Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Mój projekt badawczy koncentruje się na scharakteryzowaniu dynamiki, morfologii i funkcji mikrogleju w pierwszym tygodniu rozwoju embrionalnego danio pręgowanego. Mikroglej jest bardzo dynamicznym komórkiem i uważamy, że głębsza charakterystyka ich wzorców zachowań i zmian morfologicznych może dać nam interesujący wgląd w proces ich dojrzewania i aktywność w rozwijającym się mózgu. Głównym wyzwaniem w tego typu obrazowaniu jest uchwycenie wielu kanałów o wysokiej jakości i doskonałej rozdzielczości tymczasowej.

Jednak postęp w technologii konfokalnej pozwala nam skutecznie sprostać temu wyzwaniu. Wierzymy, że nasz protokół jest potężnym narzędziem, które może ułatwić charakterystykę dynamiki mikrogleju w różnych warunkach. Obejmuje to nie tylko różne etapy rozwoju, ale także bardzo płynne podłoże, w którym homeostaza mikrogleju jest zagrożona.

Na początek należy uzyskać znieczulone zarodki danio pręgowanego w buforze E3. Po wybraniu zarodków o pożądanej fluorescencji, wizualizuj ich bicie serca pod mikroskopem stereoskopowym w jasnym polu. Za pomocą pipety transferowej z szeroką końcówką pobrać do trzech zarodków i przenieść je na dolną szklaną płytkę obrazową.

Pod mikroskopem stereoskopowym, za pomocą pipety, zastąp podłoże wokół zarodków 1% niskotopliwym roztworem agao. Za pomocą plastikowej, cienkiej, zwężającej się końcówki przymocowanej do igły do drażnienia, delikatnie dociśnij każdy zarodek do dna płytki obrazowej i ustaw stronę grzbietową w kierunku szkła. Zamontuj zarodek w odwróconym mikroskopie konfokalnym.

Po ustawieniu parametrów akwizycji poklatkowej uzyskaj obrazy. Otwórz oprogramowanie do konwersji plików Imaris, a następnie przeciągnij i upuść pliki do obszaru wprowadzania. W menu wyjściowym wyznacz lokalizację przekonwertowanych plików.

Kliknij Ustaw rozmiar woksela, aby zweryfikować i naciśnij przycisk Rozpocznij wszystko, aby rozpocząć konwersję pliku do formatu IMS. Po uruchomieniu pozwól oprogramowaniu analitycznemu uruchomić się na arenie. Kliknij Obserwuj folder, aby otworzyć wcześniej przekonwertowany plik.

Po załadowaniu pliku do oprogramowania kliknij widok plasterków, aby przewinąć stos c. Za pomocą suwaka na pasku narzędzi plasterków zmierz średnice komórek po narysowaniu średnicy zaznaczonych komórek za pomocą wskaźnika. Kliknij i przeciągnij myszą, aby narysować segment obejmujący rdzeń komórki i obserwować długość segmentu narysowanego na pasku narzędzi miary znajdującym się po prawej stronie obszaru obserwacji.

Aby automatycznie wykryć komórki, wróć do widoku 3D i kliknij ikonę punktu na pasku narzędzi obiektu, aby dodać nowy obiekt plam na liście obiektów i otwórz kreatora automatycznego tworzenia plam. W pierwszym kroku kreatora zaznacz opcję, aby podzielić na segmenty tylko interesujący Cię obszar. Następnie włącz opcję śledzenia miejsc w godzinach nadliczbowych, aby obliczyć dane śledzenia, a także obiektywne statystyki obiektów, aby umożliwić porównanie miejsc i rozszerzyć zakres danych.

Kliknij przycisk Dalej w prawym dolnym rogu okna kreatora. Określ obszar zainteresowania lub obszar ROI, który otacza tektum wzrokowe zarodka. Kliknij i przeciągnij małe białe strzałki znajdujące się na każdej powierzchni, aby zmodyfikować rozmiar ROI.

