Name: Ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego Ca2+ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj metodę pomiaru bezwzględnego stężenia wapnia cytozolowego i średnicy naczyń limfatycznych w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia badanie dynamiki wapnia i kurczliwości w izolowanych naczyniach szczura.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health, w tym National Institute of General Medical Sciences, Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE), Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy [P20-GM109005], National Cancer Institute [1R37CA282349-01] oraz American Heart Association Predoctoral Fellowship [Numer nagrody: 23PRE1020738; https://doi.org/10.58275/AHA.23PRE1020738.pc.gr.161089]. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH lub AHA. Rysunki 1 i 3 zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Real-Time Analysis of Calcium and Contractility in Isolated Lymph Vessels

<ol><li>Takahashi, T., Shibata, M., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+macromolecule+concentration+in+collecting+lymphatics+in+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of macromolecule concentration in collecting lymphatics in rat mesentery.</a> Microvasc Res. 54 (3), 193-205 (1997).</li>
<li>Ishikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+renal+lymphatics+under+normal+and+pathological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">The human renal lymphatics under normal and pathological conditions.</a> Histopathology. 49 (3), 265-273 (2006).</li>
<li>Fanous, M. Y. Z., Phillips, A. J., Windsor, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenteric+lymph%3A+the+bridge+to+future+management+of+critical+illness%5BTitle%5D)+AND+%22JOP%22%5BJournal%5D)">Mesenteric lymph: the bridge to future management of critical illness.</a> JOP. 8 (4), 374-399 (2007).</li>
<li>El-Chemaly, S., Levine, S. J., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+in+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Lymphatics in lung disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1131 (1), 195-202 (2008).</li>
<li>Klotz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+lymphatics+are+heterogeneous+in+origin+and+respond+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac lymphatics are heterogeneous in origin and respond to injury.</a> Nature. 522 (7554), 62-67 (2015).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li>
<li>Aukland, K., Reed, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial-lymphatic+mechanisms+in+the+control+of+extracellular+fluid+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Interstitial-lymphatic mechanisms in the control of extracellular fluid volume.</a> Physiol Rev. 73 (1), 1-78 (1993).</li>
<li>Zawieja, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+physiology+of+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat+Res+Biol%22%5BJournal%5D)">Contractile physiology of lymphatics.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).</li>
<li>Nipper, M. E., Dixon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Lymphatic+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Engineering the Lymphatic System.</a> Cardiovasc Eng Technol. 2 (4), 296-308 (2011).</li>
<li>Choi, I., Lee, S., Hong, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+era+of+the+lymphatic+system%3A+No+longer+secondary+to+the+blood+vascular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">The new era of the lymphatic system: No longer secondary to the blood vascular system.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (4), 006445(2012).</li>
<li>Ji, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells%2C+lymphedematous+lymphangiogenesis%2C+and+molecular+control+of+edema+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat+Res+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells, lymphedematous lymphangiogenesis, and molecular control of edema formation.</a> Lymphat Res Biol. 6 (3-4), 123-137 (2008).</li>
<li>Scallan, J. P., Zawieja, S. D., Castorena-Gonzalez, J. A., Davis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+pumping%3A+mechanics%2C+mechanisms+and+malfunction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic pumping: mechanics, mechanisms and malfunction.</a> J Physiol. 594 (20), 5749-5768 (2016).</li>
<li>Lee, S., Roizes, S., vonder Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+L-+and+T-type+voltage-dependent+Ca2%2B+channels+in+regulation+of+lymphatic+vessel+contractile+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of L- and T-type voltage-dependent Ca2+ channels in regulation of lymphatic vessel contractile activity.</a> J Physiol. 592 (24), 5409-5427 (2014).</li>
<li>Telinius, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphatic+vessel+contractile+activity+is+inhibited+in+vitro+but+not+in+vivo+by+the+calcium+channel+blocker+nifedipine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human lymphatic vessel contractile activity is inhibited in vitro but not in vivo by the calcium channel blocker nifedipine.</a> J Physiol. 592 (21), 4697-4714 (2014).</li>
<li>Imtiaz, M. S., Zhao, J., Hosaka, K., vonder Weid, P. Y., Crowe, M., van Helden, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaking+through+Ca2%2B+stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys J. 92 (11), 3843-3861 (2007).</li>
<li>Jo, M., Trujillo, A. N., Yang, Y., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+functional+ryanodine+receptors+in+rat+mesenteric+collecting+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evidence of functional ryanodine receptors in rat mesenteric collecting lymphatic vessels.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 317 (3), H561-H574 (2019).</li>
<li>Stolarz, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin+Activates+Ryanodine+Receptors+in+Rat+Lymphatic+Muscle+Cells+to+Attenuate+Rhythmic+Contractions+and+Lymph+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin Activates Ryanodine Receptors in Rat Lymphatic Muscle Cells to Attenuate Rhythmic Contractions and Lymph Flow.</a> J Pharmacol Exp Ther. 371 (2), 278-289 (2019).</li>
<li>Van, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+Prevents+the+Lymphostasis+Caused+by+Doxorubicin+in+the+Rat+Mesenteric+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dantrolene Prevents the Lymphostasis Caused by Doxorubicin in the Rat Mesenteric Circulation.</a> Front Pharmacol. 12, 727526(2021).</li>
<li>Atchison, D. J., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+extra-+and+intracellular+Ca2%2B+in+the+lymphatic+myogenic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of extra- and intracellular Ca2+ in the lymphatic myogenic response.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 272 (1), R326-R333 (1997).</li>
<li>Atchison, D. J., Rodela, H., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+stores+modulation+in+lymph+vessels+depends+on+wall+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium stores modulation in lymph vessels depends on wall stretch.</a> Can J Physiol Pharmacol. 76 (4), 367-372 (1998).</li>
<li>Zhao, J., van Helden, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ET-1-associated+vasomotion+and+vasospasm+in+lymphatic+vessels+of+the+guinea-pig+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">ET-1-associated vasomotion and vasospasm in lymphatic vessels of the guinea-pig mesentery.</a> Br J Pharmacol. 140 (8), 1399-1413 (2003).</li>
<li>Cotton, K. D., Hollywood, M. A., McHale, N. G., Thornbury, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outward+currents+in+smooth+muscle+cells+isolated+from+sheep+mesenteric+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Outward currents in smooth muscle cells isolated from sheep mesenteric lymphatics.</a> J Physiol. 503 (1), 1-11 (1997).</li>
