Name: Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Odkryj metodę generowania organoidów czerniaka pochodzących od pacjentów w celu badania mikrośrodowiska nowotworowego i odpowiedzi na immunoterapię. Ta technika wspiera rozwój spersonalizowanych terapii onkologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało częściowo sfinansowane z grantów od R01(CA258113), SPORE (CA261608) i P01 (CA114046). Rysunek 1 został przygotowany w BioRender.com.

Ludzkie tkanki czerniaka zostały pobrane od pacjentów leczonych na Uniwersytecie Pensylwanii przy użyciu protokołu pobierania tkanek (UPCC08607), który został zatwierdzony przez Institutional Review Board of the University of Pennsylvania. Wszyscy pacjenci podpisali świadomą zgodę. Po wycięciu tkanek ludzkiego czerniaka, tkankę nowotworową umieszcza się w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco i utrzymuje w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia (w ciągu 6 godzin). Organoidy pochodzące od pacjentów z czerniakiem (MPDO) pochodziły ze świeżego guza, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1.
1. Izolacja komórek z ludzkiej tkanki czerniaka
<ol>
	<li>Przygotowania przed rozpoczęciem zabiegu 
	UWAGA: Do hodowli zdysocjowanej tkanki czerniaka można zastosować dwie metody hodowli (Matrigel i żel kolagenowy):
	<ol>
		<li>W przypadku metody Matrigel: Przygotować roztwór powlekający z matrycy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (GFR), rozcieńczając matrycę błony podstawnej GFR pożywką do hodowli organoidów (patrz tabela 1) w stosunku 1:2. Dodać około 115 μl rozmrożonego roztworu do każdego z kilku dołków na 48-dołkowej płytce i pozostawić do zestalenia na 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze.</li>
		<li>W przypadku metody z żelem kolagenowym: Dodaj 1 ml żelu kolagenowego (patrz Tabela 1) do 30-milimetrowej wkładki z membraną wewnętrzną. Pozostawić żel do zestalenia się na 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj kondycjonowaną L-WRN klasę medium<sup="xref">15. Pożywka kondycjonowana L-WRN jest wytwarzana z linii komórkowej L-WRN zaprojektowanej do wydzielania Wnt3a, R-spondyny 3 i Noggin do jednego kondycjonowanego podłoża, które jest szeroko stosowane do hodowli komórkowych.
	<ol>
		<li>Rozmrozić krioprobówkę z ogniwami L-WRN w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml pożywki L-komórkowej (patrz Tabela 1) i zawiesinę komórek L-WRN do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 120 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant, upewniając się, że na dnie pozostało ~500 μl w celu ponownego zawieszenia osadu komórek.</li>
		<li>Przenieść osad komórkowy w supernatancie do 30 ml pożywki L-komórkowej na lodzie i dodać 150 μl higromycyny (500 μg/ml) i 300 μl G418 (500 μg/ml). Wysiewać komórki o gęstości 3 × 106 na kolbie T-150 i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 aż do ~90% konfluencji.</li>
		<li>Gdy komórki zlewają się w ~ 90%, podziel komórki na pięć kolb T-150, przemywając 20 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), zasysając i trawiąc 3 ml substytutu trypsyny. Po 5 minutach zneutralizować 9 ml pożywki L-komórkowej, a następnie odwirować przez 5 minut w temperaturze 120 × g w temperaturze 4 °C. Gdy ~ 100% zlewa się, podziel pięć kolb T-150 na 10 3-warstwowych kolb T-175.</li>
		<li>Po zlewaniu się przemyj komórki 2 x 50 ml PBS, a następnie 25 ml pożywki myjącej (patrz Tabela 1).</li>
		<li>Dodać 75 ml pożywki do hodowli pierwotnej do każdej kolby 3-warstwowej T-175 i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 (patrz Tabela 1).</li>
		<li>Po 3 dniach zebrać kondycjonowane podłoże do stożkowego podłoża o pojemności 50 ml i wirować w temperaturze 1 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant (kondycjonowaną pożywkę), upewniając się, że pozostało 5 ml.</li>
		<li>Dodać świeże 75 ml pierwotnej pożywki do hodowli komórkowych do każdej 3-warstwowej kolby T-175 i inkubować przez dodatkowe 3 dni, aby zebrać dodatkowe kondycjonowane podłoże.</li>
		<li>Do zebranej kondycjonowanej pożywki dodać równą objętość pierwotnej pożywki do hodowli komórkowych (50% objętości) i przefiltrować próżniowo zawartość za pomocą filtra 0,22 μm. Porcje należy przechowywać w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania lub 4 °C do 2-3 tygodni. Stosować tę pożywkę w celu uzupełnienia pożywek organoidowych (patrz Tabela 1). 
		UWAGA: Przed użyciem rozmrozić porcje w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie mieszaniny komórkowej ze świeżej tkanki czerniaka
	<ol>
		<li>Świeżo wyciętą tkankę czerniaka umyć na 10 ml szalki Petriego zawierającej środek myjący. Po pierwszym płukaniu użyj sterylnej pęsety, aby przenieść guz na drugą szalkę Petriego w celu dalszego mycia i powtórz ten proces 3 razy na lodzie, aby zachować integralność i żywotność guza. Podczas tych cykli płukania używaj sterylnych nożyczek i ostrza, aby usunąć nadmiar tkanki łącznej, tłuszczu i resztki krwi. Po trzech płukaniach umieść guz na pustej szalce Petriego i użyj sterylnych ostrzy, aby go drobno zmielić. 
		UWAGA: Po zmieleniu guz powinien mieć konsystencję żelu. Im drobniejsze mielenie guza, tym wyższa będzie wydajność komórek. Dzieje się tak, ponieważ większe grudki guza będą trudniejsze do strawienia i mogą nie przejść przez sitko do komórek nylonowych o średnicy 70 μm w kolejnym etapie.</li>
		<li>Po dokładnym umyciu i zmieleniu tkanki nowotworowej przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml przygotowanej pożywki wytrawiającej (patrz Tabela 1). Umieścić stożek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, upewniając się, że zawartość jest wirowana co 5 minut.</li>
		<li>Po 25 minutach dodać 30 ml pożywki ADMEM/F12 zawierającej 10% FBS, aby zatrzymać trawienie. 
		UWAGA: Te określone ilości są przeznaczone dla nowotworów o masie nie większej niż 0,2 g.</li>
		<li>Przefiltrować strawioną zawiesinę komórkową przez sitko z nylonu o średnicy 70 μm, a następnie przepłukać sitko zredukowanym roztworem surowicy ADMEM/F12 (1x) (1:1) zawierającym 10% FBS. Po zakończeniu mycia użyj pipety, aby pobrać wszelkie pozostałe media z dna filtra, aby upewnić się, że pobrana została jak największa liczba komórek. Następnie odwirować przy ciśnieniu 300 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce do hodowli organoidów (patrz tabela 1).</li>
		<li>Hodowla zawiesiny jednokomórkowej czerniaka w systemach hodowli Matrigel lub kolagenu:
		<ol>
			<li>Matrigel: Policz zawiesinę jednokomórkową, aby upewnić się, że około 2 × 105 komórek zostało wysianych we wstępnie podgrzanych studzienkach pokrytych Matrigelem, uzupełnionych 200 μl pożywki do hodowli organoidów. 
			UWAGA: Organoidy na bazie Matrigelu są używane do badania patofizjologii, badania przesiewowego skuteczności leków i testowania toksyczności leków16.</li>
			<li>Żel kolagenowy: Policz zawiesinę jednokomórkową, aby upewnić się, że około 106 komórek jest zmieszanych z 1 ml żelu kolagenowego. Dodaj mieszaninę do wstępnie zestalonych wkładek membranowych żelu kolagenowego i umieść je na 6-dołkowej płytce. Dodaj wystarczającą ilość pożywki do hodowli organoidów, aby zanurzyć wkładki zawierające komórki i żel kolagenowy. 
			UWAGA: Organoidy żelu kolagenowego są używane do pomiaru migracji limfocytów T i badania rozwoju tkanek16.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pozwól organoidom rosnąć, upewniając się, że co 3 dni dodaje się świeże podłoże.</li>
		<li>Organoidy należy przepuścić, gdy osiągną rozmiar 150-200 μm lub zakonserwować je w kriokonserwacji do czasu dalszego użycia.
		<ol>
			<li>W celu przejścia organoidów przenieś organoidy do stożkowego pojemnika o pojemności 15 ml i przemyj 1x DPSB. Odwirować mieszaninę w temperaturze 300 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać substytut trypsyny (50-100 μl na organoid) przez 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, upewniając się, że zawartość jest wirowana co 3 minuty.</li>
			<li>Zatrzymaj trawienie za pomocą pożywki ADMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) zawierającej 10% FBS. Odwirować mieszaninę o stężeniu 300 × g przez 7 minut i ponownie zawiesić w pożywce do hodowli organoidów.</li>
			<li>Wysiewać zawiesinę jednokomórkową do nowego dołka pokrytego Matrigelem/kolagenem o tej samej początkowej gęstości wysiewu (2 × 105 komórek w 200 μl pożywki do hodowli organoidów dla studzienek pokrytych Matrigelem na płytce 48-dołkowej lub 10-6 komórek w 1 ml pożywki do hodowli organoidów do powlekanej kolagenem wkładki z membraną wewnętrzną o średnicy 30 mm).</li>
			<li>W celu kriokonserwacji należy trawić MPDO za pomocą substytutu trypsyny do zawiesin jednokomórkowych, a następnie ponownie zawiesić10-6 komórek w 1 ml pożywki do zamrażania (patrz Tabela 1).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Patient-Derived Melanoma Organoids: A Frontier in Cancer Immunotherapy

