Name: Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj protokół produkcji wektorów AAV w komórkach HEK293 w zawiesinie, który zwiększa wydajność i redukuje nakład pracy w terapii genowej układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z funduszu badawczego Królewskiej Holenderskiej Akademii Sztuk i Nauk (KNAW) oraz grantem z Start2Cure (0-TI-01). Dziękujemy Leishy Kopp za jej wkład i rady w tworzeniu protokołu. Figury zostały stworzone przy użyciu Biorenderu.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania Królewskiej Holenderskiej Akademii Nauk (KNAW) i były zgodne z holenderskim prawem o doświadczeniach na zwierzętach w ramach projektu numer AVD8010020199126. W Rysunek 1 znajduje się schematyczny przegląd całego protokołu. Od wysiewu komórek do oczyszczenia AAV, protokół trwa 6 dni.
1. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Oczyszczanie plazmidu
	<ol>
		<li>Przeprowadzić ekstrakcję plazmidu zgodnie z opisem producenta z kilkoma regulacjami, aby zapewnić sterylność plazmidów.</li>
		<li>Przygotuj 70% etanolu, używając sterylnej wody destylowanej i absolutnego etanolu.</li>
		<li>Po etapie wirowania izopropanolu wysusz plazmidy w pokrywie komory przepływowej i dodaj sterylny 70% etanol do probówek. Po wytrąceniu etanolu wysuszyć plazmidy w okapie komory przepływowej i ponownie zawiesić plazmid w sterylnej wodzie destylowanej. Uważaj, aby używać wysterylizowanych probówek do mikrowirówek.</li>
		<li>Pobrać podwielokrotność do oznaczania ilościowego, analizy ograniczeń i, w razie potrzeby, sekwencjonowania. Zaleca się sprawdzenie integralności powtórzeń odwróconego zakończenia (ITR), ponieważ mutacje mogą mieć negatywny wpływ na wydajność. Dostosować stężenie próbki do 1 μg/μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 10x buforu do lizy Tween
	<ol>
		<li>Rozpuścić 30,3 g buforu Tris i 2,033 g MgCl2,6H 2O w 400 ml sterylnej wody destylowanej, ustawić pH na 8,0 i zwiększyć całkowitą objętość do 450 ml.</li>
		<li>Utrzymuj Tween 20 w sterylnej formie, dodaj 50 ml Tween 20 do roztworu buforowego w okapie i sterylizuj filtr za pomocą filtra próżniowego 0,2 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczenia jodiksanolu
	<ol>
		<li>Roztwór jodiksanolu jest dostarczany w stężeniu 60%. Użyj roztworu początkowego, aby przygotować roztwory 15%, 25% i 40%.</li>
		<li>Aby uzyskać 15% roztwór, rozcieńczyć 60 ml 60% roztworu 48 ml 5 M NaCl i 48 ml PBS-MK (5x PBS z 5 mM MgCl2 i 12,5 mM KCl) i dodać wodę destylowaną do 240 ml.</li>
		<li>Aby uzyskać 25% roztwór, rozcieńczyć 67 ml 60% roztworu i 32 ml PBS-MK. Dodaj wodę destylowaną do 160 ml. Dobrze wymieszaj i dodaj 1,6 ml roztworu czerwieni fenolowej.</li>
		<li>Aby uzyskać 40% roztwór, rozcieńczyć 160 ml 60% roztworu z 48 ml PBS-MK i dodać wodę destylowaną do 240 ml. Aby uzyskać 60% roztwór, dodaj 1 ml czerwieni fenolowej do 100 ml 60% roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PBS 5% roztwór sacharozy
	<ol>
		<li>Dodaj 25 g sacharozy do 500 ml butelki DPBS bez wapnia i magnezu. Dobrze wstrząsnąć i przefiltrować za pomocą filtra próżniowego do butelek 0,2 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór glikolu polietylenowego (PEG) 8000
	<ol>
		<li>Rozpuścić 400 g PEG 8000 i 24 g NaCl w sterylnej wodzie destylowanej i dostosować do końcowej objętości 1000 ml. Mieszać z ogrzewaniem, aż do całkowitego rozpuszczenia. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą papieru pH.</li>
		<li>Filtruj sterylizację za pomocą filtra próżniowego do butelek 0,2 μM, aby uzyskać 40% roztwór PEG 8000. Należy pamiętać, że filtracja zajmie trochę czasu ze względu na lepkość roztworu - przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórek zawiesinowych HEK293
<ol>
	<li>Do czyszczenia używaj chusteczek nasączonych 70% etanolem. Wyczyść kaptur bezpieczeństwa biologicznego, przygotuj i wyczyść wszystkie materiały potrzebne do hodowli komórek.</li>
	<li>Rozgrzej 30 ml pożywki z komórek zawiesinowych do temperatury 37 °C w stożkowej probówce do hodowli o pojemności 50 ml. Odzyskaj komórki produkcyjne wirusa z ciekłego azotu. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Tuż przed całkowitym rozmrożeniem fiolki należy ją oczyścić chusteczką nasączoną 70% etanolem i przenieść fiolkę do kaptura bezpieczeństwa biologicznego. 
	UWAGA: Szczegółowe informacje na temat użytych tutaj komórek do produkcji wirusa znajdują się w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Szybko przenieś komórki do wstępnie podgrzanej stożkowej probówki hodowlanej o pojemności 50 ml. Hodowla komórek w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C, wilgotności 80%, 8%CO2, 200 obrotów na minutę (RPM) i średnicy wytrząsania 50 mm. Komórki pasażowe, gdy żywotność przekracza 90%, a gęstość komórek przekracza 1-3 x 106 komórek/ml. 
	UWAGA: Zastosowany inkubator ma średnicę wytrząsania 50 mm; Warunki hodowli należy dostosować do innej średnicy wytrząsania.</li>
	<li>Komórki pasażowe 3-4 dni po rozmrożeniu. Sprawdź probówki hodowlane, aby upewnić się, że nie ma oznak zanieczyszczenia; Na przykład grzyb pojawi się jako odbarwiony (lub zielony) pierścień.</li>
	<li>Przygotować 400 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego na próbkę, używając 1 ml paski.</li>
	<li>Szybkie pobieranie komórek zawiesinowych z inkubatora. Natychmiast pobrać 500 μl z probówki za pomocą 1 ml stripette. Delikatnie pipetować w górę i w dół.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do przygotowanej probówki z błękitem trypanowym. Delikatnie odwróć rurkę, aby wymieszać; Nie pipetować w celu wymieszania, ponieważ doprowadzi to do śmierci komórki. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze.</li>
	<li>Pobrać 50 μl zawiesiny komórek poddanej działaniu błękitu trypanowego i nałożyć ją na szkiełko hemocytometru. Policz całkowitą liczbę komórek żywotnych i oblicz ilość zawiesiny komórek i pożywki potrzebnej do przejścia lub transfekcji następnego dnia.</li>
	<li>Podgrzewać pożywkę w inkubatorze przez 10-15 minut. Dodać zawiesinę komórkową do podgrzanego podłoża i wrócić do inkubatora. W przypadku pasażowania komórek przez 3 dni (tj. od poniedziałku do czwartku) ustaw na 0,5 x 106 komórek/ml; dla komórek pasażujących przez 4 dni (tj. od czwartku do poniedziałku), ustaw na 0,3 x 106 komórek/ml. 
