Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Rolę białek szoku cieplnego rozpoczynam od porównania ochrony retrostatycznej do antygenów wywołujących infekcje u ludzi, takie jak malaria i gruźlica. Moje badania koncentrują się zasadniczo na cechach funkcji struktury maszynerii białkowej szoku cieplnego tych patogenów, które powodują infekcje u ludzi. Białka szoku cieplnego są na ogół wysoce koncepcyjne, jednak wykazują pewien poziom specjalizacji funkcjonalnej.

Ponadto są one związane z opornością na leki. W związku z tym trwają prace mające na celu ukierunkowanie ich na odwrócenie oporności na leki w różnych modelach choroby. Obejmują one techniki biochemiczne, biofizyczne, bioinformatyczne i biologiczne komórki.

Innymi słowy, do badania ról tych białek wykorzystuje się różne obszary technik. W naszym przypadku badanie białek, które są głównym czynnikiem wywołującym malarię, polega na tym, że są one trudne do wyprodukowania, a to ogranicza zdolność do uruchomienia tych białek. Na przykład trudno jest wygenerować wystarczające poziomy do krystalizacji i obrazowania białek.

Ustaliliśmy niektóre z biofunkcjonalnych wskaźników tych białek u osoby chorej na malarię. Ustaliliśmy również testy, aby uruchomić związki ukierunkowane na te białka w czynnikach powodujących malarię i TD. Obecny protokół jest używany do badania surowej i cytoprotekcyjnej funkcji fałdowania białka opiekuńczego lub białka HSP 70, przy użyciu modelu równego. Protokół może być również przyjęty do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych, ukierunkowanych na każde białko 70.

Na początek oznacz dwie mililitrowe mikroprobówki wirówkowe. Odpipetować 50 mikrolitrów podwielokrotności E. coli, kultur DnaK 756 do probówek. Umieść probówki na lodzie.

Dodaj od 10 do 50 nanogramów plazmidowego DNA do każdej oddzielnej probówki z podwielokrotnościami E. coli. Trzymaj probówki na lodzie przez 30 minut. Następnie umieść ogniwa w temperaturze 42 stopni Celsjusza na 60 sekund, aby zaszokować je cieplnie.

Odpipetować 950 mikrolitrów świeżego, dwukrotnie drożdżowego bulionu tryptonowego do probówek. Następnie inkubuj probówki w shakerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odpipetować 100 mikrolitrów przekształconej kultury komórkowej i rozprowadzić je na płytkach agarowych z dwukrotnym tryptonem drożdżowym zawierającym antybiotyki.

Odwirować pozostałe komórki przez jedną minutę w temperaturze 5 000 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować około 800 mikrolitrów bulionu. Ponownie zawiesić granulowane komórki w pozostałym podłożu.

Umieść odzyskane komórki na dwukrotnej płytce z agarem z tryptonem drożdżowym. Następnie inkubuj obie płytki agarowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Aby pokryć komórki, użyj sterylnej pętli, aby pobrać pojedynczą kolonię z transformantów.

Zaszczep go w 10 mililitrach dwukrotnego bulionu tryptonowego drożdżowego uzupełnionego antybiotykami. Teraz przygotuj seryjne rozcieńczenie komórek od 100 do 10 do ujemnej kwinty w dwumililitrowych mikroprobówkach wirówkowych. Przed wykryciem komórek umieść płytki agarowe uzupełnione antybiotykami i IPTG w piekarniku w temperaturze 40 stopni Celsjusza z częściowo otwartymi pokrywkami.

Gdy płytki są wystarczająco suche, umieść dwa mikrolitry seryjnie rozcieńczonych komórek na płytkach agarowych. Umieścić każdą próbkę na dwóch oddzielnych płytkach. Inkubuj jedną płytkę w dopuszczalnej temperaturze wzrostu 37 stopni Celsjusza, a drugą w niedozwolonej temperaturze wzrostu 43,5 stopnia Celsjusza.

Aby potwierdzić ekspresję rekombinowanych białek, użyj sterylnej pętli, aby pobrać część pozostałych komórek z tej samej kolonii transformantów. Zaszczep komórki w 10 mililitrach bulionu tryptonowego z drożdży uzupełnionych antybiotykiem. Inkubuj kultury na shakerze przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wszystkie komórki E. coli DnaK 756 rosły w dopuszczalnej temperaturze wzrostu 37 stopni Celsjusza. Jednak tylko komórki heterologiczne wykazujące ekspresję DnaK i KPf rosły w niedopuszczającej temperaturze wzrostu. Zmutowane komórki eksprymujące KPfV 436F rosły tylko w 37 stopniach Celsjusza, ale nie rosły w 43,5 stopnia Celsjusza.

Na początek odpipetuj 80 mikrolitrów przekształconych komórek E. coli do fiolki. Odpipetować 20 mikrolitrów czterokrotnie, kiepski bufor ładujący SDS do fiolki. Gotuj zawiesinę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut w bloku grzewczym.

Następnie załaduj 10 mikrolitrów próbki na prefabrykowany żel SDS. Elektroforezę żelu w temperaturze pokojowej przez godzinę przy napięciu 120 woltów w buforze SDS. Po zakończeniu elektroforezy zabarwić żel w barwie Coomassie przez godzinę.

Odbarwić żel w buforze zatrzymującym, zawierającym 50% metanolu i 10% kwasu octowego, w wodzie destylowanej przez dwie godziny. Umieść żel w systemie obrazowania żelu, aby uwidocznić prążki białkowe. Następnie przenieś białka żelu SDS do membrany nitrocelulozowej.

Przemyć membranę nitrocelulozową trzykrotnie w buforze do mycia. Przenieść błonę do 5% beztłuszczowego mleka zawierającego przeciwciała rozcieńczonego w stosunku 1 do 2 000. Inkubować błonę z przeciwciałami w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 60 obr./min przez godzinę.

Następnie przemyj membranę nitrocelulozową w buforze TBS z kętkami pośrednimi, trzy razy po 15 minut, aby usunąć wszelkie niespecyficznie związane przeciwciała. Teraz przenieś membranę do naczynia z przeciwciałem wtórnym. Inkubować membranę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 60 obr./min przez godzinę.

Po umyciu membrany, tak jak poprzednio, użyj ulepszonego odczynnika do wykrywania chemiluminescencji, aby rozwiązać pasma. Wizualizacja pasm za pomocą imagera żelowego.