Monochromatyczny multipleksowy ilościowy pomiar długości telomerów PCR

Telomery to powtarzające się regiony nukleoproteinowe na końcach chromosomów, które skracają się za każdym razem, gdy komórki się dzielą, co powoduje zmniejszenie średniej długości telomerów w ciągu całego życia. Nasze laboratorium bada długoterminowy i międzypokoleniowy wpływ traumy i przeciwności losu na starzenie się komórek, mierząc długość telomerów w badaniach populacyjnych. Zainteresowanie biologią telomerów wykracza poza pomiar średniej długości telomerów.

Opracowywane są nowe metody oceny długości telomerów specyficznych dla chromosomów i badania powiązań między wynikami zdrowotnymi a innymi aspektami biologii telomerów, takimi jak białka związane z telomerami i uszkodzenia DNA. Interdyscyplinarna sieć badawcza telomerów kierowana przez kierownika laboratorium, dr Stacy Drury, pracuje nad zwiększeniem rygoru pomiaru telomerów i odtwarzalności poprzez wspieranie międzynarodowych badań zespołowych dokumentujących wpływ czynników przedanalitycznych na precyzję oznaczania telomerów, a także ustalanie wytycznych dotyczących raportowania pomiarów długości telomerów generowanych za pomocą qPCR. Zwiększona precyzja MMqPCR pozwala na bardziej szczegółowe analizy wpływu wczesnych przeciwności losu i ekspozycji środowiskowej w ciągu życia na starzenie się komórek.

Na przykład poprzez identyfikację okresów wrażliwości, w których narażenie występujące w tym oknie czasowym ma głębszy wpływ na wyniki zdrowotne w późniejszym życiu. Zacznij od dodania próbek genomowego DNA wyekstrahowanych z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do pasków PCR, odpowiednio A, B i C. Następnie wirować rozmrożoną kontrolną porcję DNA przez 30 sekund.

Po krótkim odwirowaniu probówki, odessać pełną objętość do pierwszej probówki w pasku probówki do PCR o standardowej krzywej. Następnie dodaj 70 mikrolitrów wody klasy PCR do drugiej przez osiem probówek paska PCR o standardowej krzywej. Następnie ponownie zawiesić kontrolne DNA w pierwszej probówce i odessać 70 mikrolitrów do drugiej probówki.

Odczekać 30 sekund i ponownie zawiesić roztwór w drugiej probówce. Zebrać odczynniki do mieszania głównego i pozwolić im osiągnąć temperaturę pokojową w kapturze PCR. Następnie dodać jeden mikrolitr podwielokrotności SYBR Green do podwielokrotności buforowej.

Wirować wszystkie porcje przez 10 sekund i odwirowywać je przez pięć sekund. Następnie dodaj określone ilości wszystkich odczynników i starterów do mieszanki głównej do pięciomililitrowej probówki z betainą. Po wyjęciu polimerazy DNA z minus 20 stopni Celsjusza, wiruj ją przez 10 sekund, a następnie odwiruj przez pięć sekund.

Po odwirowaniu powoli dodaj 128 mikrolitrów do mieszanki głównej. Wiruj pięciomililitrową rurkę z mieszanką główną przez 30 sekund, a następnie odłóż ją na bok. Na początek umieść dwie 96-dołkowe płytki, koryto załadowcze i wielokanałowe końcówki do pipet w kapturze PCR.

Po oznaczeniu każdej tabliczki obróć płytę pierwszą o 180 stopni, tak aby numery kolumn były odwrócone do góry nogami, pozostawiając płytę drugą skierowaną w stronę technika. Następnie wlej pięciomililitrową probówkę przygotowanej mieszanki wzorcowej MMqPCR do koryta załadowczego. Użyj końcówki pipety, aby upewnić się, że cały roztwór z probówki został przeniesiony.

Przymocuj końcówki do pipety wielokanałowej, dociskając u podstawy każdej końcówki, aby zapewnić szczelne uszczelnienie. Używając odwróconego pipetowania, najpierw dozuj mieszankę wzorcową do wszystkich parzystych lub wszystkich nieparzystych kolumn, naprzemiennie między dwiema płytkami. Po wirtowaniu i odwirowaniu pasków PCR ułóż je w stojaku na probówki w kolejności, w jakiej zostaną umieszczone na płytkach.

Teraz obróć obie płyty o 180 stopni, aby numery kolumn zostały odwrócone w stosunku do technika. Użyj pipety wielokanałowej, aby ponownie zawiesić roztwory w paskach PCR. Za pomocą odwróconego pipetowania należy wypełnić pierwsze trzy kolumny każdej płytki paskiem A do PCR, naprzemiennie między parzystymi lub nieparzystymi kolumnami, tak jak w przypadku umieszczania mieszanki wzorcowej.

Używając pipety o pojemności 200 mikrolitrów ustawionej na 90 mikrolitrów, dokładnie zawieś siódmą probówkę z roztworem wzorcowym w pasku S do PCR i napełnij kolumny od czwartej do szóstej na płytkach. Po napełnieniu talerzy delikatnie postukaj nimi o blat stołu, aby upewnić się, że płyn w studzienkach osiada na dnie. Następnie przykryj górną część płytek foliami uszczelniającymi, dociskając opuszkami palców wszystkie krawędzie folii, aby zapewnić szczelne uszczelnienie.

Aby wymieszać zawartość talerzy, obracaj je na górze okapu przez 30 sekund. Następnie umieść uszczelnione płytki w wirówce na dwie minuty, tak aby otwory studzienek były skierowane do środka. Teraz umieść płytki w termocyklerze, upewniając się, że numery kolumn są czytelne.