<ol><li>Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cell+Lines+Are+Useful+Model+Systems+for+Medical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1098(2019).</li>
<li>Shannon, A. E., Boos, C. E., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culturing+multicellular+tumor+models%3A+Modeling+the+tumor+microenvironment+and+analysis+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Co-culturing multicellular tumor models: Modeling the tumor microenvironment and analysis techniques.</a> Proteomics. 21 (9), e2000103(2021).</li>
<li>Jubelin, C., Muñoz-Garcia, J., Griscom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell Biosci. 12, 155(2022).</li>
<li>Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+prospects+of+patient-derived+xenografts+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research.</a> Cancers (Basel). 15 (17), 4352(2023).</li>
<li>Nabel, C. S., Heiden, M. G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenografts+to+study+cancer+metabolism%3A+when+does+X+mark+the+spot%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenografts to study cancer metabolism: when does X mark the spot).</a> Cancer Res. 81 (17), 4399(2021).</li>
<li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+%28PDXs%29+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 99(2018).</li>
<li>Woo, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+copy+number+profiles+during+engraftment+and+passaging+of+patient-derived+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Conservation of copy number profiles during engraftment and passaging of patient-derived cancer xenografts.</a> Nat Genet. 53 (1), 86(2021).</li>
<li>Somasundaram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-infiltrating+mast+cells+are+associated+with+resistance+to+anti-PD-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Tumor-infiltrating mast cells are associated with resistance to anti-PD-1 therapy.</a> Nat Commun. 12 (1), 346(2021).</li>
<li>Abdolahi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+%28PDX%29+models%2C+applications+and+challenges+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft (PDX) models, applications and challenges in cancer research.</a> J Transl Med. 20 (1), 206(2022).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+The+current+status+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Comm%22%5BJournal%5D)">Organoids: The current status and biomedical applications.</a> Med Comm. 4 (3), e274(2023).</li>
<li>Minoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+cancer+organoids+as+a+functional+system+to+model+different+disease+stages+and+therapy+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bladder cancer organoids as a functional system to model different disease stages and therapy response.</a> Nat Commun. 14, 2214(2023).</li>
<li>Ou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+melanoma+organoid+models+facilitate+the+assessment+of+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived melanoma organoid models facilitate the assessment of immunotherapies.</a> eBioMedicine. 92, 104614(2023).</li>
<li>Grönholm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+for+precision+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy.</a> Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).</li>
<li>Ou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+platforms+to+study+therapeutic+efficacy+of+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Preclinical platforms to study therapeutic efficacy of human γδ T cells.</a> Clin Transl Med. 12 (6), e814(2022).</li>
<li>Murine L-Wrn conditioned medium protocol. The University of Texas MD Anderson Cancer Center. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mdanderson.org/documents/Labs/Taniguchi%20Laboratory/Mouse%20CM.pdf">https://www.mdanderson.org/documents/Labs/Taniguchi%20Laboratory/Mouse%20CM.pdf</a> (2024).</li>
<li>Jee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+collagen-based+3D+matrix+for+gastrointestinal+tract-derived+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Development of collagen-based 3D matrix for gastrointestinal tract-derived organoid culture.</a> Stem Cells Int. 13 (2019), 8472712(2019).</li>
<li>Pipkin, M. E., Rao, A., Lichtenheld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+control+of+the+perforin+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The transcriptional control of the perforin locus.</a> Immunol Rev. 235 (1), 55(2010).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tim-3+suppresses+the+killing+effect+of+V%CE%B39V%CE%B42+cells+on+colon+cancer+cells+by+reducing+perforin+and+granzyme+B+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Tim-3 suppresses the killing effect of Vγ9Vδ2 cells on colon cancer cells by reducing perforin and granzyme B expression.</a> Exp Cell Res. 386 (1), 111719(2020).</li>
<li>Li, L. T., Jiang, G., Chen, Q., Zheng, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki67+is+a+promising+molecular+target+in+the+diagnosis+of+cancer+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Ki67 is a promising molecular target in the diagnosis of cancer (Review).</a> Mol Med Rep. 11 (3), 1566-1572 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Li, H. Y., Ren, K., Wang, C., Bu, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+organoid+research+progress+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Dermatology+and+Venereology%22%5BJournal%5D)">Skin organoid research progress and potential applications.</a> International Journal of Dermatology and Venereology. 5 (2), 101-106 (2022).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+mucosal+melanoma+organoid+platform+for+modeling+tumor+heterogeneity+and+exploring+immunotherapy+combination+options%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">A human mucosal melanoma organoid platform for modeling tumor heterogeneity and exploring immunotherapy combination options.</a> Sci Adv. 9 (43), eadg6686 (2023).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Ganesh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rectal+cancer+organoid+platform+to+study+individual+responses+to+chemoradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation.</a> Nat Med. 25 (10), 1607-1614 (2019).</li>
<li>Vilgelm, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-needle+aspiration-based+patient-derived+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids.</a> iScience. 23 (8), 101408(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Pojawienie się ChNP rozwiązało wiele ograniczeń związanych z innymi wcześniej ustalonymi metodami badań nad rakiem, wprowadzając jednocześnie potencjalne zastosowania w tej dziedzinie. Ta technologia organoidów została po raz pierwszy zaproponowana w 2009 roku przez Hansa Cleversa i współpracowników, którzy byli w stanie z powodzeniem ustanowić system hodowli organoidów jelitowych poprzez hodowlę komórek macierzystych Lgr5 + pochodzących z jelita myszy w żelu matrycowym 3D zawierającym czynniki R-sponsin, EGF i Noggin20. Kilka lat później, w 2020 r., zespół Koehlera poinformował o modelu hodowli organoidów, który po raz pierwszy umożliwił generowanie skóry in vitro przy użyciu wyłącznie ludzkich PSC21. W świetle tych niezwykłych postępów w technologii organoidów, szybko pojawił się rozwój modeli organoidów nowotworowych, które mogą zrewolucjonizować badania nad rakiem i opracowywanie leków.
W związku z tym protokół ten koncentruje się na wyjaśnieniu etapów związanych z uzyskaniem organoidów ze świeżo wyciętego ludzkiego czerniaka, przyczyniając się do trwających wysiłków na rzecz pogłębienia naszej wiedzy na temat biologii nowotworów i poprawy strategii opracowywania leków. W związku z tym walidacja podobieństwa PDO do guza rodzicielskiego była przedmiotem badań w wielu laboratoriach. Warto zauważyć, że Sun i współpracownicy przeprowadzili badania przy użyciu porównywalnej metodologii PDO do modelowania czerniaka błony śluzowej (MM), ostatecznie potwierdzając, że organoidy zachowały histopatologiczne cechy pierwotnych guzów. Obejmowały one takie cechy, jak niestabilność chromosomalna, a także obecność czerniaka i markerów melanosomów22. Ze względu na ustaloną retencję biologii, liczne grupy badały również przydatność PDO do przewidywania odpowiedzi klinicznych na różne leki i nowe strategie terapeutyczne. Na przykład grupa Vlachogiannisa wykazała, że w przerzutowych nowotworach przewodu pokarmowego PDO dokładnie przewidywały reakcje na leki, które pasowały do wyników klinicznych pacjenta23. Podobnie, grupa Ganesha wygenerowała również żywy biobank organoidów od pacjentów z rakiem odbytnicy i doszła do wniosku, że odpowiedzi ex vivo na chemioterapię i radioterapię korelowały z indywidualnymi odpowiedziami klinicznymi odkażdego pacjenta. Łącznie badania te sugerują, że PDO mogą służyć jako wierne modele do badania ewolucji nowotworów i są obiecujące w pogłębianiu naszej wiedzy na temat reakcji na leczenie raka.
ChNP wykazują znaczny potencjał badawczy; Wyzwanie polega jednak na inwazyjnym charakterze pozyskiwania tkanek poprzez chirurgiczną resekcję lub biopsję gruboigłową, co może być uciążliwe dla pacjentów. Tkanka musi następnie zostać mechanicznie lub enzymatycznie zdysocjowana, co może zakłócić natywną architekturę wzrostu 3D. Aby rozwiązać to ograniczenie, aspiracja cienkoigłowa (FNA) stała się klinicznie preferowaną, minimalnie inwazyjną procedurą, która delikatnie ekstrahuje i oddziela komórki nowotworowe od zrębu sklerotycznego bez konieczności trawienia lub dodatkowego przetwarzania25. Takie podejście zachowuje natywną architekturę wzrostu guza. Vilgelm i współpracownicy badali skuteczność FNA jako procedury izolacji organoidów, jednocześnie badając zdolność organoidu do zachowania właściwości biologicznych nowotworów macierzystych. Ich odkrycia wykazały, że tkanki nowotworowe wyizolowane za pomocą FNA-PDO zachowały kluczowe właściwości histologiczne i immunofenotypowe podobne do tych z oryginalnego guza, co sugeruje potencjalną skuteczność tej metody w izolacji organoidów25.
ChNP stanowią przełomowe osiągnięcie o wielu potencjalnych zastosowaniach. Zdolność do replikacji specyficznych dla pacjenta środowisk nowotworowych otwiera drzwi do wielu krytycznych ścieżek badawczych. Od badań przesiewowych leków, przez odkrywanie mechanizmów oporności, badanie niuansów heterogeniczności guza i podejść do nadzoru nad rakiem, po badanie inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych wraz z terapiami komórkowymi i celowanymi, potencjał tej technologii wykracza poza jej bezpośrednie zastosowania.