<li>Mathias, R., vonder Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+NO-cGMP-KATP+channel+pathway+in+the+mesenteric+lymphatic+pump+dysfunction+observed+in+the+guinea+pig+model+of+TNBS-induced+ileitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the NO-cGMP-KATP channel pathway in the mesenteric lymphatic pump dysfunction observed in the guinea pig model of TNBS-induced ileitis.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (6), G623-G634 (2013).</li>
<li>Garner, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KATP+channel+openers+inhibit+lymphatic+contractions+and+lymph+flow+as+a+possible+mechanism+of+peripheral+edema%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">KATP channel openers inhibit lymphatic contractions and lymph flow as a possible mechanism of peripheral edema.</a> J Pharmacol Exp Ther. 376 (1), 40-50 (2021).</li>
<li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytosolic+Ca2%2B+in+isolated+contractile+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytosolic Ca2+ in isolated contractile lymphatics.</a> J Vis Exp. (58), e3438(2011).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), 1-20 (2011).</li>
<li>Harmer, A. R., Abi-Gerges, N., Morton, M. J., Pullen, G. F., Valentin, J. P., Pollard, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+in+vitro+contractility+assay+using+canine+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Validation of an in vitro contractility assay using canine ventricular myocytes.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 260 (2), 162-172 (2012).</li>
<li>IonOptix LLC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IonWizard+7.2+Acquisition%22">IonWizard 7.2 Acquisition</a>. , IonOptix LLC. Westwood, PA. (2017).</li>
<li>IonOptix LLC. IonWizard 7.2 Core & Analysis Functions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IonOptix+LLC%22">IonOptix LLC</a>. , IonOptix LLC. Westwood, PA. (2017).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Zawieja, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ano1+mediates+pressure-sensitive+contraction+frequency+changes+in+mouse+lymphatic+collecting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ano1 mediates pressure-sensitive contraction frequency changes in mouse lymphatic collecting vessels.</a> J Gen Physiol. 151 (4), 532-554 (2019).</li>
<li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> J Physiol. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li>
<li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., vonder Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent+manners%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent manners.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2287-H2295 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Ze względu na delikatną i drobną naturę LV konieczne jest zachowanie najwyższej ostrożności zarówno podczas procesu preparacji, jak i kaniulacji. Nawet niewielkie uszkodzenie naczynia może prowadzić do rozwoju nieżywotnej lewej komory lub powodować nieprawidłowości w stanach nieustalonych [Ca2+]i . Spójność ustawień wzbudzenia jest równie istotna w całej serii eksperymentalnej, aby zapewnić porównywalność w pomiarach [Ca2+]i między grupą kontrolną a grupą leczoną. Niezachowanie jednolitych ustawień stwarza znaczne ryzyko przeszacowania lub niedoszacowania [Ca2+]i na wszystkich statkach w ramach serii eksperymentalnej. Podobnie, równie ważne jest dokładne identyfikowanie i monitorowanie tego samego regionu naczynia podczas każdego eksperymentu.
Zastosowanie wskaźnika ratiometrycznego Fura-2AM normalizuje zmiany fluorescencji spowodowane nierówną grubością tkanki, rozkładem/wyciekiem fluoroforu lub fotowybielaniem, problemami powszechnymi w przypadku barwników o pojedynczej długości fali. 31 Umożliwia to ciągłe monitorowanie opisane w niniejszym protokole. Ponieważ jednak Fura-2 działa poprzez chelatację Ca2+, możliwe jest przeciążenie LV i zmniejszenie [Ca2+]i dostępnego do skurczu lub odpowiedzi na lek. W takich przypadkach skoki Ca2+ mogą być nadal obserwowane, gdy nie ma rytmicznych skurczów. Różna długość lewej komory również może przyczyniać się do tego zjawiska. Chociaż te pomiary Ca2+ prawdopodobnie mogą być nadal ważne, może być konieczne zmniejszenie stężenia Fura-2AM w replikowanych konfiguracjach, aby z powodzeniem osiągnąć zarówno pomiary Ca2+ , jak i średnicy. Nasze wyniki obejmują tylko LV, dla których zarówno skoki Ca2+ , jak i rytmiczne skurcze były obecne na początku badania.
Pomiar R, min i R, max jest krytycznym etapem obliczania wartości bezwzględnej [Ca2+]i. Ponieważ Rmin powinno być stosunkiem Fura-2 przy braku Ca2+, do PSS wolnego od Ca2+ dodano wysokie stężenie EGTA, aby zapewnić chelatację wszelkich pozostałych Ca2+. Wstępne badania przeprowadzono z EDTA w PSS wolnym od Ca2+, co skutkowało sporadycznymi skurczami naczyń z odpowiadającymi im kolcami Ca2+ . W przypadku Rmax do PSS dodano wysokie stężenie Ca2+ wraz z jonoforem, jonomycyną, aby zmaksymalizować sygnał [Ca2+]i . Roztwór o wysokiej zawartości Ca2+ może się wytrącać, co może wymagać usunięcia EDTA z PSS. Co ważne, te dodatkowe pomiary Rmin i Rmax dają możliwość oceny fizjologicznie istotnych zmian w [Ca2 + ]i, co może dostarczyć informacji na temat mechanizmów pobudliwości i kurczliwości błony27 , a także pozwolić na porównania wyjściowe między grupami eksperymentalnymi w porównaniu z protokołami, które podają tylko stosunek 340/380 dla Fura-2. Nieosiągnięcie odpowiednich wartości R, min i R, max wyklucza możliwość obliczenia wartości bezwzględnych [Ca2+]i.
Ze względu na kurczliwy charakter LV, metoda ta może zapewnić jedynie pomiar globalnych poziomów Ca2 +, a nie lokalnych zdarzeń uwalniania Ca2 +, które można zmierzyć w sparaliżowanych naczyniach32. Jednak metoda ta jest korzystna do korelowania zmian bezwzględnej dynamiki [Ca2 +] i ze kurczliwością w porównaniu z metodami wykorzystującymi sparaliżowane naczynia lub pojedyncze komórki28,32. W tym podejściu zakłada się, że większość mierzonego Ca2+ pochodzi z komórek mięśni limfatycznych. Jednak komórki śródbłonka, które są również obecne w tych izolowanych LV, mogą przyczyniać się do całkowitego obserwowanego sygnału Ca2 + 33. Wkład ten można oszacować na podstawie lewej komory nabłonkowej, która została ogołocona ze śródbłonka34. Skurcze LV mogą również powodować nieznaczne przesuwanie się ściany naczynia do przodu i z ostrości podczas cyklu skurczu. Dlatego ważne jest, aby używać krótkich segmentów naczynia, które można naciągnąć mocno, ale bez rozciągania naczynia.
Poza zastosowaniem w lewej dawce, metoda ta może być wykorzystana do badania izolowanych naczyń z innych łożysk naczyniowych, w tym tętniczek i żył, i jest obiecująca do potencjalnego wykorzystania w neurobiologii i innych gałęziach biologii naczyniowej. Badanie wpływu różnych agonistów lub antagonistów ukierunkowanych na różne szlaki transdukcji sygnału to kolejna droga do zbadania podstawowej dynamiki Ca2 + . Co więcej, technika ta może być również stosowana do badań porównawczych obejmujących próbki kontrolne i poddane działaniu substancji od odpowiednich zwierząt. Co więcej, podejście to można dostosować do wdrożenia na poziomie komórkowym, na przykład w izolowanych komórkach mięśni limfatycznych, co wymaga minimalnych regulacji komory perfuzyjnej i obiektywów mikroskopu. Podsumowując, metoda ta zapewnia fizjologicznie istotny wgląd w globalną dynamikę Ca2+ , ponieważ koreluje z kurczliwością i rytmicznością w LV oraz zapewnia solidną ocenę potencjalnych regulatorów dynamiki Ca2+ w zbieraniu LV.