	UWAGA: Według producenta, komórki produkcyjne wirusa podwajają się co 26 godzin i powinny wynosić od 3,5 x 106 do 5,5 x 106 przed pasażem. Komórki mogą być przechowywane do przejścia 20.</li>
</ol>
3. Transfekcja
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Po 24 godzinach przed transfekcją posadź 1 x 106 komórek na ml w 300 ml pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2
	<ol>
		<li>Ciepłe podłoże, plazmidy i odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej. Ilości, które należy przygotować, znajdują się w tabeli 1.</li>
		<li>Krótko wirować plazmidy i odczynniki. Dodaj plazmidy do przygotowanego podłoża, wir. Dodaj odczynnik do transfekcji i krótko odwiruj. Nie mieszaj mieszaniny po tym kroku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>W międzyczasie policz komórki przygotowane w dniu 1. Komórki powinny mieć od 2 do 2,5 x 10,6 komórek na ml i > 95% żywotności.</li>
		<li>Po inkubacji, kroplami, dodaj mieszaninę transfekcji do komórek, delikatnie obracając probówkę. Inkubować przez 72-96 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zbieranie komórek
<ol>
	<li>Dzień 5
	<ol>
		<li>Dodać 33 ml 10x buforu do lizy komórek (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2), wymieszać delikatnie wstrząsając i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny z wytrząsaniem.</li>
		<li>Wirować przy 3428 x g w temperaturze 4 °C przez 60 min. Przefiltrować przez filtr próżniowy PES 0,45 μM w celu sklarowania lizatu komórkowego, pozostawiając oczyszczony lizat w pojemniku filtra. 
		UWAGA: Opcjonalnie po filtracji: pobrać 50 μl próbki do ilościowego PCR (Q-PCR).</li>
		<li>Dodać 90 ml 40% roztworu PEG 8000 do 360 ml przefiltrowanego lizatu komórkowego.</li>
		<li>Oczyść mieszadło z 70% etanolem i dodaj do próbki. Mieszać na lodzie lub w chłodni przy 300 obr./min przez 1 godzinę. Inkubować w temperaturze 4 °C bez mieszania przez noc. 
		UWAGA: Przetestowano czas inkubacji od 1 h do 72 h. Dłuższy czas inkubacji ma negatywny wpływ na ogólne wytrącanie białka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Oczyszczanie jodixanolu
<ol>
	<li>Dzień 6
	<ol>
		<li>Przenieść całą próbkę objętości kultury wytrąconej PEG do czystej, dużej stożkowej probówki i odwirować w temperaturze 2820 x g i temperaturze 4°C przez 15 minut.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad PEG w 15 ml DPBS z wapniem i magnezem. Granulka jest trudna do ponownego zawieszenia; Poświęć trochę czasu, aby zrobić to ostrożnie.</li>
		<li>Przenieś zawieszoną część do czystej probówki o pojemności 50 ml. PEG pozostanie po bokach rury bioreaktora. Dodaj dodatkowe 10 ml, uważając, aby zebrać cały osad PEG. Przenieś wszystko do pojemnika o pojemności 50 ml na łączną objętość 25-30 ml.</li>
		<li>Dodać 40 μl DNaseI (10 U/μL). Umieścić w inkubatorze na 1 h 37°C. 
		UWAGA: Opcjonalnie po inkubacji DNazy: pobrać 50 μl próbki do Q-PCR.</li>
		<li>Wyczyść mieszadła, które były używane do wytrącania PEG, dobrze z roztworem chlorku, a następnie 70% etanolem. Pozostaw mieszadła w 70% etanolu do następnego eksperymentu.</li>
		<li>Napełnij probówkę polialomerową o wymiarach 25 mm x 89 mm za pomocą szklanej pipety Pasteura 15,5 ml skoncentrowanego lizatu komórkowego w każdej probówce. Po dodaniu lizatu komórkowego wymień szklaną pipetę Pasteura na nową.</li>
		<li>Dodaj roztwory jodiksanolu od 15% do 60%: delikatnie wlej 9 ml 15% roztworu jodiksanolu pod lizat komórkowy. Następnie dodaj 5 ml 25% i 40% roztworów jodiksanolu, a na koniec dodaj 5 ml 60% roztworu jodiksanolu.</li>
		<li>Uzupełnij rurkę za pomocą strzykawki z DPBS +/+, aby usunąć większość pęcherzyków powietrza, uważając, aby nie naruszyć warstw jodiksanolu. Uszczelnij rurkę za pomocą elektrycznej nakładki na rurkę.</li>
		<li>Wirować w wirniku bez obrotu przez 1 h 10 min przy 490 000 x g w temperaturze 16 °C w ultrawirówce. Wyjmij z ultrawirówki, złóż probówki w metalowym zatrzasku i przygotuj probówki zbiorcze. Otwórz wirnik w masce w przypadku rozlania podczas wirowania.</li>
		<li>Przygotuj jedną probówkę o pojemności 50 ml (do wyrzucenia probówki rotora), jedną probówkę o pojemności 15 ml (do zbierania wirusa), strzykawkę o pojemności 5 ml oraz igłę 30 g i 19 G na gradient.</li>
		<li>Nakłuć otwór w górnej części rurki igłą 30G. Pozostawić igłę na miejscu. Umieścić igłę 19G na strzykawce.</li>
		<li>Ostrożnie przebij rurkę tuż pod granicą faz 40%/60%, którą można zobaczyć za pomocą czerwonego wskaźnika fenolowego. Upewnij się, że skos igły jest skierowany w stronę warstwy 40%.</li>
		<li>Wyjmij igłę 30G z górnej części tubki za pomocą ręki niedominującej. Z igłą ściętą do góry, powoli wyekstrahuj wirusa/jodiksanol. Celem jest ekstrakcja od 3 ml do 4,5 ml. Mniej więcej w połowie i dobrze w warstwie 40%/przezroczystej, obróć igłę, aby skos był skierowany w dół i kontynuuj ekstrakcję, aby uniknąć zbierania się z warstwy białka.</li>
		<li>Przygotować probówkę o pojemności 50 ml ręką niedominującą, ostrożnie wyjąć igłę, umieszczając probówkę w probówce o pojemności 50 ml i wyrzucić. Rozcieńczyć zawiesinę AAV/jodiksanol 5x w DPBS, napełniając do 15 ml.</li>
		<li>Przenieść do odśrodkowej rurki filtracyjnej i odwirować w temperaturze 3428 x g, 4 °C przez 10 minut. Odrzucić przepływ; delikatnie wyjąć uchwyt filtra i przelać dolny pojemnik do butelki na odpady. Dodać 15 ml PBS-5% sacharozy do przefiltrowania i ponownego zawieszenia.</li>
		<li>Wirować przy 3428 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Powtórzyć wymianę buforu co najmniej 3 razy. Przechowywać wirusa (~150-250 μL) w temperaturze 4 °C (PHP. Warianty B maksymalnie 3 miesiące) lub podwielokrotność do 50 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C przez długi czas. 
		UWAGA: PHP. Warianty kapsydu B są wrażliwe na zamrażanie/rozmrażanie, dlatego należy tego unikać.</li>
		<li>Miareczkowanie należy przeprowadzić zgodnie z opisem w poprzednim protokole10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Simplified and Efficient AAV Production Using HEK293 Suspension Culture