Konwencjonalne modele hodowli komórkowych 2D są niezbędnymi narzędziami w badaniach nad rakiem do badania progresji i terapii raka1. Modele te nie tylko pozwalają na kontrolowanie warunków eksperymentalnych w celu zbadania mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw rozwoju i progresji raka, ale także zapewniają opłacalne i stosunkowo szybkie wyniki eksperymentalne. Ich zastosowanie jest jednak ograniczone ze względu na ograniczoną różnorodność komórkową w mikrośrodowisku guza (TME), której nie można podsumować w współpłaszczyznowej naturze modeli monokulturowych2. Dodatkowo, modele hodowli komórkowych oferują zbyt uproszczone środowisko w porównaniu do ludzkiego ciała3. W związku z tym, aby lepiej zrozumieć progresję raka i opracować skuteczne metody leczenia, naukowcy zwrócili się ku innowacyjnym modelom, które mają na celu dokładne odtworzenie TME w naturze. W związku z tym utrzymanie wierności rodzimym nowotworom ma kluczowe znaczenie w tych modelach. Biorąc pod uwagę skomplikowaną naturę nowotworu, każde znaczące odchylenie od pierwotnego guza może wprowadzić nieprzewidziane zmienne, które mogą zakłócić sensowne wnioski na temat zachowania guza. 
Chociaż ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) pojawiły się jako system modelowy, który pozwala na monitorowanie postępu nowotworu in vivo, pewne ograniczenia kwestionują, jak dobrze rozwinięty guz podsumowuje biologię ludzkiego raka4. Na przykład czerniak TME zawiera komórki odpornościowe naciekające nowotwór i komórki zrębu. Po pasażowaniu jako ksenoprzeszczep, komórki nienowotworowe od pacjenta będą stopniowo tracone, co może wybrać adaptacje, które różnią się od tych w guzach pacjenta. Chociaż ograniczenia te można złagodzić, wykonując ograniczone pasażki PDX in vivo, różnice między gatunkami mogą nadal stwarzać ryzyko zmian genetycznych w PDX, które odbiegają od zmian w rodzimym guzie5. Co więcej, modele PDX są zwykle ustalane u myszy z obniżoną odpornością, aby zapobiec odrzuceniu tkanek ludzkich. Ogranicza to możliwość badania roli układu odpornościowego gospodarza w nowotworach, zwłaszcza w badaniach immunoterapeutycznych6. My i inni wszczepiliśmy PDX w "humanizowane" myszy7,8. Jednak ustalenie modeli PDX u humanizowanych myszy jest czasochłonne i kosztowne. Opracowanie pojedynczego modelu PDX na podstawie próbki guza pacjenta może zająć od kilku miesięcy do lat, co ogranicza szybkość i skalę badań. Pomimo tych ograniczeń, wykazano, że modele PDX dokładnie reprezentują biologię TME, dzięki czemu są szeroko wykorzystywane do opracowywania terapii przeciwnowotworowych, medycyny spersonalizowanej i immunoterapii, między innymi9. 
Alternatywna technika hodowli 3D, która się pojawiła, to organoid pochodzący od pacjenta (PDO), gdzie świeżo wycięty guz pacjenta jest hodowany w celu stworzenia modeli, które utrzymują heterogeniczność fenotypową, histoarchitekturę i komunikację międzykomórkową10. Jego zdolność do bliskiego przypominania rodzimych nowotworów została wcześniej wykazana, gdzie hodowane organoidy z nieinwazyjnego raka pęcherza moczowego (NMIBC) i inwazyjnego raka pęcherza moczowego (MIBC) z powodzeniem podsumowały kluczowe aspekty nowotworów rodzicielskich11. Ze względu na swój potencjał i zalety w porównaniu z innymi modelami, PDO oferują szeroką gamę dostosowanych zastosowań, których brakuje innym modelom, w tym między innymi badanie i rozwój inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych wraz z terapiami komórkowymi i celowanymi. Na przykład wcześniej używaliśmy organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem (MPDO) do badania zdolności limfocytów naciekających nowotwór (TIL) do ekspansji przez IL-2 i przeciwciała anty-PD1 (αPD-1). Wyniki pokazały, że TIL namnażane przez IL-2 i αPD-1 nie tylko miały większą liczbę, ale mogły również skutecznie infiltrować MPDO i zabijać komórki czerniaka z większą wydajnością niż TIL ekspandowane przy użyciu innych metod12. Inne grupy wykazały podobne wyniki, w których użycie anty-PD-1 i/lub anty-PD-L1 prowadzi do tego, że TIL pozostają funkcjonalne w PDO, co z kolei prowadzi do zabijania nowotworów13. Dodatkowo, nasza grupa wykorzystała również MPDO do oceny zdolności infiltracji i zabijania komórek T γδ14. Możliwość zastosowania PDO obejmuje szeroki zakres obszarów, w tym ekspansję TIL, badania cytotoksyczności i badania przesiewowe małych cząsteczek. Wszystkie te aplikacje podkreślają potencjał i użyteczność, jakie daje ten model. W związku z tym opisujemy szczegółowy protokół hodowli MPDO.