Układ naczyń limfatycznych znajduje się w wielu układach narządów, w tym w mózgu, sercu, płucach, nerkach i krezce1,2,3,4,5,6, i działa poprzez wypychanie płynu (limfy) z przestrzeni śródmiąższowych do centralnych przewodów żylnych w celu utrzymania homeostazy płynów7,8,9,10. Zaczyna się od ślepo zakończonych naczyń włosowatych limfatycznych w łożyskach naczyń włosowatych, które spływają do naczyń limfatycznych (LV). Komórki LV do zbierania składają się z dwóch warstw komórek: warstwy komórek śródbłonka otoczonej warstwą komórek mięśni limfatycznych (LMC)10,11. Transport płynu limfatycznego odbywa się zarówno poprzez siły zewnętrzne (np. tworzenie się nowej limfy, pulsacje tętnicze, wahania ciśnienia w żyłach centralnych), jak i siły wewnętrzne12.
Wewnętrzną siłą transportu limfy jest spontaniczny, rytmiczny skurcz zbierających się LV, na którym skupia się większość badań nad funkcjonowaniem układu limfatycznego. Ta wewnętrzna pompa limfatyczna jest zasadniczo regulowana przez cykliczne wznoszenie się i opadanie cytozolowego, wolnego Ca2 + ([Ca2 + ]i). Spontaniczna depolaryzacja błony plazmatycznej w LMC aktywuje bramkowane napięciem kanały Ca2+ typu "L" (Cav1.x), wywołując napływ Ca2+ i późniejszy rytmiczny skurcz LV8,9,10. Rola ta została zademonstrowana poprzez blokowanie Cav1.x za pomocą specyficznych środków, takich jak nifedypina, która hamowała skurcze LV i powodowała rozszerzenie naczyń krwionośnych13,14. Przejściowy wzrost [Ca2 + ]i lub "skok Ca2 +" w LMC, w którym pośredniczą kanały Cav1.x, może również mobilizować wewnątrzkomórkowe zapasy Ca2+ poprzez aktywację receptorów trifosforanu inozytolu (IP3) i receptorów ryanodine (RyR) na siateczce sarkoplazmatycznej (SR) 15,16,17,18. Obecne dowody sugerują, że receptory IP3 dostarczają więcej Ca2+ wymaganego do normalnych skurczów LV w porównaniu do RyRs15,16,19,20,21; jednak RyR może odgrywać rolę podczas patologii lub w odpowiedzi na interwencję farmaceutyczną17,18. Dodatkowo, aktywacja kanałów K+ aktywowanych przez Ca2+ 22 i kanałów potasowych wrażliwych na ATP (KATP) 23,24 może hiperpolaryzować błonę LMC i hamować spontaniczną aktywność skurczową.
Istnieje wiele innych kanałów jonowych i białek, które mogą regulować dynamikę Ca2+ podczas zbierania LV. Wykorzystanie metod do badania zmian w Ca2+ i kurczliwości naczyń w odpowiedzi na czynniki farmakologiczne w czasie rzeczywistym jest ważne dla zrozumienia tych potencjalnych regulatorów. Wcześniejsza metoda wykorzystująca Fura-2 do pomiaru względnych zmian w LV [Ca2+]i została opisana25. Ponieważ stała dysocjacji dla Fura-2 i Ca2+ jest znana26, możliwe jest obliczenie rzeczywistych stężeń Ca2+, co rozszerza zastosowanie tej metody i zapewnia dodatkowy wgląd w sygnalizację Ca2+, pobudliwość błony i mechanizmy kurczliwości27, a także pozwala na porównania linii wyjściowych między grupami eksperymentalnymi. To ostatnie podejście zostało zastosowane w kardiomiocytach28, a zatem może być dostosowane do LV. W artykule przedstawiono ulepszoną metodę, która łączy te dwa podejścia do pomiaru i obliczania zmian w bezwzględnych [Ca2 +] i, a także kurczliwości/rytmiczności naczyń w sposób ciągły w czasie rzeczywistym w izolowanych, ciśnieniowych LV. Przedstawiamy również reprezentatywne wyniki dla pacjentów z lewej dawki leczonych nifedypiną.

