Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)
23 lutego 2024
Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.
Zakres naszych badań polega na opracowaniu i zastosowaniu OPTIR-FISH do identyfikacji pojedynczych komórek i analizy ich metabolizmu na poziomie pojedynczej komórki. Naszym celem jest zrozumienie, w jaki sposób poszczególne komórki oddziałują na siebie w złożonym środowisku oraz zrozumienie ich fizjologii i ról. Analiza metabolizmu na poziomie poszczególnych komórek, szczególnie w środowisku rodzimym, może dostarczyć bezcennych informacji na temat niejednorodnych, złożonych działań w systemach biologicznych.
Jednak równoczesne zadanie różnicowania tożsamości komórkowej i wyjaśniania metabolizmu na poziomie pojedynczej komórki pozostaje wyzwaniem. Nasza zaawansowana platforma obrazowania wibracyjnego, optyczna fototermiczna podczerwień, oferuje badanie metabolizmu pojedynczych komórek. Jednocześnie jest naturalnie wysoce kompatybilny z dobrze znaną fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu identyfikacji gatunków drobnoustrojów.
W związku z tym prosta integracja umożliwia jednoczesne metabolizm i identyfikację w tej samej rozdzielczości obrazowania. Na początek weź komórki bakteryjne utrwalone w paraformaldehydzie, odwiruj komórki w temperaturze 14 000 G przez 10 minut, a następnie usuń supernatant. Ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach 96% etanolu klasy analitycznej i inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.
Powtarzaj wirowanie przez pięć minut. Następnie usuń etanol i wysusz osad ogniwa na powietrzu. Teraz hybrydyzuj komórki w roztworze zawierającym znakowany fluorescencyjnie oligonukleotyd przez trzy godziny w temperaturze 46 stopni Celsjusza.
Natychmiast po hybrydyzacji odwirować próbki w wirniku podgrzanym do 46 stopni Celsjusza przez 15 minut w maksymalnej dozwolonej temperaturze. Następnie przemyć próbki w buforze o odpowiedniej dokładności przez 15 minut w temperaturze 48 stopni Celsjusza. Po ponownym odwirowaniu próbki umyj komórki 500 mikrolitrami lodowatego PBS.
Ponownie zawieś je w 20 mikrolitrach PBS i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia. Na początek weź standaryzowane preparaty z fluorkiem wapnia. Zanurz je w 70% etanolu na 15 minut i spłucz dwa razy wodą dejonizowaną.
Przenieś czyste szkiełka do 0,1% roztworu poli-L-lizyny i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie spłucz szkiełka wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia. Następnie rozmrozić przygotowane próbki komórek w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.
Aby uniknąć nadmiernej ilości kryształków soli z PBS podczas suszenia próbki, należy dwukrotnie umyć rozmrożone komórki wodą dejonizowaną. Odwirować przy 14 000 G przez 10 minut i usunąć supernatant. Ponownie wprowadź pierwotną objętość dejonizowanej wody do komórek i delikatnie je wiruj.
Po umyciu odwirować komórki w stężeniu 14 000 G przez 10 minut w celu zagęszczenia próbek komórek bakteryjnych i usunięcia supernatantu. Delikatnie wirować pozostały roztwór przez około 30 sekund i nanieść od jednego do dwóch mikrolitrów tego roztworu na przygotowane szkiełko z fluorkiem wapnia.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ fluorescencji podczerwonej (OPTIR-FISH) do identyfikacji pojedynczych komórek oraz analizy ich metabolizmu na poziomie pojedynczej komórki. Metodologia ta ma na celu dostarczenie wiedzy na temat oddziaływań komórkowych w złożonych środowiskach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Analiza metaboliczna
Wstęp
- Zrozumienie metabolizmu pojedynczych komórek jest kluczowe dla odkrycia złożonych procesów biologicznych.
- Obecne metody napotykają trudności w rozróżnianiu tożsamości komórkowej podczas analizy metabolizmu.
- Metoda OPTIR-FISH łączy obrazowanie wibracyjne z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ.