<table><tbody><tr><td>2 ml czerwona nakrętka Fiolka kriogeniczna z polipropylenu z gwintem wewnętrznym</td><td>Corning</td><td>431420</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TC</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>105 mm Kleszcze polistyrenowe Sterylne</td><td>zatyczki Evergreen&nbsp;</td><td>222-1121-B1I</td><td></td></tr><tr><td>150 cm2 Kolba do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 (1x) Zredukowana pożywka surowicy (1:1)</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Fiolet brylantowy 510 przeciwciało anty-ludzkiej perforyny</td><td>BioLegend</td><td>308120</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 przeciwciało anty-ludzkie Ki-67</td><td>BioLegend</td><td>350522</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 antyludzkie przeciwciało CD366 (Tim-3)</td><td>BioLegend</td><td>345028</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 antyludzkie przeciwciało CD45</td><td>BioLegend</td><td>304050</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych 0,4 i mikro; m, Średnica 30 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>PIHP03050</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do barwienia komórek</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 40 &micro; m Nylon Corning</td><td>&nbsp;</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 70 i mikro; m Nylon Corning</td><td>&nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, Typ IV, proszek</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Rat Collagen I</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowlana, PS, 48 dołków, TC traktowana pokrywką, sterylna</td><td>Max Scientific&nbsp;</td><td>07-6048</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - wysoka zawartość glukozy 4,5 mg/ml</td><td>Corning</td><td>MT10-0130CV</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza I -</td><td>Millipore Sigma</td> II stopnia <td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 1%&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, FBS</td><td>Corning</td><td>MT35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>FITC Zestaw do wykrywania apoptozy Aneksyna V I</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>556547</tr><tr><td>Forskolina</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>Selektywny antybiotyk Geneticin (siarczan G418) (50 mg/ml)</td><td>Suplement ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka odżywcza szynki F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B (50 mg / ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Komórka L-WRN</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Bez fenolu i Fakt wzrostu. Zredukowany</td><td></td><td></td> filtr strzykawkowy Corning 356231 <td></td></tr><tr><td>Millex PVDF, 0,22 i mu; M</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nunc TripleFlask Kolba do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher</td><td>132867</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyjanine5 anty-ludzkie przeciwciało CD8a</td><td>BioLegend</td><td>301010</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy 7 Mysz anty-ludzka CD279 (PD-1)</td><td>BD Nauki biologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td>561272</tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-kwaśny</td> roztwór wodorowęglanu sodu <td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>(NaHCO3) (7,5%)</td><td>Jakość Biologiczna&nbsp;</td><td>118-085-721</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza chirurgiczne ze stali nierdzewnej nr 22</td><td>Integra</td><td>4-322</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