<table><tbody><tr><td>Obiektyw fluorescencyjny 20x S</td><td>Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stany Zjednoczone)</td><td>UPlanSApo</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety ze szkła borokrzemianowego</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)</td><td>GCP-75-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Dwutlenek węgla (CO2)</td><td>nexAir (Memphis, TN, Stany Zjednoczone)</td><td>UN3156</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, Stany Zjednoczone)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (C10H16N2O8)</td><td>Odczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (C14H24N2O10)</td><td>Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)</td><td>O2783-100</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Invitrogen (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza (C6H12O6)</td><td>Odczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Grawitacyjny regulator ciśnienia</td><td>wykonany na zamówienie w laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednostka grzewcza</td><td>Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)</td><td>TC-09S</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>IonOptix (Westwood, MA, Stany Zjednoczone)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stany Zjednoczone)</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Invitrogen (Waltham, MA, Stany Zjednoczone)</td><td>I24222</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix Cell Framing Adaptor</td><td>IonOptix (Westwood, MA, Stany Zjednoczone)</td><td>665 DXR</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care (Telangana, Indie)</td><td>NDC 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Izolowana komora perfuzyjna naczynia</td><td>Oprzyrządowanie Żywych Systemów (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)</td><td>CH-1</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do przygotowania węzłów</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, Stany Zjednoczone)</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła LED</td><td>Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Stany Zjednoczone)</td><td>TL4</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Acros Organics (New Jersey, NJ, Stany Zjednoczone)</td><td>213115000</td><td></td></tr><tr><td>System wideo MyoCam-S3 Fast CMOS</td><td>IonOptix (Westwood, MA, Stany Zjednoczone)</td><td>MCS300</td><td></td></tr><tr><td>Nifedipine</td><td>Sigma (St. Louis, MO, Stany Zjednoczone)</td><td>N7634</td><td></td></tr><tr><td>Nici</td><td></td><td></td><td></td>oftalmiczne</tr><tr><td>Tlen (O2)</td><td>nexAir (Memphis, TN, Stany Zjednoczone)</td><td>UN1072</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pluronowy</td><td>Sigma (St. Louis, MO, Stany Zjednoczone)</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>System monitorowania ciśnienia</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)</td><td>PM-4</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych (Burlington, VT, Stany Zjednoczone)</td><td>PT-F</td><td></td></tr><tr><td>Wyłożona silikonem szalka Petriego</td><td>wykonana na zamówienie w laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Odczynniki Fishera (Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu (NaH2PO4)</td><td>Bioodczynniki Fisher (Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>BP329-500</td><td></td></tr><tr><td>Szczury Sprague-Dawley</td><td>Envigo RMS (Indianapolis, IN, USA)</td><td>Samiec</td><td>w wieku 9-13 tygodni</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems (Wetzlar, Niemcy)</td><td>Nożyczki sprężynowe S9D</td><td></td></tr><tr><td>Vannas</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, Stany Zjednoczone)</td><td>15000-03</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego ca2+ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych

Real-time Evaluation of Absolute, Cytosolic, Free Ca2+ and Corresponding Contractility in Isolated, Pressurized Lymph Vessels

