Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego
May 17th, 2024
Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.
Mój projekt badawczy koncentruje się na scharakteryzowaniu dynamiki, morfologii i funkcji mikrogleju w pierwszym tygodniu rozwoju embrionalnego danio pręgowanego. Mikroglej jest bardzo dynamicznym komórkiem i uważamy, że głębsza charakterystyka ich wzorców zachowań i zmian morfologicznych może dać nam interesujący wgląd w proces ich dojrzewania i aktywność w rozwijającym się mózgu. Głównym wyzwaniem w tego typu obrazowaniu jest uchwycenie wielu kanałów o wysokiej jakości i doskonałej rozdzielczości tymczasowej.
Jednak postęp w technologii konfokalnej pozwala nam skutecznie sprostać temu wyzwaniu. Wierzymy, że nasz protokół jest potężnym narzędziem, które może ułatwić charakterystykę dynamiki mikrogleju w różnych warunkach. Obejmuje to nie tylko różne etapy rozwoju, ale także bardzo płynne podłoże, w którym homeostaza mikrogleju jest zagrożona.
Na początek należy uzyskać znieczulone zarodki danio pręgowanego w buforze E3. Po wybraniu zarodków o pożądanej fluorescencji, wizualizuj ich bicie serca pod mikroskopem stereoskopowym w jasnym polu. Za pomocą pipety transferowej z szeroką końcówką pobrać do trzech zarodków i przenieść je na dolną szklaną płytkę obrazową.
Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą pipety, zastąp podłoże wokół zarodków 1% niskotopliwym roztworem agao. Za pomocą plastikowej, cienkiej, zwężającej się końcówki przymocowanej do igły do drażnienia, delikatnie dociśnij każdy zarodek do dna płytki obrazowej i ustaw stronę grzbietową w kierunku szkła. Zamontuj zarodek w odwróconym mikroskopie konfokalnym.
Po ustawieniu parametrów akwizycji poklatkowej uzyskaj obrazy. Otwórz oprogramowanie do konwersji plików Imaris, a następnie przeciągnij i upuść pliki do obszaru wprowadzania. W menu wyjściowym wyznacz lokalizację przekonwertowanych plików.
Kliknij Ustaw rozmiar woksela, aby zweryfikować i naciśnij przycisk Rozpocznij wszystko, aby rozpocząć konwersję pliku do formatu IMS. Po uruchomieniu pozwól oprogramowaniu analitycznemu uruchomić się na arenie. Kliknij Obserwuj folder, aby otworzyć wcześniej przekonwertowany plik.
Po załadowaniu pliku do oprogramowania kliknij widok plasterków, aby przewinąć stos c. Za pomocą suwaka na pasku narzędzi plasterków zmierz średnice komórek po narysowaniu średnicy zaznaczonych komórek za pomocą wskaźnika. Kliknij i przeciągnij myszą, aby narysować segment obejmujący rdzeń komórki i obserwować długość segmentu narysowanego na pasku narzędzi miary znajdującym się po prawej stronie obszaru obserwacji.
Aby automatycznie wykryć komórki, wróć do widoku 3D i kliknij ikonę punktu na pasku narzędzi obiektu, aby dodać nowy obiekt plam na liście obiektów i otwórz kreatora automatycznego tworzenia plam. W pierwszym kroku kreatora zaznacz opcję, aby podzielić na segmenty tylko interesujący Cię obszar. Następnie włącz opcję śledzenia miejsc w godzinach nadliczbowych, aby obliczyć dane śledzenia, a także obiektywne statystyki obiektów, aby umożliwić porównanie miejsc i rozszerzyć zakres danych.
Kliknij przycisk Dalej w prawym dolnym rogu okna kreatora. Określ obszar zainteresowania lub obszar ROI, który otacza tektum wzrokowe zarodka. Kliknij i przeciągnij małe białe strzałki znajdujące się na każdej powierzchni, aby zmodyfikować rozmiar ROI.
