Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293
26 kwietnia 2024
Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.
Nasze laboratorium wykorzystuje czynniki wirusowe jako platformę do dostarczania genów terapeutycznych do uszkodzonego układu nerwowego. W ostatnim czasie opracowano wiele nieinwazyjnych czynników wirusowych, które są w stanie przekroczyć barierę krew-mózg. Zastosowanie tych czynników wymaga wysokich mian, a co za tym idzie usprawnienia procesu produkcyjnego.
Wdrożenie naszej procedury komórek zawiesinowych HEK293 sprawia, że ten protokół AAV jest mniej pracochłonny w porównaniu z innymi systemami opartymi na komórkach adherentnych, jednocześnie uzyskując wyższą wydajność wektorów AAV. Nie ma metod leczenia naprawy uszkodzeń w ośrodkowym układzie nerwowym. Naszym celem jest wykorzystanie nieinwazyjnych wektorów wirusowych do stymulacji naprawy ośrodkowego układu nerwowego.
Zaletą tego protokołu jest to, że możemy teraz produkować wektory wirusowe z dużą wydajnością, co pozwala nam na nieinwazyjne dostarczanie genów terapeutycznych do uszkodzonego ośrodkowego układu nerwowego. Nasze obecne prace utorują drogę do opracowania nieinwazyjnej terapii genowej dla wielu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane, choroba Parkinsona i choroba Alzheimera. Na początek umieść wszystkie materiały potrzebne do hodowli komórek HEK293 w czystym kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
Po rozmrożeniu przenieś zawiesinę komórek HEK293 z fiolki na 30-mililitrową, wstępnie podgrzaną pożywkę z komórek zawiesiny w 50-mililitrowej probówce. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności 80%, 8% dwutlenku węgla i 200 obr./min przez trzy do czterech dni. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do 400 mikrolitrów 0,4% roztworu błękitu trypanowego i delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać.
Umieścić 50 mikrolitrów zawiesiny komórek poddanych działaniu błękitu trypanowego na szkiełku hemocytometrycznym. Policz całkowitą liczbę żywych komórek i oblicz wymaganą ilość zawiesiny komórek do transfekcji. Dodaj wymaganą ilość zawiesiny komórkowej do wstępnie podgrzanej pożywki zawiesinowej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 8% dwutlenkiem węgla.
Dodaj 1 milion komórek na mililitr zawiesiny komórek HEK293 w 300 mililitrach zawiesiny komórek zawiesinowych i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 8% dwutlenkiem węgla. Drugiego dnia ogrzej pożywkę z komórkami zawiesiny, plazmidy i odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej. Dodaj plazmidy do przygotowanego podłoża i krótko wiruj.
Następnie dodaj odczynnik do transfekcji i ponownie krótko wiruj przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Podczas inkubacji mieszanki transfekcyjnej należy policzyć komórki wyhodowane pierwszego dnia i, jeśli to konieczne, dostosować gęstość komórek w zakresie od dwóch do 2,5 miliona komórek na mililitr. Po 30 minutach, kroplami, dodaj mieszaninę transfekcji do komórek, delikatnie obracając probówkę i inkubuj przez 72 do 96 godzin.
Piątego dnia dodaj 33 mililitry 10-krotnego buforu do lizy komórek do komórek i wymieszaj, delikatnie potrząsając. Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny, wstrząsając. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 3,428G w czterech stopniach Celsjusza przez 60 minut.
Przefiltrować supernatant przez filtr próżniowy PES o grubości 0,45 mikrona i zebrać oczyszczony lizat do pojemnika filtrującego. Dodaj 90 mililitrów 40% roztworu PEG 8, 000 do 360 mililitrów przefiltrowanego lizatu komórkowego. Dodaj 70% sterylizowany etanolem mieszadło do lizatu komórkowego i mieszaj z prędkością 300 obr./min na lodzie lub w chłodnym pomieszczeniu przez godzinę.
