Wytwarzanie zdecelularizowanej matrycy śledziony pochodzącej od szczurów
9 lutego 2024
Bezkomórkowa matryca śledziony (DSM) ma obiecujące zastosowania w dziedzinie inżynierii tkankowej wątroby. Protokół ten określa procedurę przygotowania DSM dla szczurów, która obejmuje zbieranie śledziony szczurów, ich decellularację poprzez perfuzję i ocenę powstałego DSM w celu potwierdzenia jego cech.
Naszym celem jest normalna strategia, która polega na zastosowaniu zdecelularizowanego rozmiaru matrycy śledziony i alternatywnego rusztowania za pomocą sztucznych poziomów, co pokazuje szczegółową procedurę zbierania czerwonej śledziony i przygotowania zdecelularizowanej macierzy śledziony, która zachowuje makrostruktury i składniki metryki zewnątrzkomórkowej. Nasz protokół zapewnia łatwo dostępny rozmiar metryczny śledziony i alternatywę dla poziomów dawcy skali. Nasza metoda przygotowania metryki decelularyzacji śledziony wykazała skuteczność, stabilność i minimalną inwazyjność.
Metoda ta pozwala zachować naturalną strukturę architektoniczną śledziony i naturalną sieć naczyniową. Oferuje rusztowanie, pełną implantację komórek i trójwymiarową dynamiczną hodowlę, tworząc w ten sposób podstawę do postępu badań nad wątrobą modyfikowaną tkankowo. Na początek umieść znieczulonego, ogolonego szczura w pozycji leżącej na stole operacyjnym.
Wstrzyknąć dwa mililitry heparynizowanej soli fizjologicznej do żyły grzbietowej prącia w celu ogólnoustrojowego antyzakrzepu. Zdezynfekuj ogoloną skórę brzucha roztworem jodu powidonu i przykryj sterylną ściereczką. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w kształcie krzyża w jamie brzusznej.
Rozciągając jamę brzuszną za pomocą kleszczy hemostatycznych, odwróć wątrobę w kierunku przepony. Zewnętrz przewód pokarmowy na prawą stronę brzucha i przykryj go wilgotną gazą. Ostrożnie oddziel i przetnij więzadło śledzionowo-żołądkowe, aby odsłonić wnękę śledziony.
Stopniowo wypreparuj wzdłuż wnęki śledziony, aby oddzielić i odsłonić wspólną tętnicę wątrobową, tętnicę żołądkowo-dwunastniczą i tętnicę śledzionową. Podwiązać i przeciąć tętnicę żołądkowo-dwunastniczą i wspólną tętnicę wątrobową, stopniowo dysocjując otaczającą tkankę. Odwróć śledzionę w prawą stronę, aby odsłonić aortę brzuszną.
Delikatnie wykonaj rozwarstwienie za pomocą bawełnianych wacików, aby odsłonić aortę brzuszną i pień trzewny. Umieść jedwabny szew z trzema zerami o długości około trzech centymetrów, powyżej i poniżej gałęzi pnia trzewki. Następnie umieść 10-centymetrowy szew jedwabny z sześcioma zerami na gałęzi pnia celiakii.
Podwiązać aortę brzuszną poniżej i powyżej gałęzi pnia trzewnej. Następnie wykonaj małe nacięcie w gałęzi tętnicy. Delikatnie podnieś sześć jedwabny szew zerowy i wprowadź cewnik żylny o rozmiarze 24 do tętnicy śledziony wzdłuż pnia trzewnego.
Podwiązać cewnik, aby zabezpieczyć go na miejscu. Użyj pompy strzykawkowej, aby zainparzyć 50 mililitrów heparynizowanej soli fizjologicznej w tempie czterech mililitrów na minutę. Jednocześnie przeciąć żyłę wrotną jako kanał odpływowy, aby umożliwić przepływ płynu z śledziony.
Ostrożnie wypreparuj otaczającą tkankę śledziony, unikając uszkodzenia trzustki, zachowując jednocześnie główne naczynia dodatkowe. Sprawdź, czy nie ma wycieków wokół śledziony. Następnie usuń śledzionę i trzustkę i opłucz je w zwykłej soli fizjologicznej.
Przenieś śledzionę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej zwykłą solą fizjologiczną. I przechowuj go w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Na początek trzykrotnie zamroź i rozmroź zamrożoną śledzionę szczura, aby uszkodzić komórki śledziony.
Na czystej ławce ustaw pompę perystaltyczną, dwulitrowy zbiornik, silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej 2,4 milimetra i pułapkę bąbelkową. Napełnij system perfuzyjny wodą dejonizowaną. Pozostaw go włączonego przez 10 minut.
Ostrożnie przenieś zebraną śledzionę do pojemnika wypełnionego wodą dejonizowaną. Następnie podłącz silikonową rurkę do cewnika żylnego, który został wprowadzony do tętnicy śledzionowej. Wykonaj obfitowanie roztworami wody dejonizowanej, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 i PBS.
Napełnij 50-mililitrową probówkę wirówkową PBS, zawierającą 10% penicyliny streptomycyny. Przenieś zdecelularowaną matrycę śledziony do PBS. Przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dalszych eksperymentów.
Całkowita decelularyzacja śledziony została osiągnięta w ciągu około 11 godzin. Kolor stopniowo przechodził od głębokiej czerwieni do modelowanej jasnoczerwieni, a ostatecznie do białego, półprzezroczystego wyglądu, przy czym ogólna morfologia pozostała nienaruszona.
