalne na platformie roboczej. Dodaj 100 mikrolitrów sterylnego 0,4% roztworu żelatyny do studzienek czarnej ścianki 96-dołkowej przezroczystej płytki dolnej. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut.Pod odwróconym mikroskopem potwierdź, że komórki śródbłonka w kolbie T75 są w 80 do 100% zlewne. Usunąć kompletną pożywkę DMEM z kolby przez aspirację. Aby umyć komórki, dodaj 10 mililitrów PBS i delikatnie potrząśnij kolbą.Zastąp PBS pięcioma mililitrami roztworu do dysocjacji komórek. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez około 12 minut. Postukaj w kolbę po sześciu minutach, aby ułatwić dysocjację.Dodać pięć mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki DMEM do kolby i wymieszać zawiesinę komórkową. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwirować przy 150 G przez pięć minut. W międzyczasie, za pomocą pipety pastora podłączonej do próżni, odessać roztwór żelatyny z płytki 96-dołkowej.Po odwirowaniu komórek usunąć supernatant z probówki, nie naruszając osadu. Za pomocą pipety serologicznej dodać do probówki osiem mililitrów świeżej kompletnej pożywki DMEM i delikatnie odpipetować zawiesinę, aby rozbić osad komórkowy. Policz komórki za pomocą niebieskiego wyzwalacza na hemocytometrze.Dodaj kompletną pożywkę DMEM, aby uzyskać gęstość 600 000 komórek na mililitr zawiesiny. Wymieszaj zawiesinę komórkową, delikatnie odwracając probówkę. Dodaj zawiesinę komórek do 50-mililitrowego zbiornika na pipety wielokanałowej.Co 30 sekund delikatnie kołysz zbiornikiem na boki, aby wymieszać zawiesinę, i użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 100 mikrolitrów do każdej studzienki 96-dołkowej płytki pokrytej żelatyną. Załóż przezroczystą pokrywę płytki i delikatnie potrząśnij płytką, przesuwając ją po powierzchni sterylnego kaptura z północy na południe i ze wschodu na zachód. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 16 do 24 godzin.Po wyhodowaniu komórek śródbłonka na 96-dołkowej płytce, wyjmij ją z inkubatora i potwierdź współpłynność za pomocą odwróconego mikroskopu. Wrzuć talerz do zlewu, aby usunąć cały nośnik, i osusz górną część talerza ręcznikiem papierowym. Dodaj roztwór HBSS Heaps Assay Buffer Plus Pro Benefit do 50-mililitrowego zbiornika rozpuszczalnika do pipet wielokanałowych.Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 mikrolitrów buforu testowego do każdej studzienki i pozostaw komórki na pięć minut. Następnie przesuń płytkę, aby usunąć bufor testowy. Dodaj bufor pobierający do oddzielnego 50-mililitrowego wielokanałowego zbiornika rozpuszczalnika do pipet.Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 mikrolitrów buforu ładującego barwnik do każdego dołka płytki testowej. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 45 minut. Po inkubacji obserwuj płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić wchłanianie barwnika.Przesuń płytkę, aby usunąć roztwór barwnika. Umyj komórki dwukrotnie 50 mikrolitrami roztworu HBSS Heaps Assay Buffer Plus Pro Benefit Solution w każdym dołku. Przesuń płytkę, aby usunąć bufor testowy.Dodaj 92 mikrolitry buforu testowego HBSS Heaps do każdej studzienki i ponownie obejrzyj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby upewnić się, że nadmiar barwnika został całkowicie usunięty, a komórki pozostają przylegające. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać dwa mikrolitry roztworów antagonistów i nośnik do odpowiednich studzienek. Po włączeniu czytnika płytek należy ustawić temperaturę na 37 stopni Celsjusza i inkubować płytkę przez 15 minut.Zmierz fluorescencję tła w kolumnach pierwszej i drugiej, wykonując pięć skanów na studzienkę. Wysunąć płytkę z czytnika płytek. Następnie z 8-probówkowego paska PCR szybko dodaj sześć mikrolitrów roztworu agonisty za pomocą wielokanałowej pipety do każdej studzienki w kolumnach pierwszej i drugiej.Zmierz zmianę fluorescencji, gdy w komórkach zachodzi mobilizacja wapnia. Wykonaj 20 skanów każdej studni. Test mobilizacji wapnia z komórkami śródbłonka wykazał, że studzienki kontroli pozytywnej bez antagonisty wykazywały szybki wzrost fluorescencji.Studzienki o wysokich stężeniach antagonistów wykazywały minimalną zmianę fluorescencji, podobnie jak studzienki kontroli ujemnej bez agonisty.

characterizing-modulators-protease-activated-receptors-with-calcium

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Prezentujemy test rozszczepienia peptydów fluorogennych, który pozwala na szybkie badanie przesiewowe aktywności proteolitycznej proteaz na peptydach reprezentujących miejsce cięcia peptydów fuzji wirusów. Metoda ta może być również stosowana na dowolnym innym motywie aminokwasowym w sekwencji białka w celu zbadania aktywności proteazy.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa

Opisano techniki generowania biblioteki krótkich peptydów, które mogą aktywować komórki tuczne za pośrednictwem receptora MRGPRX2. Powiązane techniki są łatwe, niedrogie i można je rozszerzyć na inne receptory komórkowe.

Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Przedstawiamy i demonstrujemy zoptymalizowany test wiązania nitrocelulozy, który może być użyty do ilościowego określenia autofosforylacji oczyszczonych bakteryjnych kinaz histydynowych. Nasza metoda ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami opartymi na SDS-PAGE, stanowiąc cenną alternatywę dla charakterystyki tych ważnych białek.

Kwantyfikacja autofosforylacji bakteryjnej kinazy histydynowej przy użyciu testu wiązania nitrocelulozy

Tutaj prezentujemy efektywną hydrolizę i późniejszą ochronę Fmoc aminokwasu wyizolowanego z kompleksu zasad Ni-Schiffa. Przedstawione tutaj warunki hydrolizy są odpowiednie do stosowania, gdy wymagane jest zachowanie kwasowo-labilnych grup ochronnych łańcucha bocznego. Technika ta może być dostosowana do różnych nienaturalnych substratów aminokwasowych.

Hydroliza kompleksu zasad Ni-Schiffa w warunkach odpowiednich do zachowania kwasowo-labilnych grup ochronnych

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Tutaj opisujemy protokół do badania prenylacji i obciążenia guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) GTPazy Rho. Protokół ten składa się z dwóch szczegółowych metod, a mianowicie frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentu sprzężonego z GTPazą. Protokół może być używany do pomiaru prenylacji i obciążenia GTP różnych innych małych GTPaz.

Wykrywanie prenylacji małej GTPazy i wiązania GTP za pomocą frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentowego sprzężonego z GTPazą

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Naucz się testu mobilizacji wapnia w komórkach śródbłonka do badania receptorów aktywowanych proteazą. Ta metoda skraca czas analizy i poprawia powtarzalność wyników w badaniach nad parmamodlinami.

Charakterystyka modulatorów receptorów aktywowanych proteazą za pomocą testu mobilizacji wapnia za pomocą czytnika płytek

Przeglądaj więcej filmów