Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Zakres naszych badań koncentruje się na interakcjach patogenów gospodarza, ze szczególnym naciskiem na zrozumienie modulacji szlaków odpowiedzi na niesfałdowane białka podczas zakażenia HIV-1. Badanie to dotyczy tego, w jaki sposób stres ER i markery aktywacji UPR są zmieniane po zakażeniu HIV-1, a także jego wpływ na replikację wirusa i zakaźność w limfocytach T. Po raz pierwszy w ramach kompleksowego badania wykazaliśmy, że HIV-1 wymaga optymalnego progu aktywacji UPR dla jego efektywnej replikacji, a zarówno indukcja UPR powyżej tego progu, jak i innowacje poniżej tego progu są szkodliwe dla replikacji HIV-1.

W tym miejscu przedstawiamy zestaw kompleksowych protokołów, aby zrozumieć rolę UPR w replikacji HIV-1, której brakowało w poprzednich badaniach. Będzie to stanowić bazę dla przyszłych badaczy zajmujących się UPR w infekcjach wirusowych i pomoże w sprostaniu przyszłym wyzwaniom. Nasze badanie podkreśliło kilka kluczowych punktów dla dalszych badań mechanistycznych, aby zrozumieć udział określonych białek wirusowych i innych czynników gospodarza, które pośredniczą w regulacji UPR podczas infekcji HIV-1.

Również udział UPR w regulacji zakaźności wirionów może być kolejnym interesującym zadaniem do rozwiązania. Aby rozpocząć wysiewanie 0,1 razy 10 do mocy 6 komórek TZM-bl na 24-dołkowej płytce, używając 500 mikrolitrów kompletnego DMEM na każdą studzienkę i umieścić ją w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 do 12 godzin. Z fiolki zawierającej wirusa HIV-1 przenieś odpowiednią ilość wirusa do studzienek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem PBS przed utrwaleniem ich w 500 mikrolitrach 0,25% roztworu aldehydu glutarowego. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez pięć do siedmiu minut. Po umyciu PBS nałóż na komórki 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu barwiącego i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności przez 2 do 18 godzin.

Pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu policz niebieskie zainfekowane komórki w pięciu losowych polach. Ponownie zawiesić 8 milionów komórek CEM-GFP w jednym mililitrze kompletnego podłoża RPMI 1640 zawierającego polibren. Dodać zapas wirusa i uzupełnić objętość do dwóch mililitrów kompletną pożywką.

Umieść komórki w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na cztery godziny z przerywanym stukaniem co 30 do 45 minut. Hoduj równą liczbę komórek na 6-dołkowej płytce hodowlanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Co 24 godziny po odwirowaniu zbierać supernatant z granulowanych komórek i dodawać bufor do lizy komórek do granulowanych komórek.

Napraw 1 milion każdych niezakażonych i 0,5 wielokrotności infekcji zakażonych wirusem HIV-1 komórek CEM-GFP za pomocą 200 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut. Odwirować komórki w stężeniu 100 G przez pięć minut i traktować podniebienie 500 mikrolitrami 0,1 molowej glicyny przez pięć minut. Po dwukrotnym umyciu komórek PBS i ponownym ich zawieszeniu w 100 mikrolitrach PBS, dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do komór na próbki.

Obracać komórki w cytowirówce w temperaturze 1 000 G przez cztery minuty, aby przykleić komórki do szkiełek. W celu przepuszczalności dodaj kilka kropli 0,1% Triton X-100 do komórek. Po 10 minutach dodaj kroplami PBS, aby umyć komórki.

Inkubować komórki z 10 mikrolitrami pięcioma mikromolowymi tioflawinami T przez 30 minut, następnie dodać pięć mikrolitrów pożywki montażowej i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Pod 63-krotną soczewką zanurzeniową z glicerolem uchwyć konfokalne obrazy stałych komórek. Retikulum endoplazmatyczne lub stres ER spowodowany zakażeniem HIV-1 analizowano, obserwując agregaty białkowe wewnątrz komórki za pomocą barwienia tioflawiną T.

