Name: Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70. Ta metoda pozwala ocenić aktywność szaperonową Hsp70 i jego rolę w ochronie komórek przed stresem cieplnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wsparta grantami uzyskanymi z grantu Międzynarodowego Centrum Inżynierii Genetycznej i Biotechnologii (ICGEB) numer grantu, HDI/CRP/012, Dyrekcji ds. Badań Uniwersytetu Venda, grant I595, Departament Nauki i Innowacji (DSI) oraz Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) z Południowej Afryki (numery grantów, 75464 i 92598) przyznane AS.

1. Transformacja
UWAGA: Używaj sterylnych naczyń szklanych do hodowli, końcówek pipet oraz świeżo przygotowanych i autoklawowanych pożyw. Przygotować kultury komórek E. coli w 2x tryptonie drożdżowym (YT) [1,6% tryptonu (w/v), 1% ekstraktu drożdżowego (w/v), 0,5% NaCl (w/v), 1,5% agaru (w/v)] agary. Ogólne odczynniki użyte w protokole oraz ich źródła znajdują się w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Oznaczyć 2,0 ml probówek do mikrowirówek i podwielokrotność 50 μl kompetentnych komórek E. coli dnaK756, utrzymując komórki na lodzie.</li>
	<li>Do probówek mikrowirówek o pojemności 2,0 ml z właściwymi komórkami, podwielokrotność 10-50 ng plazmidu pQE60/DnaK, pQE60/KPf i pQE60/KPf-V436F plazmidu DNA9 do oddzielnych probówek.</li>
	<li>Probówki do mikrowirówek o pojemności 2,0 ml zawierające właściwe komórki i plazmidowe DNA należy przechowywać na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Szok termiczny kompetentne komórki i DNA mieszają się przez 60 s w temperaturze 42 °C i włóż probówki do mikrowirówki z powrotem na lód na 10 minut.</li>
	<li>Dodać 950 μl świeżego bulionu 2x YT (wstępnie inkubowanego w temperaturze 37 °C) i inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 150 obrotów/min przez 1 godzinę. Pozostaw komórki do wzrostu znacznie dłużej, aby w razie potrzeby przyspieszyć ich regenerację. 
	UWAGA: Unikaj energicznego potrząsania komórkami.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl komórek i rozprowadzić je na 2 płytkach agarowych YT zawierających 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml tetracykliny dla odpowiedniego szczepu i 100 μg/ml ampicyliny (patrz tabela materiałów) w celu wyboru plazmidu.</li>
	<li>Odwirować pozostałe komórki (których objętość wynosi obecnie około 900 μl) przez 1 minutę w temperaturze 5000 x g (w temperaturze 4 °C) za pomocą mikrowirówki stołowej.</li>
	<li>Zdekantować około 800 μl bulionu i użyć pozostałej pożywki do ponownego zaparcia granulowanych komórek.</li>
	<li>Umieść odzyskane komórki na płytce agarowej 2x YT.</li>
	<li>Inkubować obie płytki agarowe przez noc (lub około 17 godzin) w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Komórki te rosną bardzo wolno i mogą wymagać znacznie dłuższej inkubacji. Uważaj, aby dostrzec kolonie, które mogą zaczynać się od bardzo małych. Płytka zawierająca komórki zawieszone ponownie po odwirowaniu (etap 1.7) służy jako zapas w przypadku, gdy wydajność przemiany komórek jest niska, w którym to przypadku granulowane komórki mogą poprawić odzysk wszelkich przekształconych komórek. Jednakże, jeśli wydajność przemiany jest doskonała, płytka agarowa, na której posiano skoncentrowane komórki, może charakteryzować się przerośniętą kulturą podczas inkubacji, co utrudnia identyfikację pojedynczych kolonii. W takim przypadku druga płytka agarowa może być tą, na której rosną dobrze rozmieszczone kolonie.</li>
</ol>
2. Poszycie komórek
<ol>
	<li>Weź pojedynczą kolonię z transformantów i zaszczep ją w 10 ml bulionu 2x YT uzupełnionego 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml tetracykliny do selekcji komórek E. coli dnaK756 i 100 μg/ml ampicyliny do selekcji plazmidu. 
	UWAGA: Użyj kolb (≥50 ml), aby zapewnić napowietrzenie podczas mieszania kultury. Inkubować inokulum przez noc (17 godzin) w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 150 obrotów/min.</li>
	<li>Następnego ranka wykonaj odczyt absorbancji przy OD600.</li>
	<li>Oczyść powierzchnię stołu warsztatowego za pomocą 75% etanolu do przetarcia powierzchni w ramach przygotowań do plamienia komórek.</li>
	<li>Używając probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml, ustandaryzuj kulturę do odczytu OD600 wynoszącego 2,0 przy użyciu bulionu 2x YT. 
	UWAGA: Upewnij się, że odczyty OD są wykonywane prawidłowo, ponieważ ten krok jest ważny dla standaryzacji gęstości komórek w różnych próbkach.</li>
	<li>Używając probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml, przygotuj seryjne rozcieńczenia komórek od 100 do 10-5.</li>
	<li>Inkubować płytki agarowe, które mają być użyte do namierzenia komórek, w piecu ustawionym na 40 °C, aby umożliwić wyschnięcie płytek z częściowo otwartymi pokrywkami, aby zapewnić ucieczkę pary wodnej. 
	UWAGA: Aby upewnić się, że komórki są widoczne w jednakowo oddalonych odległościach, narysuj linie na kartce papieru, na której wydrukowany jest szablon miejsc wykrywania.</li>