<ol><li>Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+of+administration+for+adeno-associated+viruses+carrying+gene+therapies+for+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases.</a> Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).</li>
<li>Pietersz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhP.B+Enhanced+adeno-associated+virus+mediated-expression+following+systemic+delivery+or+direct+brain+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483(2021).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Several+rAAV+vectors+efficiently+cross+the+blood%E2%80%93brain+barrier+and+transduce+neurons+and+astrocytes+in+the+neonatal+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22MolTher%22%5BJournal%5D)">Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system.</a> MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).</li>
<li>Goertsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+variants+with+brain-wide+transgene+expression+and+decreased+liver+targeting+after+intravenous+delivery+in+mouse+and+marmoset%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset.</a> Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).</li>
<li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li>
<li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((purification%2C+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> J Vis Exp. (143), e58960(2019).</li>
<li>Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+dual+promoter+adeno-associated+viral+vector+for+efficient+delivery+of+two+genes+to+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Thr%22%5BJournal%5D)">A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons.</a> Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).</li>
<li>Verhaagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+gene+therapy%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal gene therapy, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).</li>
<li>Nasse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addgene+AAV+data+hub%3A+A+platform+for+sharing+AAV+experimental+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data.</a> Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).</li>
<li>Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+using+suspension+HEK293+cells+and+continuous+harvest+of+vector+from+the+culture+media+for+GMP+FIX+and+FLT1+clinical+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector.</a> Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).</li>
<li>Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+mammalian+cells%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols.</a> Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).</li>
</ol>

