Ocena w czasie rzeczywistym bezwzględnego, cytozolowego, wolnego Ca2+ i odpowiadającej mu kurczliwości w izolowanych, ciśnieniowych naczyniach limfatycznych
22 marca 2024
Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego pomiaru cytozolu, wolnego wapnia [Ca2+]i i średnicy naczynia w kurczących się naczyniach limfatycznych w czasie rzeczywistym, a następnie obliczania bezwzględnych stężeń Ca2+ oraz parametrów kurczliwości/rytmiczności. Protokół ten może być stosowany do badania Ca2+ i dynamiki kurczliwości w różnych warunkach eksperymentalnych.
Badamy mechanizmy skurczów naczyń limfatycznych i przepływu limfy, aby lepiej zrozumieć patologię obrzęku limfatycznego związanego z rakiem, a także związek między układem limfatycznym a nadciśnieniem. Naszym celem jest zidentyfikowanie celów terapeutycznych w obrębie układu naczyniowego układu limfatycznego, abyśmy mogli opracować nowe metody leczenia chorób limfatycznych. Niedawne odkrycia różnych kanałów jonowych w komórkach limfatycznych mięśni i śródbłonka, które przyczyniają się do leżącej u podstaw dynamiki wapnia, okazały się kluczowe w rozwoju tej dziedziny.
Izolowane naczynia krwionośne i mikroskop przyżyciowy są kluczowymi technikami badania funkcji naczyń limfatycznych. Ostatnio pojawiła się tendencja wzrostowa polegająca na wykorzystywaniu narządów na chipie i mikro naczyń krwionośnych do badania wielu aspektów biologii limfatycznej. Bardzo mały rozmiar tkanki stanowi wyzwanie dla badania układu naczyniowego układu limfatycznego, co wymaga dużo czasu, cierpliwości i rozwoju nowych technologii.
Niedostępność markerów specyficznych dla komórek mięśni limfatycznych jest kolejną przeszkodą dla całej społeczności naukowej. Zaletą tego protokołu jest możliwość pomiaru skurczów limfy i bezwzględnego stężenia wapnia w tym samym naczyniu. Zapewnia to dodatkowy wgląd w sygnalizację wapniową, mechanizmy skurczu, a także możliwość pomiaru porównań wyjściowych między grupami leczonymi w porównaniu z innymi technikami, które mogą opierać się na względnych zmianach w wapniu lub sparaliżowanych naczyniach.
Na początek weź mikropipety ze szkła borokrzemianowego nabyte ze źródła komercyjnego. Przyciąć i wypolerować mikropipety na długość około jednego do dwóch centymetrów do użytku w izolowanej komorze perfuzyjnej naczynia, podłączyć każdą zamontowaną szklaną kaniulę w komorze obfitości naczynia do niezależnych przetworników ciśnienia ustawionych z niezależną grawitacją, zasilanych regulatorów ciśnienia i połączonych za pomocą rurki polietylenowej, zasypać komorę profuzji, szklane mikropipety, i grawitacyjny regulator ciśnienia wraz z rurką polietylenową. Z fizjologicznym roztworem soli, a następnie zaciśnij ciśnienie, aby upewnić się, że kaniule nie są pod ciśnieniem.
Na początek weź plecioną jedwabną nić do szwów i rozdziel ją na jedno włókno. Użyj dwóch kleszczy Dumont 5 z mikro końcówkami i kleszczykami, aby zrobić podwójną pętlę wokół końcówki innych kleszczy, za pomocą zapętlonych kleszczy chwyć luźny koniec szwu i ostrożnie przeciągnij go przez obie pętle. Użyj nożyczek sprężynowych Vannas, aby przyciąć nadmiar szwów z obu stron.
Po odcięciu głowy uśpionego szczura wykonaj podłużne cięcie wzdłuż linii środkowej ściany brzucha. Następnie zewnętrznij krezkę, przetnij połączenie tuż pod zwieraczem odźwiernika, około dwóch do trzech centymetrów powyżej jelita ślepego, a także połączenie z odbytnicą. Następnie wypreparowaną całą krezkę opłucz w 200 mililitrach lodowatego roztworu soli fizjologicznej.
