Name: Wytwarzanie zdecelularizowanej matrycy śledziony pochodzącej od szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania zdecelularizowanej matrycy śledziony od szczurów dla inżynierii tkankowej wątroby. Protokół zachowuje naturalną architekturę i sieć naczyniową, zapewniając szkielet do implantacji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82000624), Program Badań Podstawowych Nauk Przyrodniczych Shaanxi (2022JQ-899 i 2021JM-268), Program Wsparcia Zdolności Innowacyjnych Prowincji Shaanxi (2023KJXX-030), Kluczowy Plan Badawczo-Rozwojowy Prowincji Shaanxi Wspólny Projekt-Kluczowy Projekt Projektu (2021GXLH-Z-047), Fundację Instytucjonalną Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Xi'an Jiaotong (2021HL-42 i 2021HL-21).

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Xi'an Jiaotong i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Zbiór śledziony
<ol>
	<li>Używaj samców szczurów Sprague Dawley o wadze 250-280 g. Trzymaj szczury w pomieszczeniach o kontrolowanej temperaturze i wilgotności oraz dostarczaj im jedzenie i wodę ad libitum, z wyjątkiem postu przed operacją.</li>
	<li>Buprenorfinę (0,05 ml/kg) należy wstrzyknąć podskórnie jako środek przeciwbólowy na 1 godzinę przed operacją. Znieczulić szczura przez inhalację izofluranu. Do znieczulenia indukcyjnego należy użyć natężenia przepływu 1,5 l/min 5% izofluranu w pudełku z pleksi i utrzymywać znieczulenie z natężeniem przepływu 0,6-0,8 l/min 2% izofluranu przez maskę. Potwierdź głębokość znieczulenia, ściskając palce u stóp.</li>
	<li>Użyj golarki elektrycznej, aby ogolić skórę na całym brzuchu. Zabezpiecz szczura w pozycji leżącej na stole operacyjnym. Wstrzyknąć 2 ml heparynizowanej soli fizjologicznej (1,000 j. heparyny) przez żyłę grzbietową prącia, aby uzyskać ogólnoustrojową antykoagulację. Zdezynfekuj ogoloną skórę roztworem jodu powidonu i przykryj sterylną ściereczką.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w kształcie krzyża za pomocą nożyczek chirurgicznych w jamie brzusznej, odsłoń jamę brzuszną, rozciągając się kleszczami hemostatycznymi i odwróć wątrobę w kierunku przepony. Zewnętrz przewód pokarmowy na prawą stronę brzucha i przykryj go wilgotną gazą.</li>
	<li>Ostrożnie oddziel i przetnij więzadło śledzionowo-żołądkowe, aby odsłonić wnękę śledziony. 
	UWAGA: Śledzionę, która pojawia się jako czerwonawa, wydłużona struktura o wymiarach około 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm, można zidentyfikować w lewej jamie brzusznej.</li>
	<li>Stopniowo oddzielaj i odsłaniaj wspólną tętnicę wątrobową, tętnicę żołądka i dwunastnicę oraz tętnicę śledzionową, przeprowadzając sekcję wzdłuż wnęki śledziony. Podwiązać i przeciąć tętnicę żołądkowo-dwunastniczą i wspólną tętnicę wątrobową, stopniowo dysocjując otaczającą tkankę.</li>
	<li>Odwróć śledzionę w prawą stronę, aby odsłonić aortę brzuszną. Delikatnie wykonaj rozwarstwienie i odsłoń aortę brzuszną i pień trzewny za pomocą bawełnianych wacików. Umieść jedwabny szew 3-0 o długości około 3 cm powyżej i poniżej gałęzi pnia celiakii, a następnie umieść jedwabny szew 6-0 o długości około 10 cm na gałęzi pnia trzewki.</li>
	<li>Podwiąż aortę brzuszną poniżej i powyżej gałęzi pnia trzewnej. Wykonaj małe nacięcie w gałęzi tętnicy. Delikatnie podnieś szew jedwabny 6-0, wprowadź cewnik żylny 24 G do tętnicy śledzionowej wzdłuż pnia trzewnego, a następnie podwiązaj go i zabezpiecz.</li>
