Name: Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: Poznaj metodę OPTIR-FISH do identyfikacji pojedynczych komórek i analizy ich metabolizmu na poziomie jednej komórki. Technika łączy obrazowanie fototermiczne w podczerwieni z hybrydyzacją in situ fluorescencją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Health R35GM136223, R01AI141439 J.X.C.

Comprehensive Protocol for Cell Identification and Metabolic Analysis Using OPTIR-FISH

<ol><li>Evers, T. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+metabolic+heterogeneity+by+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis.</a> Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).</li>
<li>Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+culturing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Present and future of culturing bacteria.</a> Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).</li>
<li>Epstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenomenon+of+microbial+uncultivability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phenomenon of microbial uncultivability.</a> Curr Opin Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).</li>
<li>Su, C., Lei, L., Duan, Y., Zhang, K. -Q., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-independent+methods+for+studying+environmental+microorganisms%3A+methods%2C+application%2C+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 993-1003 (2012).</li>
<li>Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+metabolic+activities+in+single+cells%2C+with+emphasis+on+nanoSIMS%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS.</a> FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).</li>
<li>Jiang, H., Kilburn, M. R., Decelle, J., Musat, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoSIMS+chemical+imaging+combined+with+correlative+microscopy+for+biological+sample+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">NanoSIMS chemical imaging combined with correlative microscopy for biological sample analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 41, 130-135 (2016).</li>
<li>Porta Siegel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+integration+with+other+imaging+modalities+for+greater+molecular+understanding+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and integration with other imaging modalities for greater molecular understanding of biological tissues.</a> Mol Imaging Biol. 20 (6), 888-901 (2018).</li>
<li>Lagunov, O., Drenchev, N., Chakarova, K., Panayotov, D., Hadjiivanov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labelling+in+vibrational+spectroscopy%3A+a+technique+to+decipher+the+structure+of+surface+species%5BTitle%5D)+AND+%22Top+Catal%22%5BJournal%5D)">Isotopic labelling in vibrational spectroscopy: a technique to decipher the structure of surface species.</a> Top Catal. 60, 1486-1495 (2017).</li>
<li>Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+photothermal-fluorescence+in+situ+hybridization+for+functional+analysis+and+genetic+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells.</a> Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).</li>
<li>Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+oligodeoxynucleotide+probes+for+the+major+subclasses+of+proteobacteria%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22System+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions.</a> System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).</li>
<li>Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Vancanneyt, M., Schleifer, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+suite+of+16S+rRNA-specific+oligonucleotide+probes+designed+to+investigate+bacteria+of+the+phylum+cytophaga-flavobacter-bacteroides+in+the+natural+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment.</a> Microbiology. 142, 1097-1106 (1996).</li>
<li>Daims, H., Stoecker, K., Wagner, M. Fluorescence In Situ Hybridization for the Detection of Prokaryotes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDaims%2C+H+%22Molecular+Microbial+Ecology%22">Molecular Microbial Ecology</a>. , Taylor & Francis. London. (2004).</li>
<li>Bridger, J. M., Volpi, E. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+JM+%22Fluorescence+In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%3A+Protocols+and+Applications%22">Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications</a>. , Springer, Humana. Totowa, NJ. (2010).</li>
<li>Wang, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+simple+FISH+protocol+with+hybridization-sensitive+fluorescent+linear+oligodeoxynucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A quick and simple FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligodeoxynucleotide probes.</a> RNA. 18 (1), 166-175 (2012).</li>
<li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase-an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers%3A+new+features+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">probeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Res. 44, D586-D589 (2016).</li>
<li>Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mathFISH%2C+a+web+tool+that+uses+thermodynamics-based+mathematical+models+for+in+silico+evaluation+of+oligonucleotide+probes+for+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">mathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (3), 1118-1122 (2011).</li>
