Name: Monochromatyczny multipleksowy ilościowy pomiar długości telomerów PCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Naucz się monochromatycznego multipleksowego ilościowego pomiaru długości telomerów PCR do badania starzenia się komórkowego z ludzkiego DNA. Ta metoda zapewnia precyzyjne i powtarzalne wyniki w badaniach populacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Komitetowi Doradczemu Sieci Badawczej Telomerów oraz funduszom National Institute on Aging / National Institute of Environmental Health Sciences (U24 AG066528 i U24 AG066528-S1), które umożliwiły wykonanie tej pracy.

Accurate Telomere Length Assessment in Human Population Studies

<ol><li>Hemann, M., Strong, M., Hao, L., Greider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shortest+telomere%2C+not+average+telomere+length%2C+is+critical+for+cell+viability+and+chromosome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability.</a> Cell. 107 (1), 67-77 (2001).</li>
<li>Xu, L., Li, S., Stohr, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+telomere+biology+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Pathol%3A+Mech+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of telomere biology in cancer.</a> Ann Rev Pathol: Mech Dis. 8, 49-78 (2013).</li>
<li>Lindrose, A., Drury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+reporting+recommendations+for+pcr-based+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Telomere+Research+Network%22%5BJournal%5D)">Minimum reporting recommendations for pcr-based telomere length measurement.</a> Telomere Research Network. , (2020).</li>
<li>Verhulst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary%3A+The+reliability+of+telomere+length+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Commentary: The reliability of telomere length measurements.</a> Int J Epidemiol. 44 (5), 1683-1686 (2015).</li>
<li>Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement-caveats+and+a+critical+assessment+of+the+available+technologies+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools.</a> Mutat Res. 730 (1-2), 59-67 (2012).</li>
<li>Mundstock, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+obesity+on+telomere+length%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis.</a> Obesity. 23 (11), 2165-2174 (2015).</li>
<li>Haycock, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucocyte+telomere+length+and+risk+of+cardiovascular+disease%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: Systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 349, 4227(2014).</li>
<li>Astuti, Y., Wardhana, A., Watkins, J., Wulaningsih, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoking+and+telomere+length%3A+A+systematic+review+of+84+studies+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoking and telomere length: A systematic review of 84 studies and meta-analysis.</a> Environ Res. 158, 480-489 (2017).</li>
<li>Ridout, K. K., Ridout, S. J., Price, L. H., Sen, S., Tyrka, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depression+and+telomere+length%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Depression and telomere length: A meta-analysis.</a> J Affect Disord. 191, 237-247 (2016).</li>
<li>Wang, Q., Zhan, Y., Pedersen, N. L., Fang, F., Hägg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+all-cause+mortality%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length and all-cause mortality: A meta-analysis.</a> Ageing Res Rev. 48, 11-20 (2018).</li>
<li>Hu, R., Hua, X. G., Jiang, Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+telomere+length+in+risk+and+recurrence+of+prostate+cancer%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Associations of telomere length in risk and recurrence of prostate cancer: A meta-analysis.</a> Andrologia. 51 (7), e13304(2019).</li>
<li>Schneider, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+telomere+length+with+risk+of+disease+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Inter+Med%22%5BJournal%5D)">Association of telomere length with risk of disease and mortality.</a> JAMA Inter Med. 182 (3), 291-300 (2022).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+the+risk+of+cardiovascular+diseases%3A+A+mendelian+randomization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Telomere length and the risk of cardiovascular diseases: A mendelian randomization study.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 1012615(2022).</li>
<li>D'mello, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+shortened+leukocyte+telomere+length+and+cardiometabolic+outcomes%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Cardiovasc+Gene%22%5BJournal%5D)">Association between shortened leukocyte telomere length and cardiometabolic outcomes: Systematic review and meta-analysis.</a> Circulation: Cardiovasc Gene. 8 (1), 82-90 (2015).</li>
<li>Wilbourn, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+telomere+length+and+mortality+risk+in+non-model+vertebrate+systems%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The relationship between telomere length and mortality risk in non-model vertebrate systems: A meta-analysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160447(2018).</li>
<li>Gardner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+and+telomere+length%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Gender and telomere length: Systematic review and meta-analysis.</a> Exp Gerontol. 51, 15-27 (2014).</li>
<li>Lai, T. -P., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+telomere+length+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of telomere length measurement methods.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160451(2018).</li>
<li>Cawthon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+measurement+by+quatitative+pcr%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere measurement by quatitative pcr.</a> Nuc Acid Res. 30 (10), e47-e53 (2002).</li>
<li>Cawthon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement+by+a+novel+monochrome+multiplex+quantitative+pcr+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative pcr method.</a> Nuc Acid Res. 37 (3), e21-e21 (2009).</li>
<li>Lindrose, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+comparison+studies+of+telomere+length+measurement+using+qpcr+approaches%3A+A+critical+appraisal+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Method comparison studies of telomere length measurement using qpcr approaches: A critical appraisal of the literature.</a> PLoS One. 16 (1), e0245582(2021).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+extraction%2C+DNA+integrity%2C+and+laboratory+on+the+precision+of+qpcr-based+telomere+length+measurement+-+a+multi-lab+impartial+study%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA extraction, DNA integrity, and laboratory on the precision of qpcr-based telomere length measurement - a multi-lab impartial study.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ph+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 474-481 (1997).</li>
<li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+yield+and+purity%3A+An+overlooked+detail+of+pcr+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA yield and purity: An overlooked detail of pcr troubleshooting.</a> Clin Microbiol Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).</li>
<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+chronological+age+across+the+human+lifespan%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+414+study+samples+including+743%2C019+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length and chronological age across the human lifespan: A systematic review and meta-analysis of 414 study samples including 743,019 individuals.</a> Ageing Res Rev. 90, 102031(2023).</li>
<li>Axelrad, M. D., Budagov, T., Atzmon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+telomerase+activity%3B+a+yin+and+yang+of+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence.</a> J Vis Exp. (75), e50246(2013).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-mediated+inflammatory+diseases+and+leukocyte+telomere+length%3A+A+mendelian+randomization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genetics%22%5BJournal%5D)">Immune-mediated inflammatory diseases and leukocyte telomere length: A mendelian randomization study.</a> Front Genetics. 14, 1129247(2023).</li>
<li>Van Ockenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressful+life+events+and+leukocyte+telomere+attrition+in+adulthood%3A+A+prospective+population-based+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Stressful life events and leukocyte telomere attrition in adulthood: A prospective population-based cohort study.</a> Psychol Med. 45 (14), 2975-2984 (2015).</li>
<li>Zong, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+air+pollution+exposure+and+telomere+length%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health%22%5BJournal%5D)">Ambient air pollution exposure and telomere length: A systematic review and meta-analysis.</a> Public Health. 215, 42-55 (2023).</li>
<li>Tang, L., Li, D., Wang, J., Su, B., Tian, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+air+pollution%2C+genetic+risk+and+telomere+length+in+uk+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22J+Expo+Sci+Environ+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Ambient air pollution, genetic risk and telomere length in uk biobank.</a> J Expo Sci Environ Epidemiol. , (2023).</li>
<li>Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement-caveats+and+a+critical+assessment+of+the+available+technologies+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools.</a> Mutat Res. 730 (1), 59-67 (2012).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+cell+type-specific+telomere+length+changes+in+subsets+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic and cell type-specific telomere length changes in subsets of lymphocytes.</a> J Immunol Res. 2016, 5371050(2016).</li>
<li>Needham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Socioeconomic+status%2C+health+behavior%2C+and+leukocyte+telomere+length+in+the+national+health+and+nutrition+examination+survey%2C+1999-2002%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Sci+Med%22%5BJournal%5D)">Socioeconomic status, health behavior, and leukocyte telomere length in the national health and nutrition examination survey, 1999-2002.</a> Soc Sci Med. 85, 1-8 (2013).</li>
<li>Verhulst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+comparability+between+qpcr-based+telomere+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Res%22%5BJournal%5D)">Improving comparability between qpcr-based telomere studies.</a> Mol Ecol Res. 20 (1), 11-13 (2020).</li>
<li>Dagnall, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pre-analytic+variables+on+the+reproducibility+of+qpcr+relative+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement.</a> PloS one. 12 (9), e0184098(2017).</li>
<li>Lin, J., Smith, D. L., Esteves, K., Drury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement+by+qpcr-summary+of+critical+factors+and+recommendations+for+assay+design%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement by qpcr-summary of critical factors and recommendations for assay design.</a> Psychoneuroendocrinology. 99, 271-278 (2019).</li>