	<li>Umieścić 2 μl seryjnie rozcieńczonych komórek na płytkach agarowych uzupełnionych 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml tetracykliny, 100 μg/ml ampicyliny i 0,5 mM IPTG (do indukcji ekspresji rekombinowanych białek) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieścić każdą próbkę na dwóch oddzielnych płytkach (jedna do inkubacji w temperaturze 37 °C, a druga w temperaturze 43,5 °C). 
	UWAGA: Unikaj przekłuwania płytki agarowej.</li>
	<li>Umieść próbki kontrolne na tej samej płytce, co próbki eksperymentalne, aby zminimalizować wpływ na środowisko.</li>
	<li>Przeprowadź szybkie plamienie, aby upewnić się, że proces został zakończony, zanim komórki zaczną rosnąć, ponieważ może to spowodować wypaczone wzorce wzrostu. 
	UWAGA: Ważne jest, aby unikać aerozoli podczas plamienia, ponieważ mogą one zanieczyścić płytki. Ważne jest również, aby płytki były zamknięte między plamkami, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Inkubować jedną płytkę w temperaturze 37 °C (dopuszczalna temperatura wzrostu), a drugą w niedozwolonej temperaturze wzrostu 43,5 °C. 
	UWAGA: Inkubuj płytki do góry nogami, aby uniknąć gromadzenia się pary na pokrywie, ponieważ skondensowana woda zmyłaby nakrapiane kolonie z ich pozycji.</li>
	<li>Umieść wszystkie płytki w inkubatorach w tym samym czasie i unikaj otwierania inkubatora do następnego ranka. 
	UWAGA: Odradza się kilkukrotne otwieranie drzwi inkubatora podczas inkubacji płytek. Dzieje się tak, ponieważ dostęp powietrza do inkubatora może powodować wahania temperatury, które niekorzystnie wpływają na wzrost komórek.</li>
</ol>
3. Potwierdzenie ekspresji białek rekombinowanych
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnej pętli pobierz część pozostałych komórek z tej samej kolonii przekształconych komórek E. coli dnaK756.</li>
	<li>Zaszczep komórki w 10 ml bulionu YT uzupełnionego 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml tetracykliny i 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować przez noc (17 h) w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 150 obrotów/min.</li>
	<li>Przenieś kulturę do 90 ml sterylnego bulionu 2x YT zawierającego niezbędne antybiotyki, jak wspomniano w kroku 3.2. Pozwól komórkom urosnąć do środkowej fazy logarytmicznej (OD600 = 0,4-0,6).</li>
	<li>Pobrać 2 ml próbki kultury przed indukcją (0 h indukcji próbki).</li>
	<li>Dodać IPTG do końcowego stężenia 1 mM w celu indukcji produkcji białka i ponownie inkubować komórki w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pobrać drugą próbkę o objętości 2 ml 6 godzin po indukcji.</li>
	<li>Zebrać komórki, odwirowując przy 5000 x g przez 10 minut. Utrzymuj temperaturę wirówki na poziomie 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w buforze PBS (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4) i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. SDS-PAGE i analizy western blot
<ol>
	<li>Przygotuj 2x 10% żele SDS zgodnie z wcześniejszym opisem19.</li>
	<li>Zachowaj jeden z żeli SDS-PAGE do późniejszego barwienia za pomocą barwnika Coomassie, aby wyświetlić pasma białkowe. Użyj drugiego żelu SDS-PAGE do przeprowadzenia analizy western blot.</li>
	<li>Pobrać 80 μl zawieszonych próbek i wymieszać z 20 μl 4 ładujących Laemmli SDS.</li>
	<li>Gotować zawiesinę w temperaturze 100 °C przez 10 minut. Następnie załadować 10 μl każdej próbki na prefabrykowany żel SDS (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wykonuj elektroforezę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przy napięciu 120 V w 1x roztworze bufora do pracy SDS (25 mm Tris, 250 mm glicyna, 0,1% (w/v) SDS).</li>
	<li>Barwić żel barwnikiem Coomassie (patrz Tabela Materiałów) przez 1 godzinę, a następnie odbarwiać za pomocą buforu odbarwiającego (50% (v/v) metanolu, 10% (v/v) kwasu octowego w wodzie destylowanej) przez 2 godziny.</li>
	<li>Wizualizację prążków białkowych obecnych w żelu za pomocą systemu obrazowania żelu (patrz tabela materiałów). Uruchom ponownie kolejny żel SDS-PAGE z tymi samymi próbkami, postępując zgodnie z wyżej wymienionym protokołem.</li>
	<li>Po zakończeniu cyklu elektroforetycznego weź żele SDS-PAGE, aby przeprowadzić analizę western blot, jak opisano wcześniej19.</li>
	<li>Przemyć membranę nitrocelulozową, na którą przeniesiono białka trzykrotnie, w buforze do przemywania (TBS-Tween, pH 7,4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Tween]).</li>
	<li>Użyj α-DnaK (patrz Tabela materiałów), aby wykryć odpowiednio DnaK i α-PfHsp70-17, aby wykryć KPf i jego mutanta, KPf-V436F).</li>
	<li>Stosować przeciwciała w rozcieńczeniu 1:2000 w 5% mleku beztłuszczowym. Inkubować w temperaturze 4 °C, wytrząsając z prędkością 60 obrotów/min przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć niespecyficznie związane przeciwciało, przemłukując membranę nitrocelulozową w TBS-Tween 3 razy w ciągu 15 minut.</li>
	<li>Inkubować błonę w przeciwciałie drugorzędowym (α-króliku, patrz tabela materiałów) w takich samych warunkach, jak w poprzednim kroku. Po tym następuje kolejne płukanie w tych samych warunkach, co przeciwciało pierwszorzędowe.</li>
	<li>Rozwiąż prążki za pomocą odczynnika do wykrywania wzmocnionej chemiluminescencji (ECL).</li>
	<li>Wizualizacja pasm za pomocą obrazowania żelowego.</li>
</ol>

