Name: Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Naucz się oczyszczania białka FEN1 metodą chromatografii powinowactwa z użyciem etykiety 6X-His. Ta technika pozwala uzyskać czyste białko do badań funkcjonalnych DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów National Science Foundation (1929346) i American Cancer Society (RSG-21-028-01). Chcielibyśmy również podziękować członkom laboratorium Balakrishnan za pomocne dyskusje.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Aby oczyścić rekombinowany FEN1, należy wyrazić konstrukt (pET-FCH-FEN1) w komórkach BL21(DE3), jak wcześniej opisano przez Ononye et al.8.
	<ol>
		<li>Zaszczepić pożywkę LB (Tabela 1) 1% hodowlą przez noc i hodować komórki w temperaturze 37 °C, aż OD osiągnie 0,6.</li>
		<li>Indukować 0,4 M izopropylo-beta-D-tiogalaktozydem (IPTG) i hodować kulturę przez dodatkowe 3 godziny.</li>
		<li>Zebrać komórki, odwirowując kulturę w temperaturze 5 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przechowuj granulki w zamrażarce o temperaturze -80°C.</li>
		<li>W dniu oczyszczania wyjąć osad komórkowy z zamrażarki o temperaturze -80 °C, pozostawić do rozmrożenia na lodzie i ponownie zawiesić osad w 100 ml buforu do lizy (Tabela 1). 
		UWAGA: Lizat komórkowy należy zawsze umieszczać na lodzie podczas przenoszenia, aby zapobiec proteolizie. Po rozmrożeniu cały proces oczyszczania musi zostać zakończony tego samego dnia. Lizatu komórkowego nie należy przechowywać w lodówce przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do zlewki o pojemności 250 ml i poddać sonikacji na lodzie przez 30 s ON i 30 s OFF przy amplitudzie 35% przez 15 min. 
	UWAGA: Zapoznaj się z ustawieniami producenta, aby określić amplituda.</li>
	<li>Przenieść sonifikowaną próbkę do probówki wirówkowej i wirować pod ciśnieniem 27 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania klarownego lizatu. Umieścić lizat komórkowy na lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C do momentu wstrzyknięcia próbki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kolumn pokrewieństwa
<ol>
	<li>Dopasuj kolumny (jedną dla żywicy Ni-NTA i jedną dla żywicy na bazie kobaltu) do stojaka zaciskowego tak, aby kolumny były trzymane tak prosto, jak to możliwe, unikając pochylenia kolumn. Upewnij się, że spód kolumn jest zatyczony korkiem i dodaj 1-2 ml buforu startowego na dno każdej kolumny, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas pakowania kolumny.</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij butelkami z żywicą, aż żywica zostanie całkowicie zawieszona. Otwórz górną część kolumn i wlewaj 10 ml każdej zawiesiny w sposób ciągły, aby uniknąć wtrącania się pęcherzyków powietrza. Wlej żywicę na metalową szpatułkę lub szklany pręt trzymany na krawędzi kolumny, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w kolumnie.</li>
</ol>
3. Upakowanie kolumn za pomocą adaptera przepływu
<ol>
	<li>Odłącz korek od kolumny i podłącz spód do jednego końca rurki. Podłącz drugi koniec rurki do portu UV systemu FPLC.</li>
	<li>Upewnij się, że obudowa wspornika łóżka została wciągnięta do korpusu adaptera przepływu i wsuń korpus adaptera przepływu na górę kolumny (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A). Trzymając zatrzask krzywki w pozycji 1, opuść adapter przepływu, uważając, aby nie włożyć go do bufora (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Przełącz zatrzask krzywki w pozycję 2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Podłącz rurkę do systemu i uruchom przepływ bufora rozruchowego na 1-2 minuty, aby usunąć rurkę z powietrza i zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas pakowania.</li>