	<li>Za pomocą pompy strzykawkowej z szybkością 4 ml/min podać heparynizowany roztwór soli fizjologicznej (25 j./ml) w objętości 50 ml. W tym samym czasie przeciąć żyłę wrotną jako kanał odpływowy, aby umożliwić przepływ podanego płynu ze śledziony. Zwierzę zostaje poddane eutanazji przez wykrwawienie.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj otaczającą tkankę śledziony, unikając uszkodzenia trzustki, zachowując jednocześnie główne naczynia dodatkowe.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma wycieków wokół śledziony, a następnie usuń śledzionę i trzustkę i spłucz je w zwykłej soli fizjologicznej. 
	UWAGA: Śledziona i trzustka szczurów są ściśle połączone, a trzustka owija się wokół tętnicy śledzionowej. Jeśli śledziona jest usuwana oddzielnie, podwiązanie wielu małych naczyń krwionośnych może być trudne. W tej procedurze śledziona jest usuwana wraz z trzustką. Po decelularyzacji śledziona i trzustka stają się przezroczyste i widoczne jest mikrokrążenie, co ułatwia zachowanie śledziony z nienaruszonymi naczyniami krwionośnymi.</li>
	<li>Przenieś śledzionę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej solą fizjologiczną i przechowuj ją w zamrażarce o temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Śledziona i cewnik żylny wprowadzone do tętnicy śledziony zostaną poddane kriokonserwacji razem w celu wygodnego połączenia podczas eksperymentów perfuzyjnych.</li>
</ol>
2. Decelularyzacja śledziony
<ol>
	<li>Powtórz cykl zamrażania i rozmrażania 3x w sterylnym pojemniku, aby zlizować komórki śledziony. 
	UWAGA: Cykl zamrażania-rozmrażania jest metodą fizyczną stosowaną do decelularyzacji rusztowania. Tkankę śledziony umieszcza się na noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C w celu zamrożenia, a następnie wyjmuje z środowiska o niskiej temperaturze i umieszcza w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej lub 37 °C w celu rozmrożenia. Ten proces zamrażania i rozmrażania powtarza się 3-6 razy, co rozrywa błony komórkowe i prowadzi do lizy komórek.</li>
	<li>Ustaw system perfuzyjny na czystym stole składającym się z pompy perystaltycznej, zbiornika o pojemności 2 litrów, silikonowej rurki o średnicy wewnętrznej 2,4 mm i pułapki bąbelkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Napełnij system perfuzyjny wodą dejonizowaną (ddH2O) i utrzymuj go w ruchu przez 10 minut.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś pobraną śledzionę do pojemnika wypełnionego ddH2O.</li>
	<li>Podłącz rurkę silikonową do cewnika żylnego, który został wprowadzony do tętnicy śledzionowej.</li>
	<li>Rozpocznij perfuzję z ddH2O z szybkością 2 ml/min przez 30 min.</li>
	<li>Kontynuować perfuzję z ddH2O z szybkością 4 ml/min przez 30 minut.</li>
	<li>Perfuzja z 0,1% (w/v) roztworem SDS przez 4 godziny.</li>
	<li>Perfuzja z 1% (v/v) roztworem Triton X-100 przez 2 godziny.</li>
	<li>Utymuluj z PBS z szybkością 4 ml/min przez 4 godziny w celu umycia DSM. 
	UWAGA: Używanie pompy perystaltycznej do jednokierunkowej perfuzji wszystkich cieczy.</li>
	<li>Po zakończeniu perfuzji podwiązaj i przetnij gałęzie naczyniowe między trzustką a śledzioną, a następnie usuń trzustkę. Przechowywać DSM w czystej i szczelnie zamkniętej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml nasączonej PBS zawierającym 10% penicyliny-streptomycyny w temperaturze -20 °C, aż będzie gotowy do użycia w przyszłych eksperymentach.</li>
</ol>