Darmowa próbka TransIT została dostarczona przez firmę Mirus do wstępnych testów, po których odczynnik został zakupiony do dalszego wykorzystania. Autorzy nie mają żadnych innych konkurencyjnych interesów finansowych, o których mogliby informować.

Systemowe podawanie AAV jest potężnym narzędziem do transferu genów do OUN; jednak produkcja AAV jest kosztownym i pracochłonnym procesem. Dzięki zastosowaniu komórek zawiesinowych zmniejsza się nakład pracy i tworzywa sztuczne w porównaniu z przylegającą kulturą HEK293T na płytkach o długości15 cm2 . Co więcej, zastosowane tutaj rurki stożkowe są łatwe w obsłudze i maksymalizują wykorzystanie przestrzeni laboratoryjnej. Protokół został opracowany przez dwóch badaczy, a następnie zastosowany przez innych w laboratorium. Seria produkcji przeprowadzona przez trzech niezależnych badaczy przyniosła średnio wystarczającą liczbę wektorów na partię, aby wstrzyknąć 6-7 myszy.
Zastosowanie ogniw zawiesinowych HEK293 zostało opisane wcześniej13,14. Jednak opisana zawiesinowa linia komórkowa nie jest swobodnie dostępna do celów badawczych. Jest to wąskie gardło dla badaczy akademickich przy stosowaniu opisanych metod. Zawiesinowa linia komórkowa opisana w niniejszym protokole jest swobodnie dostępna do celów badawczych. Hodowla komórek zawiesinowych została przeprowadzona w stożkowych probówkach zamiast w probówkach Erlenmeyera, aby zaoszczędzić miejsce i czas. W przypadku Erlenmeyera można hodować do 4 produkcji jednocześnie, w porównaniu z 12 produkcjami przy użyciu rurek stożkowych. Probówki stożkowe można bezpośrednio przenieść do wirówki w celu zbioru.
Jedną z alternatywnych możliwości systemu hodowli komórek zawiesinowych jest układ bakulowirusowy. Zaletą systemu baculo jest to, że te komórki i pożywki są publicznie dostępne i można je łatwo zastosować. Dla naukowców dostępne są repozytoria, takie jak Addgene, zawierające dużą bibliotekę gotowych do użycia plazmidów transferowych AAV12. Chociaż mogą one również zawierać zastrzeżenia, takie jak wadliwe ITR, służą jako dobre źródło eksperymentów typu plug-and-play. Zdecydowano się zachować system produkcyjny oparty na HEK293, ponieważ dostępne plazmidy mogą być bezpośrednio wykorzystane do produkcji bez przenoszenia konstruktu na bakulowirusa.
Do transfekcji polietylenoimina jest stosunkowo tania i dlatego jest odczynnikiem do transfekcji z wyboru. Jako alternatywę oceniono nowatorską metodę transfekcji (TransIt) w celu zwiększenia wydajności wektorów. Zaobserwowano trzykrotną poprawę przy użyciu o połowę mniejszej ilości plazmidów. To sprawia, że TransIt jest interesującym alternatywnym odczynnikiem do transfekcji, gdy potrzebne są większe zapasy. Ograniczeniem tego jest koszt, co czyni go mniej interesującym dla małych partii.
Podsumowując, przedstawiono tutaj protokół, który można wykorzystać do produkcji wysokowydajnego AAV w komórkach zawiesinowych w warunkach laboratorium akademickiego. Opisano narzędzia, które mogą być używane w laboratorium akademickim do produkcji AAV z wysoką wydajnością.

Wirus związany z adenowirusem (AAV) został odkryty w 1965 roku i od tego czasu jest używany w niezliczonych aplikacjach1. AAV zostały zastosowane w badaniach neurobiologicznych do badania funkcji genów i neuronów, mapowania obwodów neurologicznych lub tworzenia modeli zwierzęcych dla choroby2. Tradycyjnie odbywa się to poprzez wstrzyknięcie bezpośrednio w miejsce zainteresowania, ponieważ większość naturalnych serotypów nie przekracza bariery krew-mózg lub potrzebuje do tego dużej dawki1,2,3.
Wraz z odkryciem AAV. PHP. B4 i kapsydy nowej generacji, takie jak AAV. PHP.eB5 oraz AAV. CAP-B106, możliwe jest celowanie w ośrodkowy układ nerwowy (OUN) za pomocą prostego wstrzyknięcia ogólnoustrojowego. Mapowanie przestrzenne ujawnia komórki, na które atakuje AAV. PHP.eB na poziomie komórkowym6,7. W połączeniu ze specyficznymi promotorami/wzmacniaczami, kapsydy te oferują neurobiologom szerokie możliwości badania genów i funkcji mózgu poprzez nieinwazyjne dostarczanie AAV4,8.
Podczas gdy do AAV potrzebna jest niższa dawka. PHP.eB (zazwyczaj 1 do 5 x 1011 kopii genomu (GC)/mysz) w porównaniu do AAV9 (4 x 1012 GC/mysz)7, nadal trzeba wyprodukować więcej wektorów w porównaniu ze strategiami bezpośredniego wstrzykiwania (zwykle 1 x 109 GC/μL iniekcji). Większość naturalnych serotypów można wytworzyć przy użyciu klasycznego systemu hodowli komórek adherentnych w połączeniu z oczyszczaniem jodiksanolu9,10,11,12. Dla AAV. PHP.eB Wiąże się to z pracochłonnym procesem hodowli i transfekcji komórek w celu uzyskania wystarczającej liczby wektorów dla jednego eksperymentu8. W związku z tym opracowano produkcję AAV w hodowli komórek zawiesinowych w probówkach stożkowych. Rurki stożkowe o pojemności do 300 ml są kompaktowe, co pozwala zaoszczędzić zarówno miejsce w inkubatorze, jak i tworzywa sztuczne. Komórki zawiesinowe są znacznie łatwiejsze do hodowli i obróbki w dużych ilościach niż komórki przylegające na płytkach 15 cm. Elementy transfekcji protokołu pozostają takie same. Dlatego plazmidy używane wcześniej z systemem adherent mogą być łatwo wykorzystane w tym protokole opartym na produkcji w komórkach zawiesinowych. Protokół został z powodzeniem przekazany innym badaczom w laboratorium i z powodzeniem wykorzystany do różnych kapsydów i konstruktów.