Układ naczyń limfatycznych, obecnie często określany jako "trzecie krążenie", znajduje się w wielu ważnych układach narządów. Główną funkcją mechaniczną układu limfatycznego jest powrót płynu z przestrzeni zewnątrzkomórkowych z powrotem do centralnych przewodów żylnych. W transporcie limfy pośredniczą spontaniczne rytmiczne skurcze naczyń limfatycznych (LV). Skurcze lewej dawki są w dużej mierze regulowane przez cykliczny wzrost i spadek cytozolowego, wolnego wapnia ([Ca2 + ]i).
Ten artykuł przedstawia metodę jednoczesnego obliczania zmian w bezwzględnych stężeniach [Ca2+]i i kurczliwości/rytmiczności naczyń w czasie rzeczywistym w izolowanych, ciśnieniowych LV. Używając izolowanych LV krezkowych szczurów, badaliśmy zmiany w [Ca2+]i i kurczliwości/rytmiczności w odpowiedzi na dodanie leku. Izolowane LV zostały załadowane wskaźnikiem ratiometrycznym Ca2+-sensoring Fura-2AM, a mikroskopia wideo w połączeniu z oprogramowaniem do wykrywania krawędzi została wykorzystana do uchwycenia [Ca2+]i i pomiary średnicy w sposób ciągły w czasie rzeczywistym.
Sygnał Fura-2AM z każdego LV został skalibrowany do minimalnego i maksymalnego sygnału dla każdego statku i użyty do obliczenia bezwzględnego [Ca2+]i. Pomiary średnicy wykorzystano do obliczenia parametrów kurczliwości (amplituda, średnica końcowa rozkurczowa, średnica końcowa skurczowa, obliczony przepływ) i rytmiczności (częstotliwość, czas skurczu, czas relaksacji) i skorelowano z pomiarami bezwzględnymi [Ca2+]i.

Kurczliwość naczyń limfatycznych (LVs) oraz odpowiadające im zmiany w wolnym Ca2+ cytozolu ([Ca2+]i) oceniano w izolowanych naczyniach limfatycznych krezki szczura po ekspozycji na różne stężenia nifedypiny (NIF; 0.1-100 nM) (Rysunek 6). Parametry, w tym amplituda skoku Ca2+, bazowy poziom Ca2+ oraz szczytowy poziom Ca2+, wykazywały zależny od stężenia spadek wraz z sukcesywnym dodawaniem NIF do komory perfuzyjnej (Rysunek 7A). Jednocześnie parametry kurczliwości, takie jak amplituda skurczu i obliczony przepływ, również wykazały stopniowy spadek (Rysunek 7B). Odnotowano niewielki wzrost średnicy EDD pod wpływem NIF (Rysunek 7B). Częstotliwość skoków Ca2+ oraz częstotliwość skurczów wydają się być odpowiedzią typu wszystko albo nic. Jednak efekt ten wystąpił przy 10 nM w przypadku jednego naczynia LV, podczas gdy we wszystkich naczyniach LV skurcze ustały przy 100 nM. Tym samym połączone dane tworzą wykresy przypominające stopniową odpowiedź zależną od stężenia. Efekt ten jest zgodny z wcześniejszymi publikacjami, w których stosowano NIF w badaniach LVs w innych preparatach (miografia druciana i ciśnieniowa13,14). Wykresy Manhattan pokazują indywidualne odpowiedzi LVs dla miar rytmiczności, w tym odstępu, czasu skurczu i czasu rozkurczu (Rysunek 7C). Ten rodzaj prezentacji danych pozwala badaczowi wyodrębnić te odpowiedzi typu wszystko albo nic lub zmienność rytmów skurczu, co dostarcza dodatkowych informacji o mechanizmach leżących u podstaw tych zjawisk. Ostatecznie spadki amplitudy i częstotliwości skurczów doprowadziły do zmniejszenia obliczonego przepływu przez te izolowane LVs, co służy jako wskaźnik zastępczy dla funkcji in vivo. Ogólnie spadek kurczliwości LVs korelował ze zmniejszeniem [Ca2+]i. Nasze wyniki stanowią bezpośredni dowód na to, że w zakresie do 100 nM NIF skutecznie hamuje skurcze i oscylacje [Ca2+]i w LVs poprzez antagonizowanie kanałów Cav1.x obecnych w komórkach mięśni limfatycznych (LMCs).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig01v2.jpg" /> 
Rysunek 1: Zdjęcie układu izolowanej komory naczyniowej. W badaniach nad perfuzją naczyń wykorzystano izolowaną komorę naczyniową wyposażoną w termoregulator. Do kontroli ciśnienia za pomocą zbiornika z PSS wykorzystano grawitację. Ciśnienie monitorowano za pomocą przetworników podłączonych do kaniul doprowadzających (P1) i odprowadzających (P2). Skrót: PSS = fizjologiczny roztwór soli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig02.jpg" /> 
Rycina 2: Schemat przygotowania węzła. (A) Przygotowanie podwójnej pętli pod mikroskopem stereoskopowym&#160;przy użyciu pojedynczej nici z 3-warstwowej jedwabnej nici chirurgicznej, (B) chwycenie wolnego końca i przeciągnięcie go przez obie pętle, (C) zaciśnięcie węzła z obu stron, aby zachować niewielki otwór, oraz (D) odcięcie nadmiaru nici z każdej strony; niebieska ramka pokazuje gotowy do użycia pełny podwójny węzeł nadgarstkowy. Pasek skali = 1.5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Schemat przepływu pracy eksperymentalnej dla pozyskiwania danych. Zdrowego szczura zanieczulono poprzez indukcję 5% izofluranem, a następnie przeprowadzono dekapitację w celu usunięcia krwi z tułowia. Wykonano cięcie w linii pośrodkowej, aby odsłonić i wyizolować krezkę. Wyizolowaną krezkę rozłożono w lodowatym roztworze PSS, a &#160;LV oddzielono od tkanki tłuszczowej w celu kanulacji w izolowanej komorze perfuzyjnej naczyń. Kąpiel umieszczono na stoliku mikroskopu odwróconego, korzystając z obiektywu 20x. Naczynie pobudzano naprzemiennie światłem o długości fali 340 i 380 nm, a widma fluorescencyjne emisji rejestrowano za pomocą kamery CCD przy 510 nm. Komputer podłączony do mikroskopu generował zapisy skurczowe i Ca2+ przy użyciu oprogramowania do przechwytywania fluorescencji i detekcji krawędzi obrazu. Pasek skali = 1 mm. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; CCD = urządzenie sprzężone ładunkowo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig04.jpg" /> 
Rycina 4: Reprezentatywny zapis kurczliwości naczyń limfatycznych (LV). (A) Przykładowy zapis zmian średnicy kaniulowanych LV obciążonych wskaźnikiem obrazowania Ca2+ Fura 2 AM w PSS oraz (B) powiększony zapis pokazujący wszystkie parametry związane z kurczliwością naczyń: EDD, ESD, AMP i częstotliwość. Wartości te zostały wykorzystane do obliczenia rytmiczności i przepływu. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; EDD = średnica końcowodiastoliczna; ESD = średnica końcowosystoliczna; AMP = amplituda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig05.jpg" /> 
Rycina 5: Reprezentatywny zapis obrazowania Ca2+ w LV. (A) Przykład zapisu zmian bezwzględnego stężenia &#160;[Ca2+]i w kaniulowanych LV obciążonych Fura-2 w PSS oraz (B) powiększony zapis przedstawiający wszystkie parametry (Peak, Amplitude oraz Baseline) związane z [Ca2+]i (bez korekcji tła). Skrót: PSS = fizjologiczny roztwór soli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig06.jpg" /> 
Rycina 6: Przegląd kurczliwości LV i obrazowania Ca2+. Reprezentatywne zapisy odpowiadające (A) średnicy, (B) stosunkowi 340/380 oraz (C) bezwzględnemu stężeniu [Ca2+]i przy linii bazowej PSS, nifedypinie (antagoniście kanałów Cav1.x (Ca2+)) oraz odpowiedzi na stężenie, w tym Rmin i Rmax. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; NIF = nifedypina; Rmin = minimalny sygnał fluorescencji Fura-2; Rmax = maksymalny sygnał fluorescencji Fura-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66535/66535fig07.jpg" /> 
Rysunek 7: Oscylacje Ca2+ i odpowiadająca im kurczliwość zablokowane przez nifedypinę w LV. (A) Parametry Ca2+ (n = 3) oraz (B) kurczliwości (n = 3) ulegały zmniejszeniu w sposób zależny od stężenia po dodaniu nifedypiny, antagonisty napięciowo-zależnych kanałów Cav1.x (Ca2+). (C) Reprezentatywne wykresy Manhattan przedstawiają średni odstęp czasowy (Δt) między skurczami oraz czasy skurczu i rozkurczu. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Skróty: PSS = fizjologiczny roztwór soli; LV = naczynie limfatyczne; NIF = nifedypina; EDD = średnica koniec-rozkurczowa; AMP = amplituda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66535/66535fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego pomiaru cytozolu, wolnego wapnia [Ca2+]i i średnicy naczynia w kurczących się naczyniach limfatycznych w czasie rzeczywistym, a następnie obliczania bezwzględnych stężeń Ca2+ oraz parametrów kurczliwości/rytmiczności. Protokół ten może być stosowany do badania Ca2+ i dynamiki kurczliwości w różnych warunkach eksperymentalnych.

Ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego Ca2+ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych

The lymphatic vasculature, now often referred to as &#34;the third circulation,&#34; is located in many vital organ systems. A principal mechanical ...

Badamy mechanizmy skurczów naczyń limfatycznych i przepływu limfy, aby lepiej zrozumieć patologię obrzęku limfatycznego związanego z rakiem, a także związek między układem limfatycznym a nadciśnieniem. Naszym celem jest zidentyfikowanie celów terapeutycznych w obrębie układu naczyniowego układu limfatycznego, abyśmy mogli opracować nowe metody leczenia chorób limfatycznych. Niedawne odkrycia różnych kanałów jonowych w komórkach limfatycznych mięśni i śródbłonka, które przyczyniają się do leżącej u podstaw dynamiki wapnia, okazały się kluczowe w rozwoju tej dziedziny.Izolowane naczynia krwionośne i mikroskop przyżyciowy są kluczowymi technikami badania funkcji naczyń limfatycznych. Ostatnio pojawiła się tendencja wzrostowa polegająca na wykorzystywaniu narządów na chipie i mikro naczyń krwionośnych do badania wielu aspektów biologii limfatycznej. Bardzo mały rozmiar tkanki stanowi wyzwanie dla badania układu naczyniowego układu limfatycznego, co wymaga dużo czasu, cierpliwości i rozwoju nowych technologii.Niedostępność markerów specyficznych dla komórek mięśni limfatycznych jest kolejną przeszkodą dla całej społeczności naukowej. Zaletą tego protokołu jest możliwość pomiaru skurczów limfy i bezwzględnego stężenia wapnia w tym samym naczyniu. Zapewnia to dodatkowy wgląd w sygnalizację wapniową, mechanizmy skurczu, a także możliwość pomiaru porównań wyjściowych między grupami leczonymi w porównaniu z innymi technikami, które mogą opierać się na względnych zmianach w wapniu lub sparaliżowanych naczyniach.Na początek weź mikropipety ze szkła borokrzemianowego nabyte ze źródła komercyjnego. Przyciąć i wypolerować mikropipety na długość około jednego do dwóch centymetrów do użytku w izolowanej komorze perfuzyjnej naczynia, podłączyć każdą zamontowaną szklaną kaniulę w komorze obfitości naczynia do niezależnych przetworników ciśnienia ustawionych z niezależną grawitacją, zasilanych regulatorów ciśnienia i połączonych za pomocą rurki polietylenowej, zasypać komorę profuzji, szklane mikropipety, i grawitacyjny regulator ciśnienia wraz z rurką polietylenową. Z fizjologicznym roztworem soli, a następnie zaciśnij ciśnienie, aby upewnić się, że kaniule nie są pod ciśnieniem.Na początek weź plecioną jedwabną nić do szwów i rozdziel ją na jedno włókno. Użyj dwóch kleszczy Dumont 5 z mikro końcówkami i kleszczykami, aby zrobić podwójną pętlę wokół końcówki innych kleszczy, za pomocą zapętlonych kleszczy chwyć luźny koniec szwu i ostrożnie przeciągnij go przez obie pętle. Użyj nożyczek sprężynowych Vannas, aby przyciąć nadmiar szwów z obu stron.Po odcięciu głowy uśpionego szczura wykonaj podłużne cięcie wzdłuż linii środkowej ściany brzucha. Następnie zewnętrznij krezkę, przetnij połączenie tuż pod zwieraczem odźwiernika, około dwóch do trzech centymetrów powyżej jelita ślepego, a także połączenie z odbytnicą. Następnie wypreparowaną całą krezkę opłucz w 200 mililitrach lodowatego roztworu soli fizjologicznej.Następnie przenieś je i zabezpiecz na wyłożonej silikonem szalce Petriego zawierającej lodowaty roztwór soli fizjologicznej za pomocą mikroskopu stereoskopowego, Dumont 5, cienkich kleszczyków inox i nożyczek sprężynowych Vannas, aby wypreparować krezkowe naczynia limfatyczne drugiego rzędu z otaczającego tłuszczu i tkanki łącznej. Teraz przenieś wypreparowane naczynie kończyny do komory obfitości naczyń w celu kaniulacji na szklanych kaniulach. Wsuń pojedynczy ładny węzeł na każdą szklaną kaniulę, przygotowując się do późniejszego zamocowania naczynia na kaniulach.Używając małego kawałka tłuszczu, ustaw kierunek naczyń limfatycznych i kanuluj dystalny koniec na P jeden. Przesuń węzeł w dół kaniuli i zaciśnij go, aby zabezpieczyć naczynie limfatyczne. Następnie zwiększ ciśnienie w naczyniu limfatycznym do czterech do pięciu milimetrów rtęci w komorze obfitości.Umieść bulgoczący kamień z 7% dwutlenkiem