<li>Wolf, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-tissue+comparison+of+telomere+length+and+quality+metrics+of+DNA+among+individuals+aged+8+to+70+years%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-tissue comparison of telomere length and quality metrics of DNA among individuals aged 8 to 70 years.</a> PLOS One. 19 (2), e0290918(2024).</li>
<li>RoDer, B., FruHwirth, K., Vogl, C., Wagner, M., Rossmanith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+long-term+storage+on+stability+of+standard+DNA+for+nucleic+acid-based+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of long-term storage on stability of standard DNA for nucleic acid-based methods.</a> J Clin Microbiol. 48 (11), 4260-4262 (2010).</li>
<li>Dagnall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pre-analytic+variables+on+the+reproducibility+of+qpcr+relative+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement.</a> PLoS One. 12 (9), e0184098(2017).</li>
<li>Shao, W., Khin, S., Kopp, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+effect+of+repeated+freeze+and+thaw+cycles+on+stability+of+genomic+DNA+using+pulsed+field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Characterization of effect of repeated freeze and thaw cycles on stability of genomic DNA using pulsed field gel electrophoresis.</a> Biopreserv Biobank. 10 (1), 4-11 (2012).</li>
<li>Institute for Statistics and Mathematics of WU. The Comprehensive R Archive Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/">https://cran.r-project.org/</a> (2024).</li>
<li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data%3A+a+practical+guide+for+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biol Rev. 85 (4), 935-956 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metodą najczęściej stosowaną do pomiaru TL w większych badaniach populacyjnych przed 2002 r. była analiza Southern blot końcowych długości fragmentów restrykcyjnych (TRF)24,25. TRF, pomimo doskonałej precyzji i odtwarzalności w specjalistycznych laboratoriach, ma ograniczoną możliwość zastosowania ze względu na ilość i jakość wymaganego DNA oraz ograniczoną przepustowość, zapewniając w ten sposób tło dla zwiększonego wykorzystania testów TL opartych na qPCR, a następnie testu MMqPCR. Metoda MMqPCR TL zapewnia powtarzalny pomiar TL po skonfigurowaniu, optymalizacji i konserwacji z uwagą poświęconą każdemu kryteriom kontroli jakości. Obliczanie i raportowanie specyficznego ICC dla każdej analizowanej kohorty jest wymagane w celu zapewnienia wiarygodności testu. Chociaż metoda MMqPCR zależy od jakości DNA i wiedzy technicznej, dobrze nadaje się do dużych badań populacyjnych badających TL, ponieważ wymaga niewielkich ilości DNA, jest bardziej niezawodna niż PCR singleplex i jest bardziej wydajna pod względem kosztów odczynników i czasu techników niż inne metody. Zdolność do generowania wysokich ICC dostarcza dodatkowych danych wspierających zastosowanie MMqPCR w dużych badaniach populacyjnych TL. Pomiar MMqPCR TL może być stosowany w szerokim zakresie badań mających na celu określenie roli TL jako biomarkera śmiertelności z jakiejkolwiek przyczyny, starzenia się, stresu w ciągu życia, narażenia środowiskowego i wyników zdrowia fizycznego, takich jak choroby układu krążenia i nowotwory 4,7,8,10,11,12,13,26,27,28, 29,30,31.
Jednym z ograniczeń metody MMqPCR jest to, że podaje ona TL jako stosunek T/S, względne oszacowanie długości, które różni się w zależności od wyboru pojedynczej kopii genu, składu mieszanki głównej i parametrów cyklicznych PCR32. Stosunek T/S jest niejednostkowy. W związku z tym, bez połączenia z innymi metodologiami pomiaru TL, metoda ta nie jest w stanie podać oszacowań w wartościach par podstawowych 18,33,34. W rezultacie, stosunek T/S musi zostać przekształcony w Z-score, aby miał znaczenie we wszystkich badaniach35. Należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania tej czynności w różnych laboratoriach, metodach i testach. Ponadto metoda ta, podobnie jak w przypadku testów hybrydyzacji na bazie żelu, może obejmować kwantyfikację telomerów śródmiąższowych. Jednak sekwencje te stanowią bardzo małą część całkowitej zawartości telomerów DNA na genom. Ponadto śródmiąższowe sekwencje telomerowe z większym prawdopodobieństwem zawierają niedopasowane sekwencje par zasad, które odbiegają od kanonicznych powtórzeń telomerów, zmniejszając prawdopodobieństwo wiązania i amplifikacji starterów. Ponadto, chociaż minimalna ilość DNA potrzebna do testu MMqPCR jest korzystna, ważne jest, aby zauważyć, że na pomiary TL oparte na qPCR mają wpływ czynniki przedanalityczne wpływające na jakość i integralność DNA, w tym warunki przechowywania próbki, metodologia ekstrakcji DNA i tkanka biologiczna 36,37. Wykazano, że kontrola analityczna tych czynników może zwiększyć zewnętrzną trafność pomiarów TL wygenerowanych za pomocą qPCR38. Mimo to wpływ różnic w jakości DNA na TL generowany za pomocą testu MMqPCR musi być w szczególności systematycznie oceniany, ponieważ nie istnieją obecnie żadne wytyczne oparte na danych, które pozwoliłyby określić, czy próbka jest wystarczającej jakości, aby wygenerować dokładne oszacowanie TL przy użyciu tego podejścia. Pomimo tych ograniczeń zastosowania tego testu w badaniach nad wynikami zdrowotnymi na poziomie populacji są znaczące.
W przypadku korzystania z testu MMqPCR konieczna jest ciągła ocena precyzji i przepustowości. Zgodnie z obecnymi założeniami, technicy przeprowadzają jednocześnie potrójne pobieranie próbek na zduplikowanych płytkach za pomocą dwóch termocyklerów. W przypadku braku wielu termocyklerów zalecamy zachowanie zduplikowanych pomiarów i sekwencyjne uruchamianie płyt w celu zwiększenia precyzji, nawet kosztem zmniejszonej przepustowości. Każda decyzja o nadaniu priorytetu przepustowości nad precyzją, na przykład poprzez zastosowanie pojedynczych potrójnych pomiarów, powinna być poprzedzona dokładnym testowaniem i oceną otrzymanych ICC przed przystąpieniem do analizy próbek analitycznych. Podejmując decyzje dotyczące przepustowości i precyzji, należy wziąć pod uwagę wielkość próbki i jakość próbki DNA. Mniejszy rozmiar próbki lub próbki DNA niskiej jakości wymagają priorytetowego traktowania większej precyzji23. Ma to jeszcze większe znaczenie podczas pracy z próbkami z powiązanych grup (np. członków rodziny, osób z wieloma punktami czasowymi). W takich przypadkach staranne planowanie, na przykład przypisanie powiązanych próbek do tej samej płytki przed rozpoczęciem eksperymentu, jest jednym ze sposobów zapobiegania utracie mocy statystycznej w wyniku niezamierzonego pomieszania grupy po płytce.
Do tego testu użyto spektrofotometru do oceny jakości próbki DNA: próbki w zakresie 1,6-2,0 dla proporcji 260/280 i 2,0-2,2 dla proporcji 260/230 uznano za dopuszczalne. Ta ocena jakości i dokładna ocena dwuniciowego DNA za pomocą fluorometru są krytycznymi krokami w tym protokole w celu uzyskania powtarzalnych danych TL. Inne, bardziej opisowe miary integralności DNA, takie jak wielkość fragmentu i/lub sumarczne miary jakości DNA określone za pomocą żelu agarozowego (np. liczba integralności DNA) mogą być również wykorzystane do określenia jakości próbki38. Zalecamy również, aby rozcieńczanie próbek następowało tylko w momencie przygotowania próbki do przeprowadzenia testu MMqPCR. Gwarantuje to, że podwielokrotności DNA są poddawane jak najmniejszej ilości manipulacji po ekstrakcji, co zmniejsza zmienność w postępowaniu przed testem. W przypadku konieczności transportu próbek DNA, należy je przewozić w suchym lodzie w najwyższym możliwym stężeniu, aby złagodzić degradację zachodzącą w próbkach DNA przy niższych stężeniach39,40. Ze względu na degradację DNA, która zachodzi w cyklach zamrażania i rozmrażania, liczba zamrażania i rozmrażania w celu zaopatrzenia DNA powinna być zminimalizowana41. Podwielokrotności zbiorczego kontrolnego DNA należy utworzyć przed uruchomieniem kohorty, a podwielokrotności poszczególnych analitycznych próbek DNA należy utworzyć przed przeprowadzeniem testu.
Kluczowe wskaźniki wydajności testu i kontroli jakości obejmują sygnał NTC, CV międzypłytkowe i wewnątrzpłytkowe oraz krzywą wzorcową R2. Niespełnienie kryteriów kontroli jakości można złagodzić na kilka sposobów. Regularna zmiana zapasów PCR klasyH2Oi porcjowanie podzapasów PCR klasyH2Odla każdej pary płytek zminimalizuje źródła zanieczyszczeń, a także amplifikację NTC. Dodatkowe kroki mające na celu zmniejszenie zanieczyszczenia obejmują: wyznaczenie specjalnego kaptura PCR dedykowanego tylko do testu MMqPCR; przetarcie kaptura i sprzętu do PCR roztworem odkażającym DNA; naświetlanie pomieszczenia światłem ultrafioletowym; i ćwiczenie sterylnej techniki w kapturze PCR. Aby zwiększyć powtarzalność testu i zmniejszyć CV, zaleca się energiczne wirowanie próbek, rozcieńczeń i pasków PCR na odpowiednich etapach wirowania i dokładne ponowne zawieszenie podczas pipetowania próbek DNA. Poniżej progowej wzorcowej krzywej R2 (<0,995) można najprawdopodobniej przypisać błędom pipetowania podczas ładowania płytek. Aby tego uniknąć, należy zwracać szczególną uwagę na precyzyjne pipetowanie i kalibrować pipety raz w roku, energicznie mieszać standardowe paski PCR przed załadowaniem i starannie organizować materiały eksploatacyjne, aby promować wydajny przepływ pracy. Jeśli zaobserwuje się, że przy użyciu dwóch obrabiarek i jednej płyty zaobserwowano, że stale osiągają wyższe CV, maszyna powinna być serwisowana jako potencjalny sposób na rozwiązanie problemu. Płytki kontroli jakości od producenta powinny być regularnie uruchamiane na płytach w celu oceny wydajności termocyklera.
Jeśli problemy nie ustąpią nawet po zastosowaniu kroków zalecanych powyżej, poniższe kroki można wykonać w celu rozwiązania problemu z protokołem. Prowadzenie rejestru tego, kiedy wszystkie odczynniki zostały poddane porcjowaniu i wszelkich istotnych dat ważności, może pomóc usprawnić proces rozwiązywania problemów, gdy nieuchronnie pojawią się trudności. Ważną częścią każdego procesu rozwiązywania problemów jest dostosowanie tylko jednego odczynnika na raz w celu określenia konkretnej przyczyny niespełniających kryteriów kontroli jakości, zaczynając od najtańszego odczynnika, o którym mowa. Na przykład, jeśli zarówno telomer, jak i gen z pojedynczą kopią mają niską wydajność, bardziej prawdopodobną przyczyną są wspólne odczynniki, takie jak DTT, dNTP lub podwielokrotność SYBR niż startery specyficzne dla amplikonu. Przy podanej cenie nowe porcje powinny być testowane w kolejności DTT, następnie dNTP, a na końcu, jeśli problem nadal występuje, nowe podwielokrotności SYBR. I odwrotnie, jeśli tylko jeden z amplikonów (telomer lub pojedyncza kopia genu) ma niską wydajność, przyczyną trudności jest najprawdopodobniej jeden ze starterów. Interpretacja pików krzywej topnienia przedstawiona na rysunku 8 może służyć jako źródło kluczowych informacji na potrzeby rozwiązywania problemów. Wizualizacja dwóch pików krzywej topnienia może być wykorzystana do zidentyfikowania potencjalnych problemów z konkretną próbką, ponieważ pojedyncza próbka problemowa będzie wyróżniać się na tle ogólnego trendu pików wykazywanych przez wzorce lub pozostałe próbki analityczne. Krzywa topnienia może być również wykorzystana do zdiagnozowania problemów z konkretnym starterem, jeśli piki dla danego amplikonu są systematycznie mniej ostre niż dla drugiego.
W tym manuskrypcie szczegółowo opisano, jak skutecznie skonfigurować test MMqPCR do pomiaru TL o szerokim zastosowaniu w badaniach nad zdrowiem publicznym oraz przedstawiono kluczowe zalecenia dotyczące kontroli jakości i rozwiązywania problemów w celu zwiększenia dostępności i niezawodności tej wydajnej i opłacalnej metody.