Następnie przenieś je i zabezpiecz na wyłożonej silikonem szalce Petriego zawierającej lodowaty roztwór soli fizjologicznej za pomocą mikroskopu stereoskopowego, Dumont 5, cienkich kleszczyków inox i nożyczek sprężynowych Vannas, aby wypreparować krezkowe naczynia limfatyczne drugiego rzędu z otaczającego tłuszczu i tkanki łącznej. Teraz przenieś wypreparowane naczynie kończyny do komory obfitości naczyń w celu kaniulacji na szklanych kaniulach. Wsuń pojedynczy ładny węzeł na każdą szklaną kaniulę, przygotowując się do późniejszego zamocowania naczynia na kaniulach.
Używając małego kawałka tłuszczu, ustaw kierunek naczyń limfatycznych i kanuluj dystalny koniec na P jeden. Przesuń węzeł w dół kaniuli i zaciśnij go, aby zabezpieczyć naczynie limfatyczne. Następnie zwiększ ciśnienie w naczyniu limfatycznym do czterech do pięciu milimetrów rtęci w komorze obfitości.
Umieść bulgoczący kamień z 7% dwutlenkiem węgla i 93% tlenem w komorze kąpieli, aby utrzymać fizjologiczne pH, podłącz komorę do regulatora temperatury i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza. Na początek wyizoluj i kaniuluj krezkowe naczynia limfatyczne szczura poddanego eutanazji. Zwiększ ciśnienie w naczyniach limfatycznych w komorze obfitości i pozwól im się zrównoważyć i rozwinąć stabilne spontaniczne skurcze.
Następnie inkubuj naczynia limfatyczne z estrem fura-2-acetoksymetylowym i kwasem pluronowym przez 30 minut w ciemności. Po inkubacji opróżnij całą objętość kąpieli za pomocą podciśnienia i trzykrotnie napełnij ją roztworem soli fizjologicznej o dopasowanej temperaturze. Następnie inkubuj naczynia limfatyczne w ciemności przez dodatkowe 15 minut, aby usunąć nadmiar wskaźnika i umożliwić deestryfikację, przenieś komorę do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego ze światłem LED, adapterem do kadrowania komórek obiektywu fluorescencyjnego 20 XS XS i kamerą do wychwytywania fluorescencji 15 Hz.
Podłącz mikroskop do komputera wyposażonego w oprogramowanie do obrazowania, aby zarejestrować fluorescencję i przeprowadzić detekcję krawędzi. Aktywuj źródło światła LED i interfejs systemu fluorescencyjnego. Teraz uruchom kreatora oprogramowania Ion.
Na karcie plik wybierz opcję Nowy. Następnie przejdź do zakładki Zbieraj i wybierz Eksperyment. Załaduj żądany szablon eksperymentalny i kliknij przycisk OK.
Kliknij przycisk Start znajdujący się u dołu ekranu, aby rozpocząć eksperyment. Następnie dostosuj ślady na ekranie, aby wyświetlić średnicę naczynia, licznik 340, mianownik sygnału, 380, sygnał i stosunek w kolejności malejącej. Aby zmodyfikować skalę osi Y w celu lepszej wizualizacji śladów, przejdź do pozycji Ślady.
Upewnij się, że opcja Limity automatyczne nie jest zaznaczona, a następnie wybierz opcję Edytuj limity użytkowników. Wybierz parametr, który chcesz dostosować. Wprowadź minimalne i maksymalne wartości osi, a następnie wybierz pozycję OK, aby potwierdzić.