węgla i 93% tlenem w komorze kąpieli, aby utrzymać fizjologiczne pH, podłącz komorę do regulatora temperatury i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza. Na początek wyizoluj i kaniuluj krezkowe naczynia limfatyczne szczura poddanego eutanazji. Zwiększ ciśnienie w naczyniach limfatycznych w komorze obfitości i pozwól im się zrównoważyć i rozwinąć stabilne spontaniczne skurcze.Następnie inkubuj naczynia limfatyczne z estrem fura-2-acetoksymetylowym i kwasem pluronowym przez 30 minut w ciemności. Po inkubacji opróżnij całą objętość kąpieli za pomocą podciśnienia i trzykrotnie napełnij ją roztworem soli fizjologicznej o dopasowanej temperaturze. Następnie inkubuj naczynia limfatyczne w ciemności przez dodatkowe 15 minut, aby usunąć nadmiar wskaźnika i umożliwić deestryfikację, przenieś komorę do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego ze światłem LED, adapterem do kadrowania komórek obiektywu fluorescencyjnego 20 XS XS i kamerą do wychwytywania fluorescencji 15 Hz.Podłącz mikroskop do komputera wyposażonego w oprogramowanie do obrazowania, aby zarejestrować fluorescencję i przeprowadzić detekcję krawędzi. Aktywuj źródło światła LED i interfejs systemu fluorescencyjnego. Teraz uruchom kreatora oprogramowania Ion.Na karcie plik wybierz opcję Nowy. Następnie przejdź do zakładki Zbieraj i wybierz Eksperyment. Załaduj żądany szablon eksperymentalny i kliknij przycisk OK.Kliknij przycisk Start znajdujący się u dołu ekranu, aby rozpocząć eksperyment. Następnie dostosuj ślady na ekranie, aby wyświetlić średnicę naczynia, licznik 340, mianownik sygnału, 380, sygnał i stosunek w kolejności malejącej. Aby zmodyfikować skalę osi Y w celu lepszej wizualizacji śladów, przejdź do pozycji Ślady.Upewnij się, że opcja Limity automatyczne nie jest zaznaczona, a następnie wybierz opcję Edytuj limity użytkowników. Wybierz parametr, który chcesz dostosować. Wprowadź minimalne i maksymalne wartości osi, a następnie wybierz pozycję OK, aby potwierdzić.Korzystając z oprogramowania do wykrywania krawędzi, dostosuj oświetlenie tak, aby ściana naczynia limfatycznego wyglądała jak ciemne linie. Wybierz obszar zainteresowania lub ROI wolny od tłuszczu i zanieczyszczeń i upewnij się, że nie przesuwasz tego ROI, ustaw próg tak, aby krawędź ściany naczynia była wykrywana przez cały cykl skurczu. Po aktywacji lampy powielacza zdjęć za pomocą oświetlaczy LED, naprzemiennie fale o długości 340 i 380 nanometrów oraz 50 milisekundowych ekspozycji, aby wzbudzić Fura 2, uchwycić widma emisyjne przy 510 nanometrach i 15 hercach w całym polu obrazowania.Aby zmierzyć stosunek sygnału do tła, najpierw uzyskaj fluorescencję 340 i 380 z naczyniem limfatycznym w środku pola widzenia. Następnie przenieś pole widzenia na krawędź wanny bez naczynia, aby uchwycić tło, a następnie wymień roztwór do kąpieli na roztwór soli fizjologicznej o dopasowanej temperaturze bez odczynników. Aby usunąć nadmiar wskaźnika Fura 2, rejestruj wyjściowy sygnał fluorescencyjny Fura 2 i spontaniczne skurcze przez około 30 minut.Następnie należy zarejestrować skumulowaną reakcję stężeniową nifedypiny i uzyskać pomiary tła dla każdego stężenia leku. Na koniec każdego eksperymentu przemyć naczynia limfatyczne roztworem soli fizjologicznej o dopasowanej temperaturze, aby uzyskać minimalny sygnał fluorescencyjny Fura 2 i maksymalną średnicę naczyń limfatycznych przy braku jonów wapnia, wymienić roztwór kąpieli na fizjologiczny roztwór soli o dopasowanej temperaturze, zawierający 10 milimolowych jonów wapnia i jonomycynę, aby uzyskać maksymalny sygnał fluorescencyjny Fura 2 i minimalną średnicę naczyń limfatycznych w warunki nasycenia jonów wapnia. Parametry, w tym amplituda skoku wapnia, wyjściowy poziom wapnia i szczytowy poziom wapnia, wykazywały zmniejszenie zależne od stężenia wraz ze stopniowym dodawaniem nifedypiny do komory perfuzyjnej.Równocześnie parametry skurczu, takie jak skurcz, amplituda i obliczony przepływ, również wykazały stopniowy spadek. Wykresy manhattańskie pokazały indywidualne reakcje naczyń limfatycznych dla pomiarów rytmiczności, w tym interwału, czasu skurczu i czasu relaksacji.