<table><tbody><tr><td>39 mL, Rurka polipropylenowa okrągła z szybkozłączką, 25 x 89 mm - 50Pk</td><td>Beckman Coulter</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>Adapter 600 mL probówki stożkowe, do rotora S-4x1000,&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5920701002</td><td></td></tr><tr><td>Adapter Plate pasuje do 16 bioreaktorów 600 ml</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>587633</td><td></td></tr><tr><td>Nasadki aerozolowe, do okrągłych wiader 750 ml</td> Wirówka <td>eppendorf</td><td>5820747005</td><td></td></tr><tr><td>5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, z wirnikiem S-4x1000, okrągłymi wiadrami i adapterem 15 mL/50 mL rurki stożkowe</td><td>eppendorf</td><td>5948000315</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>15230147</tr><tr><td>Rekombinowana DNaza I, bez RNaz</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana DNaza I, bez RNaz</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, wapń, magnez</td><td>Gibco</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Jednorazowe filtry PES 0,2</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>FB12566504</tr><tr><td>Fisherbrand Jednorazowe jednostki filtrujące PES 0,45</td><td></td><td></td> Fisher FB12566505 <td></td></tr><tr><td>Uchwyt na probówki hodowlane 50 ml pasuje również do probówki Falcon</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>31362</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do probówki do hodowli komórkowych 600 ml</td><td>Inkubator Infors HT/ TPP</td><td>66129</td><td></td></tr><tr><td>Minitron 50 mm</td><td>Infors HT</td><td>500043</td><td></td></tr><tr><td>LV-MAX Medium produkcyjne</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>A3583401</tr><tr><td>N-Tray Universal</td><td>Infors HT/ TPP</td><td>31321</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep - Iodixanol</td><td>Serumwerk bernburg</td><td>1893</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Liniowy chlorowodorek polietyleniminy klasy transfekcyjnej (MW 40,000)</td><td>Poly-sciences</td><td>24765-100</td><td></td></tr><tr><td>Czerwony roztwór fenolowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72420100</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy) 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-VirusGEN</td><td>Mirus</td><td>Mir 6706</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>5250061</td><td></td></tr><tr><td>Bioreaktory TubeSpin-50ml</td><td>TTP</td><td>87050</td><td></td></tr><tr><td>Bioreaktory TubeSpin-600ml</td><td>TTP</td><td>87600</td><td></td></tr><tr><td>Komórki do produkcji wirusów</td><td>Gibco</td><td>A35347</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 MWCO 100 000</td><td>Cytvia</td><td>28932363</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych hek293

Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells

Wektory wirusowe (AAV) związane z adenowirusem są niezwykłym narzędziem do badania ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Innowacyjne kapsydy, takie jak AAV. PHP.eB, wykazują rozległą transdukcję OUN przez wstrzyknięcie dożylne u myszy. Aby osiągnąć porównywalną transdukcję, potrzebne jest 100-krotnie wyższe miano (minimalnie 1 x10 11 kopii genomu/mysz) w porównaniu z bezpośrednim wstrzyknięciem do miąższu OUN. W naszej grupie produkcja AAV, w tym AAV. PHP.eB opiera się na przylegających komórkach HEK293T i metodzie potrójnej transfekcji. Osiągnięcie wysokiej wydajności AAV z przylegającymi komórkami pociąga za sobą pracochłonny i materiałochłonny proces. To ograniczenie skłoniło do opracowania protokołu hodowli komórek na bazie zawiesiny w stożkowych probówkach. AAV generowane w przylegających komórkach porównano z metodą produkcji zawiesiny. Porównano hodowle w zawiesinie przy użyciu odczynników do transfekcji Polietyleniminy lub TransIt. Wektory AAV oczyszczono przez ultrawirowanie w gradionym jodiksanolu, a następnie wymianę buforu i zagęszczenie za pomocą filtra odśrodkowego. Dzięki metodzie adherentnej uzyskaliśmy średnio 2,6 x 1012 kopii genomu (GC), podczas gdy metoda zawiesinowa i polietylenina dały łącznie 7,7 x 1012 GC, a TransIt łącznie 2,4 x 1013 GC. Nie ma różnicy w skuteczności transdukcji in vivo między wektorami wytwarzanymi z adherentem w porównaniu z systemem komórek zawiesinowych. Podsumowując, wprowadzono protokół produkcji AAV oparty na komórkach zawiesinowych HEK293, co skutkuje zmniejszeniem ilości czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy jednoczesnym osiągnięciu od 3 do 9 razy wyższych plonów przy użyciu komponentów dostępnych u komercyjnych dostawców do celów badawczych.