	<li>Przełącz zatrzask z powrotem do pozycji 1 i jednym płynnym ruchem opuść adapter przepływu do bufora, unikając wtrącania pęcherzyków powietrza, a następnie przełącz zatrzask z powrotem do pozycji 2. Pozwala to na przedostanie się pewnego bufora do adaptera przepływu i usunięcie wszelkich pozostałych pęcherzyków.</li>
	<li>Ustaw zatrzask w pozycji 3 i dokręć podstawę krzywki i pierścień blokujący (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2B).</li>
	<li>Rozpocznij przepływ buforu z prędkością 10 ml/min, aby upakować kolumnę. Kontynuuj ten krok przez 3 minuty lub do momentu, gdy żywica zostanie dobrze zapakowana.</li>
</ol>
4. Gruntowanie pętli próbki systemu FPLC
<ol>
	<li>Podłącz rurkę od góry pętli próbki do pętli E w systemie FPLC (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3).</li>
	<li>Podłącz rurkę od dołu sample pętli do Waste 2 w systemie FPLC.</li>
	<li>Włóż jeden koniec rurki do portu kolumny systemu FPLC, a drugi koniec umieść w butelce na odpady.</li>
	<li>Włóż rurkę z pompy A do przefiltrowanej wody podwójnie destylowanej (ddH2O).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie ustawienia pompy za pomocą oprogramowania (Rysunek 4A, oznaczony 2) i wybierz pętlę wtrysku pompy systemowej (Rysunek 4C).</li>
	<li>Kliknij ustawienia natężenia przepływu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A, oznaczony 1) i zmień natężenie przepływu na 10 ml/min. Wprowadź 0% w polu %B (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Uruchom przepływ, aby przepłukać pętlę próbki wodą, co spowoduje popchnięcie uszczelki przesuwnej w dół.</li>
	<li>Gdy uszczelka przesuwna dotrze do dna pętli próbki, zatrzymaj przepływ. Przełączyć pompę A z ddH2O na bufor rozruchowy. Podłącz rurkę od góry sample pętli do odpadu 2, a tę od dołu do pętli E. Pozostaw rurkę z portu kolumny w odpływie.</li>
	<li>Rozpocznij przepływ od 10 ml/min. Gdy uszczelka ślizgowa wypchnięta do góry przez napływający bufor rozruchowy dotrze do górnej części pętli próbki, zatrzymaj przepływ. Pętla próbki jest teraz gotowa do wstrzyknięcia próbki.</li>
</ol>
5. Wstrzyknięcie próbki
<ol>
	<li>Kliknij dwukrotnie ustawienia pompy i wybierz Ręczna pętla obciążenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>Odkręć rurkę od pętli E i umieść ją w pojemniku na odpady.</li>
	<li>Podłącz rurkę z portu kolumny do rurki na górze adaptera przepływu.</li>
	<li>Pobrać próbkę za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml, a następnie podłączyć strzykawkę do adaptera portu do wstrzykiwań.</li>
	<li>Wkręcić strzykawkę w port iniekcji i wstrzyknąć próbkę, upewniając się, że jest ona w widoczny sposób wstrzyknięta do pętli próbki. Przechowywać 100 μl próbki (lizat wejściowy z etykiety) w probówce do mikrowirówki w temperaturze -20 °C do analizy SDS-PAGE 
	UWAGA: W zależności od całkowitej objętości próbki mogą być wymagane 2-3 wstrzyknięcia.</li>
	<li>Zatkać port wtryskowy z nasadką kolumny.</li>
	<li>Podłącz rurkę od dołu sample pętli z powrotem do portu pętli E.</li>
	<li>Umieścić rurkę z pompy B w buforze elucyjnym.</li>
</ol>
6. Tworzenie i analiza metod za pomocą oprogramowania połączonego z systemem FPLC
<ol>
	<li>Przejdź do karty Narzędzia główne i wybierz pozycję Nowa metoda.</li>
	<li>Wybierz kartę Ustawienia metody w lewej kolumnie, przejdź do menu rozwijanego Typ kolumny i wybierz opcję Niestandardowe (Rysunek 5).</li>
	<li>Wprowadź objętość kolumny (5 ml).</li>
	<li>Wprowadź wymagane natężenie przepływu dla przebiegu (1 ml/min).</li>
	<li>Przejdź do opcji Wybór jednostek i wybierz CV (objętości kolumn) jako jednostkę podstawową metody.</li>
	<li>Upewnij się, że wlot A jest ustawiony na Bufor A, a wlot B jest ustawiony na Bufor B (ustawienie domyślne).</li>