real-time-evaluation-absolute-cytosolic-free-ca2-corresponding

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy metodę oceny stężenia cytosolowego Ca2+ w izolowanych naczyniach limfatycznych w celu zbadania zależnych od Ca2+ oraz uwrażliwiających na Ca2+ mechanizmów skurczu mięśni gładkich naczyń limfatycznych.

Pomiar Ca2+ cytozolu w izolowanych naczyniach limfatycznych kurczliwych

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Ten artykuł opisuje protokół, który ocenia zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2+ podczas skurczu w izolowanych miocytach serca szczura. Wraz z elektrofizjologią serca, skurczowymi/rozkurczowymi poziomami cytozolu Ca2+ i skurczem/rozluźnieniem, pomiar ten jest niezbędny do wzmocnienia mechanizmów pośredniczących w sprzężeniu pobudzenia-skurczu serca w zdrowych i chorych sercach.

Ocena wrażliwości miofilamentu ca2+ leżącej u podstaw sprzężenia wzbudzenia-skurczu serca

Wewnątrzkomórkowy recykling wapnia odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji skurczowej i rozkurczowej w kardiomiocytach. W tym miejscu opisujemy protokół oceny rezerwy Ca2 + retikulum sarkoplazmatycznego i rozkurczowej funkcji usuwania wapnia w kardiomiocytach za pomocą systemu obrazowania wapnia.

Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny właściwości kurczliwych miofibryli mięśni prążkowanych z rozdzielczością nano-Newtona. Protokół wykorzystuje konfigurację z opartą na interferometrii sondą siły optycznej. Taka konfiguracja generuje dane o wysokim stosunku sygnału do szumu i umożliwia ocenę kinetyki kurczliwości miofibryli.

Izolowanie miofibryli z biopsji mięśni szkieletowych i określanie funkcji skurczu za pomocą przetwornika siły o rozdzielczości nano-Newtona

Obecny protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc myszy do oceny kurczliwości dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic wewnątrzpłucnych w środowisku prawie in vivo.

Wykorzystanie precyzyjnie wyciętego wycinka płuc do badania regulacji skurczowej dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic śródpłucnych

Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.

Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

W tym protokole prezentujemy nowatorską technikę rejestrowania i analizowania sygnałów Ca2+ w żyłach wewnątrzpłucnych (małe żyły płucne lub PV) przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym. Technika ta obejmuje izolację małych PV, inkubację ich za pomocą wskaźnika Ca2+, kaniulowanie i zwiększanie ciśnienia, obrazowanie konfokalne sygnałów Ca2+ oraz analizę danych.

Obrazowanie sygnałówCa2+ w małych żyłach płucnych przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym

Praca pokazuje innowacyjną metodę in vivo badania kurczliwości naczyń limfatycznych szyjnych i przepływu limfy u myszy w celu przetestowania różnych funkcji fizjologicznych naczyń limfatycznych szyi (cLV) oraz strategii terapeutycznych dotyczących modulacyjnych mechanizmów regulacji limfatycznej odpływu i oczyszczania mózgu.

Możliwość odtworzenia ustawień dla in vivo dwufotonowego obrazowania kurczliwości naczyń chłonnych szyjnych i przepływu limfy u myszy

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Poznaj metodę pomiaru bezwzględnego stężenia wapnia cytozolowego i średnicy naczyń limfatycznych w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia badanie dynamiki wapnia i kurczliwości w izolowanych naczyniach szczura.

Ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego Ca2+ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych (Wideo) | JoVE Journal

Ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego Ca²⁺ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych

Przeglądaj więcej filmów