Następnie inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez mieszania. Na początek przenieś całą wytrąconą przez PEG kulturę wirusa HEK293 związanego z adenowirusem do dużej stożkowej probówki. Odwirować kulturę w temperaturze 2,820G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 mililitrach PBS z wapniem i magnezem. Przenieś zawieszoną część do 50-mililitrowej rurki. Dodaj 10 mililitrów PBS, aby zebrać pozostały osad PEG i przenieś wszystko do 50-mililitrowej probówki.
Następnie dodaj 40 mikrolitrów DNazy 1 i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą szklanej pipety Pasteura napełnij probówkę polialomerową o wymiarach 25 milimetrów na 89 milimetrów 15,5 mililitrami skoncentrowanego lizatu komórkowego. Używając nowej szklanej pipety Pasteura, delikatnie wlej dziewięć mililitrów 15% roztworu jodu pod lizat komórkowy.
Następnie dodaj pięć mililitrów 25% i 40% roztworów joduksanolu. I na koniec dodaj pięć mililitrów 60% roztworu joduksanolu. Użyj strzykawki, aby uzupełnić probówkę PBS, upewniając się, że większość pęcherzyków powietrza została usunięta bez naruszania warstw jodixanolu.
Uszczelnij rurkę za pomocą elektrycznej nakładki na rurkę. Sprawdzić, czy różne warstwy gradientu jodiksanolu są wyraźnie widoczne. Odwirować probówki za pomocą wirnika bez obrotu o temperaturze 490 000 G przez godzinę i 10 minut w temperaturze 16 stopni Celsjusza.
Po odwirowaniu złóż probówki w metalowym zapięciu. Podłączyć igłę o rozmiarze 19 do strzykawki. Następnie wykonaj nakłucie w górnej części rurki za pomocą igły o rozmiarze 30, pozostawiając włożoną igłę.
Ostrożnie przebij rurkę tuż poniżej granicy faz 40%60%jodiksanolu, jak wskazuje czerwony wskaźnik fenolu. Upewnij się, że skos igły jest skierowany w stronę warstwy 40%. Wyjąć igłę o rozmiarze 30 ręką niedominującą, powoli ekstrahując mieszaninę jodiksanolu wirusa.
Mniej więcej do połowy obróć igłę, aby skos był skierowany w dół, i kontynuuj ekstrakcję, unikając zbierania z warstwy białka. Po ekstrakcji natychmiast przenieś probówkę ultrawirówki do probówki o pojemności 50 mililitrów, aby ją wyrzucić. Dodaj zebraną zawiesinę jodiksanolu AAV do 15-mililitrowej probówki i rozcieńcz ją pięciokrotnie w PBS, wypełniając do 15 mililitrów.
Przenieść zawiesinę do odśrodkowej rurki filtracyjnej i odwirować przy 3,428G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu przepływu, dodać 15 mililitrów PBS 5% sacharozy do filtratu i ponownie zawiesić. Zebrać skoncentrowany AAV z odśrodkowej rurki filtracyjnej.
Na koniec należy przechowywać porcję wirusa w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół produkcji AAV w oparciu o zawiesinę komórek HEK293, mający na celu usprawnienie dostarczania genów terapeutycznych do uszkodzonego układu nerwowego. Protokół ten skraca czas i zmniejsza nakład pracy potrzebny do produkcji wektora, jednocześnie zwiększając wydajność w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Neuronauka
- Produkcja wektorów wirusowych
Wstęp
- Obecne metody leczenia uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego są ograniczone.
- Do skutecznego dostarczania genów wymagane są wysokie miana wektorów wirusowych.
- Istniejące metody często charakteryzują się niską wydajnością i ograniczoną skalowalnością.
- Celem badania jest usprawnienie nieinwazyjnych podejść do terapii genowej.
Cel badania
- Opracowanie wydajnego pod względem nakładów pracy protokołu produkcji AAV.
- Uzyskanie wysokich wydajności, które mogą wspierać zastosowania terapeutyczne.
- Rozwój nieinwazyjnych metod leczenia chorób neurodegeneracyjnych.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano komórki HEK293 w systemie hodowli w zawiesinie.
- Wytworzono i wyizolowano wektory wirusów towarzyszących adenowirusom (AAV).
- Kluczowe etapy obejmowały rozmrażanie komórek, transfekcję oraz odzyskiwanie wirusa poprzez ultrawirowanie.