<li>Lima, C., Muhamadali, H., Xu, Y., Kansiz, M., Goodacre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+isotopically+labeled+bacteria+at+the+single-cell+level+using+high-resolution+optical+infrared+photothermal+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging isotopically labeled bacteria at the single-cell level using high-resolution optical infrared photothermal spectroscopy.</a> Anal Chem. 93 (6), 3082-3088 (2021).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosecond-resolution+photothermal+dynamic+imaging+via+MHZ+digitization+and+match+filtering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nanosecond-resolution photothermal dynamic imaging via MHZ digitization and match filtering.</a> Nat Commun. 12 (1), 7097(2021).</li>
<li>Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bond-selective+imaging+by+optically+sensing+the+mid-infrared+photothermal+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect.</a> Sci Adv. 7 (20), (2021).</li>
<li>Xia, Q., Yin, J., Guo, Z., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+photothermal+microscopy%3A+principle%2C+instrumentation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chemi+B%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared photothermal microscopy: principle, instrumentation, and applications.</a> J Phys Chemi B. 126 (43), 8597-8613 (2022).</li>
<li>Du, J., Wang, H., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+vibrational+imaging+to+chemical+biology+with+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Bringing vibrational imaging to chemical biology with molecular probes.</a> ACS Chem Biol. 17 (7), 1621-1637 (2022).</li>
<li>Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe+design+for+super-multiplexed+vibrational+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Probe design for super-multiplexed vibrational imaging.</a> Phys Biol. 16 (4), 041003(2019).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+metabolic+imaging+with+vibrational+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes.</a> Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mapping+of+lipid+metabolites+using+an+infrared+probe+in+human-derived+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems.</a> Nat Commun. 15 (1), 350(2024).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+tracing+of+deuterium+for+imaging+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism.</a> Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).</li>
<li>Ge, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRS-FISH%3A+A+high-throughput+platform+linking+microbiome+metabolism+to+identity+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SRS-FISH: A high-throughput platform linking microbiome metabolism to identity at the single-cell level.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (26), e2203519119(2022).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+chemical+imaging+by+widefield+photothermal+sensing+of+infrared+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ultrafast chemical imaging by widefield photothermal sensing of infrared absorption.</a> Sci Adv. 5 (7), 7127(2019).</li>
<li>Zhang, J., Zhao, J., Lin, H., Tan, Y., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+chemical+imaging+by+dense-net+learning+of+femtosecond+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed chemical imaging by dense-net learning of femtosecond stimulated Raman scattering.</a> J Phys Chem Lett. 11 (20), 8573-8578 (2020).</li>
<li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsecond+fingerprint+stimulated+Raman+spectroscopic+imaging+by+ultrafast+tuning+and+spatial-spectral+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning.</a> Nat Commun. 12 (1), 3052(2021).</li>
<li>Fu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+non-fluorescent+molecules+by+photothermal+relaxation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photon%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy.</a> Nat Photon. 17, 330-337 (2023).</li>
<li>Tamamitsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid-infrared+widefield+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Mid-infrared widefield nanoscopy.</a> arXiv. , (2023).</li>
</ol>

Y.B. jest konsultantem w niepełnym wymiarze godzin w Photothermal Spectroscopy Corp.

W tym miejscu opisaliśmy szczegółowy protokół zastosowania platformy OPTIR-FISH do jednoczesnej identyfikacji gatunków drobnoustrojów i ilościowego oznaczania aktywności metabolicznej w rozdzielczości pojedynczej komórki. Kluczowe etapy obejmują hodowlę ze znakowaniem stabilnych izotopów w celu zbadania określonych aktywności metabolicznych oraz fluorescencyjną hybrydyzację in situ w celu identyfikacji docelowych gatunków drobnoustrojów. Wielokanałowe obrazowanie fluorescencyjne i obrazowanie OPTIR przy wybranych liczbach falowych mogą być wykonywane sekwencyjnie pod tym samym mikroskopem. Pokazaliśmy, jak analizować ilościowo te obrazy, aby ujawnić poziomy aktywności metabolicznej różnych gatunków w złożonej społeczności. Protokół może być szczególnie atrakcyjny dla badań metabolicznych różnych gatunków w złożonej społeczności w ich naturalnym środowisku.