Assessment of Hsp70 Chaperone Activity Using Escherichia coli dnaK756 Cells

<ol><li>Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+newly+synthesized+proteins+into+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Getting newly synthesized proteins into shape.</a> Cell. 101 (2), 119-122 (2000).</li>
<li>Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodial+heat+shock+proteins%3A+targets+for+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy.</a> FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).</li>
<li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins%3A+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li>
<li>Edkins, A. L., Boshoff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+structural+and+functional+features+of+molecular+chaperones.+Heat+shock+proteins+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria.</a> Adv Exp Med Biol. Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. , Springer. (2021).</li>
<li>Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+conformation+of+wild-type+E.+coli.+Hsp70+%28DnaK%29+chaperone+complexed+with+ADP+and+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate.</a> PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).</li>
<li>Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+70+is+able+to+suppress+the+thermosensitivity+of+an+Escherichia+coli+DnaK+mutant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain.</a> Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).</li>
<li>Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+study+of+a+Plasmodium+falciparum+Hsp70+using+three-dimensional+modelling+and+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept+Lett%22%5BJournal%5D)">Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses.</a> Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).</li>
<li>Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -R., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+modulation+of+plasmodial+Hsp70s+by+small+molecules+with+antimalarial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity.</a> Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).</li>
<li>Makhoba, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+chimeric+Hsp70+to+enhance+the+quality+of+recombinant+Plasmodium+falciparum+s-adenosylmethionine+decarboxylase+protein+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli.</a> PLoS One. 11 (3), 0152626(2016).</li>
<li>Bukau, B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+defects+caused+by+deletion+of+the+Escherichia+coli+dnaK+gene+indicate+roles+for+heat+shock+protein+in+normal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bact%22%5BJournal%5D)">Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism.</a> J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).</li>
<li>Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DnaK+protein+alleviates+toxicity+induced+by+citrate-coated+gold+nanoparticles+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli.</a> PLoS One. 10 (4), 0121243(2015).</li>
<li>Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+heat+shock+proteins+DnaK+and+HtpG+%28C62.+5%29+in+response+to+nutritional+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bact%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation.</a> J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).</li>
<li>Mayer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+mechanism+of+substrate+binding+determines+chaperone+activity+of+Hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70.</a> Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).</li>
<li>Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+bacterial+gene+%28groP+C%29+which+affects+%CE%BB+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication.</a> Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).</li>
<li>Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dnaK+protein+modulates+the+heat-shock+response+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli.</a> Cell. 34 (2), 641-646 (1983).</li>
<li>Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+defects+of+the+DnaK756+mutant+chaperone+of+Escherichia+coli+indicate+distinct+roles+for+amino-and+carboxyl-terminal+residues+in+substrate+and+co-chaperone+interaction+and+interdomain+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication.</a> J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).</li>
<li>Taj, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Eng+Res%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli as a model organism.</a> Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).</li>
<li>Sato, S., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific+cochaperonins+in+apicomplexan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).</li>
<li>Shonhai, A. Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University">https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University</a> (2007).</li>
<li>Makumire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+GGMP+repeat+segments+of+Plasmodium+falciparum+Hsp70-1+compromises+chaperone+function+and+Hop+co-chaperone+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 2226(2021).</li>
<li>Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+Hsp70+family+proteins%3A+Expanding+the+chaperone+code%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code.</a> J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).</li>
<li>Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+functionality+of+non-native+Hsp70+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3389(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Protokół demonstruje użyteczność komórek E. coli dnaK756w badaniu funkcji opiekuńczej heterologicznie wyrażonego Hsp70. Test ten można zastosować do badań przesiewowych inhibitorów ukierunkowanych na funkcję Hsp70 w celulo. Jednak jednym z ograniczeń tej metody jest to, że Hsp70, które nie są w stanie zastąpić DnaK w E. coli , nie są kompatybilne z tym testem. Brak modyfikacji potranslacyjnej21 niektórych nienatywnych Hsp70 może tłumaczyć ich brak funkcji w systemie E. coli . Test komplementacji oparty na drożdżach22 może wyeliminować niektóre niedociągnięcia testu opartego na E. coli.
Do zapewnienia powtarzalnych wyników ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia kilku kluczowych kroków. Obejmują one zapewnienie, że podczas posiewu używane są tylko komórki przekształcone przez odpowiedni konstrukt plazmidowy. Ponadto ważne jest, aby unikać zanieczyszczenia kultury na wszystkich etapach. Ponadto, ponieważ zestresowane komórki DnaK E. coli są podatne na nadmierną filamentację10, ważne jest, aby unikać energicznego wstrząsania podczas hodowli, ponieważ ten fizyczny szczep sprzyja intensywnemu filamentowaniu. Nadmiernie włóknione komórki dają wyższe fałszywe odczyty pozornego wzrostu przy OD600, co prowadzi do przeszacowania wzrostu hodowli i niekorzystnie wpływa na standaryzację komórek przed posiewem. Chociaż Hsp70 nie jest niezbędny do wzrostu E. coli w normalnych warunkach, komórki pozbawione tego białka są podatne na stres10. Z tego powodu komórki E. coli dnaK756 rosną znacznie wolniej po transformacji lub podczas odzyskiwania z zapasów glicerolu. Dodatkowo są niezwykle wrażliwe na wahania temperatury. Dlatego ważne jest, aby unikać otwierania drzwi inkubatora po umieszczeniu w środku platerowanych płytek agarowych, dopóki nie nadejdzie czas na obejrzenie płytek.
Dane Western blot są ważne dla potwierdzenia ekspresji odpowiednich rekombinowanych białek Hsp70 w komórkach E. coli dnaK756. Brak ekspresji odpowiedniego białka prowadzi do fałszywie ujemnego wyniku dla komórek rosnących w nieakceptowalnej temperaturze wzrostu.