Korzystając z oprogramowania do wykrywania krawędzi, dostosuj oświetlenie tak, aby ściana naczynia limfatycznego wyglądała jak ciemne linie. Wybierz obszar zainteresowania lub ROI wolny od tłuszczu i zanieczyszczeń i upewnij się, że nie przesuwasz tego ROI, ustaw próg tak, aby krawędź ściany naczynia była wykrywana przez cały cykl skurczu. Po aktywacji lampy powielacza zdjęć za pomocą oświetlaczy LED, naprzemiennie fale o długości 340 i 380 nanometrów oraz 50 milisekundowych ekspozycji, aby wzbudzić Fura 2, uchwycić widma emisyjne przy 510 nanometrach i 15 hercach w całym polu obrazowania.
Aby zmierzyć stosunek sygnału do tła, najpierw uzyskaj fluorescencję 340 i 380 z naczyniem limfatycznym w środku pola widzenia. Następnie przenieś pole widzenia na krawędź wanny bez naczynia, aby uchwycić tło, a następnie wymień roztwór do kąpieli na roztwór soli fizjologicznej o dopasowanej temperaturze bez odczynników. Aby usunąć nadmiar wskaźnika Fura 2, rejestruj wyjściowy sygnał fluorescencyjny Fura 2 i spontaniczne skurcze przez około 30 minut.
Następnie należy zarejestrować skumulowaną reakcję stężeniową nifedypiny i uzyskać pomiary tła dla każdego stężenia leku. Na koniec każdego eksperymentu przemyć naczynia limfatyczne roztworem soli fizjologicznej o dopasowanej temperaturze, aby uzyskać minimalny sygnał fluorescencyjny Fura 2 i maksymalną średnicę naczyń limfatycznych przy braku jonów wapnia, wymienić roztwór kąpieli na fizjologiczny roztwór soli o dopasowanej temperaturze, zawierający 10 milimolowych jonów wapnia i jonomycynę, aby uzyskać maksymalny sygnał fluorescencyjny Fura 2 i minimalną średnicę naczyń limfatycznych w warunki nasycenia jonów wapnia. Parametry, w tym amplituda skoku wapnia, wyjściowy poziom wapnia i szczytowy poziom wapnia, wykazywały zmniejszenie zależne od stężenia wraz ze stopniowym dodawaniem nifedypiny do komory perfuzyjnej.
Równocześnie parametry skurczu, takie jak skurcz, amplituda i obliczony przepływ, również wykazały stopniowy spadek. Wykresy manhattańskie pokazały indywidualne reakcje naczyń limfatycznych dla pomiarów rytmiczności, w tym interwału, czasu skurczu i czasu relaksacji.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru stężeń wapnia cytozolowego oraz średnicy naczyń w kurczących się naczyniach limfatycznych w czasie rzeczywistym. Umożliwia ona badanie dynamiki wapniowej i skurczowej w różnych warunkach doświadczalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia naczyniowa
- Sygnalizacja wapniowa
Wstęp
- Zrozumienie skurczów naczyń limfatycznych jest kluczowe w leczeniu obrzęku limfatycznego związanego z nowotworami.
- Ostatnie odkrycia w dziedzinie kanałów jonowych przyczyniły się do rozwoju biologii układu limfatycznego.
- Techniki takie jak badanie izolowanych naczyń oraz mikroskopia intravitalna są niezbędne do analizy funkcji limfatycznych.
- Wyzwania obejmują niewielki rozmiar tkanek oraz brak specyficznych markerów dla komórek mięśniowych naczyń limfatycznych.
Cel badania
- Identyfikacja celów terapeutycznych w obrębie naczyń limfatycznych.
- Opracowanie nowych metod leczenia chorób układu limfatycznego.
- Zrozumienie mechanizmów sygnałowych wapnia oraz procesów skurczu.
Zastosowane Metody
- Izolacja i kaniulacja naczyń limfatycznych krezki u uśpionych szczurów.
- Pomiar średnicy naczyń oraz stężeń wapnia przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zastosowanie specyficznych odczynników do wizualizacji dynamiki wapnia.
- Przyłożenie ciśnienia w celu utrzymania warunków fizjologicznych podczas eksperymentów.
Główne wyniki
- Osiągnięto jednoczesny pomiar stężeń wapnia oraz średnicy naczynia.
- Protokół umożliwia porównania wartości bazowych między grupami badawczymi.