Większość laboratoriów akademickich wykorzystuje adherentne komórki HEK293T do produkcji AAV8,9. Chociaż metoda ta sprawdza się stosunkowo dobrze, gdy do bezpośredniego wstrzyknięcia potrzebne są niewielkie ilości AAV, do osiągnięcia podobnej transdukcji w przypadku kapsydów systemowych, takich jak AAV.PHP.eB, wymagany jest miano wyższy 100-krotnie (minimum 1 x 1011 GC/mouse).
W niniejszym protokole opracowano metodę produkcji AAV z wykorzystaniem komórek HEK293 w zawiesinie, hodowanych w probówkach stożkowych. Hodowle w małej skali można prowadzić w probówkach o pojemności 50 ml, a w dużej skali w probówkach o pojemności 600 ml. W przypadku określonych inkubatorów orbitalnych (patrz Tabela materiałów), można zastosować statyw, w którym jednocześnie można hodować do 16 dużych probówek. Statyw ten stosuje się w połączeniu ze specjalnymi wkładami do probówek o pojemności 50 ml (Rycina 2A). System ten pozwala na znaczną oszczędność czasu w segmencie hodowli i transfekcji w ramach niniejszego protokołu. Wstępna konfiguracja produkcji została przeprowadzona z wykorzystaniem konstruktów reporterowych dla lucyferazy oraz zielonego białka fluorescencyjnego (GFP).10,11Równolegle otrzymano konstrukt GFP w naczyniach o średnicy 12 i 15 cm2 płytki zgodnie z opisem w wcześniej opublikowanym protokole12Średnia wydajność wynosi 7,7 x 1012 Pełną modyfikację GC osiągnięto przy użyciu polietyleniminy (PEI) i 2,4 x 1013 GC z wykorzystaniem TransIt (Rysunek 2B). W przypadku PEI jest to prawie 3-krotna poprawa; dla TransIt jest to 9,2-krotna poprawa w stosunku do mian uzyskanych w hodowli adherentnej (2,6 x 1012). W przypadku transfekcji komórek w zawiesinie, TransIt zapewnia około 3-krotny wzrost wydajności w porównaniu z PEI (Rycina 2B).
Następnie przetestowano działanie wektorów AAV in vivo. Wektory GFP wytworzono przy użyciu PEI oraz TransIt, a następnie porównano je z wektorami GFP otrzymanymi w klasycznym systemie adherentnym. Po 4 tygodniach od wstrzyknięcia uśmiercono myszy (6-tygodniowe samice szczepu C57BL/6 o masie 20-25 g) i oceniono ekspresję GFP w ich mózgach za pomocą badania histologicznego (Rycina 3A). Analizę porównawczą przeprowadzono na strzałkowych przekrojach mózgu. Nie zaobserwowano różnic w obrazie transdukcji wirusa wytworzonego obiema metodami produkcji (Rycina 3B). Ocecono również aktywność lucyferazy wektorów otrzymanych każdą z metod. Transdukcję mierzono in vivo przez 3 tygodnie; profil ekspresji w czasie był podobny niezależnie od zastosowanego odczynnika do transfekcji (Rycina 4).
Następnie protokół został przetestowany i wdrożony przez innych członków zespołu (Tabela 2). Produkcja innych kapsydów z użyciem PEI przebiegła pomyślnie, dając średnią wydajność 3,5 x 1012 wektorów GC. W przypadku produkcji kapsydów B10 można osiągnąć 3-krotną poprawę, stosując TransIt zamiast PEI. W innym projekcie kilka konstruktów zapakowanych w AAv.PHP.eB dało średnią wydajność 3,7 x 1012, co wystarczy do dożylnego wstrzyknięcia 7 myszy w dawce 5 x 1011 GC na mysz. Wyniki te pokazują, że protokół może być z powodzeniem stosowany przez wielu badaczy dla różnych kombinacji kapsydów i konstruktów.
<img alt="Schemat transfekcji komórek: kroki procesu od wysiewania po oczyszczanie jodiksanolem i koncentrację wirusów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd produkcji. W dniu 1 (D1) komórki są hodowane w probówkach o pojemności 300 mL. W dniu 2 (D2) komórki są transfekowane odpowiednimi plazmidami. W dniu 5 (D5) komórki są zbierane i lizowane przy użyciu 10x buforu do lizy z tweenem. Po lizie szczątki komórkowe są usuwane poprzez wirowanie. Następnie lizat komórkowy jest filtrowany w celu usunięcia dużych białek, a wirus AAV jest wytrącany przy użyciu glikolu polietylenowego (PEG) 8000. W dniu 6 (D6) przeprowadzane jest oczyszczanie jodiksanolem i koncentracja. Koncentrat PEG z dnia poprzedniego jest traktowany DNazą, a następnie poddawany gradientowi jodiksanolowemu. Oczyszczone wektory są następnie odsalane i koncentrowane przy użyciu filtra odśrodkowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Eksperyment z hodowlą komórkową z wykorzystaniem bioreaktora; wykres przedstawia całkowitą wydajność AAV w zależności od metody: adhezyjnej, PEI, TransIT." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Konfiguracja inkubatora i wydajność AAV. (A) Komórki do produkcji wirusowej są hodowane w inkubatorze z wytrząsaniem o średnicy wytrząsania 50 cm. Inkubator ten jest wyposażony w płytę adapterową do probówek 600 mL oraz specjalne wkładki do probówek 50 mL wykonane przez wydział mechatroniki. (B) Po wstępnej konfiguracji zastosowano konstrukty reporterowe, wykorzystując jako metodę transfekcji albo polietylenoiminę (PEI; łącznie 7,7 x 1012 GC, n=5), albo TransIt (łącznie 2,4 x 1013 GC, n=5), i porównano je z wydajnością uzyskaną klasyczną metodą adhezyjną (łącznie 2,6 x 1012 GC, n=5), zgodnie z opisem w Verhaagen et al.12. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces edycji genów, analiza ekspresji GFP, schemat, przygotowanie i wyniki eksperymentu na modelu mysim" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wzorzec ekspresji GFP po ocenie in vivo. (A) Schematyczne przedstawienie typowej konstrukcji wektora AAV zawierającej ubikwitywny promotor: enhancer wczesnego etapu CMV, promotor kurzej β-aktyny oraz miejsce akceptora splicingu królika β-globiny (CAG), po których następują białko GFP (Green fluorescent protein), element regulacyjny potranskrypcyjny wirusa zapalenia wątróby świstaka (WHV) (WPRE) oraz ogon poliadenylacji (pA)13. W tym przypadku 6-tygodniowe samice myszy (n=3) otrzymały wstrzyknięcie do żyły ogonowej zawierające 5 x 1011 całkowitych kopii genomowych (gc) na mysz. 4 tygodnie po wstrzyknięciu myszy uśpiono, a mózgi poddano analizie histologicznej. (B) Reprezentacyjny obraz wzorca transdukcji w przekrojach strzałkowych; przy użyciu przylegających komórek HEK293T oraz komórek w zawiesinie z odczynnikiem transfekcyjnym polietylenoiminą (PEI) lub TransIt zaobserwowano podobny wzorzec transdukcji, niezależnie od zastosowanej metody produkcji. Pasek skali = 1000 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Edycja genów u myszy; obrazowanie bioluminescencyjne; test lucyferazy; schemat eksperymentalny; analiza wykresu słupkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66532/66532fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Podobna aktywność lucyferazy niezależnie od metody transfekcji. (A) Schematyczny rysunek zastosowanej konstrukcji zawierającej powszechny promotor CMV immediate-early enhancer, promotor kurzej β-aktyny oraz miejsce akceptora splicingu króliczej β-globiny (CAG) lucyferazy (LUC) z tagiem V5 i ogonem poliadenylacyjnym hormonu wzrostu bydła (BGHpA); dawkę 5 x 1011 GC całkowite/mysz (n=3) wstrzyknięto do żyły ogonowej, a aktywność lucyferazy w obszarze czaszki (zaznaczona czerwonym okręgiem na zdjęciu przykładowym) mierzono co tydzień za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. (B) Aktywność bioluminescencyjną mierzono jako względne jednostki luminescencji (RLU), przedstawione jako niebieski słupek dla produkcji z użyciem PEI oraz brązowy słupek dla TransIt. Nie zaobserwowano istotnych różnic w aktywności lucyferazy w wybranym obszarze mózgu pomiędzy grupami. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/66532fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Parametry transfekcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/table%201_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Wydajność wdrożonego protokołu. Protokół w zawiesinie stosowany przez innych badaczy do produkcji AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66532/table%202_RE.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, ...

