Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Zakres naszych badań koncentruje się na oddziaływaniach między gospodarzem a patogenem, ze szczególnym uwzględnieniem zrozumienia modulacji szlaków odpowiedzi na nieprawidłowo sfałdowane białka podczas infekcji HIV-1. Niniejsze badanie analizuje, w jaki sposób stres retikulum endoplazmatycznego (ER) oraz markery aktywacji UPR ulegają zmianom w wyniku infekcji HIV-1, a także jaki wpływ ma to na replikację i zakaźność wirusa w limfocytach T. Po raz pierwszy, w ramach kompleksowego badania, wykazaliśmy, że HIV-1 wymaga optymalnego progu aktywacji UPR dla swojej efektywnej replikacji, a zarówno indukcja UPR powyżej tego progu, jak i inhibicja poniżej niego, są szkodliwe dla replikacji HIV-1.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy zestaw kompleksowych protokołów służących do zrozumienia roli UPR w replikacji HIV-1, których brakowało w poprzednich badaniach. Stanowią one podstawę dla przyszłych badaczy zajmujących się UPR w infekcjach wirusowych i pomogą w rozwiązywaniu przyszłych problemów badawczych.

Nasza analiza wskazała kilka kluczowych kwestii dla dalszych badań mechanistycznych, mających na celu zrozumienie roli specyficznych białek wirusowych oraz innych czynników gospodarza, które pośredniczą w regulacji UPR podczas infekcji HIV-1. Ponadto interesującym kierunkiem badawczym może być analiza wpływu UPR na regulację zakaźności wirionów.

Aby rozpocząć, należy wysiać 0,1 × 10⁶ komórek TZM-bl na płytkę 24-dołkową, stosując 500 µL kompletnego DMEM na każdy dołek, a następnie umieścić ją w inkubatorze do hodowli komórkowej na 10 do 12 godzin. Z fiolki zawierającej wirusa HIV-1 przenieść odpowiednią ilość wirusa do dołków i inkubować w temperaturze 37 °C przez cztery godziny.

Przemyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem PBS przed ich utrwaleniem w 500 µL 0,25% roztworu glutaraldehydu. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez pięć do siedmiu minut.

Po przemyciu roztworem PBS, pokryj komórki 500 µL świeżo przygotowanego roztworu barwiącego i inkubuj w temperaturze 37 °C w ciemności przez okres od 2 do 18 godzin. Pod mikroskopem przy powiększeniu 10X policz niebieskie zainfekowane komórki w pięciu losowo wybranych polach widzenia.

Resuspenduj 8 milionów komórek CEM-GFP w jednym mililitrze pełnej pożywki RPMI 1640 zawierającej polybrene. Dodaj zapas wirusa i uzupełnij objętość do dwóch mililitrów pełną pożywką.

Umieścić komórki w inkubatorze z CO₂ w temperaturze 37 °C na cztery godziny, delikatnie opukując naczynie co 30 do 45 minut. Hodować taką samą liczbę komórek w 6-dołkowej płytce hodowlanej w temperaturze 37 °C. Co 24 godziny po wirowaniu zebrać nadsącz z osadów komórkowych, a następnie dodać bufor do lizy komórek do osadu.

Utrwal 1 milion niezainfekowanych oraz 0,5 wielokrotności infekcji (MOI) zainfekowanych HIV-1 komórek CEM-GFP za pomocą 200 µL 4% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut. Wirować komórki przy 100 g przez pięć minut, a następnie potraktować osad 500 µL 0,1 M glicyny przez pięć minut. Po dwukrotnym przemyciu komórek PBS i ich ponownym zawieszeniu w 100 µL PBS, przenieś 100 µL zawiesiny komórkowej do komór pomiarowych.

Wirować komórki w cytoodśrodkowniku przy 1 000 g przez cztery minuty, aby przytwierdzić je do szkiełek. W celu permeabilizacji dodać do komórek kilka kropli 0,1% Triton X-100. Po 10 minutach stopniowo dodawać PBS, aby wypłukać komórki. Inkubować komórki z 10 µL 5 µM tioflawiny T przez 30 minut, następnie dodać 5 µL medium montażowego i nałożyć szkiełko nakrywką. Za pomocą obiektywu imersyjnego glicerynowego 63X zarejestrować obrazy konfokalne utrwalonych komórek. Stres retikulum endoplazmatycznego (ER) wywołany infekcją HIV-1 analizowano poprzez obserwację agregatów białkowych wewnątrz komórki przy użyciu barwienia tioflawiną T.

