Wytwarzanie zdecelularizowanej matrycy śledziony pochodzącej od szczurów
February 9th, 2024
Bezkomórkowa matryca śledziony (DSM) ma obiecujące zastosowania w dziedzinie inżynierii tkankowej wątroby. Protokół ten określa procedurę przygotowania DSM dla szczurów, która obejmuje zbieranie śledziony szczurów, ich decellularację poprzez perfuzję i ocenę powstałego DSM w celu potwierdzenia jego cech.
Naszym celem jest normalna strategia, która polega na zastosowaniu zdecelularizowanego rozmiaru matrycy śledziony i alternatywnego rusztowania za pomocą sztucznych poziomów, co pokazuje szczegółową procedurę zbierania czerwonej śledziony i przygotowania zdecelularizowanej macierzy śledziony, która zachowuje makrostruktury i składniki metryki zewnątrzkomórkowej. Nasz protokół zapewnia łatwo dostępny rozmiar metryczny śledziony i alternatywę dla poziomów dawcy skali. Nasza metoda przygotowania metryki decelularyzacji śledziony wykazała skuteczność, stabilność i minimalną inwazyjność.
Metoda ta pozwala zachować naturalną strukturę architektoniczną śledziony i naturalną sieć naczyniową. Oferuje rusztowanie, pełną implantację komórek i trójwymiarową dynamiczną hodowlę, tworząc w ten sposób podstawę do postępu badań nad wątrobą modyfikowaną tkankowo. Na początek umieść znieczulonego, ogolonego szczura w pozycji leżącej na stole operacyjnym.
Wstrzyknąć dwa mililitry heparynizowanej soli fizjologicznej do żyły grzbietowej prącia w celu ogólnoustrojowego antyzakrzepu. Zdezynfekuj ogoloną skórę brzucha roztworem jodu powidonu i przykryj sterylną ściereczką. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w kształcie krzyża w jamie brzusznej.
Rozciągając jamę brzuszną za pomocą kleszczy hemostatycznych, odwróć wątrobę w kierunku przepony. Zewnętrz przewód pokarmowy na prawą stronę brzucha i przykryj go wilgotną gazą. Ostrożnie oddziel i przetnij więzadło śledzionowo-żołądkowe, aby odsłonić wnękę śledziony.
Stopniowo wypreparuj wzdłuż wnęki śledziony, aby oddzielić i odsłonić wspólną tętnicę wątrobową, tętnicę żołądkowo-dwunastniczą i tętnicę śledzionową. Podwiązać i przeciąć tętnicę żołądkowo-dwunastniczą i wspólną tętnicę wątrobową, stopniowo dysocjując otaczającą tkankę. Odwróć śledzionę w prawą stronę, aby odsłonić aortę brzuszną.
Delikatnie wykonaj rozwarstwienie za pomocą bawełnianych wacików, aby odsłonić aortę brzuszną i pień trzewny. Umieść jedwabny szew z trzema zerami o długości około trzech centymetrów, powyżej i poniżej gałęzi pnia trzewki. Następnie umieść 10-centymetrowy szew jedwabny z sześcioma zerami na gałęzi pnia celiakii.
Podwiązać aortę brzuszną poniżej i powyżej gałęzi pnia trzewnej. Następnie wykonaj małe nacięcie w gałęzi tętnicy. Delikatnie podnieś sześć jedwabny szew zerowy i wprowadź cewnik żylny o rozmiarze 24 do tętnicy śledziony wzdłuż pnia trzewnego.
Podwiązać cewnik, aby zabezpieczyć go na miejscu. Użyj pompy strzykawkowej, aby zainparzyć 50 mililitrów heparynizowanej soli fizjologicznej w tempie czterech mililitrów na minutę. Jednocześnie przeciąć żyłę wrotną jako kanał odpływowy, aby umożliwić przepływ płynu z śledziony.
Ostrożnie wypreparuj otaczającą tkankę śledziony, unikając uszkodzenia trzustki, zachowując jednocześnie główne naczynia dodatkowe. Sprawdź, czy nie ma wycieków wokół śledziony. Następnie usuń śledzionę i trzustkę i opłucz je w zwykłej soli fizjologicznej.
Przenieś śledzionę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej zwykłą solą fizjologiczną. I przechowuj go w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Na początek trzykrotnie zamroź i rozmroź zamrożoną śledzionę szczura, aby uszkodzić komórki śledziony.
Na czystej ławce ustaw pompę perystaltyczną, dwulitrowy zbiornik, silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej 2,4 milimetra i pułapkę bąbelkową. Napełnij system perfuzyjny wodą dejonizowaną. Pozostaw go włączonego przez 10 minut.