Nasze laboratorium wykorzystuje czynniki wirusowe jako platformę do dostarczania genów terapeutycznych do uszkodzonego układu nerwowego. W ostatnim czasie opracowano wiele nieinwazyjnych czynników wirusowych, które są w stanie przekroczyć barierę krew-mózg. Zastosowanie tych czynników wymaga wysokich mian, a co za tym idzie usprawnienia procesu produkcyjnego.Wdrożenie naszej procedury komórek zawiesinowych HEK293 sprawia, że ten protokół AAV jest mniej pracochłonny w porównaniu z innymi systemami opartymi na komórkach adherentnych, jednocześnie uzyskując wyższą wydajność wektorów AAV. Nie ma metod leczenia naprawy uszkodzeń w ośrodkowym układzie nerwowym. Naszym celem jest wykorzystanie nieinwazyjnych wektorów wirusowych do stymulacji naprawy ośrodkowego układu nerwowego.Zaletą tego protokołu jest to, że możemy teraz produkować wektory wirusowe z dużą wydajnością, co pozwala nam na nieinwazyjne dostarczanie genów terapeutycznych do uszkodzonego ośrodkowego układu nerwowego. Nasze obecne prace utorują drogę do opracowania nieinwazyjnej terapii genowej dla wielu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane, choroba Parkinsona i choroba Alzheimera. Na początek umieść wszystkie materiały potrzebne do hodowli komórek HEK293 w czystym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.Po rozmrożeniu przenieś zawiesinę komórek HEK293 z fiolki na 30-mililitrową, wstępnie podgrzaną pożywkę z komórek zawiesiny w 50-mililitrowej probówce. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności 80%, 8% dwutlenku węgla i 200 obr./min przez trzy do czterech dni. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do 400 mikrolitrów 0,4% roztworu błękitu trypanowego i delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać.Umieścić 50 mikrolitrów zawiesiny komórek poddanych działaniu błękitu trypanowego na szkiełku hemocytometrycznym. Policz całkowitą liczbę żywych komórek i oblicz wymaganą ilość zawiesiny komórek do transfekcji. Dodaj wymaganą ilość zawiesiny komórkowej do wstępnie podgrzanej pożywki zawiesinowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 8% dwutlenkiem węgla.Dodaj 1 milion komórek na mililitr zawiesiny komórek HEK293 w 300 mililitrach zawiesiny komórek zawiesinowych i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 8% dwutlenkiem węgla. Drugiego dnia ogrzej pożywkę z komórkami zawiesiny, plazmidy i odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej. Dodaj plazmidy do przygotowanego podłoża i krótko wiruj.Następnie dodaj odczynnik do transfekcji i ponownie krótko wiruj przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Podczas inkubacji mieszanki transfekcyjnej należy policzyć komórki wyhodowane pierwszego dnia i, jeśli to konieczne, dostosować gęstość komórek w zakresie od dwóch do 2,5 miliona komórek na mililitr. Po 30 minutach, kroplami, dodaj mieszaninę transfekcji do komórek, delikatnie obracając probówkę i inkubuj przez 72 do 96 godzin.Piątego dnia dodaj 33 mililitry 10-krotnego buforu do lizy komórek do komórek i wymieszaj, delikatnie potrząsając. Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny, wstrząsając. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 3,428G w czterech stopniach Celsjusza przez 60 minut.Przefiltrować supernatant przez filtr próżniowy PES o grubości 0,45 mikrona i zebrać oczyszczony lizat do pojemnika filtrującego. Dodaj 90 mililitrów 40% roztworu PEG 8, 000 do 360 mililitrów przefiltrowanego lizatu komórkowego. Dodaj 70% sterylizowany etanolem mieszadło do lizatu komórkowego i mieszaj z prędkością 300 obr./min na lodzie lub w chłodnym pomieszczeniu przez godzinę.Następnie inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez mieszania. Na początek przenieś całą wytrąconą przez PEG kulturę wirusa HEK293 związanego z adenowirusem do dużej stożkowej probówki. Odwirować kulturę w temperaturze 2,820G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 mililitrach PBS z wapniem i magnezem. Przenieś zawieszoną część do 50-mililitrowej rurki. Dodaj 10 mililitrów PBS, aby zebrać pozostały osad PEG i przenieś wszystko do 50-mililitrowej probówki.Następnie dodaj 40 mikrolitrów DNazy 1 i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą szklanej pipety Pasteura napełnij probówkę polialomerową o wymiarach 25 milimetrów na 89 milimetrów 15,5 mililitrami skoncentrowanego lizatu komórkowego. Używając nowej szklanej pipety Pasteura, delikatnie wlej dziewięć mililitrów 15% roztworu jodu pod lizat komórkowy.Następnie dodaj pięć mililitrów 25% i 40% roztworów joduksanolu. I na koniec dodaj pięć mililitrów 60% roztworu joduksanolu. Użyj strzykawki, aby uzupełnić probówkę PBS, upewniając się, że większość pęcherzyków powietrza została usunięta bez naruszania warstw jodixanolu.Uszczelnij rurkę za pomocą elektrycznej nakładki na rurkę. Sprawdzić, czy różne warstwy gradientu jodiksanolu są wyraźnie widoczne. Odwirować probówki za pomocą wirnika bez obrotu o temperaturze 490 000 G przez godzinę i 10 minut w temperaturze 16 stopni Celsjusza.Po odwirowaniu złóż probówki w metalowym zapięciu. Podłączyć igłę o rozmiarze 19 do strzykawki. Następnie wykonaj nakłucie w górnej części rurki za pomocą igły o rozmiarze 30, pozostawiając włożoną igłę.Ostrożnie przebij rurkę tuż poniżej granicy faz 40%60%jodiksanolu, jak wskazuje czerwony wskaźnik fenolu. Upewnij się, że skos igły jest skierowany w stronę warstwy 40%. Wyjąć igłę o rozmiarze 30 ręką niedominującą, powoli ekstrahując mieszaninę jodiksanolu wirusa.Mniej więcej do połowy obróć igłę, aby skos był skierowany w dół, i kontynuuj ekstrakcję, unikając zbierania z warstwy białka. Po ekstrakcji natychmiast przenieś probówkę ultrawirówki do probówki o pojemności 50 mililitrów, aby ją wyrzucić. Dodaj zebraną zawiesinę jodiksanolu AAV do 15-mililitrowej probówki i rozcieńcz ją pięciokrotnie w PBS, wypełniając do 15 mililitrów.Przenieść zawiesinę do odśrodkowej rurki filtracyjnej i odwirować przy 3,428G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu przepływu, dodać 15 mililitrów PBS 5% sacharozy do filtratu i ponownie zawiesić. Zebrać skoncentrowany AAV z odśrodkowej rurki filtracyjnej.Na koniec należy przechowywać porcję wirusa w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy.