Decellularized Rat Spleen Matrix Preparation for Liver Tissue Engineering

<ol><li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+and+perspectives+in+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+Pancreat+Dis+Int%22%5BJournal%5D)">State of the art and perspectives in liver transplantation.</a> Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).</li>
<li>Hautz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+dynamics+deconvoluted+by+single-cell+RNA+sequencing+in+normothermic+machine+perfusion+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver.</a> Nat Commun. 14 (1), 2285(2023).</li>
<li>Cardini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+as+a+novel+tool+to+assess+liver+quality%3A+insights+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model.</a> Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes%3A+a+promising+therapeutic+agent+for+the+treatment+of+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (18), 10972(2022).</li>
<li>Yaghoubi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prednisolone+and+mesenchymal+stem+cell+preloading+protect+liver+cell+migration+and+mitigate+extracellular+matrix+modification+in+transplanted+decellularized+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36(2022).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).</li>
<li>Xiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+riboflavin%2FUVA+cross-linking+on+anti-degeneration+and+promoting+angiogenic+capability+of+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix.</a> J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+strategy+of+tissue-engineered+liver+based+on+decellularized+spleen+matrix+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+South+Med+Univ%22%5BJournal%5D)">Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats.</a> J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).</li>
<li>Xiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+spleen+matrix+for+reengineering+functional+hepatic-like+tissue+based+on+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+culture+in+autologous+decellularized+spleen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix.</a> Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocompatibility+improvement+of+decellularized+spleen+matrix+for+constructing+transplantable+bioartificial+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver.</a> Biomed Mater. 14 (2), 25003(2019).</li>
<li>Somuncu, Ö <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+concept+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Decellularization concept in regenerative medicine.</a> Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).</li>
<li>Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%3A+evaluation%2C+modification%2C+and+application+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotech%22%5BJournal%5D)">Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods.</a> Front Bioeng Biotech. 10, 805299(2022).</li>
<li>Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix%3A+New+promising+and+challenging+biomaterials+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine.</a> Biomaterials. 289, 121786(2022).</li>
<li>Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+decellularized+human+umbilical+arteries+as+small-diameter+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts.</a> Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).</li>
<li>Li, T., Javed, R., Ao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+decellularized+extracellular+matrix-based+biomaterials+For+peripheral+nerve+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration.</a> Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
</ol>

Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

BAL stanowią skuteczne podejście do leczenia schyłkowej niewydolności wątroby, szczególnie w przypadkach, gdy przeszczepienie wątroby jest utrudnione przez obecny niedobór narządów od dawców6. Obiecującą opcją do tworzenia BAL jest wykorzystanie DLM, który zachowuje naturalny ECM i strukturę naczyniową wątroby. Jednak niedobór DLM u ludzi oraz potencjalne ryzyko zakażenia i immunogenność związane z DLM u zwierząt stanowią znaczne ograniczenia. Aby sprostać temu wyzwaniu, proponujemy nowatorską strategię, która polega na zastosowaniu bezkomórkowego macierzy śledziony (DSM) jako alternatywnego rusztowania dla BAL 8,9,10,11. Śledziony są łatwiej dostępne w różnych scenariuszach klinicznych i wykazują podobne cechy do wątroby. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowe metody pozyskiwania śledziony szczurów i przygotowania DSM, które zachowują mikrostruktury i składniki ECM.
Idealna metoda decelularyzacji usunęłaby składniki komórkowe przy zachowaniu oryginalnej struktury, składu i właściwości mechanicznych ECM 12,13,14. Metody decelularyzacji obejmują zabiegi fizyczne, chemiczne i enzymatyczne, z których każda ma swoje odrębne zalety i wady15. Chociaż metody te mogą częściowo usunąć składniki komórkowe, mogą również zagrozić składowi, strukturze i funkcjonalności pozostałego ECM. Na jakość decelularyzacji mogą mieć wpływ różnice w gęstości komórek, grubości matrycy i morfologii tkanek w różnych źródłach tkankowych.
Do tej pory nie ma złotego standardu dla procesu decelularyzacji. Zazwyczaj samo zastosowanie którejkolwiek z tych metod jest niewystarczające do zminimalizowania niekorzystnego wpływu na ECM i maksymalizacji usuwania zawartości komórkowej. W związku z tym najskuteczniejsze podejście opiera się na charakterystyce tkanki, co wymaga połączenia tych metod. W tym badaniu wykorzystaliśmy protokół, który łączył metody fizyczne (cykle zamrażania i rozmrażania oraz perfuzja) z metodami chemicznymi (SDS i TritonX-100) w celu decelularyzacji śledziony szczurów.
Cykle zamrażania i rozmrażania sprzyjają lizie komórek i szybkiemu odłączaniu komórek od ECM16. Jednocześnie perfuzja przez natywne naczynia krwionośne znacznie zwiększa efektywność decelularyzacji i zachowuje oryginalną sieć naczyniową17. Dodecylosiarczan sodu (SDS), działający jako jonowy detergent, sprawnie rozpuszcza zarówno błony komórkowe, jak i jądrowe, prowadząc do bardziej kompleksowego usuwania składników cytoplazmatycznych i jądrowych. Jednak proces ten powoduje również uszkodzenie ultrastruktury ECM z powodu wyczerpania glikozaminoglikanów (GAG) i kolagenu.
Podwyższone stężenia SDS korelowały ze zmniejszoną resztkową zawartością DNA i zmniejszoną wytrzymałością mechaniczną w rusztowaniu ECM. I odwrotnie, niższe stężenia SDS zachowały większą ilość kolagenu i indukowały mniejszą denaturację białek ECM. Natomiast Triton X-100, służący jako niejonowy detergent, skutecznie zakłóca interakcje lipidowo-lipidowe, lipidowo-białkowe i DNA-białko, oferując łagodniejsze podejście do rozpuszczania błony komórkowej. Niemniej jednak okazuje się niewystarczający do całkowitego usunięcia jąder komórkowych i DNA. Dlatego należy go połączyć z niskimi stężeniami SDS i zabiegami fizycznymi, aby zapewnić całkowite usunięcie składników komórkowych przy jednoczesnym zachowaniu oryginalnej struktury, składu i wydajności ECM. Ważne jest, aby pamiętać, że resztki detergentów mogą mieć pewną cytotoksyczność, dlatego przed przechowywaniem konieczne jest płukanie po obróbce sterylnym PBS lub wodą destylowaną.
Jednym z ograniczeń tego protokołu jest brak kwantyfikacji resztkowego SDS i Triton X-100. Decyzja ta jest oparta zarówno na doświadczeniu naszego zespołu, jak i potwierdzających raportach, które sugerują, że 4-godzinne mycie PBS jest wystarczające, aby skutecznie usunąć te substancje. Co więcej, nasze wcześniejsze eksperymenty z hodowlami komórkowymi z zastosowaniem tego protokołu nie wykazały żadnych oznak cytotoksyczności. Aby zminimalizować koszty związane z protokołem, podjęto świadomą decyzję o rezygnacji z ilościowego określania pozostałości detergentów.
Podsumowując, protokół ten przedstawia wykonalną metodę przygotowania DSM, wykazując skuteczność, stabilność i minimalną inwazyjność. DSM przygotowane przy użyciu tego protokołu utrzymują nieodłączną architekturę, skład i naturalną sieć naczyniową śledziony. Co więcej, stanowi rusztowanie do implantacji komórek i trójwymiarowej hodowli dynamicznej, tworząc w ten sposób podstawę do dalszych badań nad wątrobą modyfikowaną tkankowo.

