Name: Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metody pomiaru stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi UPR w limfocytach T zakażonych HIV-1. Dowiedz się, jak optymalna aktywacja UPR wpływa na replikację wirusa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Narodowemu Centrum Nauki o Komórkach, Departamentowi Biotechnologii, Rządowi Indii, za wsparcie wewnętrzne. AT i AD są wdzięczne za wsparcie badań doktoranckich otrzymane od National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of India. DM jest wdzięczny za stypendium JC Bose National Fellowship od SERB, rządu Indii.

Studying ER Stress and UPR Activation During HIV-1 Infection in T-Cells

<ol><li>Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLevy%2C+JA+%22HIV+and+the+Pathogenesis+of+AIDS.+3rd%22">HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd</a>. , ASM Press. (2007).</li>
<li>Hebert, D. N., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+and+out+of+the+ER%3A+Protein+folding%2C+quality+control%2C+degradation%2C+and+related+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases.</a> Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).</li>
<li>Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unfolded+protein+response%3A+The+dawn+of+a+new+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The unfolded protein response: The dawn of a new field.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).</li>
<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319 (5865), 916-919 (2008).</li>
<li>Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+the+unfolded+protein+response+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Orchestrating the unfolded protein response in health and disease.</a> J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).</li>
<li>Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+in+the+endoplasmic+reticulum+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).</li>
<li>Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-dependent+substrate+recruitment+by+the+eukaryotic+translation+initiation+factor+2+kinase+PERK%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK.</a> J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).</li>
<li>Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+translation+and+folding+are+coupled+by+an+endoplasmic-reticulum-resident+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase.</a> Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).</li>
<li>Vattem, K. M., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinitiation+involving+upstream+ORFs+regulates+ATF4+mRNA+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).</li>
<li>Harding, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+stress+response+regulates+amino+acid+metabolism+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress.</a> Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).</li>
<li>Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+inhibition+of+the+unfolded+protein+response+by+GADD34-mediated+dephosphorylation+of+eIF2%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α.</a> J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).</li>
<li>Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+transcription+factor+ATF6+is+synthesized+as+a+transmembrane+protein+and+activated+by+proteolysis+in+response+to+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress.</a> Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+induces+cleavage+of+membrane-bound+ATF6+by+the+same+proteases+that+process+SREBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs.</a> Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).</li>
<li>Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stress+response+pathway+from+the+endoplasmic+reticulum+to+the+nucleus+requires+a+novel+bifunctional+protein+kinase%2Fendoribonuclease+%28Ire1p%29+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells.</a> Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).</li>
<li>Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1+mRNA+is+induced+by+ATF6+and+spliced+by+IRE1+in+response+to+ER+stress+to+produce+a+highly+active+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor.</a> Cell. 107 (7), 881-891 (2001).</li>
<li>Calfon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRE1+couples+endoplasmic+reticulum+load+to+secretory+capacity+by+processing+the+XBP-1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA.</a> Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6%CE%B1+optimizes+long-term+endoplasmic+reticulum+function+to+protect+cells+from+chronic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress.</a> Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).</li>
<li>Shoulders, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-independent+activation+of+XBP1s+and%2For+ATF6+reveals+three+functionally+diverse+ER+proteostasis+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments.</a> Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).</li>
<li>Oslowski, C. M., Urano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+ER+stress+and+the+unfolded+protein+response+using+mammalian+tissue+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system.</a> Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).</li>
<li>Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+endoplasmic+reticulum+stress+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response.</a> Int J Cell Biol. 2010, 830307(2010).</li>
<li>Wang, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+in+the+endoplasmic+reticulum+as+a+conduit+to+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease.</a> Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).</li>
<li>Beriault, D. R., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+living+cells+using+the+fluorescent+compound%2C+Thioflavin+T%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).</li>
<li>Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+replication+requires+optimal+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response.</a> FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).</li>
<li>Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CCR5+and+CD4+cell+surface+concentrations+on+infections+by+macrophagetropic+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 72 (4), 2855(1998).</li>
<li>Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+reporter+cell+line+to+monitor+HIV+infection+and+drug+susceptibility+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).</li>
<li>Augustine, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+F%2FFBXO1+interacts+with+HIV-1+viral+infectivity+factor+%28Vif%29+and+restricts+progeny+virion+infectivity+by+ubiquitination+and+proteasomal+degradation+of+vif+protein+through+SCFcyclin+F+E3+ligase+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery.</a> J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).</li>
<li>Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+quantitating+confocal+fluorescent+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple method for quantitating confocal fluorescent images.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).</li>
<li>Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+coming+of+age%3A+Thapsigargin+as+an+inhibitor+of+sarco-endoplasmic+reticulum+Ca2%2B-ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases.</a> Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).</li>
<li>Moffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentiviral+RNAi+library+for+human+and+mouse+genes+applied+to+an+arrayed+viral+high-content+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen.</a> Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).</li>
<li>Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transcriptional+activator+protein+encoded+by+the+x-lor+region+of+the+human+T-cell+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus.</a> Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).</li>
<li>Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+enhancer+sequences+in+type+II+human+T-cell+leukemia+virus+and+bovine+leukemia+virus+long+terminal+repeats+by+virus-associated+trans-acting+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors.</a> J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).</li>
<li>Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+method+for+normalization+of+transfection+efficiency+using+enhanced+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein.</a> Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+Technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: Technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li>
<li>Peña, J., Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+virus+modulates+the+unfolded+protein+response+in+a+time-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner.</a> J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).</li>
<li>Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+is+a+quantitative+reporter+of+gene+expression+in+individual+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells.</a> FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).</li>
<li>Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fullerene+derivatives+strongly+inhibit+HIV-1+replication+by+affecting+virus+maturation+without+impairing+protease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).</li>
<li>Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+molecular+effects+of+Thapsigargin-induced+brain+ER-+stress%3A+Encompassing+inflammation%2C+MAPK%2C+and+insulin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway.</a> Life. 12 (9), 1374(2022).</li>
<li>Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin-from+traditional+medicine+to+anticancer+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug.</a> Int J Mol Sci. 22 (1), 4(2021).</li>
<li>Shaban, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-level+inhibition+of+coronavirus+replication+by+chemical+ER+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress.</a> Nat Commun. 12 (1), 5536(2021).</li>
<li>Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).</li>
<li>Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1%3A+A+link+between+the+unfolded+protein+response%2C+lipid+biosynthesis%2C+and+biogenesis+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).</li>
<li>Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+activation+and+signaling+of+IRE1+and+its+role+in+determining+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate.</a> Biomedicines. 9 (2), 156(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Zakres niniejszego protokołu obejmuje (i) postępowanie z zapasami wirusa HIV-1 oraz pomiar stężenia wirusa i zakaźności wirionu, (ii) zakażenie limfocytów T wirusem HIV-1 i ocenę jego wpływu na stres ER i różne markery UPR, (iii) wpływ knockdown markerów UPR i ich wpływ na aktywność genu HIV-1 LTR, produkcja wirusa i zakaźność wirionu oraz (iv) nadmierna stymulacja UPR za pomocą cząsteczki farmakologicznej i analiza jej wpływu na replikację HIV-1. Korzystając z obecnego zestawu protokołów, można uzyskać wyczerpujące informacje na temat wzajemnych zależności między HIV-1 a UPR. Protokoły wymienione w tym badaniu są łatwe do wykonania, opłacalne i wysoce niezawodne.