Następnie rozszerz go na wszystkie nagrane klatki z regulacjami interwałów czasowych. Następnie wybierz kanał źródłowy i ustaw uzyskany wcześniej pomiar średnicy ogniwa jako szacowaną średnicę XY. Włącz opcję odejmowania tła i kliknij Dalej.
Wprowadź wartości progowe intensywności bezpośrednio w dolnych i górnych polach progowych, aby zapewnić wykrycie wszystkich komórek. Kliknij Obszar widoku, aby obserwować wszystkie te zmiany w czasie rzeczywistym. Po spełnieniu oczekiwań kliknij przycisk Dalej, aby zatwierdzić wybrany próg jakości i kliknij przycisk Obszar widoku, aby wyświetlić miejsca spełniające te dwa parametry nałożone na kanał źródłowy.
Następnie wybierz ruch autoagresywny jako algorytm śledzenia, aby śledzić komórki, które mają mniej więcej ciągły ruch. Obserwuj ruch punktów między dwiema klatkami, aby ocenić najdłuższą odległość, na jaką komórka przemieszcza się między dwoma punktami czasu, i wprowadź szacowaną liczbę w polu maksymalnej odległości. Aby ustawić maksymalny rozmiar odstępu, jeśli interwał między klatkami jest krótszy niż 60 sekund, użyj rozmiaru trzech, a w przypadku dłuższych interwałów czasu zwiększ go sam.
Włącz wypełnianie luk wszystkimi wykrytymi obiektami, aby obniżyć próg wykrywania i połączyć ścieżki. Następnie kliknij Dalej i pozwól oprogramowaniu automatycznie wygenerować ścieżki dla wszystkich wcześniej wygenerowanych spotów. Jeśli uzyskane ścieżki są liczne lub rozdrobnione, wróć do kreatora tworzenia za pomocą przycisku Poprzedni i dostosuj wcześniej zdefiniowaną maksymalną odległość.
Aby wykluczyć ścieżki krótsze niż trzy do ośmiu minut, wprowadź wartość bezpośrednio w polu danych dla dolnego limitu filtru czasu trwania ścieżki. Kliknij Dalej, aby zatwierdzić filtr i przejść do kreatora tworzenia. Ręcznie usuń z analizy ślady wygenerowane przez makrofagi skórne, aby skupić się na mikrogleju miąższowym mózgu.
Korzystając z edytora tras, ręcznie popraw inne potencjalne błędy na trasach. Po prawej stronie obszaru widoku aktywuj przycisk trybu wyboru okręgu i podświetl utwory, które wymagają modyfikacji lub regulacji. Po wybraniu problematycznej ścieżki, za pomocą przycisków łączenia i rozłączania, edytuj ją, aby poprawnie reprezentowała ruchy komórki.
W edytorze tras wybierz tryb wyboru okręgu, aby usunąć zduplikowane pojedyncze punkty. W przypadku stosowania reportera mikrogleju z innymi znakowanymi fluorescencyjnie komórkami miąższowymi, dostosuj szacowaną średnicę XY i maksymalną odległość do nowej populacji komórek. Zmodyfikuj wejście kanału źródłowego do obrazu.
Na koniec, korzystając z zakładki statystyki, wyodrębnij żądane statystyki śledzenia. Kliknij przycisk ustawień i wybierz statystyki do obliczeń dla każdego wcześniej utworzonego obiektu punktowego lub obiektu powierzchniowego. Mózg embrionalnego danio pręgowanego został zobrazowany w całości, a lokalizacja neuronów względem mikrogleju została zobrazowana.
Dane przestrzenne uzyskane za pomocą tego protokołu przedstawiają średnią prędkość komórek mikrogleju, średnią odległość, jaką pokonują w ciągu jednej godziny, ich średnie przemieszczenie kwadratowe oraz ich rozmieszczenie w przestrzeni w różnych momentach.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę do obrazowania na żywo komórek mikrogleju w rozwijającym się tectum opticum rybki klasterowej za pomocą szybkiej mikroskopii konfokalnej skanującej. Podejście to umożliwia analizę w czasie rzeczywistym dynamiki mikrogleju in vivo w trakcie rozwoju embrionalnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Tło
- Mikroglej to dynamiczne komórki, kluczowe dla rozwoju mózgu.