Następnie rozszerz go na wszystkie nagrane klatki z regulacjami interwałów czasowych. Następnie wybierz kanał źródłowy i ustaw uzyskany wcześniej pomiar średnicy ogniwa jako szacowaną średnicę XY. Włącz opcję odejmowania tła i kliknij Dalej.

Wprowadź wartości progowe intensywności bezpośrednio w dolnych i górnych polach progowych, aby zapewnić wykrycie wszystkich komórek. Kliknij Obszar widoku, aby obserwować wszystkie te zmiany w czasie rzeczywistym. Po spełnieniu oczekiwań kliknij przycisk Dalej, aby zatwierdzić wybrany próg jakości i kliknij przycisk Obszar widoku, aby wyświetlić miejsca spełniające te dwa parametry nałożone na kanał źródłowy.

Następnie wybierz ruch autoagresywny jako algorytm śledzenia, aby śledzić komórki, które mają mniej więcej ciągły ruch. Obserwuj ruch punktów między dwiema klatkami, aby ocenić najdłuższą odległość, na jaką komórka przemieszcza się między dwoma punktami czasu, i wprowadź szacowaną liczbę w polu maksymalnej odległości. Aby ustawić maksymalny rozmiar odstępu, jeśli interwał między klatkami jest krótszy niż 60 sekund, użyj rozmiaru trzech, a w przypadku dłuższych interwałów czasu zwiększ go sam.

Włącz wypełnianie luk wszystkimi wykrytymi obiektami, aby obniżyć próg wykrywania i połączyć ścieżki. Następnie kliknij Dalej i pozwól oprogramowaniu automatycznie wygenerować ścieżki dla wszystkich wcześniej wygenerowanych spotów. Jeśli uzyskane ścieżki są liczne lub rozdrobnione, wróć do kreatora tworzenia za pomocą przycisku Poprzedni i dostosuj wcześniej zdefiniowaną maksymalną odległość.

Aby wykluczyć ścieżki krótsze niż trzy do ośmiu minut, wprowadź wartość bezpośrednio w polu danych dla dolnego limitu filtru czasu trwania ścieżki. Kliknij Dalej, aby zatwierdzić filtr i przejść do kreatora tworzenia. Ręcznie usuń z analizy ślady wygenerowane przez makrofagi skórne, aby skupić się na mikrogleju miąższowym mózgu.

Korzystając z edytora tras, ręcznie popraw inne potencjalne błędy na trasach. Po prawej stronie obszaru widoku aktywuj przycisk trybu wyboru okręgu i podświetl utwory, które wymagają modyfikacji lub regulacji. Po wybraniu problematycznej ścieżki, za pomocą przycisków łączenia i rozłączania, edytuj ją, aby poprawnie reprezentowała ruchy komórki.

W edytorze tras wybierz tryb wyboru okręgu, aby usunąć zduplikowane pojedyncze punkty. W przypadku stosowania reportera mikrogleju z innymi znakowanymi fluorescencyjnie komórkami miąższowymi, dostosuj szacowaną średnicę XY i maksymalną odległość do nowej populacji komórek. Zmodyfikuj wejście kanału źródłowego do obrazu.

Na koniec, korzystając z zakładki statystyki, wyodrębnij żądane statystyki śledzenia. Kliknij przycisk ustawień i wybierz statystyki do obliczeń dla każdego wcześniej utworzonego obiektu punktowego lub obiektu powierzchniowego. Mózg embrionalnego danio pręgowanego został zobrazowany w całości, a lokalizacja neuronów względem mikrogleju została zobrazowana.

Dane przestrzenne uzyskane za pomocą tego protokołu przedstawiają średnią prędkość komórek mikrogleju, średnią odległość, jaką pokonują w ciągu jednej godziny, ich średnie przemieszczenie kwadratowe oraz ich rozmieszczenie w przestrzeni w różnych momentach.