Białka szoku cieplnego odgrywają ważną rolę jako molekularne białka opiekuńcze, ułatwiając fałdowanie białek, zapobiegając agregacji białek i odwracając błędne fałdowanie białek1,2. Białko szoku cieplnego 70 (Hsp70) jest jednym z najbardziej znanych molekularnych białek opiekuńczych, odgrywającym kluczową rolę w homeostazie białek3,4. DnaK jest homologiem E. coli Hsp70 class<="xref">5.
Różne testy biofizyczne, biochemiczne i oparte na komórkach zostały opracowane w celu zbadania aktywności opiekuńczej Hsp70 i wykrycia inhibitorów skierowanych do tego białka opiekuńczego6,7,8. Hsp70 jest wysoce konserwatywnym białkiem. Z tego powodu doniesiono, że kilka Hsp70 organizmów eukariotycznych, takich jak Plasmodium falciparum (główny czynnik wywołujący malarię), zastępuje funkcję DnaK w E. coli6,9. W ten sposób opracowano test komplementacji oparty na E. coli, obejmujący heterologiczną ekspresję Hsp70 w E. coli, aby zbadać ich funkcję cytoprotekcyjną. Zazwyczaj test ten obejmuje wykorzystanie komórek E. coli, które mają niedobór DnaK lub wyrażają natywny DnaK, który jest funkcjonalnie upośledzony. Chociaż DnaK nie jest niezbędny do wzrostu E. coli w normalnych warunkach, staje się niezbędny, gdy komórki są hodowane w stresujących warunkach, takich jak podwyższone temperatury lub inne formy stresu10,11.
Szczepy E. coli, które zostały opracowane do badania funkcji Hsp70 za pomocą testu komplementacji, obejmują E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) i E. coli dnaK756. Komórki E. coli dnaK103 wytwarzają obcięty DnaK, który nie działa, i jako takie, komórki rosną odpowiednio w temperaturze 30 °C, podczas gdy szczep jest wrażliwy na stres zimna i cieplny12,13. Podobnie, szczep E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) nie rośnie powyżej 40 °C14,15. Szczep E. coli dnaK756 wykazuje ekspresję zmutowanego natywnego DnaK (DnaK756) charakteryzującego się trzema podstawieniami glicyny do asparaginianu w pozycjach 32, 455 i 468, co prowadzi do upośledzonych wyników proteostatycznych. W związku z tym szczep ten jest odporny na bakteriofagi λ DNA14. Dodatkowo E. coli dnaK756 wykazuje podwyższoną aktywność ATPazy, a jego powinowactwo do czynnika wymiany nukleotydów, GrpE, jest zmniejszone16. Bakteria E. coli Zmutowane szczepy DnaK służą jako idealne modele do badania aktywności opiekuńczej Hsp70 poprzez podejście komplementacyjne. Ponieważ DnaK jest niezbędny tylko w warunkach stresowych, test komplementacji jest zwykle przeprowadzany w podwyższonych temperaturach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Niektóre zalety wykorzystania E. coli w tym badaniu obejmują dobrze scharakteryzowany genom, szybki wzrost oraz niskie koszty hodowli i utrzymania17.
W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół polegający na wykorzystaniu komórek E. coli dnaK756 do badania funkcji Hsp70. Hsp70, które zastosowaliśmy w teście, to DnaK typu dzikiego i jego chimeryczna pochodna, KPf (składająca się z domeny ATPazy DnaK połączonej z C-końcową domeną wiążącą substrat Plasmodium falciparum Hsp70-16,18). KPf-V436F był heterologicznie wyrażany jako kontrola ujemna, ponieważ mutacja zasadniczo blokuje go przed wiązaniem substratów, znosząc w ten sposób jego aktywność opiekuńczą9.