Przeszczep wątroby pozostaje jedynym ostatecznym sposobem leczenia schyłkowej niewydolności wątroby1,2,3. Jednak krytyczny niedobór i pogarszająca się jakość narządów od dawców zwiększyły zapotrzebowanie na alternatywne metody leczenia4. W dziedzinie medycyny regeneracyjnej obiecującymi rozwiązaniami okazały się biosztuczne wątroby (BAL) wykorzystujące bezkomórkową matrycę wątroby (DLM)5,6,7. DLM zachowuje oryginalną strukturę wątroby, w tym jej skomplikowaną sieć mikronaczyniową i elementy ECM, oferując rusztowanie do tworzenia przeszczepialnych BAL, które mogą potencjalnie łagodzić choroby wątroby.
Pomimo obietnic, przyjęcie tej technologii napotyka wyzwania, szczególnie w pozyskiwaniu odpowiednich DLM. DLM pochodzenia ludzkiego jest towarem deficytowym, podczas gdy te pochodzące od zwierząt niosą ze sobą ryzyko przeniesienia choroby i odrzucenia układu immunologicznego. W ramach innowacyjnego podejścia nasze badania dotyczyły wykorzystania decelularizowanej matrycy śledziony (DSM) jako podstawy dla BALs8,9,10,11. Śledziony są łatwiej dostępne w różnych sytuacjach medycznych, takich jak nadciśnienie wrotne, pęknięcie pourazowe, idiopatyczna plamica małopłytkowa i dawstwo po śmierci sercowej. Dlatego śledziony są szerzej dostępne niż wątroba do celów badawczych. Pacjenci, którzy przeszli splenektomię, nie cierpią na ciężkie stany, co dodatkowo potwierdza zbędność śledziony. Mikrośrodowisko śledziony, zwłaszcza macierz zewnątrzkomórkowa i sinusoidy, jest podobne do środowiska wątroby. To sprawia, że śledziona jest odpowiednim narządem do adhezji i proliferacji komórek w badaniach nad przeszczepem hepatocytów. Opierając się na tych odkryciach, nasze poprzednie badania wykazały, że DSM mają porównywalne mikrostruktury i składniki z DLM i mogą wspierać przeżycie i funkcję hepatocytów, w tym produkcję albuminy i mocznika. Ponadto wykazano, że DSM zwiększają różnicowanie wątrobowe mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego, co prowadzi do poprawy i spójnej funkcjonalności.
Stosując DSM traktowane heparyną, opracowaliśmy funkcjonalne BALs, które są w stanie wykazać skuteczne krótkoterminowe przeciwzakrzepowe działanie przeciwzakrzepowe i częściową kompensację funkcji wątroby11. W związku z tym ten trójwymiarowy DSM jest bardzo obiecujący dla postępu w inżynierii tkankowej wątroby i terapii komórkowej. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowe metody pozyskiwania śledziony szczurów i przygotowania DSM, które zachowują mikrostruktury i składniki ECM.