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje przygotowanie odkomórkowanej macierzy śledziony (DSM) z śledzion ratów, co ma istotne znaczenie dla inżynierii tkankowej wątroby. Metoda ta pozwala na zachowanie architektury śledziony oraz sieci naczyniowej, oferując obiecujące rusztowanie do implantacji komórek i hodowli dynamicznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Medycyna regeneracyjna
- Biomateriały
Wprowadzenie
- Macierze decelularyzowane są kluczowe dla tworzenia rusztowań w inżynierii tkankowej.
- Struktura i składniki śledziony są cenne dla rozwoju tkanki wątroby.
- Zachowanie naturalnej architektury śledziony jest niezbędne dla jej funkcjonalności.
- Obecne metody mają na celu zminimalizowanie inwazyjności przy jednoczesnym zapewnieniu stabilności i wydajności.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody przygotowania DSM do inżynierii tkankowej wątroby.
- Wykazanie zachowania składników macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Stworzenie podstawy dla przyszłych badań w zakresie zastosowań inżynierii tkankowej wątroby.
Zastosowane metody
- Pobieranie śledziony szczurów od zwierząt zanieczulonych.
- Decelularyzacja przy użyciu technik perfuzji.
- Ocena integralności strukturalnej otrzymanej DSM.
- Wdrożenie trójwymiarowego dynamicznego systemu hodowli.
Główne wyniki
- Metoda decelularyzacji skutecznie utrzymuje makrostruktury śledziony.
- Otrzymana macierz pozakomórkowa (DSM) umożliwia pełną implantację komórek.
- Protokół charakteryzuje się minimalną inwazyjnością i wysoką wydajnością.
- W macierzy DSM zachowana zostaje naturalna sieć naczyniowa śledziony.
Wnioski
- DSM stanowi obiecujące rusztowanie w inżynierii tkankowej wątroby.
- Metoda ta może przyczynić się do postępów w medycynie regeneracyjnej.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole w różnych zastosowaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Wytwarzanie decelularyzowanej macierzy śledziony (DSM) dostarcza skalowalnego, strukturalnie zachowanego rusztowania do inżynierii tkanki wątroby, co pozwala rozwiązać problem niedoboru narządów dawców w schorzeniach wątroby w stadium końcowym. Dzięki zachowaniu macierzy zewnątrzkomórkowej i architektury naczyniowej śledziony, DSM umożliwia skuteczną implantację komórek oraz dynamiczną hodowlę, co zwiększa wiarygodność prognostyczną w rozwoju modeli przedklinicznych. Możliwość ta wzmacnia proces translacyjny w badaniach nad bioartystyczną wątrobą (BAL) i innowacjach w zakresie terapii komórkowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę biokompatybilności rusztowania oraz zachowania komórek sterowanego przez ECM w kontekście celów inżynierii tkankowej.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zachowanie natywnych struktur naczyniowych i macierzy w celu walidacji funkcjonalnej.
- Zwiększa pewność prognostyczną co do przydatności rusztowania w dalszych zastosowaniach z zakresu inżynierii tkanki wątrobowej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalną, decelularyzowaną macierz do standaryzowanego wysiewu komórek i testów żywotności.
- Gwarantuje gotowość do analizy poprzez zachowanie integralności ECM i architektury trójwymiarowej.
- Umożliwia ilościową ocenę przyjmowania komórek i wydajności rusztowania w dynamicznych systemach hodowli.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z rozwojem systemów istotnych dla chorób w modelach niewydolności wątroby oraz oceny BAL.
- Zapewnia ciągłość od procesu wytwarzania rusztowań po przedkliniczną walidację inżynieryjnych konstruktów tkankowych.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez zapewnienie fizjologicznie istotnej macierzy do badań translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Wytwarzanie DSM wpisuje się w kontinuum inżynierii tkankowej, od przygotowania rusztowań, poprzez rozwój modeli przedklinicznych, aż po badania translacyjne nad terapiami wątroby.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia zaawansowaną weryfikację hipotez dotyczących funkcji komórek sterowanych przez ECM oraz interakcji między rusztowaniem a organizmem gospodarza.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki w testach żywotności komórek i kompatybilności macierzy.
- Analityka: Dostarcza odczytów histologicznych i strukturalnych w celu porównania wydajności decelularyzacji i stopnia zachowania ECM.
- Badania translacyjne: Łączy inżynierię rusztowań z oceną przedkliniczną konstruktów BAL i terapii komórkowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny protokół skalowalnej produkcji rusztowań w ramach programów inżynierii tkankowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza ryzyko biologiczne w rozwoju inżynierii tkankowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie rusztowań w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w procesach badawczo-rozwojowych (R&D).
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) nad zasobami inżynierii tkankowej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka dla kandydatów w obszarze medycyny regeneracyjnej oraz potoku BAL.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie chirurgicznego pobierania tkanek oraz protokołów decelularyzacji.
- Niezbędny jest dostęp do aparatury perfuzyjnej oraz infrastruktury do analizy histologicznej.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalnej jakości rusztowań i zachowania ECM.
- Możliwe jest konieczność adaptacji metody dla różnych rozmiarów organów lub modeli gatunkowych.
- Ograniczenia obejmują konieczność starannego zachowania naczyń krwionośnych oraz walidację stopnia kompletności decelularyzacji.
