Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Opracowujemy i walidujemy organoidy pochodzące od pacjentów z czerniakiem. Jego celem jest dokładna replikacja mikrośrodowiska guza, badanie interakcji między komórkami odpornościowymi i ocena odpowiedzi terapeutycznych, w szczególności na immunoterapie. Staramy się pogłębić wiedzę na temat biologii nowotworów, ulepszyć strategie opracowywania leków i potencjalnie umożliwić spersonalizowane leczenie raka.

Dokładne naśladowanie złożonego mikrośrodowiska guza, w tym interakcji zrębu i komórek odpornościowych, pozostaje trudne. Zapewnienie, że organoidy zachowają różnorodność genetyczną i fenotypową pierwotnych nowotworów, jest wyzwaniem. Zasadnicze znaczenie ma opracowanie spójnych i skalowalnych protokołów hodowli organoidów oraz zapewnienie odtwarzalności w różnych próbkach w badaniach.

Często pacjenci onkologiczni wykazują różne reakcje na leczenie, co wymaga różnych strategii leczenia, dlatego możliwość hodowania tych organoidów pochodzących z guzów pacjenta umożliwia nam przeprowadzanie badań przesiewowych leków, które ułatwiają opracowywanie spersonalizowanych planów leczenia dostosowanych do każdego pacjenta. Na początek przygotuj roztwór powlekający zawierający matrycę błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu i pożywkę do hodowli organoidów w stosunku jeden do dwóch. Dodać 115 mikrolitrów roztworu powlekającego do każdego dołka na 48-dołkowej płytce i umieścić płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut w wilgotnym inkubatorze.

W przypadku metody kolagenowej dodaj jeden mililitr żelu kolagenowego do 30-milimetrowej wkładki z membraną wewnętrzną i pozwól mu zestalać się przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze. W celu zebrania mieszaniny komórkowej umyj świeżo wyciętą tkankę czerniaka na 10-mililitrowej szalce Petriego zawierającej pożywkę myjącą, którą umieszcza się na lodzie. Za pomocą sterylnej pęsety przenieś guz do drugiego naczynia z medium myjącym do następnego mycia lodem.

W ciągu trzech cykli płukania, za pomocą sterylnych nożyczek i ostrza, usuń nadmiar tkanki łącznej, tłuszczu i resztki krwi. Umieść guz na pustej szalce Petriego i drobno go zmielić sterylnymi ostrzami. Następnie przenieś zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 10 mililitrów przygotowanej pożywki wytrawiającej.

Umieść stożek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wiruj co pięć minut. Po 25 minutach dodaj 30 mililitrów pożywki ADMEM/F12 zawierającej 10% FBS, aby zatrzymać trawienie. Następnie przefiltrować strawioną zawiesinę komórkową przez nylonowe sitko o średnicy 70 mikrometrów i przepłukać sitko uzupełnionym ADMEM/F12.

Za pomocą pipety odzyskaj wszelkie pozostałe media z dna filtra. Następnie granulować komórki w temperaturze 300 G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu zawiesić osad w pożywce do hodowli organoidów.

Do hodowli wysiewa się 200 000 komórek we wstępnie podgrzanych studzienkach pokrytych matryżelem, uzupełnionych 200 mikrolitrami pożywki do hodowli organoidów. Alternatywnie, wysiewaj 1 milion komórek zmieszanych z jednym mililitrem żelu kolagenowego na wstępnie zestalonej wkładce membranowej żelu kolagenowego umieszczonej na sześciodołkowej płytce i dodaj pożywkę do hodowli organoidów do dołka. W przypadku przejścia organoidów o wielkości od 150 do 200 mikrometrów, przenieś je do stożka o pojemności 15 mililitrów i umyj PBS firmy Dulbecco.

Odwirować mieszaninę w temperaturze 300 G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu inkubować organoidy z substytutem trypsyny i mieszać co trzy minuty. W celu zatrzymania trawienia należy dodać ADMEM/F12 ze zredukowaną pożywką surowicy zawierającą 10% FBS.

Odwirować mieszaninę o sile 300 G przez siedem minut i ponownie zawiesić osad w pożywce do hodowli organoidów. Na koniec wysiewaj zawiesinę jednokomórkową do nowego matrigelu lub kolagenu dobrze pokrytego o tej samej początkowej gęstości wysiewu do inkubacji. Obrazy mikroskopowe organoidów inkrustowanych matrigelem w drugim i siódmym dniu wykazały, że rozmiar organoidów stopniowo się zwiększał.

Ponadto nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w proporcji limfocytów T alfa-beta między guzami rodzicielskimi a odpowiednimi organoidami hodowanymi w matrigelu lub kolagenie.