<table><tbody><tr><td>Maszyna anestezjologiczna</td><td>Aparat Harvarda</td><td>stołowa</td> pułapka bąbelkowa do <td>znieczulenia zwierząt</td></tr><tr><td></td><td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.</td><td>średnica porów: 5 &mu; m</td><td>zapobiegać pęcherzykom powietrza</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>TIPR Pharmaceutical Responsible Co., Ltd</td><td></td><td>przeciwbólowe</td></tr><tr><td>kleszcze hemostatyczne</td><td>Shanghai Medical Instruments&nbsp; Co., Ltd</td><td>J31020</td><td>narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Heparynizowana sól fizjologiczna</td><td>SPH nr 1 Biochemiczne i Pharmaceutical Co., LTD&nbsp;</td><td></td><td>zapobiegać powstawaniu zakrzepicy&nbsp;</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>RWD life science Co.</td><td></td><td>znieczulenie: do indukcji i podtrzymania znieczulenia</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Sp. z o.o.</td><td>C0222</td><td>antybiotyki in vitro w celu zapobiegania skażeniu mikrobiologicznemu</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd.</td><td>BT100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.</td><td>4481228</td><td>roztwór soli buforowej kwasu fosforowego</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd.</td><td>2,4 razy; 0,8 mm</td><td></td></tr><tr><td>szew jedwabny</td><td>Yangzhou Jinhuan Fabryka instrumentów medycznych</td><td>6-0 i 3-0</td><td>podwiązane naczynia krwionośne</td></tr><tr><td>Dodecyl siarczan sodu</td><td>Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.</td><td>151-21-3</td><td>jonowy detergent, rozpuszcza zarówno błony komórkowe, jak i jądrowe Pompa</td></tr><tr><td>strzykawkowa</td><td>Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd</td><td>BeneFusion SP5</td><td>infuzja dożylna</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.</td><td>9002-93-1</td><td>niejonowy detergent, zakłóca interakcje lipidowo-lipidowe, lipidowo-białkowe i DNA-białko</td></tr><tr><td>Cewnik żylny</td><td>B. Braun Company</td><td>24G</td><td>wprowadzający tętnicę śledzionową</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie zdecelularizowanej matrycy śledziony pochodzącej od szczurów

Fabrication of Decellularized Spleen Matrix Derived from Rats

Przeszczep wątroby jest podstawowym sposobem leczenia schyłkowej choroby wątroby. Jednak niedobór i nieodpowiednia jakość narządów od dawców wymuszają rozwój alternatywnych terapii. Biosztuczne wątroby (BAL) wykorzystujące bezkomórkową matrycę wątroby (DLM) okazały się obiecującymi rozwiązaniami. Jednak pozyskanie odpowiednich DLM pozostaje wyzwaniem. Zastosowanie bezkomórkowego macierzy śledziony (DSM) zostało zbadane jako podstawa dla BALs, oferując łatwo dostępną alternatywę. W tym badaniu śledziony szczurów zostały zebrane i pozbawione komórek przy użyciu kombinacji cykli zamrażania i rozmrażania oraz perfuzji z odczynnikami do decelularyzacji. W protokole zachowano mikrostruktury i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w DSM. Cały proces decelularyzacji trwał około 11 godzin, w wyniku czego w wyniku uzyskano nienaruszony ECM w DSM. Analiza histologiczna potwierdziła usunięcie składników komórkowych przy zachowaniu struktury i składu ECM. Przedstawiony protokół stanowi kompleksową metodę otrzymywania DSM, oferując potencjalne zastosowania w inżynierii tkankowej wątroby i terapii komórkowej. Odkrycia te przyczyniają się do opracowania alternatywnych podejść do leczenia schyłkowej niewydolności wątroby.