Wraz z rozwojem immunoterapii, istnieje ciągła potrzeba opracowania modeli, które mogłyby podsumować mikrośrodowisko guzów rodzimych. Podczas gdy tradycyjne dwu- i trójwymiarowe modele mogą dostarczyć informacji na temat rozwoju i progresji raka, brakuje im kluczowych aspektów, które utrudniają wierne naśladowanie rodzimych nowotworów. Alternatywnym modelem, który zyskał wiele uwagi, jest organoid pochodzący od pacjenta. Rozwój tych organoidów podsumowuje złożoną komunikację międzykomórkową, mikrośrodowisko guza i histoarchitekturę guzów. W artykule opisano protokół tworzenia modeli organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem (MPDO). Aby zweryfikować te modele, oceniliśmy skład komórek odpornościowych, w tym poziomy ekspresji markerów aktywacji komórek T, aby potwierdzić niejednorodność komórkową organoidów. Dodatkowo, aby opisać potencjalną użyteczność MPDO w terapiach komórkowych, oceniliśmy cytotoksyczne możliwości leczenia organoidów limfocytami T γδ. Podsumowując, modele MPDO oferują obiecujące możliwości zrozumienia złożoności guza, walidacji strategii terapeutycznych i potencjalnego postępu w spersonalizowanym leczeniu.