production-high-yield-adeno-associated-vector-batches-using-hek293

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wektory rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAVs) stają się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach. Opisujemy, w jaki sposób rAAVs mogą być produkowane w laboratorium oraz jak można oznaczać miano tych wektorów, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wyprodukowanych cząstek zakaźnych.

Produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV)

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Przedstawiono protokół generowania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności, pozbawionych wszystkich sekwencji kodujących wirusy. Klonowanie transgenów zawartych w genomie wektora opiera się na endonukleazach naprowadzających. Amplifikacja wirusa w komórkach produkcyjnych hodowanych jako komórki adherentne i w zawiesinie opiera się na wirusie pomocniczym dostarczającym geny wirusowe w trans.

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj prezentujemy protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu pAdEasy. Technologia obejmuje rekombinację plazmidów pAdTrack i pAdEasy-1, pakowanie i amplifikację adenowirusa, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, miareczkowanie wirusa oraz testowanie funkcjonalne adenowirusa.

Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.

Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych

W tym filmie opisujemy metodę obrazowania żywych komórek w celu obserwacji asymetrycznego podziału komórek progenitorowych organów sensorycznych oraz komórek epidermy w nienaruszonych poczwarkach...

Obrazowanie żywych komórek prekursorowych organów zmysłowych w nienaruszonych poczwarkach Drosophila

Poznaj protokół produkcji wektorów AAV w komórkach HEK293 w zawiesinie, który zwiększa wydajność i redukuje nakład pracy w terapii genowej układu nerwowego.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Przeglądaj więcej filmów