	<li>Wybierz kartę Konspekt metody w menu po lewej stronie. Dodaj etapy oczyszczania w następującej kolejności: równowaga, aplikacja próbki, płukanie kolumny i elucja.
	<ol>
		<li>W obszarze równowagi ustaw objętość równowagi na 10 CV. Upewnij się, że ustawienie bufora jest utrzymywane na poziomie 0% B.</li>
		<li>Na karcie przykładowej aplikacji ustaw objętość próbki, obserwując pętlę próbki. Położenie uszczelki przesuwnej wskazuje objętość próbki.</li>
		<li>Pod myciem kolumnowym ustaw objętość prania na 5 CV. Wyłącz zbieranie ułamków dla tego kroku; Zbierz płukanie w całości do zlewki podczas biegu, zamiast zbierać jako frakcje.</li>
		<li>W przypadku elucji ustaw objętość gradientu na 14 CV, zaczynając od 0% bufora B do 100% buforu B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz metodę i rozpocznij przebieg.</li>
	<li>Upewnij się, że kolektor frakcji zaczyna się w pozycji pierwszej frakcji.</li>
	<li>Wprowadź nazwę uruchomienia i kliknij przycisk Start.</li>
	<li>W fazie równowagi monitoruj krzywą UV w czasie rzeczywistym. Upewnij się, że wszystkie połączenia są bezpieczne i nie ma wycieków; Potwierdź pełny obwód, szukając bufora wpływającego do pojemnika na odpady. Jeśli krzywa UV nie ustabilizowała się w ostatnich minutach równowagi, wydłuż krok równowagi do momentu osiągnięcia stabilizacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6) .</li>
	<li>W momencie pobierania próbki należy przestawić probówki wkładane do pojemnika na odpady do czystej zlewki. Na tym etapie należy zebrać niezwiązane białka wypływające z rurek odpływowych jako przepływowe (oznaczone jako FT).</li>
	<li>Zwróć uwagę na gwałtowny wzrost krzywej UV, która prawdopodobnie osiągnie maksymalny możliwy odczyt 3,000 maU (<silna klasa="xfig">Rysunek 6). 
	UWAGA: Typowa krzywa utrzymuje się na poziomie 3,000 maU przez większość etapu aplikacji próbki.</li>
	<li>Podczas płukania kolumny, gdy resztki niezwiązanych białek są wypłukiwane, a na żywicy pozostają tylko związane białka, należy zwrócić uwagę na gwałtowny spadek krzywej UV (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6). Jeśli krzywa UV nie spadła do końca etapu prania, przedłuż krok, klikając krok wstrzymania, aż UV wystarczająco spadnie. Na początku tego etapu przenieś rurki odpływowe ze zlewki FT do innej czystej zlewki oznaczonej jako Wash.</li>
	<li>Po rozpoczęciu etapu elucji upewnij się, że kolektor frakcji przesunął się na miejsce i rozpoczął zbieranie frakcji. Wizualizuj elucję białka, szukając pików na krzywej UV (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
	<li>Po zakończeniu uruchamiania przejdź do karty Narzędzia główne i wybierz pozycję Otwórz bieg. Otwórz przebieg, aby wyświetlić chromatogram i wybierz integrację pików w górnym menu, aby zaznaczyć piki uzyskane podczas przebiegu.</li>
	<li>Wybierz zakładkę Ułamki, aby wyświetlić frakcje zawierające eluowane białko.</li>
</ol>
7. Analiza strony SDS
<ol>
	<li>Zmieszać 15 μl każdej frakcji zawierającej białko z 5 μl buforu ładującego próbkę SDS (tabela 1). Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Załaduj próbki do prefabrykowanych żeli i pracuj pod napięciem 160 V przez 45 minut wraz ze wstępnie wybarwionym markerem białkowym.</li>
	<li>Zabarwić żele w roztworze barwiącym Coomassie na błękit brylantowy przez 30 minut (Tabela 1).</li>
	<li>Umyj żel w ddH2O (powtórzyć 3x).</li>
	<li>Odbarwić żel w roztworze odbarwiającym przez 1 godzinę (Tabela 1).</li>
	<li>Obserwować prążki białkowe; wykryć FEN1 na znaku 42 kDa.</li>
	<li>Frakcje basenowe zawierające FEN1 i zagęścić basen za pomocą filtra odśrodkowego o sile 10 kDa. Porcję i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80°°C.</li>
</ol>