Ponieważ UPR jest szlakiem sygnałowym wrażliwym na stres, praca nad nim obejmuje dość delikatne kroki. We wszystkich eksperymentach zalecamy unikanie długo pasażowanych komórek, aby uzyskać spójność wyników. Ważne jest również utrzymanie sterylnych warunków we wszystkich technikach hodowli komórkowych, aby uniknąć skażenia bakteryjnego i drożdżowego, ponieważ mogą one utrudnić eksperymenty i odpowiednie wyniki. Co więcej, podczas obchodzenia się z komórkami podczas eksperymentów, w tym ich późniejszej hodowli, należy unikać ostrych lub długotrwałych zmian temperatury i upewnić się, że komórki są zdrowe i nie są zestresowane. W przeciwnym razie zmiany mogą spowodować dodatkowe obciążenie komórek, co może zmienić wyniki. Staraj się, aby punkty czasowe były tak stałe, jak to możliwe, ponieważ UPR jest czułą ścieżką sygnałową, a niewielka zmiana punktów czasowych może zmienić wyniki.
Metoda barwienia ThT, która wykrywa agregaty białkowe i jest stosowana do określania stresu ER22, bardzo wyraźnie pokazuje poziom stresu ER w komórkach zakażonych wirusem HIV-1. Barwienie ThT opiera się na wykrywaniu agregatów białkowych, które są skorelowane ze stresem ER. Należy jednak zauważyć, że aktywacja UPR nie zawsze może być skorelowana z agregatami białkowymi, ponieważ poszczególne szlaki sygnałowe UPR mogą być aktywowane bezpośrednio, bez udziału agregatów białkowych. Tak więc, mimo że ta metoda barwienia ThT daje wyobrażenie o poziomach stresu ER, w celu dogłębnej analizy aktywacji UPR zawsze należy ją zweryfikować z dalszą analizą markerów UPR. Ponadto, aby dokładniej określić subkomórkową lokalizację barwienia ThT, można użyć markerów, takich jak KDEL w przypadku oznaczania ER. Co więcej, w wielu przypadkach stres ER powoduje zmianę wielkości i kształtu komórki, więc można również wziąć pod uwagę obszar komórek podczas ilościowego określania intensywności ThT. Dostępność wysoce czułych, niezawodnych i opłacalnych komercyjnych przeciwciał specyficznych dla genów zrewolucjonizowała wiele aspektów nauk przyrodniczych, umożliwiając łatwiejszą analizę poziomów białek w komórkach. Ponadto obecnie dostępne są bardzo czułe rodzaje sprzętu do wizualizacji prążków białkowych na blotach i sprawiające, że kwantyfikacja jest szybka i łatwiejsza. W ten sposób aktywacja markerów UPR może być łatwo analizowana za pomocą immunoblottingu. Ponieważ jednak ekspresja białek markerowych UPR jest stosunkowo niska, do analizy ich ekspresji należy użyć znacznego stężenia białka. Co więcej, rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych powinno być odpowiednio zoptymalizowane w oparciu o ekspresję białka w użytych komórkach, aby uniknąć niespecyficznego wiązania i szumu tła w plamach. Ponadto, jak pokazano na rysunku 4C, przeciwciało ATF6 jest poliklonalne i daje szereg niespecyficznych prążków. Konieczna jest właściwa optymalizacja płukania i stężenia przeciwciał, aby do pewnego stopnia zredukować te niespecyficzne prążki. Skrzepy należy odpowiednio umyć po inkubacji w roztworze blokującym, przeciwciałie pierwszorzędowym i przeciwciałie drugorzędowym w celu zmniejszenia tła i prążków niespecyficznych. Podczas tworzenia plam należy unikać przesycenia prążków, aby uzyskać właściwą wizualizację wzoru w uzyskanych wynikach. Patrząc na szeroki zakres tego artykułu dotyczącego metody, nie skupiliśmy się na szczegółowych metodach i rozwiązywaniu problemów dla ogólnych technik immunoblottingu; jednak można zapoznać się z artykułami metodycznymi Mahmooda i Yanga33 , a także Ghosha i wsp.34 w tym samym celu. Ponieważ obecnie RT-PCR jest bardzo powszechnie stosowaną metodą, łatwo dostępne startery i maszyny RT-PCR dostarczają danych do analizy niektórych markerów UPR. Należy jednak zachować środki ostrożności podczas przygotowywania RNA i cDNA do RT-PCR, ponieważ jest to bardzo czuła metoda, a niewielkie różnice w jakości próbek i pipetowania mogą prowadzić do ogromnych różnic w odczycie. Wszelkie zanieczyszczenia DNA lub białkami należy usunąć z próbek RNA. Ponadto próbki należy zawsze pobierać w trzech egzemplarzach do qRT-PCR, aby zmniejszyć błąd pipetowania. Stężenie DNA używanego do qRT-PCR powinno być zoptymalizowane w taki sposób, aby wartość CT dla każdej próbki była niższa niż 30, ponieważ wszystko powyżej 30 nie jest uważane za idealne. W przypadku qRT-PCR należy zawsze zachować kontrolę ujemną, aby uniknąć fałszywie dodatniego odczytu. Splicing XBP1 można analizować zarówno za pomocą qRT-PCR, jak i semi-qRT-PCR. Ponieważ qRT-PCR nie pokazuje dokładnie splicingu, semi-qRT-PCR powinien być zawsze wykonywany oddzielnie od qRT-PCR w celu walidacji danych i określenia względnego stosunku XBP1 spliced do nonspliced. Ponieważ różnica między rozmiarem sklejonego i niesplecionego XBP1 wynosi zaledwie 26 nt, do rozwiązania żelu należy użyć większego procentu żelu agarozowego. Ponadto pasma powinny być rozdzielone przy niskim napięciu i dłuższym czasie trwania, aby zapewnić lepszą separację. Inną metodą, która jest obecnie bardziej popularna do obserwacji splicingu XBP1, jest test splicingu, który wykorzystuje trawienie enzymu restrykcyjnego Pst1 w cDNA i zapewnia lepszą wizualizację splicingu XBP135. Metoda ta może być również stosowana w celu wizualizacji splicingu XBP1 w próbkach zakażonych wirusem HIV-1. Wyniki uzyskane z immunoblottingu i RT-PCR można wykorzystać do walidacji wyników barwienia ThT.
Reprezentatywne wyniki pokazane na rycinie 5 sugerują, że aktywacja UPR po zakażeniu HIV-1 koreluje ze zwiększonym barwieniem ThT pokazanym na rysunku 4. Jednak ograniczenia stosowania immunoblottingu i RT-PCR do analizy UPR polegają na tym, że są one rygorystyczne i należy monitorować wiele produktów genowych, ponieważ poszczególne geny UPR mogą być modyfikowane niezależnie przez czynniki stresowe inne niż ER. Ponadto metody te pośrednio mierzą stres ER, patrząc na różne markery UPR. Dlatego barwienie ThT i analiza markerów UPR za pomocą immunoblottingu i RT-PCR mogą być stosowane razem do analizy wpływu zakażenia HIV-1 na stres ER i aktywację UPR w limfocytach T.
Druga część tego artykułu dotyczy protokołów związanych ze zrozumieniem wpływu UPR na replikację HIV-1. Stwierdzono, że metoda odwrotnej transfekcji zastosowana do knockdown markerów UPR opisana w tym artykule powoduje znaczne zmniejszenie ekspresji markerów UPR. Jak wspomniano w protokole, fluorescencja GFP została użyta do normalizacji odczytu lucyferazy do testu lucyferazy. Jednak w wielu przypadkach odczyt GFP może być również zakłócony ze względu na specyficzną transfekcję genu36, więc w takim przypadku można użyć innych markerów fluorescencyjnych, takich jak RFP, YFP lub całkowite stężenie białka, aby znormalizować odczyt lucyferazy. Ponadto w niektórych przypadkach, gdy komórki są trudne do lizy, takich jak komórki TZM-bl, przed dodaniem substratu lucyferazy można dodać dodatkowy odczynnik do lizy. Jak przedstawiono w wynikach, wyniki lucyferazy (lewy panel 6A) są zgodne z wynikami testu ELISA p24 w przypadku PERK (Figura 6B Lewy panel), gdzie knockdown PERK znacznie zmniejsza aktywność genu HIV-1 i produkcję wirusa. Natomiast w przypadku HSPA5 knockdown HSPA5 nie wpływa na aktywność genu sterowaną przez LTR (Figura 6A prawy panel), zgodnie z wynikami testu lucyferazy, podczas gdy wpływa na produkcję wirusa zgodnie z testem ELISA p24 (Figura 6B Prawy panel). W ten sposób wyniki te sugerują, że różne markery UPR mogą mieć różny wpływ na aktywność genu LTR napędzanego przez HIV-1 i produkcję wirusa. Antygen p24 mierzony w supernatancie metodą ELISA wskazuje przede wszystkim na stężenie cząstek wirusa uwolnionych w supernatancie hodowli. W związku z tym rutynowo naukowcy wykorzystywali wyniki ELISA wychwytywania antygenu p24 jako pośrednie wskazanie produkcji wirusa w supernatancie komórki37. W związku z tym test lucyferazy w komórkach i test p24 ELISA supernatantu mogą być używane razem w celu określenia wpływu na aktywność genu HIV-1 LTR i produkcję wirusa. Protokół ten może być również wykorzystany do analizy wpływu innych markerów UPR na aktywność genów HIV-1 LTR i produkcję wirusa przy użyciu specyficznych dla genu shRNA. W przypadku wszystkich tych eksperymentów obejmujących odczyty testu p24 ELISA i lucyferazy ważne jest, aby upewnić się, że utrzymane są odpowiednie rozcieńczenia i czas inkubacji, a wartości należące do kategorii wartości odstających nie powinny być brane pod uwagę. Na przykład podczas wykonywania testu ELISA p24 wartość OD450 z zakresu 0,1-2 jest uważana za idealną. Drugim podejściem do zbadania roli UPR w replikacji HIV-1 jest zastosowanie cząsteczek farmakologicznych, takich jak Thapsigargin, induktor stresu ER lub TUDCA, inhibitor stresu ER. Leki te są bardzo często stosowane do badania UPR w różnych kontekstach 38,39,40,41. W tym artykule przedstawiliśmy protokół leczenia Thapsigargin i przeanalizowaliśmy jego wpływ na postęp zakażenia HIV-1 w limfocytach T. Przed użyciem leku w jakimkolwiek eksperymencie zdecydowanie zaleca się przetestowanie żywotności komórek dla zakresu dawek leku w linii komórkowej, która ma być użyta. Należy unikać stężenia, które daje mniej niż ~80% żywotności komórek w danej linii komórkowej. Ponadto do testów żywotności komórek należy zawsze pobierać zdrowe komórki, ponieważ komórki, które są już zestresowane, nie pokażą prawidłowego odczytu, a resztki komórek mogą powodować zmętnienie i dawać fałszywe odczyty. Protokół wspomniany w tym badaniu pokazuje wpływ Thapsigargin na replikację wirusa w ciągu 72 godzin po zakażeniu, co zapewnia lepsze zrozumienie wpływu leku na replikację wirusa w czasie. Można również stosować krótsze odstępy czasu, takie jak 12 godzin, 24 godziny, 36 godzin, 48 godzin, 60 godzin i 72 godziny po zakażeniu, aby dokładniej przeanalizować najwcześniejszy punkt czasowy, w którym lek zaczyna wykazywać swój wpływ na replikację wirusa.
Ponieważ UPR jest również zaangażowany w degradację białek i dynamikę błony42,43, możliwe jest, że UPR może odgrywać rolę w zakaźności wirionów. Zakaźność wirionów wytwarzanych przez komórki może być również analizowana przy użyciu podanego protokołu. Wyżej wymienione protokoły można również wykorzystać do określenia wpływu zakażenia HIV-1 na stres ER i UPR oraz jego funkcjonalnego znaczenia w ludzkich PBMC dla bardziej istotnych biologicznie badań. Zrozumienie funkcji ER-UPR w zakażeniu HIV-1 jest niezbędne ze względu na rosnącą świadomość jego udziału w rozwoju wielu poważnych chorób. Informacje uzyskane przy użyciu tego zestawu metod wzbogacą tę niezbadaną dziedzinę, oferując ważne zrozumienie interakcji między HIV-1 a UPR.

Zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS) charakteryzuje się stopniowym zmniejszaniem liczby limfocytów T CD4+, co prowadzi do postępującego niepowodzenia odpowiedzi immunologicznej. Ludzki wirus niedoboru odporności-1 (HIV-1) jest czynnikiem wywołującym AIDS. Jest to otoczkowy, jednoniciowy wirus RNA z pozytywnym zmysłem z dwiema kopiami RNA na wirion i należy do rodziny retroviridae. Produkcja wysokich stężeń białek wirusowych w komórce gospodarza powoduje nadmierny nacisk na maszynerię fałdowania białek w komórce1. ER jest pierwszym przedziałem w szlaku wydzielniczym komórek eukariotycznych. Jest odpowiedzialny za produkcję, zmianę i dostarczanie białek do szlaku wydzielniczego i miejsc docelowych przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Białka przechodzą liczne zmiany potranslacyjne i zwijają się do swojej naturalnej konformacji w ER, w tym glikozylacji związanej z asparaginą oraz tworzenia wewnątrz- i międzycząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych2. W związku z tym w świetle ER obecne są wysokie stężenia białek, które są bardzo podatne na agregację i nieprawidłowe fałdowanie. Różne stany fizjologiczne, takie jak szok cieplny, infekcje bakteryjne lub wirusowe, które wymagają zwiększonej syntezy białek lub mutacji białek, prowadzą do stresu ER z powodu zwiększonej akumulacji białka w ER, zaburzając w ten sposób homeostazę światła ER. Stres ER aktywuje sieć wysoce konserwatywnych adaptacyjnych ścieżek transdukcji sygnału, Unfolded Protein Response (UPR)3. UPR stosuje się w celu przywrócenia normalnego stanu fizjologicznego ER poprzez dostosowanie jego ciężaru rozłożonego białka i zdolności fałdowania. Jest to spowodowane zwiększeniem rozmiaru ER oraz molekularnych białek opiekuńczych i fałdowatych rezydujących w ER, co skutkuje zwiększeniem zdolności fałdowania ER. UPR zmniejsza również obciążenie białkowe ER poprzez globalne tłumienie syntezy białek na poziomie translacyjnym i zwiększa klirens niesfałdowanych białek z ER poprzez regulację w górę degradacji związanej z ER (ERAD)4,5.
Stres ER jest wykrywany przez trzy białka transbłonowe rezydujące w ER: kinazę retikulum endoplazmatycznego podobną do kinazy białkowej R (PKR), aktywujący czynnik transkrypcyjny 6 (ATF6) i enzym wymagający inozytolu typu 1 (IRE1). Wszystkie te efektory są utrzymywane w stanie nieaktywnym przez wiązanie się z rodziną białek szoku cieplnego A (Hsp70) należących do 5 (HSPA5), znanych również jako białko wiążące (BiP) / białko regulowane glukozą 78-kDa (GRP78). Po stresie ER i akumulacji niesfałdowanych/nieprawidłowo sfałdowanych białek, HSPA5 dysocjuje i prowadzi do aktywacji tych efektorów, które następnie aktywują szereg dalszych celów, które pomagają w rozwiązaniu stresu ER i, w ekstremalnych warunkach, spromują śmierć komórki6. Po dysocjacji od HSPA5 PERK ulega autofosforylacji, a jego aktywność kinazy jest aktywowana7. Jego aktywność kinazy fosforyluje eIF2α, co prowadzi do tłumienia translacyjnego, obniżając obciążenie białkami klasy ER<sup="xref">8. Jednak w obecności fosfo-eukariotycznego czynnika inicjacji 2α (eIF2α), nieulegające translacji otwarte ramki odczytu na określonych mRNA ulegają preferencyjnej translacji, takiej jak ATF4, regulującej geny wywołane stresem. Homologiczne białko ATF4 i C/EBP (CHOP) to czynniki transkrypcyjne, które regulują geny wywołane stresem oraz regulują apoptozę i szlaki śmierci komórki9,10. Jednym z celów ATF4 i CHOP jest białko indukowane zatrzymaniem wzrostu i uszkodzeniem DNA (GADD34), które wraz z fosfatazą białkową 1 defosforyluje peIF2α i działa jako regulator sprzężenia zwrotnego dla tłumienia translacyjnego11. Pod wpływem stresu ER ATF6 dysocjuje od HSPA5, a jego sygnał lokalizacji Golgiego jest eksponowany, co prowadzi do jego translokacji do aparatu Golgiego. W aparacie Golgiego ATF6 jest rozszczepiany przez proteazę miejsca 1 (S1P) i proteazę miejsca 2 (S2P) w celu uwolnienia rozszczepionej formy ATF6 (ATF6 P50). ATF6 p50 jest następnie przemieszczany do jądra, gdzie indukuje ekspresję genów zaangażowanych w fałdowanie, dojrzewanie i wydzielanie białek, a także degradację białek12,13. Podczas stresu ER IRE1 dysocjuje od HSPA5, multimeryzuje i ulega autofosforylacji14. Fosforylacja IRE1 aktywuje jego domenę RNazy, w szczególności pośrednicząc w splicingu 26 nukleotydów z centralnej części mRNA białka wiążącego X-box 1 (XBP1)15,16. W ten sposób powstaje nowy C-koniec nadający funkcję transaktywacji, generujący funkcjonalne białko XBP1s, silny czynnik transkrypcyjny kontrolujący kilka genów wywołanych stresem ER17,18. Połączona aktywność tych czynników transkrypcyjnych włącza programy genetyczne mające na celu przywrócenie homeostazy ER.
Istnieją różne metody wykrywania stresu ER i UPR. Należą do nich konwencjonalne metody analizy markerów UPR: 19,20. Różne niekonwencjonalne metody obejmują pomiar stanu redoks UPR i rozkładu wapnia w świetle ER, a także ocenę struktury ER. Mikroskopia elektronowa może być wykorzystana do sprawdzenia, jak bardzo zwiększa się światło ER w odpowiedzi na stres ER w komórkach i tkankach. Metoda ta jest jednak czasochłonna i zależy od dostępności mikroskopu elektronowego, który może nie być dostępny dla każdej grupy badawczej. Ponadto pomiar strumienia wapnia i stanu redoks ER jest trudny ze względu na dostępność odczynników. Co więcej, odczyt z tych eksperymentów jest bardzo czuły i mogą mieć na niego wpływ inne czynniki metabolizmu komórkowego.
Potężna i prosta technika monitorowania wyjścia UPR polega na pomiarze aktywacji różnych ścieżek sygnałowych UPR i jest stosowana od dziesięcioleci w różnych scenariuszach stresu. Te konwencjonalne metody pomiaru aktywacji UPR są ekonomiczne, wykonalne i dostarczają informacji w krótszym czasie w porównaniu z innymi znanymi metodami. Obejmują one immunoblotting w celu pomiaru ekspresji markerów UPR na poziomie białka, takich jak fosforylacja IRE1, PERK i eIF2α oraz rozszczepienie ATF6 poprzez pomiar formy P50 ATF6 i ekspresji białka innych markerów, takich jak HSPA5, spliced XBP1, ATF4, CHOP i GADD34, a także RT-PCR w celu określenia poziomów mRNA, a także splicing mRNA XBP1.
Ten artykuł opisuje sprawdzony i niezawodny zestaw protokołów do monitorowania stresu ER i aktywacji UPR w komórkach zakażonych HIV-1 oraz do określenia funkcjonalnego znaczenia UPR w replikacji i zakaźności HIV-1. Protokoły wykorzystują łatwo dostępne i ekonomiczne odczynniki i dostarczają przekonujących informacji o wynikach UPR. Stres ER jest wynikiem akumulacji niesfałdowanych/nieprawidłowo sfałdowanych białek, które są podatne na tworzenie agregatów białkowych21. Niniejszym opisujemy metodę wykrywania tych agregatów białkowych w komórkach zakażonych wirusem HIV-1. Barwienie tioflawiną T jest stosunkowo nową metodą stosowaną do wykrywania i ilościowego oznaczania tych agregatów białkowych22. Beriault i Werstuck opisali tę technikę w celu wykrycia i ilościowego określenia agregatów białkowych, a tym samym poziomów stresu ER w żywych komórkach. Wykazano, że mała cząsteczka fluorescencyjna tioflawina T (ThT) wiąże się selektywnie z agregatami białkowymi, zwłaszcza z włókienkami amyloidowymi.
W tym artykule opisujemy użycie ThT do wykrywania i ilościowego określania stresu ER w komórkach zakażonych wirusem HIV-1 i korelujemy go z konwencjonalną metodą monitorowania UPR poprzez pomiar aktywacji różnych szlaków sygnałowych UPR.
Ponieważ brakuje również wyczerpujących informacji na temat roli UPR podczas infekcji HIV-1, udostępniamy zestaw protokołów, aby zrozumieć rolę UPR w replikacji HIV-1 i zakaźności wirionów. Protokoły te obejmują knockdown markerów UPR za pośrednictwem lentiwirusa, a także leczenie farmakologicznymi induktorami stresu ER. W artykule przedstawiono również rodzaje odczytu, które można wykorzystać do pomiaru ekspresji genu HIV-1, produkcji wirusa, a także zakaźności wytworzonych wirionów, takich jak odpowiednio test lucyferazy oparty na długich powtórzeniach końcowych (LTR), test immunoenzymatyczny sprzężony z enzymem p24 (ELISA) i test barwienia reporterowego β-gal.
Korzystając z większości tych protokołów, niedawno opisaliśmy funkcjonalną implikację infekcji HIV-1 dla UPR w limfocytach T23, a wyniki tego artykułu sugerują niezawodność opisanych tutaj metod. W związku z tym artykuł ten zawiera zestaw metod wyczerpujących informacji dotyczących interakcji HIV-1 ze stresem ER i aktywacją UPR.