Telomery to kompleksy ochronne znajdujące się na końcach wszystkich chromosomów eukariotycznych, składające się z wysoce konserwatywnych, powtarzalnych sekwencji DNA oraz białek z nimi związanych. Telomer chroni integralność DNA, zapewniając stabilność chromosomową. Postępujące skracanie telomerów zachodzi w dzielących się komórkach w wyniku niepełnej syntezy DNA nici opóźnionej, uszkodzeń DNA oraz innych czynników1,2. Rosnąca liczba dowodów wspierających uznanie długości telomerów (TL) za biomarker starzenia się i chorób związanych z wiekiem w ciągu całego życia człowieka wiąże się ze zwiększeniem liczby rodzajów testów pomiaru TL wykorzystywanych do oceny roli TL w badaniach nad ekspozycją, chorobami i stanem zdrowia ludzi3,4,5. Metaanalizy wykazały związki TL z ogólną śmiertelnością, ekspozycją na czynniki środowiskowe oraz efektami zdrowotnymi, w tym z nowotworami, chorobami układu sercowo-naczyniowego i cukrzycą6,7,8,9,10,11,12,13. Powyższe meta-asocjacje wynikają z badań wykorzystujących jedną z ponad dwóch tuzinów różnych metod pomiaru TL, przy czym siła tych związków wykazuje tendencję do zróżnicowania w zależności od zastosowanej metody14,15,16. Wybór optymalnej metody pomiaru TL dla danego badania naukowego jest kluczowym krokiem w celu zapewnienia dokładnych wyników, ponieważ każda metoda posiada własne zalety i wady5,17.
Ze względu na stosunkowo niski koszt odczynników, krótki czas oczekiwania na wyniki analiz, skalowalność oraz mniejsze zapotrzebowanie na początkową ilość DNA, techniki pomiaru TL oparte na metodzie PCR są często preferowane podczas prowadzenia badań na dużych populacjach próbek, badań z ograniczonym dostępem do próbek o wysokich stężeniach DNA lub badań, w których priorytetem jest wysoka przepustowość. Pierwsza metoda pomiaru TL oparta na PCR, czyli jednoplexowa ilościowa reakcja polimerazy łańcuchowej (qPCR) opracowana pierwotnie przez Richarda Cawthona, wykorzystuje stosunek sygnałów fluorescencji amplifikacji telomerów (T) i genu pojedynczej kopii (S), przeprowadzanych na oddzielnych płytkach PCR18. W tym podejściu startery komplementarne do powtarzalnych sekwencji DNA telomerów (T) są używane do amplifikacji całkowitej zawartości DNA telomerowego w próbce, a następnie są one ilościowo określane poprzez detekcję fluorescencyjnego reportera SYBR green. Podobnie, startery komplementarne do regionu międzygenowego konserwatywnego genu pojedynczej kopii (S) są wykorzystywane do ilościowego określenia liczby kopii genomu. Te dwie wartości są wyznaczane&#160;w odniesieniu do standardowej krzywej DNA genomowego, stosowanej we wszystkich analizach w ramach projektu w celu kontrolowania zmienności między płytkami. Podzielenie całkowitej ilości DNA telomerowego (T) przez liczbę pojedynczych kopii genomu (S) daje stosunek T/S, będący bezwymiarową, względną miarą reprezentującą średnią zawartość telomerów na komórkę dla danej próbki DNA18,19. Zatem stosunek T/S nie jest bezpośrednim pomiarem długości funkcjonalnej; niemniej jednak, zgodnie z normami literaturowymi, w całym niniejszym protokole posługujemy się terminem średnia TL na próbkę.
Metoda ta została opracowana w 2009 roku, kiedy Richard Cawthon opisał test monochromatycznego multipleksowego qPCR (MMqPCR) jako podejście mające na celu potencjalne zmniejszenie zmienności stosunku T/S w porównaniu z pierwotną metodą pojedynczego qPCR19. Test MMqPCR łączy zalety metody qPCR z dodatkową korzyścią w postaci pomiaru sygnałów T i S w tej samej studzience reakcyjnej przy użyciu jednego fluoroforu raportującego, co zmniejsza błąd w stosunku do pojedynczego qPCR i skutkuje wyższą precyzją oraz powtarzalnością19. Ponadto ta metoda multipleksowa potencjalnie obniża koszty i zwiększa wydajność, ponieważ wymaga połowy liczby reakcji w porównaniu z testem pojedynczym19.
Biorąc pod uwagę zalety pomiaru TL metodą MMqPCR, metoda ta jest odpowiednia do badań populacyjnych nad powiązaniami TL z czynnikami ekspozycji, efektami zdrowotnymi i procesami biologicznymi. Jednakże wdrożenie tej metody może być trudne. Aby sprostać tym wyzwaniom, szczegółowo opisujemy protokół pomiaru TL metodą MMqPCR stosowany w naszym laboratorium, podkreślając kluczowe kroki wprowadzone w celu zwiększenia precyzji analizy, zmniejszenia ryzyka kontaminacji oraz poprawy powtarzalności.
Ponadto protokół ten opisuje kroki służące do oczyszczania danych i obliczania współczynnika korelacji wewnątrzklasowej (ICC), który jest ważną miarą statystyczną powtarzalności pomiarów TL&#160;2. Na podstawie naszych reprezentatywnych wyników wykazujemy możliwość uzyskania wysokich wartości ICC przy zastosowaniu tego protokołu. Dodatkowo identyfikujemy kroki kontroli jakości (QC) i rozwiązywania problemów, które powinny zmniejszyć zmienność pomiarów TL i zwiększyć wynikowy wskaźnik ICC. Ze względu na wysoką powtarzalność, wydajność i opłacalność tej metody, pomiar TL za pomocą MMqPCR jest idealny do epidemiologicznych badań nad TL. Rysunek 1&#160; przedstawia wizualny przegląd metody MMqPCR opisanej w tym protokole.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig01v2.jpg" /> 
Rycina 1: Przegląd metody. Ogólny schemat monochromatycznej multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej do pomiaru długości telomerów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Probówki 0,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0099</td><td>Seal-Rite 0,5 ml Probówki mikrowirówkowe, sterylne Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5599</td><td>Seal-Rite 1,5 ml Probówki do mikrowirówek, sterylne Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>100mM DTT</td><td>In House</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wykonane z zapasu DTT, rozcieńczonego octanu sodu i klasy PCR H2O Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-959-53A</td><td>Corning 352196 Falcon 15 ml stożkowe probówki wirówkowe Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>1M MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>50152107</td><td>Biotang Inc 1M MgCl2 1M roztwór chlorku magnezu, przygotowany w wodzie 18,2 megaomów i przefiltrowany przez filtr 0,22 mikrona Temperatura i warunki przechowywania: 4 & stopnie; C&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Złoty bufor</td><td>w domu</td><td>Nie dotyczy</td><td>10X Złoty bufor rozcieńczony PCR klasy H2O Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 & stopni; C&nbsp;</td></tr><tr><td>25mM dNTPs</td><td>New England BioLabs</td><td>N0446S</td><td>Zestaw roztworów deoksynukleotydowych Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki 5 ml</td><td>Termo Fisher</td><td>3391276</td><td>Argos Technologies Probówki do mikrowirówek &ndash; 5mL Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td>96-dołkowe płytki PCR z twardą skorupą, niskoprofilowe, cienkościenne, listwowe, białe / przezroczyste Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa Office</td><td>Depot</td><td>3489072</td><td>Reynolds Wrap Stanard Rolka folii aluminiowej, 12" x 75', srebrna Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold Kit &ndash; Polimeraza i bufor</td><td>Thermo Fisher</td><td>4311806</td><td>AmpliTaq Gold DNA Polymerase z Gold Buffer i MgCl2 (MgCl2 w tym zestawie nie jest używany), 10X Gold Buffer, 2.5U AmpliTaq Gold Polymerase Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Betaina</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ77507AB</td><td>Betaina, 5M Solution, klasa biologii molekularnej, ultraczysta, 10mL Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Big Tube Rack</td><td>Thermo Fisher</td><td>344817</td><td>Fisherbrand 4-drożny stojak na tuby Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CFX Maestro</td><td>Bio-Rad</td><td>12004110</td><td>Oprogramowanie do konfiguracji płytki PCR w czasie rzeczywistym, zbierania danych, statystyk i tworzenia wykresów wyników Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Moduł reakcji optycznej