Optimizing FPLC for Efficient Purification of His-Tagged FEN1 Protein

<ol><li>Balakrishnan, L., Bambara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flap+endonuclease+1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Flap endonuclease 1.</a> Annu Rev Biochem. 82, 119-138 (2013).</li>
<li>Asagoshi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEN1+functions+in+long+patch+base+excision+repair+under+conditions+of+oxidative+stress+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">FEN1 functions in long patch base excision repair under conditions of oxidative stress in vertebrate cells.</a> Mol Cancer Res. 8 (2), 204-215 (2010).</li>
<li>Lyamichev, V., Brow, M. A., Dahlberg, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-specific+endonucleolytic+cleavage+of+nucleic+acids+by+eubacterial+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases.</a> Science. 260 (5109), 778-783 (1993).</li>
<li>Bornarth, C. J., Ranalli, T. A., Henricksen, L. A., Wahl, A. F., Bambara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+flap+modifications+on+human+FEN1+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of flap modifications on human FEN1 cleavage.</a> Biochemistry. 38 (40), 13347-13354 (1999).</li>
<li>Xu, Y., Potapova, O., Leschziner, A. E., Grindley, N. D., Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contacts+between+the+5%27+nuclease+of+DNA+polymerase+I+and+its+DNA+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Contacts between the 5' nuclease of DNA polymerase I and its DNA substrate.</a> J Biol Chem. 276 (32), 30167-30177 (2001).</li>
<li>Wen-Hui, K., Kuo, K., Chase, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+interactions+between+poly-histidine+fusion+tagsand+immobilized+metal+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Exploiting the interactions between poly-histidine fusion tagsand immobilized metal ions.</a> Biotechnol Lett. 33 (6), 1075-1084 (2011).</li>
<li>Charlton, A., Zachariou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+of+native+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immobilized metal ion affinity chromatography of native proteins.</a> Methods Mol Biol. 421, 25-35 (2008).</li>
<li>Ononye, O. E., Njeri, C. W., Balakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+processing+enzyme+FEN1+and+its+regulation+by+protein+lysine+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA processing enzyme FEN1 and its regulation by protein lysine acetylation.</a> Methods Mol Biol. 1983, 207-224 (2019).</li>
<li>Econo-column flow adaptor instruction manual. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M7380014.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M7380014.pdf</a> (2015).</li>
<li>NGC Chromatography systems and ChromLab software instrument guide version 3.3. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10026252.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10026252.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Chromatografia powinowactwa jest szeroko stosowaną techniką oczyszczania białek wiążących DNA. Chromatografia powinowactwa do metali immobilizowanych (IMAC) to specyficzny rodzaj chromatografii powinowactwa, która wykorzystuje jony metali do wychwytywania reszt histydyny sekwencji peptydowej. Z tego powodu "znacznik 6X-his" lub "znacznik poli-his" jest przyłączony do N-końca lub C-końca białek, które mają być oczyszczone. Nikiel i kobalt są najczęściej stosowanymi jonami metali i różnią się kompatybilnością z odczynnikam...