Kształt i rozmiar MPDO monitorowano w czasie, aby zbadać dynamikę ich wzrostu. Jak pokazano na rysunku 2, w początkowym okresie wzrostu rozmiar organoidów znacząco zwiększył się w ciągu przedstawionych 7 dni. Po zaobserwowaniu dynamiki wzrostu MPDO, skupiono się na ocenie składu komórek odpornościowych, aby zweryfikować, czy organoidy wiernie odtwarzają cechy pierwotnych guzów. Ocena ta, koncentrująca się głównie na liczebności limfocytów T αβ, pozwoliła określić stopień podobieństwa między organoidami a guzem macierzystym. Jak widać, rysunek 3 ilustruje, że nie było statystycznie istotnych różnic w proporcji limfocytów T αβ pomiędzy guzami macierzystymi a odpowiadającymi im organoidami hodowanymi w Matrigelu lub kolagenie. Po wykazaniu podobieństw między guzami macierzystymi a organoidami, oceniono aktywność limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej. Strategię bramkowania przedstawiono na rysunku 4; została ona opracowana poprzez zdefiniowanie pojedynczych, żywych leukocytów, a następnie bramkowanie populacji limfocytów T CD3+ i CD8+ w celu zbadania powszechnych markerów aktywacji limfocytów T.
Biorąc pod uwagę rolę cytotoksycznych limfocytów T w generowaniu cytokin i uwalnianiu cząsteczek cytotoksycznych, takich jak granzym B i perforyna, zmierzono ich ekspresję. Ekspresję granzymu B i perforyny wykryto odpowiednio na poziomie 35,1% i 2,17%17. Ekspresja immunoglobuliny limfocytów T i domeny mucyny 3 (Tim3) w 1,83% limfocytów T CD8+ jest zgodna z charakterystyką immunosupresyjnego TME18. Ekspresja receptora programowanej śmierci (PD-1) w 49,5% populacji CD8+ w obrębie MPDO dodatkowo podkreśla immunosupresyjny charakter mikrośrodowiska organoidu. Na koniec, w limfocytach T CD8+ oceniono również ekspresję białka Ki-67 (Ki67), będącego markerem proliferacji, która wyniosła 26,8%19
MPDO mogą być również wykorzystywane do oceny zdolności cytotoksycznej limfocytów T γδ. Kilka 10-dniowych MPDO poddano działaniu limfocytów T γδ. Po 24-godzinnej inkubacji MPDO zebrano, dysocjowano do postaci zawiesiny pojedynczych komórek i ponownie zawieszono w 100 µL buforu wiążącego zawierającego 5 µL AV-FITC oraz 5 µL PI. Po inkubacji przez 15 min w ciemności w temperaturze pokojowej przeprowadzono analizę cytometryczną w celu określenia cytotoksyczności indukowanej przez limfocyty T γδ wobec komórek w MPDO. Jak widać w Rysunek 5 A, Bpo potraktowaniu komórkami γδ T, w większości komórek w MPDO zaobserwowano cechy apoptozy (80,5%). Stanowi to kontrast w stosunku do eksperymentu kontrolnego, w którym cechy apoptozy wystąpiły jedynie u niewielkiej części komórek (19,2%).
<img alt="Proces hodowli organoidów czerniaka; schemat; siekanie tkanki, dysocjacja, zawiesina komórkowa, wysiew." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat ilustrujący hodowlę MPDO. Wycięta świeża tkanka czerniaka jest rozdrabniana mechanicznie i enzymatycznie w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Zawiesinę tę hoduje się następnie w dołkach pokrytych Matrigel lub żelem kolagenowym w celu utworzenia organoidów. Skrót: MPDO = organoid czerniaka pochodzący od pacjenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Postępy wzrostu komórek, dzień 2 w porównaniu z dniem 7, obraz mikroskopowy pokazujący zmiany w morfologii komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obrazy z mikroskopii konfokalnej MPDO osadzonych w Matrigelu w 2. i 7. dniu. Zawiesina pojedynczych komórek ze świeżej tkanki czerniaka jest hodowana w Matrigelu. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu konfokalnego w 2. i 7. dniu. Wielkość organoidów stopniowo wzrasta. Paski skali = 100 µm. Skrót: MPDO = organoid pochodzący od pacjenta z czerniakiem (melanoma patient-derived organoid). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres procentowego udziału limfocytów T CD45+; porównanie guza, kolagenu i Matrigelu; ns oznacza brak istotności statystycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza cytometrii przepływowej porównująca skład limfocytów T αβ w guzie wyjściowym i organoidach hodowanych w żelu kolagenowym lub Matrigelu. Ilościowe oznaczenie komórek odpornościowych w MPDO przeprowadzono za pomocą FACS. Porównanie liczby limfocytów T αβ w guzach wyjściowych oraz MPDO hodowanych w żelu kolagenowym lub Matrigelu po 7 dniach. n = 8; ns = brak istotności (nieparametryczny test wielokrotny). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej przedstawiający bramkowanie populacji komórek: limfocytów, CD3+, analiza CD8+." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej oraz analiza wykorzystana do charakterystyki komórek odpornościowych w 10-dniowych MPDO hodowanych w Matrigelu. Strategia bramkowania w celu rozróżnienia subpopulacji komórek odpornościowych, a następnie kwantyfikacja i profil różnych markerów ekspresyjnnych w obrębie organoidów. Skróty: MPDO = organoid pochodzący od pacjenta z czerniakiem; FSC-A = forward scatter-peak area; FSC-H = forward scatter-peak height; SSC-A = side scatter-peak area. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres cytometrii przepływowej i cytotoksyczności; leczenie komórkami γδ T zwiększa poziomy Annexin V i PI; apoptoza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66509/66509fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
Rycina 5: Leczenie komórkami γδ T indukuje śmierć komórek w MPDO. MPDO inkubowano z komórkami γδ T przez 24 h, następnie MPDO zebrano i rozbito do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. (A) Barwienie Annexin V i PI organoidów hodowanych w Matrigelu po leczeniu komórkami γδ T. Wyraźne jest przesunięcie w stronę nekrozy po zastosowaniu komórek γδ T. (B) Ilościowe oznaczenie komórek apoptotycznych w MPDO po leczeniu komórkami γδ T. n = 5 *p &lt; 0.05; **p &lt; 0.01 (nieparametryczny test wielokrotny). Skróty: MPDO = organoid pochodzący od pacjenta z czerniakiem; PI = jodek propidyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Skład wszystkich pożywek i odczynników użytych w tym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66509/66509_Table%201%20(2).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj prezentujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem poprzez hodowlę oddzielonych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek czerniaka. Organoidy te wiernie odwzorowują specyficzne dla pacjenta nowotwory in vitro, oferując innowacyjne podejście do badania mechanizmów immunosupresyjnych nowotworów, badań przesiewowych leków, mechanizmów oporności na leki i podejść do nadzoru nad rakiem.

Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While ...

Opracowujemy i walidujemy organoidy pochodzące od pacjentów z czerniakiem. Jego celem jest dokładna replikacja mikrośrodowiska guza, badanie interakcji między komórkami odpornościowymi i ocena odpowiedzi terapeutycznych, w szczególności na immunoterapie. Staramy się pogłębić wiedzę na temat biologii nowotworów, ulepszyć strategie opracowywania leków i potencjalnie umożliwić spersonalizowane leczenie raka.Dokładne naśladowanie złożonego mikrośrodowiska guza, w tym interakcji zrębu i komórek odpornościowych, pozostaje trudne. Zapewnienie, że organoidy zachowają różnorodność genetyczną i fenotypową pierwotnych nowotworów, jest wyzwaniem. Zasadnicze znaczenie ma opracowanie spójnych i skalowalnych protokołów hodowli organoidów oraz zapewnienie odtwarzalności w różnych próbkach w badaniach.Często pacjenci onkologiczni wykazują różne reakcje na leczenie, co wymaga różnych strategii leczenia, dlatego możliwość hodowania tych organoidów pochodzących z guzów pacjenta umożliwia nam przeprowadzanie badań przesiewowych leków, które ułatwiają opracowywanie spersonalizowanych planów leczenia dostosowanych do każdego pacjenta. Na początek przygotuj roztwór powlekający zawierający matrycę błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu i pożywkę do hodowli organoidów w stosunku jeden do dwóch. Dodać 115 mikrolitrów roztworu powlekającego do każdego dołka na 48-dołkowej płytce i umieścić płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut w wilgotnym inkubatorze.W przypadku metody kolagenowej dodaj jeden mililitr żelu kolagenowego do 30-milimetrowej wkładki z membraną wewnętrzną i pozwól mu zestalać się przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze. W celu zebrania mieszaniny komórkowej umyj świeżo wyciętą tkankę czerniaka na 10-mililitrowej szalce Petriego zawierającej pożywkę myjącą, którą umieszcza się na lodzie. Za pomocą sterylnej pęsety przenieś guz do drugiego naczynia z medium myjącym do następnego mycia lodem.W ciągu trzech cykli płukania, za pomocą sterylnych nożyczek i ostrza, usuń nadmiar tkanki łącznej, tłuszczu i resztki krwi. Umieść guz na pustej szalce Petriego i drobno go zmielić sterylnymi ostrzami. Następnie przenieś zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 10 mililitrów przygotowanej pożywki wytrawiającej.Umieść stożek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wiruj co pięć minut. Po 25 minutach dodaj 30 mililitrów pożywki ADMEM/F12 zawierającej 10% FBS, aby zatrzymać trawienie. Następnie przefiltrować strawioną zawiesinę komórkową przez nylonowe sitko o średnicy 70 mikrometrów i przepłukać sitko uzupełnionym ADMEM/F12.Za pomocą pipety odzyskaj wszelkie pozostałe media z dna filtra. Następnie granulować komórki w temperaturze 300 G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu zawiesić osad w pożywce do hodowli organoidów.Do hodowli wysiewa się 200 000 komórek we wstępnie podgrzanych studzienkach pokrytych matryżelem, uzupełnionych 200 mikrolitrami pożywki do hodowli organoidów. Alternatywnie, wysiewaj 1 milion komórek zmieszanych z jednym mililitrem żelu kolagenowego na wstępnie zestalonej wkładce membranowej żelu kolagenowego umieszczonej na sześciodołkowej płytce i dodaj pożywkę do hodowli organoidów do dołka. W przypadku przejścia organoidów o wielkości od 150 do 200 mikrometrów, przenieś je do stożka o pojemności 15 mililitrów i umyj PBS firmy Dulbecco.Odwirować mieszaninę w temperaturze 300 G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu inkubować organoidy z substytutem trypsyny i mieszać co trzy minuty. W celu zatrzymania trawienia należy dodać ADMEM/F12 ze zredukowaną pożywką surowicy zawierającą 10% FBS.Odwirować mieszaninę o sile 300 G przez siedem minut i ponownie zawiesić osad w pożywce do hodowli organoidów. Na koniec wysiewaj zawiesinę jednokomórkową do nowego matrigelu lub kolagenu dobrze pokrytego o tej samej początkowej gęstości wysiewu do inkubacji. Obrazy mikroskopowe organoidów inkrustowanych matrigelem w drugim i siódmym dniu wykazały, że rozmiar organoidów stopniowo się zwiększał.Ponadto nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w proporcji limfocytów T alfa-beta między guzami rodzicielskimi a odpowiednimi organoidami hodowanymi w matrigelu lub kolagenie.