Wyczyść górną część każdej płytki czystą chusteczką przed zamknięciem górnej części termocyklera. Następnie kliknij przycisk Start Run w oprogramowaniu termocyklera dla obu maszyn. Po wyświetleniu monitu wprowadź tytuł plików analizy, który będzie używany do oznaczania i śledzenia danych z tego eksperymentu.

Rozpocznij od wykonania testu MMqPCR w celu pomiaru długości telomerów. Następnie otwórz oprogramowanie i wybierz funkcję Konfiguracja płyty. Następnie wybierz opcję Wyświetl lub Edytuj blachę z menu rozwijanego.

Teraz podkreśl wszystkie dołki na talerzu. Kliknij Wybierz fluorofory. Zaznacz pole oznaczone SYBR i upewnij się, że wszystkie inne pola nie są zaznaczone.

Następnie kliknij OK, aby potwierdzić. Zachowując podświetlenie na wszystkich odwiertach, zlokalizuj i zaznacz pole obok SYBR, obok słowa Załaduj, aby oznaczyć wszystkie studnie SYBR. Teraz podświetl trzy studzienki kontrolne bez szablonu umieszczone na górze lub na dole standardowego rozcieńczenia szeregowego kontroli.

Następnie z menu Sample Type (Typ próbki) po prawej stronie wybierz NTC. Podświetl 21 dołków, które składają się na standardowe rozcieńczenie szeregowe kontroli i wybierz Standard z menu Typ próbki. Podczas gdy te studnie są nadal wybrane, kliknij Replikacja techniczna.

Z menu Replikuj rozmiar wybierz trzy, a następnie wybierz opcję Poziomo i kliknij przycisk Zastosuj. Następnie przewiń w dół do sekcji Seria rozcieńczeń i wprowadź dwa w polu Współczynnik rozcieńczenia. Dla płytki P1 wprowadź dwa razy 10 do potęgi minus trzy w polu Stężenie początkowe.

Następnie zaznacz pole Zmniejszanie i kliknij Zastosuj, aby potwierdzić ustawienia. Dla tabliczki P2 wprowadź 3,13 razy 10 do potęgi ujemnej piątki w polu Stężenie początkowe. Upewnij się, że zaznaczyłeś pole Zwiększanie, a następnie wybierz pozycję Zastosuj, aby sfinalizować konfigurację.

Teraz podświetl kolumny odpowiadające paskowi PCR A.Z menu Typ próbki wybierz Nieznany, a następnie przejdź do wyboru Replikacja techniczna. W menu Replikuj rozmiar wybierz trzy i wybierz opcję Poziomo przed kliknięciem przycisku Zastosuj. Kliknij przycisk OK w prawym dolnym rogu okna Edytor blachy.

Potwierdź zmiany, klikając przycisk Tak po wyświetleniu monitu. Następnie sprawdź, czy krzywe na karcie Kwantyfikacja wydają się odpowiednie zarówno dla kroku dziewiątego, jak i kroku 12 oraz czy wartości wydajności między tymi dwoma krokami nie różnią się o więcej niż 10%W przypadku P1 wybierz krok dziewiąty i zaznacz 21 dołków odpowiadających krzywej standardowej. Skopiuj wartości Cq z prawego dolnego rogu okna oprogramowania.

Następnie otwórz szablon arkusza danych telomerów i wklej te wartości do standardowego jednego arkusza, kolumny B.Następnie wprowadź wartość nachylenia kroku dziewiątego do komórki C4 w standardowym arkuszu. Sprawdzić, czy współczynnik zmienności dla każdego trójki wzorcowego rozcieńczenia jest niższy niż 0,1. W CFX wyklucz z analizy wszystkie odstające punkty danych, które powodują, że zestaw trójek wypada poza zakres.

Teraz upewnij się, że tylko 72 dołki na próbki w pliku analizy P1 są podświetlone na niebiesko na karcie Kwantyfikacja. Następnie w kroku dziewiątym skopiuj wartości Cq i SQ znajdujące się w prawym dolnym rogu okna oprogramowania i wklej je do arkusza próbek P1, zaczynając od komórki D3. Korzystając z CFX Maestro, upewnij się, że wszystkie wartości Cq dla próbek analitycznych mieszczą się w zakresie najniższych i najwyższych wartości Cq krzywej wzorcowej. W arkuszu Excela sprawdź, czy początkowe stężenie w NTC jest mniejsze niż 5% średniej ilości DNA w dołkach na próbki.

W celu kontroli jakości na poziomie próbki należy zbadać odchylenia standardowe i współczynnik zmienności w kolumnach J i K na arkuszach próbek P1 i P2. Sprawdzić, czy CV między poszczególnymi próbkami w arkuszu P1 i P2, w szczególności w kolumnie G, nie przekraczają 0,05. Jeżeli CV międzypłytkowe próbki jest wyższe niż dopuszczalne, należy usunąć maksymalnie jeden potrójny roztwór z obliczeń dla każdej próbki.

W celu kontroli jakości na poziomie płytki należy sprawdzić, czy średnia różnica między płytkami we wszystkich próbkach na każdej płytce jest mniejsza niż 0,05. Jeżeli CV międzypłytkowe próbki jest wyższe niż dopuszczalne, z obliczeń dla każdej próbki należy usunąć maksymalnie jeden potrójny powtórzenie. W celu dodatkowej kontroli jakości na poziomie płyty sprawdź, czy całkowita różnica między płytami w arkuszu P1 w porównaniu z arkuszem P2 jest mniejsza niż 0,06.