Zwiększona intensywność thioflawiny T sugerowała obecność większej liczby agregatów białkowych oraz nasilenie stresu retikulum endoplazmatycznego.

Aby rozpocząć, resuspender komórki CEM-GFP zainfekowane HIV-1 z wielokrotnością infekcji 0,5 w buforze do lizy na lodzie przez 45 minut, okresowo mieszając na wirówce typu vortex. Po wirowaniu zebrać supernatant do nowej probówki.

Gotuj próbki białek o równych stężeniach w buforze Laemmliego w temperaturze 96°C przez pięć minut. Rozdziel próbki na żelu SDS PAGE o stężeniu od 10 do 12%.

Przenieś żel na membranę PVDF. Zablokuj membranę 5% BSA przez jedną do dwóch godzin, następnie przemyj membranę dwukrotnie TBST i inkubuj z białkowymi przeciwciałami pierwszorzędowymi na rotatorze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia inkubuj blot z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1,5 godziny. Po przemyciu TBST dodaj substrat do detekcji chemiluminescencyjnej, aby zwizualizować prążki białkowe.

Aby przeanalizować ekspresję mRNA, należy przygotować 10 µL mieszanin reakcyjnych zawierających matrycę cDNA, 5 µL barwnika SYBR Green oraz 10 pmol każdej pary specyficznych dla genu starterów oligonukleotydowych. Mieszaniny należy poddać amplifikacji w urządzeniu do real-time PCR.

Aby przeanalizować splicing XBP-1, należy rozdzielić amplikony w 2,5% żelu agarozowym zawierającym 50 ng bromku etydyny na ml i wizualizować je za pomocą systemu dokumentacji żeli. Po trypsynizacji wysiać około 0,25 × 10⁶ komórek HEK 293T wraz z mieszaniną do transfekcji na płytkę 24-dołkową i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C. Do dołków dodać 125 µL kompletnej pożywki DMEM i resuspenderć komórki w celu równomiernego wysiania. Po 24 godzinach zastąpić istniejącą pożywkę 250 µL niekompletnej pożywki DMEM.

Dodać świeżo przygotowaną drugą mieszaninę do transfekcji i inkubować przez 36 godzin. Po wirowaniu resuspendować komórki w komercyjnie dostępnym substracie lucyferazy. Przenieść resuspendowany lizat komórkowy do nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej i inkubować przez 10 do 15 minut.

Za pomocą luminometru odczytaj poziom lucyferazy. Zmierz fluorescencję GFP w tych samych próbkach, aby znormalizować odczyt lucyferazy, korzystając z czytnika mikroplate w trybie mikropłytkowym. Po 24 godzinach od transfekcji komórek HEK-293T dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki DMEM do każdej studni płytki 6-dołkowej, a po 48 godzinach zbierz supernatant lentiwirusowy.

Inkubuj 2 miliony komórek Jurkat J6 zawieszonych w kompletnym medium RPMI z dodatkiem polybrenu w płytce 6-dołkowej z równą objętością supernatantu lentiwirusem dla każdej grupy kontrolnej oraz lentiwirusem do specyficznego wyciszenia genu. Po 24 godzinach dodaj puromycynę do każdego dołka w celu wyselekcjonowania stabilnych komórek. Wirowanie w celu pelletowania komórek przeprowadzaj co 24 godziny, a następnie dodawaj dwa mililitry świeżego kompletnego medium RPMI 1640 z puromycyną.

Komórki CEM-GFP poddano działaniu 100 nanomolarnego Thapsigarginu przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po przemyciu komórek pożywką RPMI 1640 zainfekowano je HIV-1 z wielokrotnością infekcji 0,5. Nadnad supernatanty z każdej próbki zebrano w celu przeprowadzenia testu ELISA dla białka p24.

Cytotoksyczność tapsygargyny przeanalizowano za pomocą testu MTT, który wykazał nieistotną cytotoksyczność przy pożądanej stężeniu. Wpływ leku na stres retikulum endoplazmatycznego (ER) przeanalizowano za pomocą immunoblottingu dla HSPA-5. Wstępna inkubacja z 100 nM tapsygarginy przez 12 godzin indukowała ekspresję HSPA-5 we wszystkich punktach czasowych. Test ELISA dla P24 wykazał wpływ na produkcję wirusa.