Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

W tym badaniu mamy na celu oczyszczenie endonukleazy płatowej 1 lub FEN1, kluczowego białka replikacji DNA za pomocą chromatografii powinowactwa. Pozwoli nam to zbadać funkcję FEN1 w replikacji i naprawie DNA w kontrolowanym środowisku in vitro, pogłębiając naszą wiedzę na temat jego funkcji i ról biologicznych. Do oczyszczania białek wiążących DNA stosuje się różne rodzaje chromatografii, z których najczęstszą jest chromatografia powinowactwa.

W chromatografii powinowactwa chromatografia powinowactwa do unieruchomionego metalu jest jednym z najsilniejszych narzędzi do oczyszczania białek znakowanych przez His, ponieważ oddziaływanie między izotagowanym Hisem a jonem metalu, zwykle niklem lub kobaltem, jest bardzo silne. Dwa kluczowe czynniki wpływające na pomyślny proces oczyszczania białka to wydajność białka i czystość białka. W zależności od przeznaczenia białka, wydajność lub czystość mogą być preferowane w stosunku do innych.

Nasze odkrycia pokazują, że wybór odpowiedniej żywicy do oczyszczania białek znakowanych His może przynieść wyniki pożądane w dalszych zastosowaniach białek. Na początek dopasuj kolumny do stojaka zaciskowego tak prosto, jak to możliwe. Zatkaj spód każdej kolumny korkiem.

Dodaj od jednego do dwóch mililitrów buforu startowego na dno każdej kolumny, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas pakowania kolumny. Następnie otwórz górną część kolumn i wlej 10 mililitrów każdej zawiesiny w sposób ciągły na metalową szpatułkę lub szklany pręt trzymany na krawędzi kolumny, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Zdejmij korek z kolumny i połącz spód kolumny z jednym końcem rurki.

Podłącz drugi koniec rurki do portu UV systemu FPLC. Sprawdź, czy obudowa wspornika łóżka jest wciągnięta do korpusu adaptera przepływowego. I wsuń korpus adaptera przepływu na górną część kolumny z zatrzaskiem krzywki w pozycji 1, opuść adapter przepływu.

Następnie przełącz zatrzask krzywki w pozycję 2. Podłącz rurkę do systemu i uruchom przepływ bufora na jedną do dwóch minut, aby usunąć powietrze z rurki i zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas pakowania. Następnie przestaw zatrzask z powrotem do pozycji 1, płynnie opuść adapter przepływu do bufora, unikając pęcherzyków powietrza, i przełącz zatrzask z powrotem do pozycji 2.

Po przełączeniu zatrzasku z pozycji 2 na 3 dokręć zarówno podstawę krzywki, jak i pierścień blokujący. Następnie uruchom przepływ bufora z prędkością 10 mililitrów na minutę przez trzy minuty lub do momentu, gdy żywica będzie dobrze wypełniona. Po zapakowaniu kolumny FPLC podłącz rurkę od góry pętli próbki do pętli E w systemie FPLC.

Przymocuj rurkę od dołu sample pętli do Waste 2 w systemie FPLC. Następnie włóż jeden koniec rurki do portu kolumny systemu FPLC, a drugi koniec umieść w butelce na odpady. Włóż rurkę z pompy A do przefiltrowanej wody podwójnie destylowanej.

Następnie otwórz oprogramowanie. Kliknij zakładkę Kontrola systemu. Kliknij dwukrotnie Ustawienia pompy i wybierz System Pump Inject Loop.

Kliknij Ustawienia natężenia przepływu i ustaw natężenie przepływu na 10 mililitrów na minutę. Wprowadź wartość 0% w polu procent B. Następnie uruchom przepływ, aby przepłukać pętlę próbki wodą, aby popchnąć uszczelkę przesuwną w dół.

Gdy uszczelka przesuwna dotrze do dna pętli próbki, zatrzymaj przepływ. Następnie przełączyć pompę A z wody podwójnie destylowanej na bufor rozruchowy. Podłącz rurkę od góry pętli próbki do odpadu 2, a rurkę od dołu do pętli E. Pozostaw rurkę z portu kolumny w odpływie i ponownie rozpocznij przepływ z prędkością 10 mililitrów na minutę.

Aby rozpocząć, zapakuj kolumnę FPLC i przygotuj pętlę próbki do załadowania próbki. Teraz przejdź do oprogramowania. Kliknij dwukrotnie Ustawienia pompy i wybierz Ręczna pętla obciążenia.

Teraz podłącz rurkę z portu kolumny do rurki na górze adaptera przepływu. Odkręć rurkę od pętli E i umieść ją w pojemniku na odpady. Następnie za pomocą strzykawki o pojemności 30 mililitrów pobrać próbkę i podłączyć strzykawkę do adaptera portu iniekcyjnego.

Wkręcić strzykawkę w port iniekcji i wstrzyknąć próbkę, upewniając się, że jest ona w widoczny sposób wstrzyknięta do pętli próbki. Teraz zatkać port wtrysku z nasadką kolumny. Podłącz rurkę od dołu sample pętli do portu pętli E.

Następnie umieścić rurkę z pompy B w buforze elucyjnym. Przejdź do karty Narzędzia główne i wybierz pozycję Nowa metoda. Następnie wybierz kartę Ustawienia metody w lewej kolumnie.

Przejdź do menu rozwijanego typu kolumny i wybierz opcję Niestandardowy. Wprowadź objętość kolumny jako pięć mililitrów, a wymagane natężenie przepływu dla przebiegu jako jeden mililitr na minutę. Przejdź do wyboru jednostek i wybierz CV, woluminy kolumn, jako jednostkę podstawową metody.

Sprawdź, czy wlot A jest ustawiony na bufor A1, a wlot B na bufor B1. Następnie wybierz zakładkę Konspekt metody w menu po lewej stronie. W obszarze Equilibration (Równowaga) ustaw objętość równowagi na 10 CV. Na karcie Sample Application (Przykładowa aplikacja) ustaw objętość próbki, obserwując pętlę próbki. Przejdź do kolumny Wash i ustaw objętość prania na 5 CV. W przypadku Illusion ustaw objętość gradientu na 14 CV, zaczynając od 0%Buffer B do 100%Buffer B, zapisz metodę i rozpocznij przebieg.

Upewnij się, że kolektor frakcji zaczyna się w pozycji pierwszej frakcji. Wprowadź nazwę uruchomienia i kliknij przycisk Uruchom. Podczas aplikacji próbki należy zamienić probówki znajdujące się aktualnie w pojemniku na odpady na czystą zlewkę.

Zbierz niezwiązane białka wypływające z tych rurek podczas przepływu i oznacz je jako FT. Po zakończeniu uruchamiania przejdź do karty Narzędzia główne i wybierz pozycję Otwórz bieg. Otwórz przebieg, aby wyświetlić chromatogram. Wybierz Integracja pików w górnym menu, aby zaznaczyć uzyskane szczyty.

Wybierz zakładkę Frakcje, aby wyświetlić frakcje zawierające białko, z którego wymyka się ulotka.