<table><tbody><tr><td>2-&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8,05,740</td><td>Składnik do ładowania próbki Barwnik</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Labchem</td><td>101005125</td><td>Składnik destainera</td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8008300100</td><td>Składnik SDS</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Merck</td><td>HG000BX1.500</td><td>Składnik pożywki i cieczy do oznaczania wzrostu</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Clever Scientific</td><td>14131031</td><td>Certyfikowana biologia molekularna agaroza</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101875295</td><td>Składnik żelu SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>VWR International</td><td>0339&mdash;EU&mdash; 25G</td><td>Selektywny antybiotyk</td></tr><tr><td>Bis</td><td>Sigma-aldrich</td><td>1015460100</td><td>Składnik SDS</td></tr><tr><td>Bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0449-25G</td><td>Składnik do ładowania próbki barwnika</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td>Do właściwego przygotowania komórek</td></tr><tr><td>Błękit brylantowy Coomassie</td><td>Barwnik VWR International</td><td>443293X</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Dwuzasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB10368</td><td>Składnik buforu PBS</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>32109</td><td>Odczynnik do wykrywania Western blot</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>17898</td><td>Barwnik interkalacyjny DNA</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>SAAR2676520L</td><td>Składnik do ładowania próbki</td></tr><tr><td>barwnik Glicyna</td><td>VWR International</td><td>10119CU</td><td>Składnik karty charakterystyki</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Glentham nauki przyrodnicze</td><td>162IL</td><td>induktor</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Melford</td><td>K0126</td><td>Selektywny antybiotyk</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Merck</td><td>SAAR4123000EM</td><td>Składnik pożywki i płynnego testu wzrostu</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Labchem</td><td>113140129</td><td>Składnik odbarwiacza</td></tr><tr><td>Jednozasadowy fosforan potasu</td><td>Merck</td><td>1,04,87,30,250</td><td>Składnik buforu PBS</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Merck</td><td>HG000BX4.250</td><td>Składnik pożywki i płynnego testu wzrostu</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>SAAR5042020EM</td><td>Składnik buforu PBS</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Thermofischer scientific</td><td>PB7320</td><td>Membrana Western blot</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>SAAR5822320EM</td><td>Składnik pożywki i cieczy do oznaczania wzrostu</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>VWR International</td><td>108073</td><td>Do rozdzielania białek eksprymowanych</td></tr><tr><td>Spectramax iD3</td><td>Separacje</td><td>373705019</td><td>Automatyczny czytnik płytek</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>VWR international</td><td>ACRO420580500</td><td>Składnik żelu SDS</td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Duchefa Biochemies</td><td>T0150.0025</td><td>Selektywny antybiotyk</td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR International</td><td>19A094101</td><td>Składnik żelu SDS</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Merck</td><td>SAAR3164500XF</td><td>Składnik zachodniego buforu do płukania</td></tr><tr><td>Zachodnia komora transferowa</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PB0112</td><td>Przenoszenie białka do membrany nitrocelulozowej</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Merck</td><td>HG000BX6.500</td><td>Składnik pożywki i płynnego testu wzrostu</td></tr> <tr><td>&przeciwciało alfa;-DnaK</td><td>Inqaba</td><td>BK CAC09317</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr> <tr><td>i przeciwciało alfa;-królika</td><td>Thermofischer scientific</td><td>31460</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr></tbody></table>