<table><tbody><tr><td>Akrylamid</td><td>Biorad, Stany Zjednoczone</td><td>1610107</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>G-Biosciences, Stany Zjednoczone</td><td>RC1013</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ATF4</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, USA</td><td>11815</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ATF6</td><td>Abcam, Wielka Brytania</td><td>ab122897</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CHOP</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, USA</td><td>2897</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-eIF2 i alfa</td><td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td><td>sc-11386</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:2000&nbsp;</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-GADD34</td><td>Abcam, Wielka Brytania</td><td>ab236516</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td><td>sc-32233</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:3000&nbsp;</td></tr><tr>przeciwciało <td>anty-HSPA5</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, USA</td><td>3177</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-IRE1</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, USA</td><td>3294</td><td>Detekcja Western blot Rozcieńczenie-1:2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało koniugatywne anty-mysie HRP&nbsp;</td><td>Biorad, Stany Zjednoczone</td><td>1706516</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie- 1:4000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-peIF2&alfa</td><td>Invitrogen, USA</td><td>44-728G</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-PERK</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, USA</td><td>5683</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:2000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-pIRE1</td><td>Abcam, Wielka Brytania</td><td>ab243665</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-pPERK</td><td>Invitrogen, USA</td><td>PA5-40294</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało koniugowane przeciw królikowi HRP</td><td>Biorad, USA</td><td>1706515</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie- 1:4000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-XBP1</td><td>Abcam, Wielka Brytania</td><td>ab37152</td><td>Wykrywanie Western blot Rozcieńczenie-1:1000</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa szybkoobrotowa</td><td>Eppendorf, USA</td><td>5804R</td><td>Wirnik- F-45-30-11</td></tr><tr><td>Wolnoobrotowa wirówka stołowa</td><td>Eppendorf, USA</td><td>5702R</td><td>Rotor-A-4-38</td></tr><tr><td>Bis-Akrylamid</td><td>Biorad, USA</td><td>1610201</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td> <td>MP biomedicals, USA</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Biorad, USA</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transfekcji ssaków CalPhos</td><td>Clontech, Takara Bio, USA</td><td>631312</td><td>Zapas wirusa przygotowanie</td></tr><tr><td>CEM-GFP</td><td>NIH, Repozytorium AIDS, USA</td><td>3655</td><td></td></tr><tr><td>Klarowność Podłoże ECL</td><td>Biorad, USA</td><td>1705061</td><td>substrat do wykrywania chemiluminescencji</td></tr><tr><td>Clarity max Podłoże</td><td>ECL Biorad, USA</td><td>1705062</td><td>substrat do wykrywania chemiluminescencji</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Olympus, Japonia</td><td>Model: FV3000</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka cytospinowa</td><td>Thermo Fisher Scientific, Stany</td><td>Zjednoczone ASHA78300003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega, Stany Zjednoczone</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, Stany</td><td>Zjednoczone 12635</td><td></td></tr><tr><td>EtBr</td><td>Invitrogen,</td> <td>USA'15585011</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen, USA</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen, USA</td><td>11811023</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 25%</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G6257</td><td>Test zakaźności</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>Q24755</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T</td><td>NCCS, Indie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zakaźny klon molekularny HIV-1 pNL4-3</td><td>NIH, repozytorium AIDS, USA</td><td>114</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon, Japonia</td><td>Model: Eclipse Ti2</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Uniwersalny SYBR Green Supermix</td><td>Biorad, USA</td><td>1715124</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat J6</td><td>NCCS, Indie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M8266</td><td>Zakaźność test</td></tr><tr><td>MMLV-RT&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik MTT</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M5655</td><td>Test żywotności komórek</td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>Fluka Chemika</td><td>40255</td><td>Test zakaźności</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>Q27605</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA do wychwytywania antygenu P24</td><td>ABL, Stany Zjednoczone</td><td>5421</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler wstępnie wybarwiona drabinka białkowa</td><td>Sci-fi Biologicals, Indie</td><td>PGPMT078</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clontech, Stany Zjednoczone</td><td>632515</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>151140122</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor fosfatazy</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>4906837001</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Mastermix do PCR o wysokiej wierności z buforem GC</td><td>NEB, USA</td><td>M05532</td><td></td></tr><tr><td>pLKO.1-TRC</td><td>Addgene, USA</td><td>10878</td><td>Wektor klonowania lentiwirusa</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene, USA</td><td>12259</td><td>Wektor obwiedni VSV-G</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenina (PEI)&nbsp;</td><td>Polysciences, Inc., USA</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>244023</td><td>Test zakaźności</td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P3289</td><td>Test zakaźności</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy</td><td>Sigma-Aldrich, USA&nbsp;</td><td></td><td></td>5056489001</tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene, Stany Zjednoczone</td><td>12260</td><td>Plazmid do pakowania lentiwirusowego</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P8833</td><td>Wybór stabilnych komórek</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Biorad, USA</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Startery losowe</td><td>Invitrogen, USA</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Substrat Steady-Glo</td><td>Promega, Stany Zjednoczone</td><td>E2510</td><td>Test lucyferazy</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td></td><td>TEMED Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>17919</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>Tioflawina T</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone</td><td>Q15965</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen, Stany Zjednoczone</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>TZM-bl</td><td>NIH, Repozytorium AIDS, USA</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Optima L90K, USA</td><td>330049</td><td>Rotor-SW28Ti</td></tr><tr><td>UltraPure X-gal</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15520-018</td><td>Test zakaźności</td></tr></tbody></table>

pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach t zakażonych hiv-1 i analiza jego roli w replikacji hiv-1

Measuring Endoplasmic Reticulum Stress and Unfolded Protein Response in HIV-1 Infected T-Cells and Analyzing its Role in HIV-1 Replication

Infekcje wirusowe mogą powodować stres retikulum endoplazmatycznego (ER) z powodu nieprawidłowego nagromadzenia białka, co prowadzi do Unfolded Protein Response (UPR). Wirusy opracowały strategie manipulowania UPR gospodarza, ale w literaturze brakuje szczegółowej wiedzy na temat modulacji UPR i jej funkcjonalnego znaczenia podczas zakażenia HIV-1. W tym kontekście niniejszy artykuł opisuje protokoły stosowane w naszym laboratorium do pomiaru poziomu stresu ER i UPR podczas zakażenia HIV-1 w limfocytach T oraz wpływu UPR na replikację wirusa i zakaźność. 
Barwienie tioflawiną T (ThT) jest stosunkowo nową metodą używaną do wykrywania stresu ER w komórkach poprzez wykrywanie agregatów białkowych. W tym miejscu zilustrowaliśmy protokół barwienia ThT w komórkach zakażonych wirusem HIV-1 w celu wykrycia i ilościowego określenia stresu ER. Co więcej, stres ER wykryto również pośrednio, mierząc poziomy markerów UPR, takich jak BiP, fosforylowany IRE1, PERK i eIF2α, splicing XBP1, rozszczepienie ATF6, ATF4, CHUP i GADD34 w komórkach zakażonych HIV-1, przy użyciu konwencjonalnego immunoblottingu i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Odkryliśmy, że fluorescencja ThT koreluje ze wskaźnikami aktywacji UPR. W artykule przedstawiono również protokoły analizy wpływu stresu ER i modulacji UPR na replikację HIV-1 poprzez eksperymenty knockdown, a także zastosowanie cząsteczek farmakologicznych. Wpływ UPR na ekspresję/replikację genu HIV-1 i produkcję wirusa analizowano odpowiednio za pomocą testów reporterowych lucyferazy i ELISA wychwytywania antygenu p24, podczas gdy wpływ na zakaźność wirionu analizowano przez barwienie zakażonych komórek reporterowych. Podsumowując, ten zestaw metod zapewnia kompleksowe zrozumienie szlaków odpowiedzi na niesfałdowane białko podczas infekcji HIV-1, ujawniając jej skomplikowaną dynamikę.