Użyliśmy tutaj bakterii jako przykładu, ale ten protokół można dostosować do innych organizmów, takich jak grzyby i komórki ssaków. Jednym z kluczowych punktów jest dodanie sond wibracyjnych docelowego procesu metabolicznego do pożywki hodowlanej wolnej od normalnego odpowiednika. Na przykład, jeśli bada się metabolizm lipidów z kwasów tłuszczowych, kwasy tłuszczowe znakowane azydotagiem należy uzupełnić do ich standardowej pożywki hodowlanej składającej się z delipidowej płodowej surowicy bydlęcej (FBS), ponieważ kwasy tłuszczowe pierwotnie pochodzą z FBS. Dodatkowo czas inkubacji musi również odpowiadać tempu wzrostu różnych komórek grzybów lub ssaków. Zapewnia to prawidłowy wzrost komórek, jednocześnie maksymalizując skuteczność znakowania sond wibracyjnych w docelowych makrocząsteczkach.
Opisany tutaj protokół może być również zaadaptowany do badania innych procesów metabolicznych poza syntezą białek z glukozy. Wszystkie główne biomolekuły, w tym białka, lipidy, kwasy nukleinowe i węglowodany, mogą być zobrazowane za pomocą OPTIR19,20. Ponadto istnieje szeroki wybór strategii znakowania, w tym znakowanie izotopowe, takie jak 13C, 15N, 18O i 2H, oraz dodawanie znaczników wibracyjnych, takich jak C≡C i C≡N do małych cząsteczek21. Ze względu na małe rozmiary etykiet i wysoką biokompatybilność jest to preferowana metoda badania metabolizmu w porównaniu z analogami fluorescencji. Aby zbadać inne procesy metaboliczne przy użyciu różnych sond wibracyjnych, protokół ten można zmodyfikować, w tym etapy hodowli komórkowej i znakowania metabolicznego, a także wybór liczby falowej na podstawie różnych sond i produktów metabolicznych, które można znaleźć w odpowiednich odniesieniach 21,22,23. Niektóre z przykładów obejmują mapowanie nowo zsyntetyzowanych lipidów z kwasu azydkowo-palmitynowego w dwuwymiarowych (2D) i trójwymiarowych (3D) systemach hodowli pochodzących od człowieka24, obrazowanie nowo zsyntetyzowanego białka z azydohomoalaniny w komórkach makrofagów23, obrazowanie metabolizmu glukozy za pomocą deuteru-glukozy w komórkach PC325 oraz analiza inkorporacji deuteru z ciężkiej wody jako markera aktywności w ludzkim mikrobiomie jelitowym26.
Potencjalnym ograniczeniem protokołu jest granica wykrywalności wynosząca 13C w złożonych społecznościach. Wykazaliśmy, że dla użytej tutaj czystej kultury granica wykrywalności wynosi 5% z 13C w całkowitym węglu9. Wykazaliśmy również, że mieszając w pełni 13komórek E. coli znakowanych C z nieznakowanymi próbkami ludzkiego złożonego mikrobiomu jelitowego, możemy z pewnością różnicować E. coli na podstawie profili metabolicznych pomimo potencjalnej zmienności widmowej związanej z różnymi komórkowymi składami chemicznymi pochodzącymi z różnych nieznakowanych gatunków mikrobiomu jelitowego9. Jednak złożone społeczności mikrobiologiczne, na które wpływ ma unikalna fizjologia obecnych gatunków drobnoustrojów, mogą wykazywać niespójne wskaźniki asymilacji 13C. W takich przypadkach warto dalej badać zdolność różnicowania metabolicznego 13komórek znakowanych izotopem C i 12komórek znakowanych znakiem towarowym C OPTIR-FISH w kontekście złożonej społeczności. Wydajność platformy można jeszcze poprawić. Na przykład, łącząc szerokokątną konfigurację OPTIR, można znacznie zwiększyć prędkość obrazowania27. Zaawansowane metody odszumiania oparte na uczeniu maszynowym mogą zostać włączone do platformy, aby jeszcze bardziej zwiększyć szybkość obrazowania28,29. Aby lepiej zobrazować szczegółowy rozkład metabolitów w komórkach drobnoustrojów, można zastosować niedawno opracowane technologie superrozdzielczości 30,31.