Zwiększona intensywność tioflawiny T sugerowała więcej agregatów białkowych i zwiększony stres ER. Aby rozpocząć, należy ponownie zawiesić 0,5 wielokrotności zakażenia komórkami CEM-GFP zakażonymi wirusem HIV-1 w buforze do lizy na lodzie przez 45 minut z przerywanym wirowaniem. Po odwirowaniu zebrać supernatant do świeżej probówki.

Gotować próbki białek o równych stężeniach w buforze Laemmli w temperaturze 96 stopni Celsjusza przez pięć minut. Rozpuścić próbki na żelu 10 do 12% SDS PAGE. Przenieś żel na membranę PVDF.

Zablokuj membranę 5% BSA na jedną do dwóch godzin, a następnie przemyj membranę dwukrotnie TBST i zbadaj z przeciwciałami pierwotnymi specyficznymi dla białka na rockerze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia sonduj blot za pomocą przeciwciał wtórnych przez 1,5 godziny. Po umyciu TBST dodaj substrat wykrywający chemiluminescencję, aby uwidocznić prążki białkowe.

Aby przeanalizować ekspresję mRNA, przygotuj 10 mikrolitrowych mieszanin reakcyjnych zawierających matrycę CDNA, pięć mikrolitrów zielonego barwnika SYBR i 10 pikomoli każdej pary starterów oligonukleotydowych specyficznych dla genu. Uruchom mieszaniny na maszynie do PCR w czasie rzeczywistym. Aby przeanalizować splicing XBP-1, należy rozdzielić amplikony do 2,5% żelu agarozowego zawierającego 50 nanogramów bromku etydyny na mililitr i zwizualizować w żelowym przyrządzie do dokumentacji.

Po trypsynizacji wysiew około 0,25 razy 10 do mocy 6 komórek HEK 293T z mieszanką transfekcyjną na 24-dołkowej płytce i inkubować przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 125 mikrolitrów kompletnej pożywki DMEM do studzienek i ponownie zawieś komórki, aby uzyskać równomierny wysiew. Po 24 godzinach zastąp istniejącą pożywkę 250 mikrolitrami niekompletnej pożywki DMEM.

Dodaj świeżo przygotowaną drugą mieszankę do transfekcji i inkubuj przez 36 godzin. Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w komercyjnie pozyskanym substracie lucyferazy. Dodać zawieszony lizat komórkowy do nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej i inkubować przez 10 do 15 minut.

W luminometrze uzyskaj odczyt lucyferazy. Zmierz fluorescencję GFP w tych samych próbkach, aby znormalizować odczyt lucyferazy w czytniku mikromodowym mikropłytki. Po 24 godzinach transfekcji komórek HEK-293T dodaj jeden mililitr kompletnego DMEM do każdej studzienki 6-dołkowej płytki i zbierz supernatant lentiwirusa po 48 godzinach.

Inkubować 2 miliony komórek Jurkat J6 zawieszonych w polibrenie zawierającym kompletną pożywkę RPMI na 6-dołkowej płytce z równą objętością supernatantu lentiwirusowego dla każdej kontrolnej i specyficznej dla genu lentiwirusa knockdown. Dodaj puromycynę po 24 godzinach do każdej studzienki, aby wybrać stabilne komórki. Osadzaj komórki co 24 godziny i dodaj dwa mililitry świeżej, kompletnej pożywki RPMI 1640 z puromycyną.

Traktuj komórki CEM-GFP 100 nanomolami thapsigarginy przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po umyciu komórek pożywką RPMI 1640 należy zainfekować 0,5-krotnością zakażenia wirusem HIV-1. Zebrać supernatanty z każdej próbki do testu ELISA p24.

Cytotoksyczność tapsygarginy analizowano przy użyciu testu NTT wykazującego nieistotną cytotoksyczność w pożądanym stężeniu. W badaniu immunoblottingu HSPA5 przeanalizowano wpływ leku na stres ER. Wstępne traktowanie 100 nanomolową thapsigarginą przez 12 godzin indukowało ekspresję HSPA5 we wszystkich punktach czasowych.

Test P24 ELISA wykazał wpływ na produkcję wirusa.