W niniejszej pracy opisaliśmy szczegółowy protokół badania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) in vitro oraz aktywacji odpowiedzi białkowej nieprawidłowo sfałdowanych białek (UPR) po zakażeniu limfocytów T wirusem HIV-1 (Rycina 2). Niniejsze badanie opisuje również metody analizy funkcjonalnego znaczenia UPR w replikacji HIV-1 oraz zakaźności wirionów (Rycina 3).
W tym celu przeanalizowano stres retikulum endoplazmatycznego (ER) wywołany zakażeniem HIV-1 poprzez obserwację agregatów białkowych wewnątrz komórek przy użyciu barwienia tioflawiną T. Jak pokazano na Rysunku 4A, intensywność ThT reprezentuje agregaty białkowe w komórkach niezakażonych i zakażonych. Podobnie, jako kontrolę pozytywną, Rysunek 4B przedstawia barwienie ThT w komórkach traktowanych tapsygarginą. Zwiększona intensywność ThT sugeruje obecność większej liczby agregatów białkowych, co koreluje ze zwiększonym stresem ER.
Ponadto, aby potwierdzić tę obserwację, zastosowano bardziej konwencjonalną metodę, polegającą na analizie markerów UPR. Aktywację UPR analizowano początkowo poprzez badanie aktywacji głównych efektorów – IRE1, ATF6 i PERK. Aktywację IRE1 mierzono poprzez analizę poziomów phospho-IRE1 za pomocą immunoblottingu lizatów komórek niezakażonych i zakażonych, pobranych w różnych punktach czasowych po infekcji, co przedstawiono na Rysunku 5A. Wzrost stosunku pIRE1/całkowite IRE1 sugeruje aktywację IRE1. Podobnie aktywację PERK mierzono poziomami phospho-PERK w komórkach niezakażonych i zakażonych (Rysunek 5B). Aktywację ATF6 ilościowo określono na podstawie poziomu ekspresji formy ATF6 P50 za pomocą immunoblottingu (Rysunek 5C). Innym ważnym markerem UPR jest główny regulator i chaperon ER, HSPA5. Poziom HSPA5 analizowano również metodą immunoblottingu, jak pokazano na Rysunku 5D. Analogiczny protokół zastosowano dla innych markerów UPR, takich jak sXBP1, peIF2α, ATF4, CHOP i GADD34, wykorzystując przeciwciała specyficzne dla tych białek (Rysunek uzupełniający 1). Splicing mRNA XBP1 można analizować zarówno za pomocą ilościowego RT-PCR (Rys. 5E), jak i półilościowego RT-PCR. Ponieważ ilościowy RT-PCR nie mógł specyficznie zidentyfikować splicingu, zestawiono go z testem splicingu z wykorzystaniem półilościowego RT-PCR (Rysunek 5F). Stosując powyższy protokół, zaobserwowaliśmy, że dane z qRT-PCR są zgodne z danymi z semi-qRT-PCR. Podobnie jak w przypadku qRT-PCR wykonanego dla sXBP1, protokół ten wykorzystano do analizy innych markerów UPR, takich jak HSPA5, ATF4, CHOP i GADD34 na poziomie mRNA (Rysunek uzupełniający 2)
Następnie, aby zbadać rolę UPR w replikacji HIV-1 i zakaźności wirionów, przeprowadziliśmy wyciszenie (knockdown) wybranych markerów UPR: PERK oraz HSPA5. Stosując wspomniane protokoły, osiągnęliśmy znaczący poziom wyciszenia tych markerów zarówno w komórkach HEK-293T (Rycina 6A), jak i w komórkach J6 (Rycina 6B). Wykorzystując te komórki z wyciszonymi genami, zbadaliśmy wpływ wyciszenia na aktywność genu sterowanego przez LTR HIV-1 (Rycina 6A), przedstawioną jako stosunek ekspresji Luc/GFP w odpowiednich próbkach. Produkcję wirusa zmierzono za pomocą testu ELISA p24 w naddatku, co przedstawiono na Rycynie 6B. Zakaźność produkowanych wirionów można również przeanalizować za pomocą protokołu barwienia β-gal w ten sam sposób, jak pokazano na Rycynie 1A.
Ponadto, wykorzystując chemiczny induktor stresu ER, tapsygargin, można zbadać wpływ nadmiernej stymulacji UPR na replikację HIV-1, produkcję wirusa oraz zakaźność wirionów. Cytotoksyczność tapsygarginy przy zastosowanym stężeniu przeanalizowano za pomocą testu MTT (Rycina 7A), który wykazał, że cytotoksyczność przy pożądanym stężeniu jest nieistotna. W celu analizy wpływu leku na stres ER wykonano immunoblotting dla HSPA5 (Rycina 7B). Wyniki wskazują, że 12-godzinna inkubacja wstępna z 100 nM tapsygarginy indukowala ekspresję HSPA5 we wszystkich punktach czasowych. Test p24 ELISA pokazuje wpływ na produkcję wirusa oraz zakaźność wytworzonych wirionów, co można przeanalizować zgodnie z wcześniejszym opisem.
<img alt="Analiza infekcji komórek; mikroskopia i wykres słupkowy przedstawiający poziomy p24 w czasie w badaniu nad infekcją wirusową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig01.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilościowe oznaczenie zakaźności wirionów i analiza postępu infekcji. (A) Ilościowe oznaczenie zakaźności wirionów za pomocą testu β-gal na komórkach TZM-bl. Zakaźność wirusa określono poprzez dodanie 1 ng, 0.1 ng i 0.01 ng wirusa do komórek TZM-bl, a następnie wykonanie barwienia β-gal i przeliczenie liczby niebieskich komórek. Powiększenie: 10x. (B) Analiza postępu infekcji w komórkach CEM-GFP zainfekowanych HIV-1 z MOI 0.5, oparta na testie ELISA z wychwytywaniem antygenu p24 z supernatantów hodowli. Komórki CEM-GFP zainfekowano HIV-1 z MOI 0.5, a supernatanty poddano analizie p24 ELISA. Słupki błędów przedstawiono jako wartości średnia ± S.E. Gwiazdki oznaczają poziom istotności, określony na rycinach jako ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 oraz ****=p ≤ 0.0001, analizowane za pomocą testu t Studenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu ilościowego oznaczania wirusa; test ELISA p24, komórki CEM-GFP, profilowanie markerów UPR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig02.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schematyczne przedstawienie kroków niezbędnych do analizy wpływu infekcji HIV-1 na stres ER oraz UPR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyciszanie markerów UPR, proces infekcji HIV-1; konstrukty shRNA, lucyferaza, schemat testu ELISA p24." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig03.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat blokowy etapów analizy wpływu UPR na replikację HIV-1, produkcję wirusa oraz zakaźność wirionów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie komórkowe w kontraście fazowym, z użyciem GFP i tioflawiny T; wykres intensywności fluorescencji; mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig04.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Analiza poziomu stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) w limfocytach T wywołanego zakażeniem HIV-1 z wykorzystaniem barwienia ThT. (A) Komórki CEM-GFP zainfekowano HIV-1 z MOI 0.5 i zebrano 72 h po zakażeniu. Komórki utrwalono i zabarwiono tioflawiną T. Ekspresja GFP wskazuje zainfekowane komórki CEM-GFP. Wykres przedstawia intensywność tioflawiny T w przypadku komórek niezinfekowanych i zainfekowanych HIV-1. Na wykresie przedstawiono dane z około 50 komórek z n = 3 powtórzeń biologicznych. (B) Komórki CEM-GFP traktowano DMSO oraz TG przez 12 h. Komórki utrwalono i zabarwiono tioflawiną T. Wykres przedstawia intensywność tioflawiny T w przypadku komórek traktowanych DMSO i TG. Na wykresie przedstawiono dane z około 50 komórek z n = 3 powtórzeń biologicznych. Słupki błędów przedstawiono jako wartości średnia ± S.E. Gwiazdki oznaczają poziom istotności, który na rysunkach wskazano jako ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 oraz **** = p ≤ 0.0001, przeanalizowane za pomocą testu t Studenta. UN: niezinfekowane; IN: zainfekowane; TG: tapsigargin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza Western blot wykazująca ekspresję białek po infekcji; obejmuje wykresy i elektroforezę w żelu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig05.