- Zrozumienie ich zachowania może dać wgląd w dojrzewanie mózgu.
- Postępy w mikroskopii konfokalnej poprawiają możliwości obrazowania.
- Wyzwania obejmują rejestrowanie wysokiej jakości obrazów na wielu kanałach.
Cel badania
- Scharakteryzowanie dynamiki i morfologii mikrogleju podczas rozwoju embrionalnego rybki klasterowej.
- Opracowanie protokołu skutecznego obrazowania mikrogleju.
- Ułatwienie badania zachowania mikrogleju na różnych etapach rozwoju.
Zastosowanie metod
- Zastosowanie znieczulonych zarodków rybki klasterowej w buforze E3 do obrazowania.
- Zastosowanie 1% niskotopliwego agaru do stabilizacji zarodków.
- Zdjęcia time-lapse za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego.
- Analiza obrazów za pomocą oprogramowania Imaris do śledzenia komórek mikrogleju.
Główne wyniki
- Skuteczna rejestracja komórek mikrogleju w tectum opticum.
- Charakteryzacja ruchu i morfologii mikrogleju na przestrzeni czasu.
- Wgląd w średnią prędkość i przebywaną odległość przez mikroglej.
- Wizualizacja interakcji mikrogleju z neuronami w rozwijającym się mózgu.
Wnioski
- Opracowany protokół jest cennym narzędziem do badania dynamiki mikrogleju.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia ról mikrogleju w rozwoju mózgu.
- Możliwe zastosowania w różnych ustawieniach badawczych dotyczących mikrogleju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Live imaging and quantitative tracking of microglia dynamics in zebrafish embryos enables high-resolution interrogation of innate immune cell behavior during early brain development. This approach supports predictive confidence in neuroinflammation models and informs target validation for neuroimmune-modulating therapeutics. The protocol's integration of advanced imaging and automated analysis positions it as a reusable capability for early discovery and mechanistic de-risking in CNS drug pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of microglial migration and maturation in a vertebrate system.
- Supports functional target validation by quantifying cell motility and spatial distribution.
- Facilitates mechanistic de-risking of neuroimmune pathways relevant to CNS disorders.
- Provides high-content data for hypothesis-driven interrogation of microglial roles in development.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated, reproducible imaging workflow for microglial tracking in vivo.
- Generates quantitative outputs such as migration speed and displacement for assay standardization.
- Enables screening of genetic or pharmacological perturbations affecting microglial dynamics.
- Supports platform scalability and reuse across developmental and disease-relevant contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microglial behavior metrics with translational biomarkers of neuroinflammation.
- Provides continuity from discovery-stage imaging to preclinical model validation.
- Informs risk-adjusted advancement of neuroimmune targets based on in vivo functional data.
- Supports predictive de-risking for CNS therapeutic portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling quantitative, live-cell imaging of microglia in a transparent vertebrate model. It supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking for neuroimmune targets.
- Discovery Biology: Quantifies microglial migration, maturation, and spatial distribution to clarify developmental pathways.
- Screening: Provides standardized, reproducible imaging and tracking outputs for compound or genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative readouts such as mean speed, displacement, and cell distribution for robust condition comparison.
- Translational Research: Aligns in vivo microglial metrics with preclinical biomarker strategies in CNS disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for diverse neuroimmune research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage in CNS discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroimmune targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and live zebrafish embryo handling.
- Depends on access to advanced imaging platforms and IMARIS analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data analysis workflows.
- Adaptable to other fluorescent reporter lines and developmental stages with protocol adjustments.
- Limited to transparent, externally developing model systems for optimal imaging quality.