Dostępne są liczne strategie dla zrozumienia biologii komórkowej. Jedno z podejść obejmuje strategię odgórną, w której mutacje genetyczne są wprowadzane do genu, a następnie ocena wynikających z nich zmian fenotypowych w organizmie modelowym. I odwrotnie, podejście redukcjonistyczne pociąga za sobą wstępne wyjaśnienie mechanizmów molekularnych i funkcji enzymatycznych danego białka, któremu towarzyszy charakterystyka jego interakcji z innymi składnikami komórkowymi. Następnie ocenia się wpływ tego białka na szlak biologiczny. Chociaż każde podejście badawcze ma swoje nieodłączne zalety i ograniczenia, osiągnięcie kompleksowego zrozumienia szlaku biologicznego wymaga badań interdyscyplinarnych.
Ponieważ DNA jest genetycznym wzorcem życia, zrozumienie mechanizmów duplikacji DNA i utrzymania genomu było przedmiotem aktywnego zainteresowania od ponad siedmiu dekad. Badania w dziedzinie replikacji DNA dostarczyły wielu danych dotyczących poszczególnych struktur i funkcji wielu białek replikacyjnych. Badania te, które obejmują aspekty mechanistyczne i testy aktywności biochemicznej, stały się możliwe dzięki oczyszczeniu tych białek, umożliwiając ich skrupulatne zbadanie w środowisku in vitro. W związku z tym oczyszczanie białek staje się nieodzowną i wszechobecną techniką w większości przedsięwzięć badawczych mających na celu rozwikłanie mechanistycznych spostrzeżeń na temat replikacji DNA.
Ten artykuł przedstawia metodologię izolowania białka replikacji DNA oznaczonego 6X-histydyną, które uległo nadekspresji w komórkach bakteryjnych. Interesującym białkiem jest ludzka endonukleaza płatowa 1 (FEN1), nukleaza specyficzna dla struktury, która odgrywa kluczową rolę w replikacji opóźnionej nici, a także jest krytycznym uczestnikiem szlaków naprawy DNA, takich jak naprawa przez wycinanie zasady (BER)1,2,3. Podstawową funkcją FEN1 jest rozszczepienie u podstawy struktury płata z przemieszczeniem 5', produktu pośredniego, który powstaje podczas replikacji DNA lub BER. Początkowo, badania biochemiczne oceniające aktywność enzymatyczną FEN1 sugerowały mechanizm "śledzenia", w którym nukleaza rozpoznawałaby wolny koniec 5'-fosforanu struktury płatowej, a następnie podążałaby wzdłuż klapki do jej podstawy przed jej rozszczepieniem4. Późniejsze badania wykazały, że FEN1 działa poprzez mechanizm "nawlekania", w którym najpierw wiąże się z podstawą klapy, a następnie przewleka wolny koniec 5' przez jej aktywne miejsce przed rozszczepieniem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) 5. Zdolność do nadekspresji i izolacji rekombinowanego FEN1 ułatwiła te przełomowe odkrycia, umożliwiając naukowcom zastosowanie jej w badaniach biochemicznych i strukturalnych.
Chromatografia powinowactwa jest powszechnie stosowaną metodą separacji do oczyszczania DNA. Technika ta wykorzystuje odwracalne powinowactwo wiązania białek docelowych do ligandów unieruchomionych na żywicy w celu specyficznego uwięzienia białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jednym z najczęściej stosowanych biopowinowactwa jest silne oddziaływanie między aminokwasem, histydyną i jonami metali, takimi jak nikiel i kobalt, a zatem może być wychwytywane na żywicy naładowanej Ni2+ lub Co2+.
Sekwencja DNA kodująca ciąg 6-9 reszt histydyny (His) jest często włączana do konstruktu plazmidowego, który koduje interesujące białko (na N-końcu lub C), oznaczając białko znacznikiem 6X-His-tag lub znacznikiem poly-His. Białko znakowane Hisem można następnie łatwo oczyścić za pomocą immobilizowanej chromatografii powinowactwa do metalu (IMAC), podtypu chromatografii powinowactwa, w której jony metali na żywicy wychwytują białka ze znacznikiem powinowactwa, które można później eluować za pomocą odpowiednich środków elucyjnych. Jony metali przejściowych, takie jak Ni2+ i Co2+, mogą być unieruchomione na matrycach agarozy lub żelu krzemionkowego pochodzących z grup N,N,N'-tris-(karboksymetylo)-etylenodiaminy lub kwasu nitrylotrioctowego (NTA)6.
Ligandy metali są znane z tego, że są odporne na degradację przez czynniki fizyczne, chemiczne i biologiczne i mają tę przewagę nad innymi typami ligandów6,7. Dodatkowo, znacznik His-tag jest stosunkowo mały i nie wpływa znacząco na strukturę ani funkcję białka7. Jednak w bakteryjnym systemie ekspresji wiele białek ulegających ekspresji chromosomalnej ma powinowactwo do jonów metali i może współoczyszczać się z białkiem docelowym. Nikiel i kobalt to typowe jony metali stosowane w matrycach IMAC. Żywica Ni-NTA i żywica na bazie kobaltu TALON są powszechnie stosowane do oczyszczania białek znakowanych przez Hisa.
Ni-NTA kontra TALON 
Odpowiednie jony metali zarówno Ni-NTA, jak i TALON są unieruchamiane na żywicy za pomocą ligandów NTA. Uważa się, że Ni-NTA ma wyższą zdolność wiązania, wiążąc do 100 mg / ml białka. Może to skutkować wyższą wydajnością białka, z zastrzeżeniem, że białka zanieczyszczające mogą być jednocześnie oczyszczane. W przeciwieństwie do tego, żywica ma wyższą specyficzność wiązania w stosunku do białek znakowanych His i może być w stanie wytwarzać frakcje o wyższej czystości. W tym badaniu zamierzamy porównać skuteczność oczyszczania obu żywic przy użyciu referencyjnego zautomatyzowanego systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek, systemu NGC (patrz tabela materiałów).
i kompatybilność 
są wymagane podczas oczyszczania białek do lizy komórek, przygotowania próbki, równoważenia żywicy i elucji wychwyconego białka z żywicy. Tris, MOPS i HEPES o stężeniu do 100 mM są znanymi kompatybilnymi dla żywicy Ni-NTA. często zawierają środki redukujące, które zapobiegają utlenianiu białka i agregacji białek. Jednak powyżej limitu progowego środki redukujące mogą pozbawić żywicę jonów metali. Zalecane stężenie środków redukujących, takich jak beta-merkaptoetanol (BME) lub ditiotreitol (DTT) wynosi poniżej 1 mM dla wyżej wymienionych żywic na bazie niklu i kobaltu.
do oczyszczania hFEN1 to Tris zawierające NaCl, BME, fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), EDTA i glicerol. NaCl utrzymuje białko w postaci rozpuszczalnej i zakłóca interakcje molekularne, takie jak wiązanie DNA. BME redukuje utlenione białka, a tym samym zapobiega agregacji białek. PMSF) jest inhibitorem proteazy, który zapobiega degradacji białka docelowego za pośrednictwem proteazy. EDTA eliminuje kationy dwuwartościowe z próbki, uniemożliwiając im dostęp do nukleaz i proteaz. Glicerol zwiększa stabilność białka w postaci wodnej. Dodatkowo bufor do lizy zawiera kompletne tabletki z inhibitorem proteazy, aby zapewnić maksymalną ochronę białka docelowego przed degradacją proteaz podczas lizy komórek. Bufor równowagowy i elucyjny zawiera imidazol, przy czym bufor elucyjny zawiera większe ilości imidazolu do wypierania związanego białka z żywicy podczas elucji.
System chromatografii nowej generacji (NGC) 
Ten zautomatyzowany, średniociśnieniowy system chromatograficzny przeznaczony do szybkiej przepływowej chromatografii cieczowej białek (FPLC) wykorzystuje dwie pompy do jednoczesnego pompowania dwóch różnych i jest w stanie wstrzykiwać szeroki zakres objętości próbek od 250 μl do 100 ml. Pętla próbki (znana w tym systemie jako Dynaloop) umożliwia wstrzykiwanie większych objętości próbek. System może być obsługiwany za pomocą oprogramowania Chromlab, które ułatwia tworzenie niestandardowych metod, manipulowanie przebiegami oczyszczania oraz analizę pików UV i frakcji białkowych.