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza ekspresji różnych markerów UPR w limfocytach T zainfekowanych HIV-1. (A-E) Komórki CEM-GFP zainfekowane HIV-1 (0,5 MOI) zbierano co 24 h aż do 4. dnia i poddawano różnym analizom opisanym poniżej. (A) Aktywację IRE1 analizowano poprzez immunoblotting pIRE1. (B) Aktywację PERK analizowano poprzez immunoblotting pPERK. (C) Aktywację ATF6 analizowano poprzez immunoblotting formy ATF6 P50. (D) Ekspresję chaperonu ER HSPA5 analizowano poprzez immunoblotting HSPA5. (E) Splicing XBP1 analizowano za pomocą qRT-PCR sXBP1 z użyciem specyficznych starterów do PCR w czasie rzeczywistym. (F) W celu analizy splicingu XBP1 metodą semi-qRT-PCR, mRNA XBP-1 amplifikowano za pomocą RT-PCR w obrębie miejsca splicingu, a następnie wizualizowano prążki. Słupki błędów przedstawiono jako średnia ± S.E. UN: niezinfekowane. IN: zainfekowane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza Western blot i wykresy słupkowe pokazujące wpływ ekspresji PERK i HSPA5 na markery infekcji HIV-1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig06.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Analiza roli UPR w replikacji HIV-1 i produkcji wirusa. (A) Wyciszono PERK (panel lewy) i HSPA5 (panel prawy) w komórkach HEK-293T, a następnie przeprowadzono test lucyferazowy w celu analizy aktywności genu sterowanego przez LTR HIV-1. Immunobloty przedstawiają stopień wyciszenia odpowiednich białek. (B) Wyciszono PERK (panel lewy) i HSPA5 (panel prawy) w komórkach J6, a następnie przeprowadzono test ELISA p24 w zebranym supernatancie w celu analizy produkcji wirusa. Immunobloty przedstawiają stopień wyciszenia odpowiednich białek. Słupki błędów przedstawiono jako wartości średnia ± S.E. Gwiazdki wskazują poziom istotności, określony na rycinach jako ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 oraz **** = p ≤ 0.0001, analizowane testem t Studenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza żywotności komórek i ekspresji białek; wykresy słupkowe i Western blot dla badania infekcji HIV-1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66522/66522fig07.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Analiza wpływu chemicznego induktora stresu ER, tapsygargyny, na progresję infekcji HIV-1. (A) Żywotność komórek CEM-GFP po traktowaniu 100 nM tapsygargyny. Żywotność komórek analizowano za pomocą testu MTT. (B) Komórki CEM-GFP poddane wstępnej inkubacji z 100 nM TG przez 12 h zainfekowano HIV-1 z MOI 0.5 i zebrano w punktach czasowych 24 h, 48 h oraz 72 h po infekcji. Immunoblot obrazuje wpływ TG na ekspresję HSPA5, natomiast wykres przedstawia produkcję wirusa analizowaną za pomocą testu ELISA p24. Słupki błędów przedstawiono jako wartości średnia ± S.E. Gwiazdki oznaczają poziom istotności, który w figurach określono jako ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 oraz ****= p ≤ 0.0001 w analizie za pomocą testu t Studenta. TG: tapsygargyna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/66522fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Analiza ekspresji różnych markerów efektorowych UPR. Ekspresja (A) sXBP1, (B) fosforylacja eIF2α, (C) ATF4, (D) CHOP oraz (E) GADD34 analizowana za pomocą immunoblottingu. (A-E) Komórki CEM-GFP zainfekowane HIV-1 z MOI 0.5 zostały zebrane po 24 h, 48 h, 72 h i 96 h od infekcji i wykorzystane do immunoblottingu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/Revised%20SUPPLEMENTARY%20FIGURE1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Analiza różnych markerów UPR na poziomie mRNA metodą qRT-PCR. (A-D) Komórki CEM-GFP zainfekowane HIV-1 z MOI 0,5 były zbierane co 24 h aż do 4. dnia i wykorzystane do qRT-PCR dla (A) HSPA5, (B) ATF4, (C) CHOP oraz (D) GADD34. Słupki błędów przedstawiają wartości średnia ± S.E. Gwiazdki oznaczają poziom istotności, który w figurach wskazano jako ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 oraz **** = p ≤ 0,0001 w analizie przeprowadzonej testem t Studenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66522/SUPPLEMENTARY%20FIGURE2%20R2.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Konstrukt</td>
			<td colspan="2">Sekwencja startera 5’ do 3’</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>XBP1 SPLICING ASSAY F</td>
			<td colspan="2">TTACGAGAGAAAACTCATGGCC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>XBP1 SPLICING ASSAY R</td>
			<td colspan="2">GGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>SPLICED XBP1 F</td>
			<td colspan="2">CTGAGTCCGAATCAGGTGCAG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>SPLICED XBP1 R</td>
			<td colspan="2">ATCCATGGGGAGATGTTCTGG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>HSPA5 F</td>
			<td colspan="2">CACAGTGGTGCCTACCAAGA</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>HSPA5 R</td>
			<td colspan="2">TGATTGTCTTTTGTCAGGGGT</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>ATF4 F</td>
			<td colspan="2">AGTCCCTCCAACAACAGCAA</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>ATF4 R</td>
			<td colspan="2">GAAGGTCATCTGGCATGGTT</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>CHOP F</td>
			<td colspan="2">CAGTGTCCCGAAGGAGAAAG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>CHOP R</td>
			<td colspan="2">CAGAGCTGGAACCTGAGGAG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>GADD34 F</td>
			<td colspan="2">ATGGACAGTGACCTTCTCGG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>GADD34 R</td>
			<td colspan="2">CTGGGCTCCTCCTAGGCT</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>ACTIN F</td>
			<td colspan="2">AGAAAATCTGGCACCACACC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>ACTIN R</td>
			<td colspan="2">GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Lista starterów użytych do analizy RT-PCR. F: Forward (przedni); R: Reverse (odwrotny)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Konstrukt shRNA</td >
			<td colspan="4">Sekwencja startera 5’ do 3’</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PERK SH1 F</td >
			<td colspan="4">CCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PERK SH1 R</td >
			<td colspan="4">AATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PERK SH2 F</td >
			<td colspan="4">CCGGGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PERK SH2 R</td >
			<td colspan="4">AATTCAAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >ATF6 SH1 F</td >
			<td colspan="4">CCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGGTTTTTG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >ATF6 SH1 R</td >
			<td colspan="4">AATTCAAAAACCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >ATF6 SH2 F</td >
			<td colspan="4">CCGGCCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGGTTTTTG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >ATF6 SH2 R</td >
			<td colspan="4">AATTCAAAAACCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >IRE1 SH1 F</td >
			<td colspan="4">CCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGGTTTTTG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >IRE1 SH1 R</td >
			<td colspan="4">AATTCAAAAACCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >IRE1 SH2 F</td >
			<td colspan="4">CCGGCCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGGTTTTTG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >IRE1 SH2 R</td >
			<td colspan="4">AATTCAAAAACCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HSPA5 SH1 F</td >
			<td colspan="4">CCGGGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTCTTTTTG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HSPA5 SH1 R</td >
			<td colspan="4">AATTCAAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTC</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HSPA5 SH2 F</td >
			<td colspan="4">CCGGGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HSPA5 SH2 R</td >
			<td colspan="4">AATTCAAAAAGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >LacZ F</td >
			<td colspan="4">CCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTTTG</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >LacZ R</td >
			<td colspan="4">AATTCAAAAATCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGA</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3: Lista starterów użytych do generowania konstruktów shRNA. F: Forward (przedni); R: Reverse (odwrotny)