W niniejszym protokole zastosowano kombinację powtarzalnych cykli zamrażania i rozmrażania oraz perfuzji odczynnikami do decelularyzacji w celu decelularyzacji śledziony szczura. Całkowita decelularyzacja śledziony została osiągnięta w ciągu około 11 h (Ryc. 2A). W trakcie procesu decelularyzacji kolor śledziony stopniowo zmieniał się z ciemnoczerwonego na cętkowany, jasnoczerwony, a ostatecznie przybrał biały, półprzezroczysty wygląd (Ryc. 2B). Ogólna morfologia pozostała względnie nienaruszona, z widocznymi strukturami naczyniowymi (Ryc. 2B).
Barwienie hematoksyliną i eozyną potwierdziło usunięcie komponentów komórkowych, ujawniając nienaruszoną ECM w obrębie DSM. Stanowi to wyraźny kontrast w stosunku do natywnej śledziony, przedstawionej na Rysunku 3A, gdzie widoczne są jądra komórkowe i elementy cytoplazmatyczne. Brak komórek potwierdzono dodatkowo poprzez barwienie 4',6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI) oraz pomiar resztkowego DNA (DSM: 10,1 ± 4 ng/mg suchej masy, natywna śledziona: 6 200 ± 300 ng/mg suchej masy). Obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego ukazały charakterystykę ultrastrukturalną DSM, która po całkowitym usunięciu limfocytów ze śledziony wykazała strukturę plastra miodu (Rysunek 3C). Wskazuje to, że decelularyzacja śledziony zachowała ultrastrukturę i architekturę normalnego organu. W celu bardziej kompleksowej oceny kluczowych białek ECM obecnych w DSM zastosowano barwienie trichromem Massona (Rysunek 3B) oraz barwienie immunofluorescencyjne. Analizie poddano w szczególności kolagen I (Rysunek 3D) oraz fibronektynę (Rysunek 3E). Wyniki wykazały, że zarówno komponenty strukturalne, jak i komponenty błony podstawnej ECM zostały zachowane w stopniu zbliżonym do natywnej śledziony.
<img alt="Układ perfuzyjny z pompą perystaltyczną, pułapką pęcherzykową i roztworem perfuzyjnym; badanie perfuzji narządu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66520/66520fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Układ eksperymentalny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66520/66520fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat zamrażania-rozmrażania i perfuzji detergentem wraz z obrazami sekwencji decelularyzacji śledziony." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66520/66520fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat procesu decelularyzacji i makroskopowe zmiany morfologiczne. (A) Schemat przygotowania decelularyzowanej macierzy śledziony. Pełną decelularyzację śledziony osiągnięto w ciągu około 11 h. (B) Makroskopowe zmiany morfologiczne śledziony podczas przygotowania DSM. W trakcie tego procesu kolor śledziony stopniowo zmieniał się z ciemnoczerwonego na cętkowany, jasnoczerwony, aż do białego, półprzezroczystego wyglądu. (B) 1. Po wielokrotnych cyklach zamrażania-rozmrażania i przed decelularyzacją. 2. Po płukaniu wodą dejonizowaną przez 1 h. 3. Po perfuzji SDS przez 4 h. 4. Po perfuzji Tritonem przez 2 h. Skróty: DSM = decellularized spleen matrix; SDS = sodium dodecyl sulfate; PBS = phosphate-buffered saline; PS = penicillin-streptomycin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66520/66520fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy histologiczne i mikroskopowe natywnej śledziony w porównaniu z macierzą zdecelularyzowanej śledziony; kolagen, fibronektyna, DAPI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66520/66520fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obserwacje morfologiczne macierzy zdecelularyzowanej śledziony. (A) barwienie H&amp;E; (B) barwienie trichromem Massona; (C) SEM; (D,E) barwienie immunofluorescencyjne kolagenu I i fibronektyny; (F) barwienie DAPI. Paski skali = 50 µm (A, B, D-F), 5 µm (C). Skróty: DSM = macierz zdecelularyzowanej śledziony; H&amp;E = hematoksylina i eozyna; SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66520/66520fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Bezkomórkowa matryca śledziony (DSM) ma obiecujące zastosowania w dziedzinie inżynierii tkankowej wątroby. Protokół ten określa procedurę przygotowania DSM dla szczurów, która obejmuje zbieranie śledziony szczurów, ich decellularację poprzez perfuzję i ocenę powstałego DSM w celu potwierdzenia jego cech.

Wytwarzanie zdecelularizowanej matrycy śledziony pochodzącej od szczurów

Liver transplantation is the primary treatment for end-stage liver disease. However, the shortage and inadequate quality of donor organs necessitate the ...