Kluczowe kroki tego protokołu obejmują optymalizację skuteczności znakowania FISH dla docelowych drobnoustrojów, co można osiągnąć dzięki racjonalnemu projektowaniu sondy oligonukleotydowej, optymalizacji stężenia formamidu i starannej kontroli środowiska hybrydyzacji. Przygotowanie próbek o odpowiedniej gęstości pojedynczej komórki do analizy wysokoprzepustowej jest ważne dla wysokiej przepustowości w praktyce. Kluczowe znaczenie ma również optymalizacja systemu, aby uzyskać odpowiedni sygnał do oznaczania ilościowego. Odbywa się to automatycznie w oprogramowaniu sterującym przyrządem podczas kroku automatycznego działania w tle. W przypadku wystąpienia odchylenia w przygotowaniu próbki, na przykład przy użyciu innego typu szkiełek zamiast standardowego szkiełka CaF2 , w oprogramowaniu można przeprowadzić ręczną optymalizację. Na etapie optymalizacji ręcznej nakładanie się światła w średniej podczerwieni i światła widzialnego jest optymalizowane poprzez skanowanie szeregu pozycji w średniej podczerwieni. Do głównych wyzwań należy wybór najbardziej odpowiednich substratów wibracyjnych i odpowiadających im liczb falowych OPTIR w celu ilościowego określenia aktywności metabolicznej będącej przedmiotem zainteresowania.
Podsumowując, badanie to pokazuje, w jaki sposób platforma OPTIR-FISH może jednocześnie osiągnąć aktywność metaboliczną i identyfikację mikrobiologiczną na poziomie pojedynczej komórki. Wierzymy, że ten szczegółowy protokół dostarczy użytecznych wskazówek w celu promowania powszechnego przyjęcia tej nowej platformy obrazowania wibracyjnego o wysokiej kompatybilności z szeroko stosowanymi narzędziami fluorescencyjnymi, umożliwiając zastosowania w różnych dziedzinach nauk przyrodniczych i medycyny oraz otwierając możliwości nowych odkryć.

Metabolizm komórkowy stanowi fundamentalny filar biologii komórki, kierując wieloma procesami, które decydują o zdrowiu, funkcjonowaniu i interakcji komórki ze środowiskiem. Analiza metabolizmu na poziomie poszczególnych komórek, szczególnie w środowisku natywnym, dostarcza bezcennych informacji, które pozwalają ujawnić heterogeniczne i złożone działania w systemach biologicznych1. Jest to szczególnie ważne w badaniach nad mikroorganizmami, ponieważ wiele mikroorganizmów wykazuje unikalne wymagania dotyczące wzrostu lub zależności środowiskowe, które stanowią wyzwanie dla tradycyjnych metod uprawy2. Na przykład, niektóre gatunki mogą wymagać określonych kompozycji składników odżywczych lub symbiotycznych relacji, które nie są łatwe do odtworzenia w warunkach laboratoryjnych, co sprawia, że nie nadają się do hodowli za pomocą standardowych technik3. Ponadto wydłużone okresy potrzebne do uprawy niektórych gatunków stanowią poważne wyzwanie dla badań mikrobiologicznych, często wykraczające poza praktyczne ramy czasowe przeznaczone na badania i analizy. Aby obejść te ograniczenia, alternatywne metody, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), pozwalają na identyfikację gatunków drobnoustrojów bez konieczności uprawy4, co pozwala uzyskać dokładniejszy i bardziej holistyczny obraz ekosystemów mikrobiologicznych. Jednak te technologie analityczne nie są w stanie wyjaśnić metabolizmu komórkowego. Luka ta uwypukla bieżące wyzwania w dziedzinie mikrobiologii: równoległe zadanie różnicowania tożsamości komórkowej i wyjaśniania metabolizmu