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Viral infections can cause Endoplasmic Reticulum (ER) stress due to abnormal protein accumulation, leading to Unfolded Protein Response (UPR). Viruses ...

Zakres naszych badań koncentruje się na oddziaływaniach między gospodarzem a patogenem, ze szczególnym uwzględnieniem zrozumienia modulacji szlaków odpowiedzi na nieprawidłowo sfałdowane białka podczas infekcji HIV-1. Niniejsze badanie analizuje, w jaki sposób stres retikulum endoplazmatycznego (ER) oraz markery aktywacji UPR ulegają zmianom w wyniku infekcji HIV-1, a także jaki wpływ ma to na replikację i zakaźność wirusa w limfocytach T. Po raz pierwszy, w ramach kompleksowego badania, wykazaliśmy, że HIV-1 wymaga optymalnego progu aktywacji UPR dla swojej efektywnej replikacji, a zarówno indukcja UPR powyżej tego progu, jak i inhibicja poniżej niego, są szkodliwe dla replikacji HIV-1.W niniejszym opracowaniu przedstawiamy zestaw kompleksowych protokołów służących do zrozumienia roli UPR w replikacji HIV-1, których brakowało w poprzednich badaniach. Stanowią one podstawę dla przyszłych badaczy zajmujących się UPR w infekcjach wirusowych i pomogą w rozwiązywaniu przyszłych problemów badawczych.Nasza analiza wskazała kilka kluczowych kwestii dla dalszych badań mechanistycznych, mających na celu zrozumienie roli specyficznych białek wirusowych oraz innych czynników gospodarza, które pośredniczą w regulacji UPR podczas infekcji HIV-1. Ponadto interesującym kierunkiem badawczym może być analiza wpływu UPR na regulację zakaźności wirionów.Aby rozpocząć, należy wysiać 0,1 × 10⁶ komórek TZM-bl na płytkę 24-dołkową, stosując 500 µL kompletnego DMEM na każdy dołek, a następnie umieścić ją w inkubatorze do hodowli komórkowej na 10 do 12 godzin. Z fiolki zawierającej wirusa HIV-1 przenieść odpowiednią ilość wirusa do dołków i inkubować w temperaturze 37 °C przez cztery godziny.Przemyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem PBS przed ich utrwaleniem w 500 µL 0,25% roztworu glutaraldehydu. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez pięć do siedmiu minut.Po przemyciu roztworem PBS, pokryj komórki 500 µL świeżo przygotowanego roztworu barwiącego i inkubuj w temperaturze 37 °C w ciemności przez okres od 2 do 18 godzin. Pod mikroskopem przy powiększeniu 10X policz niebieskie zainfekowane komórki w pięciu losowo wybranych polach widzenia. Resuspenduj 8 milionów komórek CEM-GFP w jednym mililitrze pełnej pożywki RPMI 1640 zawierającej polybrene. Dodaj zapas wirusa i uzupełnij objętość do dwóch mililitrów pełną pożywką.Umieścić komórki w inkubatorze z CO₂ w temperaturze 37 °C na cztery godziny, delikatnie opukując naczynie co 30 do 45 minut. Hodować taką samą liczbę komórek w 6-dołkowej płytce hodowlanej w temperaturze 37 °C. Co 24 godziny po wirowaniu zebrać nadsącz z osadów komórkowych, a następnie dodać bufor do lizy komórek do osadu.Utrwal 1 milion niezainfekowanych oraz 0,5 wielokrotności infekcji (MOI) zainfekowanych HIV-1 komórek CEM-GFP za pomocą 200 µL 4% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut. Wirować komórki przy 100 g przez pięć minut, a następnie potraktować osad 500 µL 0,1 M glicyny przez pięć minut. Po dwukrotnym przemyciu komórek PBS i ich ponownym zawieszeniu w 100 µL PBS, przenieś 100 µL zawiesiny komórkowej do komór pomiarowych.Wirować komórki w cytoodśrodkowniku przy 1 000 g przez cztery minuty, aby przytwierdzić je do szkiełek. W celu permeabilizacji dodać do komórek kilka kropli 0,1% Triton X-100. Po 10 minutach stopniowo dodawać PBS, aby wypłukać komórki. Inkubować komórki z 10 µL 5 µM tioflawiny T przez 30 minut, następnie dodać 5 µL medium montażowego i nałożyć szkiełko nakrywką. Za pomocą obiektywu imersyjnego glicerynowego 63X zarejestrować obrazy konfokalne utrwalonych komórek. Stres retikulum endoplazmatycznego (ER) wywołany infekcją HIV-1 analizowano poprzez obserwację agregatów białkowych wewnątrz komórki przy użyciu barwienia tioflawiną T.Zwiększona intensywność thioflawiny T sugerowała obecność większej liczby agregatów białkowych oraz nasilenie stresu retikulum endoplazmatycznego.Aby rozpocząć, resuspender komórki CEM-GFP zainfekowane HIV-1 z wielokrotnością infekcji 0,5 w buforze do lizy na lodzie przez 45 minut, okresowo mieszając na wirówce typu vortex. Po wirowaniu zebrać supernatant do nowej probówki.Gotuj próbki białek o równych stężeniach w buforze Laemmliego w temperaturze 96°C przez pięć minut. Rozdziel próbki na żelu SDS PAGE o stężeniu od 10 do 12%.Przenieś żel na membranę PVDF. Zablokuj membranę 5% BSA przez jedną do dwóch godzin, następnie przemyj membranę dwukrotnie TBST i inkubuj z białkowymi przeciwciałami pierwszorzędowymi na rotatorze przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia inkubuj blot z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1,5 godziny. Po przemyciu TBST dodaj substrat do detekcji chemiluminescencyjnej, aby zwizualizować prążki białkowe.Aby przeanalizować ekspresję mRNA, należy przygotować 10 µL mieszanin reakcyjnych zawierających matrycę cDNA, 5 µL barwnika SYBR Green oraz 10 pmol każdej pary specyficznych dla genu starterów oligonukleotydowych. Mieszaniny należy poddać amplifikacji w urządzeniu do real-time PCR.Aby przeanalizować splicing XBP-1, należy rozdzielić amplikony w 2,5% żelu agarozowym zawierającym 50 ng bromku etydyny na ml i wizualizować je za pomocą systemu dokumentacji żeli. Po trypsynizacji wysiać około 0,25 × 10⁶ komórek HEK 293T wraz z mieszaniną do transfekcji na płytkę 24-dołkową i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C. Do dołków dodać 125 µL kompletnej pożywki DMEM i resuspenderć komórki w celu równomiernego wysiania. Po 24 godzinach zastąpić istniejącą pożywkę 250 µL niekompletnej pożywki DMEM.Dodać świeżo przygotowaną drugą mieszaninę do transfekcji i inkubować przez 36 godzin. Po wirowaniu resuspendować komórki w komercyjnie dostępnym substracie lucyferazy. Przenieść resuspendowany lizat komórkowy do nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej i inkubować przez 10 do 15 minut.Za pomocą luminometru odczytaj poziom lucyferazy. Zmierz fluorescencję GFP w tych samych próbkach, aby znormalizować odczyt lucyferazy, korzystając z czytnika mikroplate w trybie mikropłytkowym. Po 24 godzinach od transfekcji komórek HEK-293T dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki DMEM do każdej studni płytki 6-dołkowej, a po 48 godzinach zbierz supernatant lentiwirusowy.Inkubuj 2 miliony komórek Jurkat J6 zawieszonych w kompletnym medium RPMI z dodatkiem polybrenu w płytce 6-dołkowej z równą objętością supernatantu lentiwirusem dla każdej grupy kontrolnej oraz lentiwirusem do specyficznego wyciszenia genu. Po 24 godzinach dodaj puromycynę do każdego dołka w celu wyselekcjonowania stabilnych komórek. Wirowanie w celu pelletowania komórek przeprowadzaj co 24 godziny, a następnie dodawaj dwa mililitry świeżego kompletnego medium RPMI 1640 z puromycyną.Komórki CEM-GFP poddano działaniu 100 nanomolarnego Thapsigarginu przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po przemyciu komórek pożywką RPMI 1640 zainfekowano je HIV-1 z wielokrotnością infekcji 0,5. Nadnad supernatanty z każdej próbki zebrano w celu przeprowadzenia testu ELISA dla białka p24.Cytotoksyczność tapsygargyny przeanalizowano za pomocą testu MTT, który wykazał nieistotną cytotoksyczność przy pożądanej stężeniu. Wpływ leku na stres retikulum endoplazmatycznego (ER) przeanalizowano za pomocą immunoblottingu dla HSPA-5. Wstępna inkubacja z 100 nM tapsygarginy przez 12 godzin indukowała ekspresję HSPA-5 we wszystkich punktach czasowych. Test ELISA dla P24 wykazał wpływ na produkcję wirusa.

measuring-endoplasmic-reticulum-stress-unfolded-protein-response-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ocena stresu siateczki śródplazmatycznej i odpowiedzi na białka niezłożone w zakażonych komórkach T wirusem HIV-1 oraz analiza jej roli w replikacji HIV-1

Opracowaliśmy wektor lentiwirusem, który oprócz LTR reagującego na Tat posiada element odpowiedzi Rev (RRE), umożliwiający regulację ekspresji genu reporterowego w sposób zależny od Tat i Rev HIV-1. Wektor ten pozwala na specyficzne wykrywanie replikującego się HIV w żywych komórkach poprzez ekspresję GFP.

Specyficzne znakowanie komórek zakażonych HIV-1 przy użyciu zależnego od Rev wektora lentiwirusego wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

W przeciwieństwie do bezkomórkowych cząsteczek HIV-1, zakażone limfocyty T CD4+ są skutecznie wykrywane przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC). Niniejszy manuskrypt opisuje metodę, w której jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) lub izolowane pDC są hodowane wspólnie z limfocytami T zakażonymi wirusem HIV-1 w celu oceny wrodzonego wykrywania przez pDC, oceniane przez uwalnianie IFN typu I.

Ocena wrodzonego wyczuwania limfocytów T CD4 + zakażonych wirusem HIV-1 przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne przy użyciu systemu kohodowli ex vivo.

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Ten raport opisuje test in vitro do pomiaru aktywności integracyjnej ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) związanego z kompleksem preintegracji () w ekstraktach cytoplazmatycznych ostro zakażonych komórek. Integracja DNA HIV-1 związanego z z heterologicznym docelowym DNA jest określana ilościowo przy użyciu zagnieżdżonej strategii reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów przedintegracyjnych HIV-1

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Tutaj opisujemy immunoprecypitację Rev w obecności replikacji HIV-1 dla spektrometrii mas. Opisane metody mogą być stosowane do identyfikacji czynników jąderkowych zaangażowanych w cykl zakaźny HIV-1 i mają zastosowanie do innych modeli chorób w celu scharakteryzowania niedostatecznie zbadanych szlaków.

Identyfikacja czynników jąderkowych podczas replikacji HIV-1 poprzez immunoprecypitację Rev i spektrometrię mas

Tutaj prezentujemy protokół, w którym pojedyncze komórki są monitorowane pod kątem ostrych zdarzeń i produktywnego zakażenia HIV-1 na urządzeniu nanofluidycznym. Dane obrazowe definiują interakcje wirus-receptor gospodarza i dynamikę szlaku sygnałowego. Jest to pierwsza metoda nanofluidycznej, wysokoprzepustowej, podłużnej hodowli pojedynczej komórki i obrazowania w celu zbadania kinetyki sygnalizacji i interakcji molekularnych.

Jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej

Poznaj metody pomiaru stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi UPR w limfocytach T zakażonych HIV-1. Dowiedz się, jak optymalna aktywacja UPR wpływa na replikację wirusa.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1 (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Przeglądaj więcej filmów