Naszym celem jest normalna strategia, która polega na zastosowaniu zdecelularizowanego rozmiaru matrycy śledziony i alternatywnego rusztowania za pomocą sztucznych poziomów, co pokazuje szczegółową procedurę zbierania czerwonej śledziony i przygotowania zdecelularizowanej macierzy śledziony, która zachowuje makrostruktury i składniki metryki zewnątrzkomórkowej. Nasz protokół zapewnia łatwo dostępny rozmiar metryczny śledziony i alternatywę dla poziomów dawcy skali. Nasza metoda przygotowania metryki decelularyzacji śledziony wykazała skuteczność, stabilność i minimalną inwazyjność.Metoda ta pozwala zachować naturalną strukturę architektoniczną śledziony i naturalną sieć naczyniową. Oferuje rusztowanie, pełną implantację komórek i trójwymiarową dynamiczną hodowlę, tworząc w ten sposób podstawę do postępu badań nad wątrobą modyfikowaną tkankowo. Na początek umieść znieczulonego, ogolonego szczura w pozycji leżącej na stole operacyjnym.Wstrzyknąć dwa mililitry heparynizowanej soli fizjologicznej do żyły grzbietowej prącia w celu ogólnoustrojowego antyzakrzepu. Zdezynfekuj ogoloną skórę brzucha roztworem jodu powidonu i przykryj sterylną ściereczką. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w kształcie krzyża w jamie brzusznej.Rozciągając jamę brzuszną za pomocą kleszczy hemostatycznych, odwróć wątrobę w kierunku przepony. Zewnętrz przewód pokarmowy na prawą stronę brzucha i przykryj go wilgotną gazą. Ostrożnie oddziel i przetnij więzadło śledzionowo-żołądkowe, aby odsłonić wnękę śledziony.Stopniowo wypreparuj wzdłuż wnęki śledziony, aby oddzielić i odsłonić wspólną tętnicę wątrobową, tętnicę żołądkowo-dwunastniczą i tętnicę śledzionową. Podwiązać i przeciąć tętnicę żołądkowo-dwunastniczą i wspólną tętnicę wątrobową, stopniowo dysocjując otaczającą tkankę. Odwróć śledzionę w prawą stronę, aby odsłonić aortę brzuszną.Delikatnie wykonaj rozwarstwienie za pomocą bawełnianych wacików, aby odsłonić aortę brzuszną i pień trzewny. Umieść jedwabny szew z trzema zerami o długości około trzech centymetrów, powyżej i poniżej gałęzi pnia trzewki. Następnie umieść 10-centymetrowy szew jedwabny z sześcioma zerami na gałęzi pnia celiakii.Podwiązać aortę brzuszną poniżej i powyżej gałęzi pnia trzewnej. Następnie wykonaj małe nacięcie w gałęzi tętnicy. Delikatnie podnieś sześć jedwabny szew zerowy i wprowadź cewnik żylny o rozmiarze 24 do tętnicy śledziony wzdłuż pnia trzewnego.Podwiązać cewnik, aby zabezpieczyć go na miejscu. Użyj pompy strzykawkowej, aby zainparzyć 50 mililitrów heparynizowanej soli fizjologicznej w tempie czterech mililitrów na minutę. Jednocześnie przeciąć żyłę wrotną jako kanał odpływowy, aby umożliwić przepływ płynu z śledziony.Ostrożnie wypreparuj otaczającą tkankę śledziony, unikając uszkodzenia trzustki, zachowując jednocześnie główne naczynia dodatkowe. Sprawdź, czy nie ma wycieków wokół śledziony. Następnie usuń śledzionę i trzustkę i opłucz je w zwykłej soli fizjologicznej.Przenieś śledzionę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej zwykłą solą fizjologiczną. I przechowuj go w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Na początek trzykrotnie zamroź i rozmroź zamrożoną śledzionę szczura, aby uszkodzić komórki śledziony.Na czystej ławce ustaw pompę perystaltyczną, dwulitrowy zbiornik, silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej 2,4 milimetra i pułapkę bąbelkową. Napełnij system perfuzyjny wodą dejonizowaną. Pozostaw go włączonego przez 10 minut.Ostrożnie przenieś zebraną śledzionę do pojemnika wypełnionego wodą dejonizowaną. Następnie podłącz silikonową rurkę do cewnika żylnego, który został wprowadzony do tętnicy śledzionowej. Wykonaj obfitowanie roztworami wody dejonizowanej, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 i PBS.Napełnij 50-mililitrową probówkę wirówkową PBS, zawierającą 10% penicyliny streptomycyny. Przenieś zdecelularowaną matrycę śledziony do PBS. Przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dalszych eksperymentów.Całkowita decelularyzacja śledziony została osiągnięta w ciągu około 11 godzin. Kolor stopniowo przechodził od głębokiej czerwieni do modelowanej jasnoczerwieni, a ostatecznie do białego, półprzezroczystego wyglądu, przy czym ogólna morfologia pozostała nienaruszona.

fabrication-of-decellularized-spleen-matrix-derived-from-rats

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu macierzy z tkanki decelularyzowanej oraz jego wstrzykiwania do mięśnia sercowego szczura in vivo.

Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

Ten film opisuje przygotowanie pozbawionej komórek nerki szczura. Uzyskane bezkomórkowe rusztowanie naczyniowe może posłużyć jako obiecująca platforma do inżynierii tkankowej przeszczepów narządowych.

Przygotowanie pozbawionej komórek nerki szczura: procedura generowania bezkomórkowego unaczynionego rusztowania całego narządu z pobranej nerki szczura

Artykuł opisuje metodologię produkcji bezkomórkowej macierzy z jelita szczura. Wyprowadzenie rusztowań jelitowych jest ważne dla przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej, biologii komórek macierzystych i testowaniu leków.

Metodologia decelularyzacji do produkcji naturalnej bezkomórkowej macierzy jelitowej

Ten protokół opisuje decelularyzację nerek szczura Sprague Dawley poprzez wstępną perfuzję detergentów przez układ krwionośny, wytwarzając bezkomórkowe matryce zewnątrzkomórkowe nerek, które służą jako szablony do ponownego zasiedlenia ludzkimi komórkami nabłonka nerkowego. Recelularyzacja i zastosowanie testu perfuzji resazuryny do monitorowania wzrostu odbywa się w specjalnie zaprojektowanych bioreaktorach perfuzyjnych.

Repopulacja komórek nabłonkowych i przygotowanie rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej gryzoni do rozwoju tkanki nerkowej

Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z chrząstki mogą być używane jako rusztowanie do naprawy chrząstki i jako środek do regeneracji tkanki kostno-chrzęstnej. W artykule szczegółowo opisano proces decelularyzacji i przedstawiono sugestie dotyczące wykorzystania tych rusztowań w warunkach in vitro.

Wytwarzanie bezkomórkowych rusztowań matrycowych pochodzących z chrząstki

Ten protokół wprowadza metodę tworzenia rusztowania przy użyciu pozbawionych komórek nerek szczurów. Protokół obejmuje procesy decelularyzacji i recelularyzacji w celu potwierdzenia biodostępności. Decelularyzacja odbywa się przy użyciu Triton X-100 i dodecylosiarczanu sodu.

Przygotowanie bezkomórkowych rusztowań nerkowych u szczurów

Opisujemy technikę chirurgiczną i proces decelularyzacji kompozytowych kończyn tylnych szczurów. Decelularyzacja odbywa się przy użyciu dodecylosiarczanu sodu o niskim stężeniu przez system perfuzji maszynowej ex vivo.

Pobieranie i decelularyzacja kończyn tylnych szczura przy użyciu bioreaktora opartego na perfuzji ex vivo do unaczynionej allotransplantacji kompozytowej

W tej pracy zoptymalizowano protokół decelularyzacji w celu uzyskania zdecelularyzowanych matryc mięśni szkieletowych płodu myszy. Mioblasty C2C12 mogą kolonizować te matryce, namnażać się i różnicować. Ten model in vitro może być wykorzystany do badania zachowania komórek w kontekście chorób mięśni szkieletowych, takich jak dystrofie mięśniowe.

Przygotowanie 3D bezkomórkowych matryc z mięśni szkieletowych płodu myszy do hodowli komórkowej

Ten artykuł opisuje protokół agregacji i hermetyzacji komórek śledziony w półstałej macierzy błony podstawnej. Konstrukty macierzy błony podstawnej mogą być wykorzystywane w hodowli trójwymiarowej do badania rozwoju organoidów lub do badań nad przeszczepami in vivo i regeneracją tkanek.

Agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Poznaj metodę wytwarzania zdecelularizowanej matrycy śledziony od szczurów dla inżynierii tkankowej wątroby. Protokół zachowuje naturalną architekturę i sieć naczyniową, zapewniając szkielet do implantacji komórek.

Wytwarzanie zdecelularizowanej matrycy śledziony pochodzącej od szczurów

Przeglądaj więcej filmów