- Podejście to jest zgodne z procesem identyfikacji gatunków drobnoustrojów.
Cel badania
- Opracowanie metody identyfikacji pojedynczych komórek.
- Analiza metabolizmu na poziomie pojedynczej komórki.
- Zrozumienie oddziaływań komórkowych w środowiskach naturalnych.
Zastosowane metody
- Optyczne obrazowanie fototermiczne w podczerwieni.
- Hybrydyzacja in situ fluorescencyjna.
- Techniki o rozdzielczości pojedynczej komórki.
- Analiza metabolizmu komórkowego.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja poszczególnych komórek przy użyciu OPTIR-FISH.
- Wgląd w metabolizm komórkowy w złożonych środowiskach.
- Wykazana kompatybilność z istniejącymi metodami identyfikacji.
- Potencjał do szerokiego zastosowania w badaniach biologicznych.
Wnioski
- OPTIR-FISH jest obiecującym narzędziem do badania metabolizmu pojedynczych komórek.
- Umożliwia ono lepsze zrozumienie interakcji i fizjologii komórkowej.
- Ta metodologia może doprowadzić do znaczących postępów w badaniach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Metoda OPTIR-FISH umożliwia jednoczesną identyfikację i profilowanie metaboliczne pojedynczych komórek w złożonych społecznościach drobnoustrojów, wypełniając krytyczną lukę w analizie pojedynczych komórek na potrzeby odkryć biofarmaceutycznych. To podejście dwumodalne zwiększa pewność predykcyjną w rozumieniu heterogeniczności komórkowej i funkcji metabolicznych, wspierając wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Integracja tożsamości komórki z aktywnością metaboliczną w rozdzielczości pojedynczej komórki dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych i przyspiesza procesy badawcze w obszarze medycyny translacyjnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę szlaków metabolicznych w zidentyfikowanych typach komórek w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie fenotypu z aktywnością metaboliczną na poziomie pojedynczej komórki.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celu poprzez rozstrzygnięcie heterogeniczności komórkowej w układach istotnych dla danej choroby.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy jednokomórkowe do dalszego przesiewania związków i analiz metabolicznych.
- Standaryzuje ilościowe odczyty metaboliczne w celu odtwarzalnego opracowania testów.
- Umożliwia wysokoprzepustową analizę zmian metabolicznych w odpowiedzi na perturbacje eksperymentalne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje fenotypy metaboliczne z biomarkerami translacyjnymi w złożonych środowiskach mikrobiologicznych lub komórkowych.
- Zapewnia ciągłość od fazy odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez monitorowanie odpowiedzi metabolicznych in situ.
- Wspiera optymalizację ryzyka w procesie rozwoju poprzez wyjaśnienie istotności funkcjonalnej subpopulacji komórkowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda OPTIR-FISH integruje się z kontinuum procesów badawczych – od wczesnego testowania hipotez, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, umożliwiając rzetelną analitykę pojedynczych komórek w ramach przepływów pracy B+R.
- Biologia odkrywcza: Łączy tożsamość komórki z funkcją metaboliczną, wspierając analizę szlaków opartą na hipotezach.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników metabolicznych w celu przygotowania testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia wysokotreściowe dane spektralne i fluorescencyjne do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy profile metaboliczne pojedynczych komórek z biomarkerami istotnymi dla chorób, gdy jest to wspierane przez badany system.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje ustandaryzowaną, skalowalną platformę do wielokrotnego użytku w różnych modelach biologicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje analizę metaboliczną pojedynczych komórek w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie funkcji komórkowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badawczych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz technik obrazowania wibracyjnego.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury optycznej fototermicznej spektroskopii w podczerwieni oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja procedur przygotowania próbek i analizy danych.
- W zależności od projektu sond rRNA i znakowania izotopowego może być wymagana adaptacja metody do różnych systemów mikrobiologicznych lub komórkowych.
- Przepustowość i rozdzielczość spektralna są ograniczone przez aparaturę obrazującą oraz złożoność próbek.