test komplementacji oparty na escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Białko szoku cieplnego 70 (Hsp70) jest konserwatywnym białkiem, które ułatwia fałdowanie innych białek w komórce, czyniąc je molekularnym opiekuńczym. Podczas gdy Hsp70 nie jest niezbędny do wzrostu komórek E. coli w normalnych warunkach, ten opiekun staje się niezbędny do wzrostu w podwyższonych temperaturach. Ponieważ Hsp70 jest wysoce konserwatywny, jednym ze sposobów badania funkcji opiekuńczej genów Hsp70 z różnych gatunków jest ich heterologiczna ekspresja w szczepach E. coli, które mają albo niedobór Hsp70, albo wyrażają natywną Hsp70, która jest funkcjonalnie upośledzona. Komórki dnaK756 E. coli nie są w stanie wspierać DNA bakteriofaga λ. Co więcej, ich natywny Hsp70 (DnaK) wykazuje podwyższoną aktywność ATPazy, wykazując jednocześnie zmniejszone powinowactwo do GrpE (czynnika wymiany nukleotydów Hsp70). W rezultacie komórki E. coli dnaK756 rosną odpowiednio w temperaturach od 30 °C do 37 °C, ale giną w podwyższonych temperaturach (>40 °C). Z tego powodu komórki te służą jako model do badania aktywności opiekuńczej Hsp70. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół zastosowania tych komórek do przeprowadzenia testu komplementacji, umożliwiającego badanie funkcji białka opiekuńczego Hsp70 w celulonu.

Rysunek 2 przedstawia obraz zeskanowanego agaru zawierającego komórki, które zostały naniesione i hodowane odpowiednio w dopuszczalnej temperaturze wzrostu 37 °C oraz 43,5 °C. Po prawej stronie Rysunku 2 wycięte fragmenty western blot reprezentują ekspresję DnaK, KPf oraz KPf-V436F w komórkach E. coli dnaK756 . Zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie komórki E. coli dnaK756  hodowane w dopuszczalnej temperaturze wzrostu 37 °C zdołały wzrosnąć. Jednak w niedopuszczalnych warunkach wzrostu przy 43,5 °C zdołały wzrosnąć tylko komórki heterologicznie eksponujące DnaK i KPf, co zgłoszono we wcześniejszych doniesieniach6,9,20(Rysunek 2). Z drugiej strony, komórki eksponujące KPf-V436F rosły tylko w 37 °C, ale nie zdołały wzrosnąć w 43,5 °C. Wykazuje to, że DnaK i KPf były w stanie przywrócić defekt wzrostu komórek E. coli dnaK756  w warunkach stresu cieplnego. Brak zdolności komórek heterologicznie eksponujących KPf-V436F do wspierania wzrostu w 43,5 °C dowodzi braku funkcji chaperonowej tego białka. W tym względzie KPf-V436F służy jako idealne białko kontrolne negatywne.
<img alt="Schemat odpowiedzi na stres cieplny szczepu E. coli dnaK756; ochrona białek; efekt plazmidu Hsp70; &gt;40°C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66515/66515fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Zasada testu komplementacji z wykorzystaniem E. coli dnaK756 komórki do badania funkcji chaperonowej białek ekspresowanych heterologicznie. E. coli dnaK756 wykazuje ekspresję natywnego białka DnaK756, które nie jest w stanie chronić komórek przed stresem termicznym. Wprowadzenie funkcjonalnego heterologicznego białka Hsp70 ratuje komórki przed śmiercią po narażeniu na stres termiczny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66515/66515fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wzrostu bakterii z użyciem Western blot; analiza rozcieńczeń seryjnych w 37°C i 43,5°C; badanie białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66515/66515fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Test komplementacji na płytkach wykazujący zdolność DnaK i KPf do ochrony komórek E. coli dnaK756 przed stresem termicznym. Transformowane komórki hodowano w temperaturze 37 °C (permissywna temperatura wzrostu) oraz 43,5 °C (non-permissywna temperatura wzrostu). Komórki zestandaryzowano i wysiano w formie rozcieńczeń seryjnych. „N” oznacza „Neat” (surowy), reprezentując pierwszą plamkę złożoną z nierozcieńczonych komórek. Po prawej stronie znajdują się wycinki z Western blot reprezentujące ekspresję trzech białek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66515/66515fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół demonstruje aktywność białka szoku cieplnego 70 (Hsp70). Komórki E. coli dnaK756 służą jako model dla testu, ponieważ zawierają natywny, funkcjonalnie upośledzony Hsp70, co czyni je podatnymi na stres cieplny. Heterologiczne wprowadzenie funkcjonalnego Hsp70 ratuje niedobór wzrostu komórek.

Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Rolę białek szoku cieplnego rozpoczynam od porównania ochrony retrostatycznej do antygenów wywołujących infekcje u ludzi, takie jak malaria i gruźlica. Moje badania koncentrują się zasadniczo na cechach funkcji struktury maszynerii białkowej szoku cieplnego tych patogenów, które powodują infekcje u ludzi. Białka szoku cieplnego są na ogół wysoce koncepcyjne, jednak wykazują pewien poziom specjalizacji funkcjonalnej.Ponadto są one związane z opornością na leki. W związku z tym trwają prace mające na celu ukierunkowanie ich na odwrócenie oporności na leki w różnych modelach choroby. Obejmują one techniki biochemiczne, biofizyczne, bioinformatyczne i biologiczne komórki.Innymi słowy, do badania ról tych białek wykorzystuje się różne obszary technik. W naszym przypadku badanie białek, które są głównym czynnikiem wywołującym malarię, polega na tym, że są one trudne do wyprodukowania, a to ogranicza zdolność do uruchomienia tych białek. Na przykład trudno jest wygenerować wystarczające poziomy do krystalizacji i obrazowania białek.Ustaliliśmy niektóre z biofunkcjonalnych wskaźników tych białek u osoby chorej na malarię. Ustaliliśmy również testy, aby uruchomić związki ukierunkowane na te białka w czynnikach powodujących malarię i TD. Obecny protokół jest używany do badania surowej i cytoprotekcyjnej funkcji fałdowania białka opiekuńczego lub białka HSP 70, przy użyciu modelu równego. Protokół może być również przyjęty do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych, ukierunkowanych na każde białko 70.Na początek oznacz dwie mililitrowe mikroprobówki wirówkowe. Odpipetować 50 mikrolitrów podwielokrotności E. coli, kultur DnaK 756 do probówek. Umieść probówki na lodzie.Dodaj od 10 do 50 nanogramów plazmidowego DNA do każdej oddzielnej probówki z podwielokrotnościami E. coli. Trzymaj probówki na lodzie przez 30 minut. Następnie umieść ogniwa w temperaturze 42 stopni Celsjusza na 60 sekund, aby zaszokować je cieplnie.Odpipetować 950 mikrolitrów świeżego, dwukrotnie drożdżowego bulionu tryptonowego do probówek. Następnie inkubuj probówki w shakerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odpipetować 100 mikrolitrów przekształconej kultury komórkowej i rozprowadzić je na płytkach agarowych z dwukrotnym tryptonem drożdżowym zawierającym antybiotyki.Odwirować pozostałe komórki przez jedną minutę w temperaturze 5 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować około 800 mikrolitrów bulionu. Ponownie zawiesić granulowane komórki w pozostałym podłożu.Umieść odzyskane komórki na dwukrotnej płytce z agarem z tryptonem drożdżowym. Następnie inkubuj obie płytki agarowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Aby pokryć komórki, użyj sterylnej pętli, aby pobrać pojedynczą kolonię z transformantów.Zaszczep go w 10 mililitrach dwukrotnego bulionu tryptonowego drożdżowego uzupełnionego antybiotykami. Teraz przygotuj seryjne rozcieńczenie komórek od 100 do 10 do ujemnej kwinty w dwumililitrowych mikroprobówkach wirówkowych. Przed wykryciem komórek umieść płytki agarowe uzupełnione antybiotykami i IPTG w piekarniku w temperaturze 40 stopni Celsjusza z częściowo otwartymi pokrywkami.Gdy płytki są wystarczająco suche, umieść dwa mikrolitry seryjnie rozcieńczonych komórek na płytkach agarowych. Umieścić każdą próbkę na dwóch oddzielnych płytkach. Inkubuj jedną płytkę w dopuszczalnej temperaturze wzrostu 37 stopni Celsjusza, a drugą w niedozwolonej temperaturze wzrostu 43,5 stopnia Celsjusza.Aby potwierdzić ekspresję rekombinowanych białek, użyj sterylnej pętli, aby pobrać część pozostałych komórek z tej samej kolonii transformantów. Zaszczep komórki w 10 mililitrach bulionu tryptonowego z drożdży uzupełnionych antybiotykiem. Inkubuj kultury na shakerze przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wszystkie komórki E. coli DnaK 756 rosły w dopuszczalnej temperaturze wzrostu 37 stopni Celsjusza. Jednak tylko komórki heterologiczne wykazujące ekspresję DnaK i KPf rosły w niedopuszczającej temperaturze wzrostu. Zmutowane komórki eksprymujące KPfV 436F rosły tylko w 37 stopniach Celsjusza, ale nie rosły w 43,5 stopnia Celsjusza.Na początek odpipetuj 80 mikrolitrów przekształconych komórek E. coli do fiolki. Odpipetować 20 mikrolitrów czterokrotnie, kiepski bufor ładujący SDS do fiolki. Gotuj zawiesinę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut w bloku grzewczym.Następnie załaduj 10 mikrolitrów próbki na prefabrykowany żel SDS. Elektroforezę żelu w temperaturze pokojowej przez godzinę przy napięciu 120 woltów w buforze SDS. Po zakończeniu elektroforezy zabarwić żel w barwie Coomassie przez godzinę.Odbarwić żel w buforze zatrzymującym, zawierającym 50% metanolu i 10% kwasu octowego, w wodzie destylowanej przez dwie godziny. Umieść żel w systemie obrazowania żelu, aby uwidocznić prążki białkowe. Następnie przenieś białka żelu SDS do membrany nitrocelulozowej.Przemyć membranę nitrocelulozową trzykrotnie w buforze do mycia. Przenieść błonę do 5% beztłuszczowego mleka zawierającego przeciwciała rozcieńczonego w stosunku 1 do 2 000. Inkubować błonę z przeciwciałami w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 60 obr./min przez godzinę.Następnie przemyj membranę nitrocelulozową w buforze TBS z kętkami pośrednimi, trzy razy po 15 minut, aby usunąć wszelkie niespecyficznie związane przeciwciała. Teraz przenieś membranę do naczynia z przeciwciałem wtórnym. Inkubować membranę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 60 obr./min przez godzinę.Po umyciu membrany, tak jak poprzednio, użyj ulepszonego odczynnika do wykrywania chemiluminescencji, aby rozwiązać pasma. Wizualizacja pasm za pomocą imagera żelowego.

