Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

Zakres naszych badań polega na opracowaniu i zastosowaniu OPTIR-FISH do identyfikacji pojedynczych komórek i analizy ich metabolizmu na poziomie pojedynczej komórki. Naszym celem jest zrozumienie, w jaki sposób poszczególne komórki oddziałują na siebie w złożonym środowisku oraz zrozumienie ich fizjologii i ról. Analiza metabolizmu na poziomie poszczególnych komórek, szczególnie w środowisku rodzimym, może dostarczyć bezcennych informacji na temat niejednorodnych, złożonych działań w systemach biologicznych.

Jednak równoczesne zadanie różnicowania tożsamości komórkowej i wyjaśniania metabolizmu na poziomie pojedynczej komórki pozostaje wyzwaniem. Nasza zaawansowana platforma obrazowania wibracyjnego, optyczna fototermiczna podczerwień, oferuje badanie metabolizmu pojedynczych komórek. Jednocześnie jest naturalnie wysoce kompatybilny z dobrze znaną fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu identyfikacji gatunków drobnoustrojów.

W związku z tym prosta integracja umożliwia jednoczesne metabolizm i identyfikację w tej samej rozdzielczości obrazowania. Na początek weź komórki bakteryjne utrwalone w paraformaldehydzie, odwiruj komórki w temperaturze 14 000 G przez 10 minut, a następnie usuń supernatant. Ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach 96% etanolu klasy analitycznej i inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Powtarzaj wirowanie przez pięć minut. Następnie usuń etanol i wysusz osad ogniwa na powietrzu. Teraz hybrydyzuj komórki w roztworze zawierającym znakowany fluorescencyjnie oligonukleotyd przez trzy godziny w temperaturze 46 stopni Celsjusza.

Natychmiast po hybrydyzacji odwirować próbki w wirniku podgrzanym do 46 stopni Celsjusza przez 15 minut w maksymalnej dozwolonej temperaturze. Następnie przemyć próbki w buforze o odpowiedniej dokładności przez 15 minut w temperaturze 48 stopni Celsjusza. Po ponownym odwirowaniu próbki umyj komórki 500 mikrolitrami lodowatego PBS.

Ponownie zawieś je w 20 mikrolitrach PBS i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia. Na początek weź standaryzowane preparaty z fluorkiem wapnia. Zanurz je w 70% etanolu na 15 minut i spłucz dwa razy wodą dejonizowaną.

Przenieś czyste szkiełka do 0,1% roztworu poli-L-lizyny i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie spłucz szkiełka wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia. Następnie rozmrozić przygotowane próbki komórek w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.

Aby uniknąć nadmiernej ilości kryształków soli z PBS podczas suszenia próbki, należy dwukrotnie umyć rozmrożone komórki wodą dejonizowaną. Odwirować przy 14 000 G przez 10 minut i usunąć supernatant. Ponownie wprowadź pierwotną objętość dejonizowanej wody do komórek i delikatnie je wiruj.

Po umyciu odwirować komórki w stężeniu 14 000 G przez 10 minut w celu zagęszczenia próbek komórek bakteryjnych i usunięcia supernatantu. Delikatnie wirować pozostały roztwór przez około 30 sekund i nanieść od jednego do dwóch mikrolitrów tego roztworu na przygotowane szkiełko z fluorkiem wapnia.