<table><tbody><tr><td>4x Laemmli bufor do próbek</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Merck</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol (BME)</td><td>Sigma</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>Chromlab wersja oprogramowania 6.1.27.0</td><td>BioRad</td><td></td><td>obsługuje system NGC</td></tr><tr><td>Kompletna tabletka inhibitora proteazy</td><td>MINI Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R</td><td>Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSD11000</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column glass</td><td>BioRad</td><td>7371512</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene dimine tetraoctowy (EDTA)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSE57020</td><td></td></tr><tr><td>Adapter przepływu</td><td>BioRad</td><td>7380014</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Dot Scientific</td><td></td><td></td>DSG22020</tr><tr><td>Imidazole</td><td>Dot Scientific</td><td>DSI52000</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Mini żele PROTEAN TGX</td> System <td>chromatograficzny BioRad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>NGC</td><td>Zautomatyzowany system chromatografii cieczowej BioRad</td><td></td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>Ni-NTA Agaroza</td><td>Qiagen</td><td>1018244</td><td></td></tr><tr><td>fluorek fenylo-metylosulfonylowy</td><td>Dot Scientific</td><td>DSP20270</td><td></td></tr><tr><td>PreScission Plus Protein Dual Color Standards&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS23020</td><td></td></tr><tr><td>TALON żywica o powinowactwie do metali</td><td>Takara</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td></td><td>DST60040</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6x-his-his-tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