Ostrożnie przenieś zebraną śledzionę do pojemnika wypełnionego wodą dejonizowaną. Następnie podłącz silikonową rurkę do cewnika żylnego, który został wprowadzony do tętnicy śledzionowej. Wykonaj obfitowanie roztworami wody dejonizowanej, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 i PBS.
Napełnij 50-mililitrową probówkę wirówkową PBS, zawierającą 10% penicyliny streptomycyny. Przenieś zdecelularowaną matrycę śledziony do PBS. Przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dalszych eksperymentów.
Całkowita decelularyzacja śledziony została osiągnięta w ciągu około 11 godzin. Kolor stopniowo przechodził od głębokiej czerwieni do modelowanej jasnoczerwieni, a ostatecznie do białego, półprzezroczystego wyglądu, przy czym ogólna morfologia pozostała nienaruszona.
Przegląd
Ten protokół opisuje przygotowanie zdezorganizowanej macierzy śledziony (DSM) z śledzion szczurów, co jest istotne dla inżynierii tkanki wątroby. Metoda zachowuje architekturę i sieć naczyniową śledziony, oferując obiecującą podstawę dla implantacji komórek i dynamicznej kultury.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Inżynieria tkanki
- Medycyna regeneracyjna
- Biomateriały
Tło
- Zdezorganizowane macierze są kluczowe dla tworzenia podstaw w inżynierii tkanki.
- Struktura i składniki śledziony są cenne dla rozwoju tkanki wątroby.
- Zachowanie naturalnej architektury śledziony jest istotne dla jej funkcjonalności.
- Obecne metody mają na celu minimalizowanie inwazyjności przy zapewnieniu stabilności i wydajności.
Cel badania
- Dostarczyć niezawodną metodę przygotowania DSM dla inżynierii tkanki wątroby.
- Wykazać zachowanie składników zewnątrzkomórkowej matrycy.
- Ustanowić podstawę dla przyszłych badań w zastosowaniach inżynierii tkanki wątroby.
Stosowane metody
- Pobieranie śledzion szczurów od znieczulonych zwierząt.
- Zdezorganizacja poprzez techniki perfuzji.
- Ocena wynikającej DSM pod kątem integralności strukturalnej.
- Wdrożenie trójwymiarowego systemu dynamicznej kultury.
Główne wyniki
- Metoda zdezorganizacji skutecznie zachowuje makrostruktury śledziony.
- Wynikająca DSM wspiera pełną implantację komórek.
- Protokół wykazuje minimalną inwazyjność i wysoką efektywność.
- Naturalna sieć naczyniowa śledziony jest zachowana w DSM.
Wnioski
- DSM jest obiecującą podstawą dla inżynierii tkanki wątroby.
- Ta metoda może ułatwić postęp w medycynie regeneracyjnej.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole dla różnych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Decellularized spleen matrix (DSM) fabrication provides a scalable, structurally preserved scaffold for liver tissue engineering, addressing the shortage of donor organs in end-stage liver disease. By maintaining the spleen's extracellular matrix and vascular architecture, DSM enables robust cell implantation and dynamic culture, supporting predictive confidence in preclinical model development. This capability strengthens the translational pipeline for bioartificial liver (BAL) research and cell therapy innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of scaffold biocompatibility and ECM-driven cell behavior for tissue engineering targets.
- Supports biological de-risking by preserving native vascular and matrix structures for functional validation.
- Facilitates predictive confidence in scaffold suitability for downstream liver tissue engineering applications.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible, decellularized matrix for standardized cell seeding and viability assays.
- Ensures assay readiness by maintaining ECM integrity and three-dimensional architecture.
- Enables quantitative assessment of cell engraftment and scaffold performance in dynamic culture systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant system development for liver failure models and BAL evaluation.
- Supports continuity from scaffold fabrication to preclinical validation of engineered tissue constructs.
- Reduces mechanistic ambiguity by offering a physiologically relevant matrix for translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
DSM fabrication integrates into the tissue engineering continuum from scaffold preparation through preclinical model development and translational research for liver therapies.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on ECM-driven cell function and scaffold-host interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for cell viability and matrix compatibility assays.
- Analytics: Provides histological and structural readouts to compare decellularization efficiency and ECM preservation.
- Translational Research: Bridges scaffold engineering with preclinical evaluation of BAL and cell therapy constructs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for scalable scaffold production across tissue engineering programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological risk in engineered tissue development.
- Operational Value: Standardizes scaffold preparation for reproducibility and scalability in R&D workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for advancing tissue engineering assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative medicine and BAL pipeline candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surgical tissue harvesting and decellularization protocols.
- Needs access to perfusion instrumentation and histological analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible scaffold quality and ECM preservation.
- Adaptation may be necessary for different organ sizes or species models.
- Limitations include the need for careful vascular preservation and validation of decellularization completeness.