unveiling-therapeutic-opportunities-with-melanoma-patient-derived

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie komórki czerniaka pochodzenia ludzkiego są wszczepiane podskórnie w obszar boczny myszy z obniżoną odpornością. Model PDX umożliwia przedkliniczne badanie komórek czerniaka, które lepiej oddaje niejednorodność guza i agresywność czerniaka obserwowane w warunkach in vivo.

Modelowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta: technika generowania mysich modeli czerniaka

Tutaj prezentujemy protokół generowania 3D organotypowego modelu skóry czerniaka sferoidalnego, który podsumowuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządu/guza in vivo, ale jednocześnie uwzględnia systematyczną interwencję eksperymentalną.

Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Modele ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) bardziej solidnie rekapitulują molekularne i biologiczne cechy czerniaka i są bardziej predykcyjne dla odpowiedzi na terapię w porównaniu do tradycyjnych testów opartych na hodowli tkanek plastycznych. W tym miejscu opisujemy nasz standardowy protokół operacyjny do tworzenia nowych modeli PDX oraz charakteryzacji/eksperymentowania z istniejącymi modelami PDX.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem

Opisano metodę tworzenia organoidów przy użyciu ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) do badań przesiewowych in vitro, co daje dopasowane pary modeli in vivo/in vitro. Guzy PDX zostały zebrane/przetworzone na małe kawałki mechanicznie lub enzymatycznie, a następnie metodą Cleversa do wyhodowania organoidów nowotworowych, które zostały pasażowane, kriokonserwowane i scharakteryzowane w stosunku do oryginalnego PDX.

Tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów PDX i organoidów pochodzących z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami

Ten protokół opisuje standaryzowaną ocenę wrażliwości leków na ukierunkowane inhibitory sygnalizacji w modelach organoidowych pochodzących od pacjentów z NSCLC.

Profilowanie wrażliwości na terapie celowane w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Przedstawiamy protokół, który może być wykorzystany do przeprowadzenia testów leków terapeutycznych z organoidami raka jajnika pochodzącymi od pacjentek.

Modele organoidowe pochodzące od pacjentek z rakiem jajnika do przedklinicznych testów leków

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Zapewniamy kompleksowy przegląd i udoskonalenie istniejących protokołów tworzenia organoidów raka wątrobowokomórkowego (HCC), obejmując wszystkie etapy hodowli organoidów. System ten służy jako cenny model do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i oceny skuteczności kandydatów na leki.

Opracowanie i optymalizacja modelu organoidowego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego pochodzącego od pacjentów w celu identyfikacji potencjalnego celu i odkrycia leku

Organoidy generowane z guzów pacjenta są ortotopowo wstrzykiwane do wątroby myszy. Resekcja nienowotworowej tkanki wątroby prowadzi do środowiska regeneracyjnego w tkance wątroby, w której znajduje się guz.

Model ksenoprzeszczepu organoidalnego uzyskany od pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym w celu zbadania wpływu regeneracji wątroby na wzrost guza

Odkryj metodę generowania organoidów czerniaka pochodzących od pacjentów w celu badania mikrośrodowiska nowotworowego i odpowiedzi na immunoterapię. Ta technika wspiera rozwój spersonalizowanych terapii onkologicznych.

Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Przeglądaj więcej filmów