Funkcjonalna charakterystyka białek wymaga ich ekspresji i oczyszczania w znacznych ilościach o wysokiej czystości do przeprowadzania testów biochemicznych. System szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) umożliwia separację złożonych mieszanin białkowych w wysokiej rozdzielczości. Dostosowując różne parametry w FPLC, takie jak wybór odpowiedniej matrycy oczyszczania, regulacja temperatury próbki białka oraz zarządzanie natężeniem przepływu próbki do matrycy i szybkością elucji, możliwe jest zapewnienie stabilności i funkcjonalności białka. W tym protokole zademonstrujemy wszechstronność systemu FPLC do oczyszczania białka endonukleazy płatowej 1 (FEN1) znakowanego 6X-His, wytwarzanego w kulturach bakteryjnych. Aby poprawić wydajność oczyszczania białek, skupimy się na wielu kwestiach, w tym na prawidłowym pakowaniu i przygotowaniu kolumny, wstrzykiwaniu próbki za pomocą pętli próbki, natężeniu przepływu próbki do kolumny oraz parametrach elucji próbki. Na koniec chromatogram zostanie przeanalizowany w celu zidentyfikowania frakcji zawierających wysoką wydajność białka oraz rozważań na temat prawidłowego długoterminowego przechowywania białka rekombinowanego. Optymalizacja metod oczyszczania białek ma kluczowe znaczenie dla poprawy precyzji i wiarygodności analizy białek.