- Uzyskano wgląd w mechanizmy skurczu.
- Wykazano pogłębione zrozumienie sygnalizacji wapniowej w naczyniach limfatycznych.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia solidne podejście do badania funkcji naczyń limfatycznych.
- Oferuje ona zalety w porównaniu z technikami opierającymi się na względnych zmianach poziomu wapnia.
- Protokół ten może ułatwić przyszłe badania nad biologią układu limfatycznego oraz chorobami z nim związanymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar ilościowy wolnego Ca2+ w cytozolu oraz kurczliwości w izolowanych naczyniach limfatycznych w czasie rzeczywistym umożliwia mechanistyczną weryfikację i minimalizację ryzyka w badaniach nad funkcjami układu limfatycznego. To dwuparametrowe podejście zwiększa wiarygodność prognostyczną walidacji celów terapeutycznych w obszarze chorób limfatycznych i portfeli badań nad biologią naczyń. Metoda ta stanowi solidną podstawę do oceny modulacji farmakologicznej kurczliwości naczyń limfatycznych oraz sygnalizacji wapniowej w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę zależnych od wapnia mechanizmów kurczliwych w naczyniach limfatycznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez korelację aktywności kanałów jonowych z kurczliwością naczyń.
- Ułatwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku potencjalnych celów wpływających na napięcie i przepływ limfy.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, ilościowe wyniki zarówno dynamiki Ca2+, jak i parametrów kurczliwych do opracowania testów.
- Umożliwia powtarzalne porównania grupy bazowej i grupy leczonej z wykorzystaniem pomiarów bezwzględnych.
- Wspiera przesiewowe badanie czynników farmakologicznych pod kątem ich wpływu na kurczliwość naczyń limfatycznych i sygnalizację wapniową.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele przedkliniczne do punktów końcowych funkcji limfatycznych istotnych dla przebiegu choroby.
- Umożliwia opracowanie biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie sygnalizacji Ca2+ z fenotypami skurczowymi.
- Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie terapii celowanych w układ limfatyczny.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych w zakresie opracowywania leków dla układu limfatycznego i naczyniowego, wspierając zarówno badania mechanistyczne, jak i profilowanie farmakologiczne.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określenie związku między sygnalizacją Ca2+ a kurczliwością naczyń limfatycznych w celu weryfikacji hipotez.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowane, ilościowe wyniki niezbędne do oceny związków i powtarzalności testu.
- Analityka: Zapewnia pomiary bezwzględne zmiennych zależnych w czasie rzeczywistym, umożliwiając solidną analizę statystyczną.
- Badania translacyjne: Łączy mechanistyczne odkrycia in vitro z modelami chorób in vivo poprzez punkty końcowe o charakterze funkcjonalnym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnorodnych modulatorów funkcji limfatycznej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz zrozumienie mechanizmów kurczliwości naczyń limfatycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar kluczowych parametrów fizjologicznych w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez dostarczenie ilościowych danych opartych na mechanizmach działania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów limfatycznych i naczyniowych we wczesnych etapach rozwoju projektów z uwzględnieniem korekty ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji naczyń, obrazowaniu fluorescencyjnym oraz analizie ilościowej.
- Wymaga specjalistycznego instrumentarium, w tym mikroskopów fluorescencyjnych oraz oprogramowania do detekcji krawędzi.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów kalibracji i pomiaru pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych typów naczyń lub gatunków może wymagać optymalizacji protokołu.
- Mały rozmiar tkanki oraz brak specyficznych markerów stanowią praktyczne wyzwania dla szerszego zastosowania metody.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:53
Setting Up the Perfusion Chamber to Measure Contractility in Isolated, Pressurized Lymph Vessels
2:34
Isolation and Cannulation of Mesenteric Lymph Vessels to Measure Cytosolic, Free Calcium and Vessel Diameter in Contracting Lymph Vessels
4:29
Measurement of the Absolute Concentrations of [Ca2+i2+]i in Isolated, Pressurized Lymph Vessels