escherichia-coli-based-complementation-assay-to-study-chaperone

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym protokole opisana jest metoda pomiaru ponownego fałdowania białek wewnątrzkomórkowych po szoku cieplnym. Metoda ta może być stosowana do badania fałd, takich jak molekularne białka opiekuńcze i ich kofaktory lub związki, które mogą wpływać na ich aktywność. Aktywność lucyferazy świetlika jest używana jako reporter do pomiaru aktywności ponownego fałdowania białka opiekuńczego.

Test ponownego fałdowania wewnątrzkomórkowego

Źródło: Dahl, J. i in. Wykrywanie pH-zależnej aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB in vitro i in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje test oparty na spektrofotometrze fluorescencyjnym, który pozwala ocenić aktywność chaperonów na białku substratu pod wpływem stresu kwasowego i cieplnego. Opisuje on kroki monitorowania rozwijającego się i agregującego się podłoża poprzez rozpraszanie światła, porównując warunki z i bez chaperone.

Ocena aktywności bakteryjnego chaperonów poprzez termiczne rozwijanie białka modelowego

Źródło: Dahl, J. i inni. Wykrywanie pH-zależnej aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB in vitro i in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje stosowanie rekombinowanych hodowli E. coli do oceny ochronnego efektu kwasowo aktywowanego chaperonu podczas stresu kwasowego. Monitorowanie wzrostu bakterii wykazuje zwiększoną przeżywalność w hodowlach ekspresujących chaperony w porównaniu z grupami kontrolnymi, podkreślając rolę chaperonów w stabilizacji białek w warunkach stresu.

Ocena ochrony roli chaperonu aktywowanego kwasem w E. coli pod wpływem stresu kwasowego

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

To badanie opisuje techniki biofizyczne, biochemiczne i molekularne do scharakteryzowania aktywności opiekuńczej Escherichia coli HdeB w warunkach kwaśnego pH. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do innych opiekuńczych chroniących przed kwasami, takich jak HdeA, i mogą być modyfikowane tak, aby działały w przypadku innych białek opiekuńczych i warunków stresu.

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Opisujemy metodę eksperymentów ratujących zubożenie, która zachowuje integralność komórkową i homeostazę białek. Adenofection umożliwia analizę funkcjonalną białek w procesach biologicznych, które opierają się na precyzyjnie dostrojonej dynamice opartej na aktynie, takiej jak mitotyczny podział komórek i miogeneza, na poziomie pojedynczej komórki.

Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

Społeczny ameba Dictyostelium discoideum został niedawno założony jako system do badania nieprawidłowego fałdowania białek i proteostazy. W tym miejscu opisujemy nową metodologię opartą na obrazowaniu do badania agregacji białek wywołanej temperaturą i odpowiedzi na stres komórkowy u D. discoideum.

Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Tutaj przedstawiono standardowe protokoły do oceny indukcji reakcji na szok cieplny (HSR) u Caenorhabditis elegans za pomocą RT-qPCR na poziomie molekularnym, fluorescencyjnych reporterów na poziomie komórkowym i termoregeneracji na poziomie organizmu.

Znormalizowane metody pomiaru indukcji reakcji na szok cieplny u Caenorhabditis elegans

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Ten protokół przedstawia technikę badania interakcji białko-białko za pomocą koralików donorowych połączonych z glutationem z ko-chaperonami z motywem TPR i koralikami akceptorowymi sprzężonymi z peptydem pochodzącym z Hsp90. Wykorzystaliśmy tę technikę do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.

Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

Poznaj test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70. Ta metoda pozwala ocenić aktywność szaperonową Hsp70 i jego rolę w ochronie komórek przed stresem cieplnym.

Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Przeglądaj więcej filmów