CFX96 do systemów PCR w czasie rzeczywistym z pakietem startowym</td><td>Bio-Rad</td><td>1845096</td><td>96-dołkowy moduł optyczny do PCR w czasie rzeczywistym Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1539706</td><td>Ditiothreitol, >99.5+ Klasa biologii molekularnej, 5 g Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-32</td><td>ELIMINase Laboratory Deminmin Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Filtr HEPA</td><td>USA Scientific</td><td>Filtry zamienne</td><td>Wysokowydajny filtr cząstek stałych do stacji roboczych AirClean Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fisher</td><td>06666A</td><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki zadaniowe, 1-warstwowe Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Koryto załadowcze</td><td>Thermo Fisher</td><td>14387069</td><td>Thermo Scientific Matrix Zbiorniki odczynników Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Nie dotyczy</td><td>Pakiet Microsoft 365, aplikacja Excel Temperatura i warunki przechowywania:</td></tr><tr><td>Mini wirówka</td> w temperaturze pokojowej <td>Genesee Scientific</td><td>31-500B</td><td>Mini wirówka Poseidon 31-500B, niebieska pokrywka Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>PCR klasy H2O</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9937</td><td>Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC) Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>PCR Hood</td><td>USA Scientific</td><td>4263-2588</td><td>Stacja robocza z kwasami nukleinowymi z filtracją HEPA, systemy AirClean Kombinowana stacja robocza PCR Temperatura i warunki przechowywania: Paski PCR o temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0776</td><td>Niskoprofilowe probówki i płaskie nakrętki, paski 8 Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Stojak na probówki do PCR</td><td>Thermo Fisher</td><td>344820</td><td>Fisherbrand 96-dołkowy stojak na probówki do PCR Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (wielokanałowe)</td><td>Ranin</td><td>17005860</td><td>Końcówki do pipet SR LTS 20&micro; L F 960A/5, 20&mikro; L Maksymalna Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (jednokanałowe)</td><td>USA Scientific</td><td>1181-3850</td><td>10&micro; L Końcówki filtra TipOne RPT z podziałką Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (jednokanałowe)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1850</td><td>20&micro; L Skośne końcówki filtra TipOne RPT Temperatura i warunki przechowywania: Końcówki</td></tr> do pipet w temperaturze pokojowej <tr><td>(jednokanałowe)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0880</td><td>200&micro; l Naturalne końcówki do pipet TipOne w stojakach Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (jednokanałowe)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2890</td><td>1000&micro; l Naturalne końcówki do pipet TipOne z podziałką w stojakach Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej</td></tr><tr><td>(wielokanałowe)Pipety</td> wielofunkcyjne <td>Ranin</td><td>17013802</td><td>Pipet-Lite L8-10XLS, 0,5 do 10 i mikro; L Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej</td></tr><tr><td>(wielokanałowe)Pipety</td> wielofunkcyjne <td>Ranin</td><td>17013803</td><td>Pipet-Lite L8-20LS+, od 2 do 20 mikro; L Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej</td></tr><tr><td>(jednokanałowe)</td><td>Pipety Thermo Fisher</td><td>F144802G</td><td>Gilson Pipetman Classic, od 1 do 10 i mikro; L Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej</td></tr><tr><td>(jednokanałowe)</td><td>Pipety Thermo Fisher</td><td>F123600</td><td>Gilson Pipetman Classic, od 2 do 20 i mikro; L Temperatura i warunki przechowywania: Pipety do temperatury pokojowej</td></tr><tr><td>(jednokanałowe)</td><td>Pipety Thermo Fisher</td><td>F123601</td><td>Gilson Pipetman Classic, od 20 do 200 i mikro; L Temperatura i warunki przechowywania: Pipettory do temperatury pokojowej</td></tr><tr><td>(jednokanałowe)</td><td>Pipety Thermo Fisher</td><td>F123602</td><td>Gilson Pipetman Classic, od 200 do 1000 mikro; L Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca do płyt</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Microseal " B&rdquo; Folia uszczelniająca do płytek PCR, klej, optyczna Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Wirówka płytkowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-100-141</td><td>Fisherbrand Mini wirówka do płytek, 230 V Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Filtr wstępny</td><td>USA Scientific</td><td>4235-3724</td><td>Filtr wstępny do systemów AirClean Stacje robocze Temperatura i warunki przechowywania: Pomieszczenie temperatura</td></tr><tr><td>Oprogramowanie R</td><td>Projekt R do obliczeń statystycznych</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wersja R 4.2.2 Temperatura i warunki przechowywania: Skala temperatury pokojowej</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>01-922-329</td><td>Waga analityczna OHAUS 30430060 serii PR, pojemność 62g Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Office Depot</td><td>458612</td><td>Nożyczki marki Office Depot, 8 ", proste, czarne, opakowanie 2 Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Sharpies</td><td>Sharpie</td><td>2151734</td><td>Brush Twin Markery permanentne, Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Single Copy Gene Forward Primer</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Niestandardowe</td><td>Patrz oddzielna tabela Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 &deg; C po ponownym uwodnieniu</td></tr><tr><td>Pojedynczy kopiujący gen Odwrotny starter</td><td>Zintegrowane technologie DNA Niestandardowe</td><td></td><td>Patrz oddzielna tabela Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 &deg; C po nawodnieniu</td></tr><tr><td>Mały stojak na probówki</td><td>Thermo Fisher</td><td>21-402-17</td><td>Thermo Fisher 8601 Odwracalne stojaki na mikroprobówki z pokrywą Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Thermo Fisher</td><td>J63560. EQE</td><td>3M NaOAc pH 5,2 Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Szpatułka ze stali nierdzewnej</td><td>Thermo Fisher</td><td>3990240</td><td>Bel-Art SP Scienceware Łyżka do pobierania próbek ze stali nierdzewnej i szpatułka Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>SYBR Green I Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym &ndash; 10 000X Koncentrat w DMSO Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 &deg; C po ponownym uwodnieniu</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-927-55A</td><td>GD/X 25 mm Sterylny filtr strzykawkowy, medium filtracyjne z octanu celulozy, 0,2 i mu; m Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>Thermo Fisher</td><td>148232A</td><td>BD Luer-Lok Jednorazowe strzykawki bez igieł, 10mL Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2474100</td><td>TE Buffer, Tris-EDTA, 1X roztwór, pH 7,6, Biologia molekularna, Fisher BioReagents Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Telomere Forward Primer</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Niestandardowe</td><td>Zobacz oddzielną tabelę Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 &deg; C po uwodnieniu</td></tr><tr><td>Odwrócony podkład telomerów</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Niestandardowe</td><td>Patrz oddzielna tabela Temperatura i warunki przechowywania: minus 20 &deg; C po ponownym nawodnieniu</td></tr><tr><td>Żarówka</td> UV <td>Light USA Scientific</td><td>4288-2540</td><td>do stacji roboczych Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-151</td><td>Fisherbrand Mini Vortex Mixer, 115 V, 50/60 Hz Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr><tr><td>Waż łódź</td><td>Thermo Fisher</td><td>01-549-752</td><td>Sterylna sześciokątna łódka wagowa Fisherbrand, 10 mL Temperatura i warunki przechowywania: Temperatura pokojowa</td></tr></tbody></table>