Lizaty komórek BL21 (DE3) wykazujących ekspresję hFEN1 przepuszczono przez równoważone żywice Ni-NTA oraz TALON. Żywica Ni-NTA jest naładowana jonami Ni2+ i charakteryzuje się wysoką pojemnością wiązania. Wyniki wskazują, że żywica Ni-NTA pozwala na uzyskanie większej ilości FEN1 w porównaniu z żywicą TALON (Rysunek 7). Znane jest również, że żywica Ni-NTA niespecyficznie wiąże inne białka ekspresowane chromosomalnie. Lizat komórkowy przepuszczony przez żywicę na bazie kobaltu zos...

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

W tym badaniu mamy na celu oczyszczenie endonukleazy płatowej 1 lub FEN1, kluczowego białka replikacji DNA za pomocą chromatografii powinowactwa. Pozwoli nam to zbadać funkcję FEN1 w replikacji i naprawie DNA w kontrolowanym środowisku in vitro, pogłębiając naszą wiedzę na temat jego funkcji i ról biologicznych. Do oczyszczania białek wiążących DNA stosuje się różne rodzaje chromatografii, z których najczęstszą jest chromatografia powinowactwa.W chromatografii powinowactwa chromatografia powinowactwa do unieruchomionego metalu jest jednym z najsilniejszych narzędzi do oczyszczania białek znakowanych przez His, ponieważ oddziaływanie między izotagowanym Hisem a jonem metalu, zwykle niklem lub kobaltem, jest bardzo silne. Dwa kluczowe czynniki wpływające na pomyślny proces oczyszczania białka to wydajność białka i czystość białka. W zależności od przeznaczenia białka, wydajność lub czystość mogą być preferowane w stosunku do innych.Nasze odkrycia pokazują, że wybór odpowiedniej żywicy do oczyszczania białek znakowanych His może przynieść wyniki pożądane w dalszych zastosowaniach białek. Na początek dopasuj kolumny do stojaka zaciskowego tak prosto, jak to możliwe. Zatkaj spód każdej

affinity-purification-6x-his-tagged-protein-using-fast-protein-liquid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opracowano i szczegółowo opisano nowatorski i wysoce wydajny dwuetapowy protokół chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na niewielkim znaczniku oczyszczającym o dwóch wrodzonych powinowactwach i jest możliwa do zastosowania w odniesieniu do szerokiego zakresu białek docelowych o różnych właściwościach.<br...

Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Źródło: Becker, B. i inni. Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych niezbędnych do transportu łańcucha toksyny rycyny A (RTA) w drożdżach. J. Vis. Exp. (2017).Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanego białka oznaczonego polisystydyną za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie niklu. Określa kluczowe kroki, w tym lizę bakteryjną przez sonikację, klarowanie i filtrację lizatu oraz selektywne wiązanie i eluację docelowego białka za pomocą...

 Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii powinowactwa niklu do oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną z bakterii Clostridium difficile.

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii powinowactwa niklu: technika oczyszczania rekombinowanych białek znakowanych polihistydyną z lizatu komórek bakteryjnych

Ten film prezentuje oczyszczanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych lub SAPN oznaczonych histydyną za pomocą chromatografii cieczowej o powinowactwie. Uzyskane w ten sposób oczyszczone frakcje SAPN nadają się do opracowania szczepionek, co daje nadzieję na potencjalne zastosowania immunoterapeutyczne.

Oczyszczanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych za pomocą chromatografii powinowactwa

W obecnym protokole demonstrujemy wysoce efektywną i opłacalną metodę oczyszczania białek na małą skalę, która pozwala na oczyszczanie rekombinowanych białek poprzez unikalne połączenie rozszczepialnego znacznika GST i małego znacznika His.

Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Naucz się oczyszczania białka FEN1 metodą chromatografii powinowactwa z użyciem etykiety 6X-His. Ta technika pozwala uzyskać czyste białko do badań funkcjonalnych DNA.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Przeglądaj więcej filmów