- Przedstawiono szczegółowe ramy czasowe dla każdego kroku eksperymentalnego, co wykazało wysoką wydajność procesu.
- Odnotowano korekty protokołu w celu zapewnienia optymalnej gęstości komórek i uzysku.
Główne wyniki
- Protokół wykazał zwiększoną wydajność AAV oraz zmniejszenie nakładu pracy w porównaniu z metodami standardowymi.
- Skuteczna produkcja wektorów wirusowych ułatwia dostarczanie genów niezbędne do regeneracji układu nerwowego.
- Kluczowe wnioski podkreślają potencjał w zakresie skutecznego zwalczania chorób neurodegeneracyjnych.
Wnioski
- Niniejsza çalışma podkreśla możliwość wykorzystania komórek HEK293 w zawiesinie do wydajnej produkcji wektorów wirusowych.
- Opisany protokół otwiera drogę do przyszłych opracowań terapeutycznych w zakresie dostarczania genów w przypadku uszkodzeń OUN.
- Implikacje obejmują potencjalne metody leczenia chorób takich jak stwardnienie rozsiane, choroba Parkinsona i choroba Alzheimera.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokowydajna produkcja AAV z wykorzystaniem komórek HEK293 w zawiesinie rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w skalowalnych dostawach wektorów do terapii genowej dla badań nad OUN oraz programów przedklinicznych. Niniejszy protokół umożliwia efektywne i powtarzalne generowanie partii AAV przy zmniejszonym nakładzie pracy i czasu, co wspiera szybką iterację i rozszerzanie portfolio w odkrywaniu neuroterapeutyków. Podejście to ma bezpośredni wpływ na dostępność wektorów dla badań nad nieinwazyjnym dostarczaniem oraz ciągłość procesu translacyjnego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia stabilne dostarczanie wektorów AAV do badania celów w OUN w oparciu o postawione hipotezy.
- Wspiera walidację funkcjonalną strategii dostarczania genów w modelach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie spójnej jakości i miana wektora.
Przesiewy i rozwój analizy
- Zapewnia standaryzowane zapasy AAV o wysokim mianie do opracowania i optymalizacji testów.
- Poprawia powtarzalność i skalowalność procesów przesiewowych in vitro i in vivo.
- Umożliwia wiarygodne porównanie wydajności transdukcji pomiędzy partiami wektorów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje produkcję wektorów do wymagań dotyczących badań nad nieinwazyjnym dostarczaniem do OUN.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez gwarantowanie spójności między partiami.
- Zmniejsza bariery operacyjne w rozwoju kandydatów do terapii genowej w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół produkcji AAV w zawiesinie integruje się z continuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając szybkie dostarczanie wektorów do identyfikacji głównych kandydatów oraz badań translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i analizę szlaków sygnałowych poprzez zapewnienie wystarczającej ilości wektora dla wielu wariantów doświadczalnych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki AAV do standaryzacji testów i oceny związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia precyzyjny pomiar wydajności wektora i efektywności transdukcji w celu podejmowania decyzji w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Zapewnia dostępność wektora do dostarczania do OUN in vivo oraz do badań nad dopasowaniem biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy skalowalną, wielokrotnego użytku platformę do produkcji AAV na potrzeby różnych programów badawczych.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad dostarczaniem genów poprzez minimalizację zmienności między partiami.
- Wartość operacyjna: Usprawnia produkcję wektorów, redukując koszty pracy i materiałów przy jednoczesnym zwiększeniu wydajności.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki szybkim dostawom wysokiej jakości wektorów dla wielu projektów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów terapii genowej celowanej w OUN.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek w zawiesinie oraz optymalizacji transfekcji.
- Wymaga dostępu do infrastruktury ultrawirowania i filtracji w celu oczyszczania wektora.
- Wymaga standaryzacji gęstości komórek i parametrów transfekcji pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych serotypów i kapsydów AAV poprzez dostosowanie protokołu.
- Zależne od uważnego monitorowania żywotności komórek i wydajności podczas całego procesu produkcji.