monochromatyczny multipleksowy ilościowy pomiar długości telomerów pcr

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Telomery to struktury rybonukleoproteinowe na końcu wszystkich chromosomów eukariotycznych, które chronią DNA przed uszkodzeniem i zachowują stabilność chromosomów. Długość telomerów (TL) jest związana z różnymi ekspozycjami, procesami biologicznymi i wynikami zdrowotnymi. W artykule opisano protokół monochromatycznego ilościowego testu łańcuchowej polimerazy (MMqPCR) rutynowo przeprowadzanego w naszym laboratorium w celu pomiaru względnej średniej TL z ludzkiego DNA. Istnieje kilka różnych metod pomiaru TL opartych na PCR, ale konkretny protokół dla metody MMqPCR przedstawiony w tej publikacji jest powtarzalny, wydajny, opłacalny i odpowiedni dla badań populacyjnych. Ten szczegółowy protokół przedstawia wszystkie informacje niezbędne badaczom do ustalenia tego testu w swoim laboratorium. Ponadto protokół ten zapewnia konkretne kroki w celu zwiększenia odtwarzalności pomiaru TL za pomocą tego testu, zdefiniowanego przez współczynnik korelacji wewnątrzklasowej (ICC) w powtarzających się pomiarach tej samej próbki. ICC jest kluczowym czynnikiem w ocenie oczekiwanej mocy dla określonej badanej populacji; w związku z tym zgłaszanie specyficznych dla kohorty ICC dla dowolnego testu TL jest niezbędnym krokiem w celu zwiększenia ogólnego rygoru populacyjnych badań TL. Przykładowe wyniki wykorzystujące próbki DNA wyekstrahowane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pokazują możliwość generowania wysoce powtarzalnych danych TL przy użyciu tego protokołu MMqPCR.

Wyniki przedstawione w Tabeli 4 i Tabeli 5 stanowią przykład wysoce powtarzalnych pomiarów TL uzyskanych zgodnie z protokołem. W przypadku tych wyników DNA wyekstrahowano z 24 próbek mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z wytycznymi producenta. Te 24 próbki analizowano na dwóch płytkach 96-dołkowych. Jakość wszystkich próbek DNA sprawdzono za pomocą spektrofotometru i fluorometru, wykorzystując średni stosunek 260/280, średni stosunek 260/230 oraz stężenie dsDNA w celu określenia kwalifikowalności do analizy i czynnika rozcieńczenia próbek (Tabela 6). Tabela 6 podkreśla również znaczenie ilościowego oznaczenia stężenia dsDNA, które może różnić się od stężenia DNA zmierzonego za pomocą spektrofotometru. Zmienność ta wynika z różnych podejść do kwantyfikacji. W szczególności spektrofotometr wyznacza stężenie DNA na podstawie absorbancji przy 280 nm i jest podatny na wahania spowodowane zanieczyszczeniami (np. białkami, solami itp.), które wpływają na odczyty absorbancji. W przeciwieństwieństwie do tego, stężenia dsDNA mierzone za pomocą fluorometru są określane przez fluorescencję barwnika, który wiąże się specyficznie z dsDNA, i w związku z tym przyjmuje się, że są one dokładniejszym odzwierciedleniem zawartości DNA. Próbki DNA poddano do trzech cykli zamrażania i rozmrażania przed analizą MMqPCR TL. Kontrolne DNA przygotowano z połączonych ekstraktów DNA z PBMC jednej osoby, co posłużyło do stworzenia siedmiopunktowego rozcieńczenia seryjnego od 2 ng/μL do 0,0313 ng/μL DNA. Niezależne krzywe standardowe stworzone dla kroku 9 PCR (amplikon telomerowy) i kroku 12 (amplikon genu pojedynczej kopii, w tym protokole albuminy) przedstawiono na Rysunku 6A,B. Analizy przeprowadzono na komercyjnym systemie detekcji Real-Time PCR, który wygenerował krzywą topnienia wykazującą powstawanie poszczególnych produktów amplikonowych w różnych temperaturach, co przedstawiono na Rysunku 8.
Tabela 4: Dane wyjściowe z pomiaru MMqPCR dla optymalnych wyników reprezentatywnych. Średnie stosunki T/S, SD, CV oraz Z-score TL dla 24 próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table 4_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 5: Wyniki danych dotyczących długości telomerów. Surowe dane z analizy MMqPCR są analizowane w oprogramowaniu, a następnie dodawane do szablonu arkusza kalkulacyjnego dołączonego jako Plik uzupełniający 1&#160; w celu dalszej analizy i kontroli jakości (QC). Ten arkusz wynikowy szablonu TL przedstawia podsumowanie danych, wyświetlając identyfikatory próbek, średnie TL, odchylenia standardowe (SD) oraz współczynniki zmienności (CV)&#160; dla każdej próbki na obu płytkach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table 5_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 6: Metryki jakości DNA z pomiarów spektrofotometrycznych i fluorometrycznych dla wyników próbek. Dane QC&#160;z podwójnej analizy spektrofotometrycznej i pojedynczego pomiaru fluorometrycznego dsDNA oraz wszelkich zanieczyszczeń w każdej próbce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table 6_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
<img alt="Rycina 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig08.jpg" /> 
Rycina 8: Przykład krzywej topnienia. Krzywa topnienia dla danych próbki wygenerowana przez oprogramowanie. Pierwszy pik w ~80 °C reprezentuje amplikon telomeru, a drugi pik w ~89 °C reprezentuje amplikon albuminy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W tym projekcie średnia wydajność telomerów wyniosła 98,6% w zakresie od 90,7 do 102,1, a średnia wydajność albuminy wyniosła 102,3% w zakresie od 93,6 do 108,2 we wszystkich seriach pomiarowych. Średnio z krzywych wzorcowych usunięto 0,97 powtórzeń, co spełnia kryteria kontroli jakości (QC) niniejszego protokołu. Średni współczynnik zmienności (CV) między płytkami wyniósł 1,83% przy SD równym 0,00616, a średni CV w obrębie płytki wyniósł 3,78% przy SD równym 0,00658. Średnie długości telomerów (TL) dla tych reprezentatywnych próbek przedstawiono w tabeli 4 oraz&#160;tabeli 5. Średnia wartość TL wyniosła 1,37 przy SD równym 0,24 i zakresie od 0,84 do 2,32. Stosunek T/S, SD, CV oraz TL znormalizowane do wyniku Z dla każdej próbki wymieniono w tabeli 4. Ponieważ wynik stosunku T/S w teście &#160;MMqPCR jest pomiarem względnym TL, wartości te przekształcono w wynik Z, aby umożliwić porównania między badaniami. ICC dla tego projektu obliczono za pomocą skryptu R zgodnie z wytycznymi TRN zawartymi w pliku uzupełniającym 2, uwzględniając efekty partii i serii pomiarowych20. Aby obliczyć ICC w obrębie projektu, ponownie przebadano 10% próbek, które przeszły weryfikację, dbając o to, aby na płytkach do ICC znalazła się co najmniej jedna próbka z każdej płytki kohorty. Ogólny wynik ICC projektu wynoszący 0,801 [CI: 0,703, 0,86] wskazuje na wysoką powtarzalność wyników TL.
Nie wszystkie wyniki będą optymalne. Wyniki przedstawione na Rysunku 9&#160;oraz w Tabeli 7&#160; ukazują suboptymalne wyniki testu MMqPCR. Rysunek 9&#160; przedstawia krzywą standardową z wydajnością telomerów poniżej 90%, co nie spełnia standardów kontroli jakości (QC) i wymaga powtórzenia całego płytki. Problemy z wydajnością starterów zazwyczaj wynikają z kwestii związanych z odczynnikami, dlatego w pierwszej kolejności należy monitorować daty przygotowania aliquotów oraz terminy ważności odczynników, aby ustalić, który z nich odpowiada za niską wydajność. Przeterminowane odczynniki powinny zostać wymienione przed ponownym uruchomieniem płytki. Tabela 7&#160; przedstawia płytkę, która przeszła wstępne kryteria QC na poziomie próbek, ale wykazuje wysoką zmienność między płytkami, co prowadzi do niepowodzenia QC na poziomie płytki. Zmienność między płytkami zazwyczaj wynika z błędów w technikach pipetowania i napełniania płytek. W takim przypadku technik powinien ocenić wszelkie problemy, które wystąpiły podczas przygotowania płytki, i upewnić się, że pipety są skalibrowane.
<img alt="Rysunek 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig09.jpg" /> 
Rysunek 9: Suboptymalne wyniki. Krzywa standardowa wyświetlona w oprogramowaniu nie przeszła kontroli jakości (QC), ponieważ wydajność amplifikacji dla primera telomerowego była mniejsza niż 90%. Obraz pochodzi z P1, lecz P2 wykazał podobnie niską wydajność. Dane z tego przebiegu nie mogły zostać wykorzystane i wszystkie próbki musiały zostać poddane analizie ponownie po wymianie przeterminowanego odczynnika, który był przyczyną problemu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 7: Wyniki suboptymalne. Tabela przedstawia szablon danych telomerowych dla serii pomiarowej, w której wiele próbek nie spełniło standardów kontroli jakości (QC). Próbki wymagające powtórzenia analizy określono na podstawie wartości CV, a następnie nazwę próbki zmieniono na czerwoną czcionkę w celu łatwej identyfikacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table 7_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Szablon arkusza danych telomerowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental File 1. MMqPCR Template_RE.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Obliczanie ICC. Protokół ten został opracowany przez Telomere Research Network (TRN). Plik ten został zmodyfikowany na podstawie 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental File 2. ICC Calculation_RE.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Wytyczne dotyczące raportowania TRN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental File 3. TRN Reporting Guidelines_RE.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru względnej długości telomerów (TL) za pomocą monochromatycznego multipleksowego ilościowego testu łańcuchowego polimerazy (MMqPCR). Test MMqPCR jest powtarzalną, wydajną i opłacalną metodą pomiaru TL z ludzkiego DNA w badaniach populacyjnych.

Monochromatyczny multipleksowy ilościowy pomiar długości telomerów PCR

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

Telomery to powtarzające się regiony nukleoproteinowe na końcach chromosomów, które skracają się za każdym razem, gdy komórki się dzielą, co powoduje zmniejszenie średniej długości telomerów w ciągu całego życia. Nasze laboratorium bada długoterminowy i międzypokoleniowy wpływ traumy i przeciwności losu na starzenie się komórek, mierząc długość telomerów w badaniach populacyjnych. Zainteresowanie biologią telomerów wykracza poza pomiar średniej długości telomerów.Opracowywane są nowe metody oceny długości telomerów specyficznych dla chromosomów i badania powiązań między wynikami zdrowotnymi a innymi aspektami biologii telomerów, takimi jak białka związane z telomerami i uszkodzenia DNA. Interdyscyplinarna sieć badawcza telomerów kierowana przez kierownika laboratorium, dr Stacy Drury, pracuje nad zwiększeniem rygoru pomiaru telomerów i odtwarzalności poprzez wspieranie międzynarodowych badań zespołowych dokumentujących wpływ czynników przedanalitycznych na precyzję oznaczania telomerów, a także ustalanie wytycznych dotyczących raportowania pomiarów długości telomerów generowanych za pomocą qPCR. Zwiększona precyzja MMqPCR pozwala na bardziej szczegółowe analizy wpływu wczesnych przeciwności losu i ekspozycji środowiskowej w ciągu życia na starzenie się komórek.Na przykład poprzez identyfikację okresów wrażliwości, w których narażenie występujące w tym oknie czasowym ma głębszy wpływ na wyniki zdrowotne w późniejszym życiu. Zacznij od dodania próbek genomowego DNA wyekstrahowanych z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do pasków PCR, odpowiednio A, B i C. Następnie wirować rozmrożoną kontrolną porcję DNA przez 30 sekund.Po krótkim odwirowaniu probówki, odessać pełną objętość do pierwszej probówki w pasku probówki do PCR o standardowej krzywej. Następnie dodaj 70 mikrolitrów wody klasy PCR do drugiej przez osiem probówek paska PCR o standardowej krzywej. Następnie ponownie zawiesić kontrolne DNA w pierwszej probówce i odessać 70 mikrolitrów do drugiej probówki.Odczekać 30 sekund i ponownie zawiesić roztwór w drugiej probówce. Zebrać odczynniki do mieszania głównego i pozwolić im osiągnąć temperaturę pokojową w kapturze PCR. Następnie dodać jeden mikrolitr podwielokrotności SYBR Green do podwielokrotności buforowej.Wirować wszystkie porcje przez 10 sekund i odwirowywać je przez pięć sekund. Następnie dodaj określone ilości wszystkich odczynników i starterów do mieszanki głównej do pięciomililitrowej probówki z betainą. Po wyjęciu polimerazy DNA z minus 20 stopni Celsjusza, wiruj ją przez 10 sekund, a następnie odwiruj przez pięć sekund.Po odwirowaniu powoli dodaj 128 mikrolitrów do mieszanki głównej. Wiruj pięciomililitrową rurkę z mieszanką główną przez 30 sekund, a następnie odłóż ją na bok. Na początek umieść dwie 96-dołkowe płytki, koryto załadowcze i wielokanałowe końcówki do pipet w kapturze PCR.Po oznaczeniu każdej tabliczki obróć płytę pierwszą o 180 stopni, tak aby numery kolumn były odwrócone do góry nogami, pozostawiając płytę drugą skierowaną w stronę technika. Następnie wlej pięciomililitrową probówkę przygotowanej mieszanki wzorcowej MMqPCR do koryta załadowczego. Użyj końcówki pipety, aby upewnić się, że cały roztwór z probówki został przeniesiony.Przymocuj końcówki do pipety wielokanałowej, dociskając u podstawy każdej końcówki, aby zapewnić szczelne uszczelnienie. Używając odwróconego pipetowania, najpierw dozuj mieszankę wzorcową do wszystkich parzystych lub wszystkich nieparzystych kolumn, naprzemiennie między dwiema płytkami. Po wirtowaniu i odwirowaniu pasków PCR ułóż je w stojaku na probówki w kolejności, w jakiej zostaną umieszczone na płytkach.Teraz obróć obie płyty o 180 stopni, aby numery kolumn zostały odwrócone w stosunku do technika. Użyj pipety wielokanałowej, aby ponownie zawiesić roztwory w paskach PCR. Za pomocą odwróconego pipetowania należy wypełnić pierwsze trzy kolumny każdej płytki paskiem A do PCR, naprzemiennie między parzystymi lub nieparzystymi kolumnami, tak jak w przypadku umieszczania mieszanki wzorcowej.Używając pipety o pojemności 200 mikrolitrów ustawionej na 90 mikrolitrów, dokładnie zawieś siódmą probówkę z roztworem wzorcowym w pasku S do PCR i napełnij kolumny od czwartej do szóstej na płytkach. Po napełnieniu talerzy delikatnie postukaj nimi o blat stołu, aby upewnić się, że płyn w studzienkach osiada na dnie. Następnie przykryj górną część płytek foliami uszczelniającymi, dociskając opuszkami palców wszystkie krawędzie folii, aby zapewnić szczelne uszczelnienie.Aby wymieszać zawartość talerzy, obracaj je na górze okapu przez 30 sekund. Następnie umieść uszczelnione płytki w wirówce na dwie minuty, tak aby otwory studzienek były skierowane do środka. Teraz umieść płytki w termocyklerze, upewniając się, że numery kolumn są czytelne.Wyczyść górną część każdej płytki czystą chusteczką przed zamknięciem górnej części termocyklera. Następnie kliknij przycisk Start Run w oprogramowaniu termocyklera dla obu maszyn. Po wyświetleniu monitu wprowadź tytuł plików analizy, który będzie używany do oznaczania i śledzenia danych z tego eksperymentu.Rozpocznij od wykonania testu MMqPCR w celu pomiaru długości telomerów. Następnie otwórz oprogramowanie i wybierz funkcję Konfiguracja płyty. Następnie wybierz opcję Wyświetl lub Edytuj blachę z menu rozwijanego.Teraz podkreśl wszystkie dołki na talerzu. Kliknij Wybierz fluorofory. Zaznacz pole oznaczone SYBR i upewnij się, że wszystkie inne pola nie są zaznaczone.Następnie kliknij OK, aby potwierdzić. Zachowując podświetlenie na wszystkich odwiertach, zlokalizuj i zaznacz pole obok SYBR, obok słowa Załaduj, aby oznaczyć wszystkie studnie SYBR. Teraz podświetl trzy studzienki kontrolne bez szablonu umieszczone na górze lub na dole standardowego rozcieńczenia szeregowego kontroli.Następnie z menu Sample Type (Typ próbki) po prawej stronie wybierz NTC. Podświetl 21 dołków, które składają się na standardowe rozcieńczenie szeregowe kontroli i wybierz Standard z menu Typ próbki. Podczas gdy te studnie są nadal wybrane, kliknij Replikacja techniczna.Z menu Replikuj rozmiar wybierz trzy, a następnie wybierz opcję Poziomo i kliknij przycisk Zastosuj. Następnie przewiń w dół do sekcji Seria rozcieńczeń i wprowadź dwa w polu Współczynnik rozcieńczenia. Dla płytki P1 wprowadź dwa razy 10 do potęgi minus trzy w polu Stężenie początkowe.Następnie zaznacz pole Zmniejszanie i kliknij Zastosuj, aby potwierdzić ustawienia. Dla tabliczki P2 wprowadź 3,13 razy 10 do potęgi ujemnej piątki w polu Stężenie początkowe. Upewnij się, że zaznaczyłeś pole Zwiększanie, a następnie wybierz pozycję Zastosuj, aby sfinalizować konfigurację.Teraz podświetl kolumny odpowiadające paskowi PCR A.Z menu Typ próbki wybierz Nieznany, a następnie przejdź do wyboru Replikacja techniczna. W menu Replikuj rozmiar wybierz trzy i wybierz opcję Poziomo przed kliknięciem przycisku Zastosuj. Kliknij przycisk OK w prawym dolnym rogu okna Edytor blachy.Potwierdź zmiany, klikając przycisk Tak po wyświetleniu monitu. Następnie sprawdź, czy krzywe na karcie Kwantyfikacja wydają się odpowiednie zarówno dla kroku dziewiątego, jak i kroku 12 oraz czy wartości wydajności między tymi dwoma krokami nie różnią się o więcej niż 10%W przypadku P1 wybierz krok dziewiąty i zaznacz 21 dołków odpowiadających krzywej standardowej. Skopiuj wartości Cq z prawego dolnego rogu okna oprogramowania.Następnie otwórz szablon arkusza danych telomerów i wklej te wartości do standardowego jednego arkusza, kolumny B.Następnie wprowadź wartość nachylenia kroku dziewiątego do komórki C4 w standardowym arkuszu. Sprawdzić, czy współczynnik zmienności dla każdego trójki wzorcowego rozcieńczenia jest niższy niż 0,1. W CFX wyklucz z analizy wszystkie odstające punkty danych, które powodują, że zestaw trójek wypada poza zakres.Teraz upewnij się, że tylko 72 dołki na próbki w pliku analizy P1 są podświetlone na niebiesko na karcie Kwantyfikacja. Następnie w kroku dziewiątym skopiuj wartości Cq i SQ znajdujące się w prawym dolnym rogu okna oprogramowania i wklej je do arkusza próbek P1, zaczynając od komórki D3. Korzystając z CFX Maestro, upewnij się, że wszystkie wartości Cq dla próbek analitycznych mieszczą się w zakresie najniższych i najwyższych wartości Cq krzywej wzorcowej. W arkuszu Excela sprawdź, czy początkowe stężenie w NTC jest mniejsze niż 5% średniej ilości DNA w dołkach na próbki.W celu kontroli jakości na poziomie próbki należy zbadać odchylenia standardowe i współczynnik zmienności w kolumnach J i K na arkuszach próbek P1 i P2. Sprawdzić, czy CV między poszczególnymi próbkami w arkuszu P1 i P2, w szczególności w kolumnie G, nie przekraczają 0,05. Jeżeli CV międzypłytkowe próbki jest wyższe niż dopuszczalne, należy usunąć maksymalnie jeden potrójny roztwór z obliczeń dla każdej próbki.W celu kontroli jakości na poziomie płytki należy sprawdzić, czy średnia różnica między płytkami we wszystkich próbkach na każdej płytce jest mniejsza niż 0,05. Jeżeli CV międzypłytkowe próbki jest wyższe niż dopuszczalne, z obliczeń dla każdej próbki należy usunąć maksymalnie jeden potrójny powtórzenie. W celu dodatkowej kontroli jakości na poziomie płyty sprawdź, czy całkowita różnica między płytami w arkuszu P1 w porównaniu z arkuszem P2 jest mniejsza niż 0,06.

monochrome-multiplex-quantitative-pcr-telomere-length-measurement

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisana jest dokładna, krótka, wyrafinowana i tania metoda, która ocenia długość telomerów w wielu tkankach i gatunkach za pomocą qRT-PCR. Ponadto opiszemy prosty test do oceny aktywności telomerazy jako uzupełniający test szkieletowy dla długości telomerów.

długość telomerów i aktywność telomerazy; Yin i Yang starzenia się komórek

W tym artykule omówiono szczegółowy protokół do ilościowego określania długości telomerów za pomocą zmodyfikowanej analizy fragmentów restrykcyjnych na końcu, który zapewnia szybki i efektywny bezpośredni pomiar długości telomerów. Technika ta może być stosowana do różnych źródeł komórkowych DNA w celu ilościowego określenia długości telomerów.

Zmodyfikowana analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych do ilościowego określania długości telomerów za pomocą hybrydyzacji w żelu

Tutaj szczegółowo opisujemy protokół ilościowego oznaczania długości telomerów za pomocą nieradioaktywnej detekcji chemiluminescencyjnej, koncentrując się na optymalizacji różnych parametrów wydajności zestawu do oznaczania długości telomerów TAGGG, takich jak ilości i stężenia w próbce.

Optymalizacja parametrów wydajnościowych testu długości telomerów TAGGG

Opisana jest ulepszona metoda polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy do genotypowania gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami służy do oddzielania strawionych amplikonów. Metoda ta może wyjaśnić monoizotopowe masy oligonukleotydów, co jest przydatne do identyfikacji składu zasadowego.

Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

Zdarzenia splicingu tandemowego występują w miejscach oddalonych od siebie o mniej niż 12 nukleotydów. Kwantyfikacja proporcji takich wariantów splicingu jest możliwa przy użyciu bezwzględnego ilościowego podejścia PCR. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób można określić ilościowo warianty splicingu genu STAT3, w których dwa zdarzenia splicingu skutkują włączeniem/wykluczeniem Serine-701 i α/β C-końcami.

Łączenie bezwzględnych i względnych ilościowych danych PCR w celu ilościowego określenia transkryptów wariantu splicingu STAT3

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta nadaje się do badania profilu ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura w kilku stanach patologicznych.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Tutaj opisujemy innowacyjną metodę określania polimorfizmów długości receptora dopełniacza 1 (CR1) do wykorzystania w wielu zastosowaniach, szczególnie w ocenie podatności na choroby takie jak choroba Alzheimera (AD). Metoda ta może być przydatna do lepszego zrozumienia roli izoform CR1 w patogenezie choroby Alzheimera.

Genotypowanie polimorfizmu długości receptora dopełniacza 1 metodą topnienia w wysokiej rozdzielczości: innowacyjne narzędzie do oceny podatności genów choroby Alzheimera

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Naucz się monochromatycznego multipleksowego ilościowego pomiaru długości telomerów PCR do badania starzenia się komórkowego z ludzkiego DNA. Ta metoda zapewnia precyzyjne i powtarzalne wyniki w badaniach populacyjnych.

Monochromatyczny multipleksowy ilościowy pomiar długości telomerów PCR

Przeglądaj więcej filmów