na poziomie pojedynczej komórki. Postępy w technikach, takich jak obrazowanie spektrometrii mas (IMS) w połączeniu ze stabilnymi izotopami, stały się potężnymi narzędziami do analizy metabolicznej pojedynczych komórek5. W tych eksperymentach komórki inkubowano z substratami zawierającymi izotopy, takie jak 13C lub 15N. Nowo anabolizowane biomolekuły przenoszą te izotopy, dzięki czemu można je odróżnić w widmach m/z. Jednak IMS cierpi z powodu drogiego oprzyrządowania, skomplikowanego przygotowania próbek, stosunkowo niskiej przepustowości i wiedzy specjalistycznej wymaganej do analizy widm m/z. W połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym specyficznym dla markerów molekularnych, poczyniono postępy w wyjaśnianiu metabolizmu komórkowego ze zwiększoną swoistością6. Niemniej jednak nadal istnieją wyzwania związane z połączeniem tych dwóch modalności. Różnica w rozdzielczości między IMS a obrazowaniem fluorescencyjnym, w połączeniu z różnymi konfiguracjami operacyjnymi, utrudnia wyrównanie i skorelowanie wyników7.
Integracja obrazowania spektroskopowego wibracyjnego z znakowaniem stabilnych izotopów oferuje nowatorskie rozwiązanie do badania metabolizmu pojedynczych komórek. Włączenie cięższych izotopów spowalnia wibracje wiązań chemicznych, prowadząc do przesuniętych ku czerwieni pików w widmach oscylacyjnych8. Warto zauważyć, że obrazowanie wibracyjne zapewnia rozdzielczość przestrzenną porównywalną z obrazowaniem fluorescencyjnym, a zarówno kwantyfikację metaboliczną, jak i identyfikację komórek można przeprowadzić w jednym ustawieniu, upraszczając rejestrację i korelację obrazu. Nasze ostatnie prace wykazały połączenie zaawansowanej platformy obrazowania wibracyjnego: optycznej fototermicznej podczerwieni (OPTIR) z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu zbadania metabolizmu glukozy w społecznościach bakteryjnych9 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). OPTIR to wibracyjny system spektroskopowy mikroskopowy, który wykorzystuje efekt fototermiczny absorpcji w średniej podczerwieni poprzez wykrywanie zmiany światła widzialnego, co zapewnia rozdzielczość submikrometrową, jak w mikroskopii optycznej, ale z dodatkowymi informacjami spektroskopowymi drgań pochodzącymi z absorpcji w średniej podczerwieni. FISH jest powszechnie stosowaną techniką określania tożsamości mikroorganizmów na poziomie pojedynczej komórki. Sekwencję oligonukleotydów można zaprojektować tak, aby celowała w określone sekwencje 16S różnych taksonów i można do niej dołączyć różne fluorofory. Specyficzna hybrydyzacja zaprojektowanych sond oligonukleotydowych z docelowym rRNA prowadzi do silnych sygnałów fluorescencyjnych gatunków docelowych w poszczególnych komórkach, a wielokanałowe obrazowanie fluorescencyjne może być wykonane w celu identyfikacji wielu gatunków w populacji. Ponieważ zarówno OPTIR, jak i obrazowanie fluorescencyjne opierają się na detekcji optycznej, połączenie fluorescencji OPTIR i FISH jest proste do wdrożenia. Obie metody mają tę samą rozdzielczość optyczną do analizy pojedynczej komórki i można je wygodnie przełączać bez konieczności dodatkowego wyrównywania lub korejestracji.
Ten protokół przedstawia szczegółowy przewodnik po wykorzystaniu platformy OPTIR-FISH do zaawansowanej analizy funkcji struktury pojedynczej komórki. Wykorzystaliśmy próbki bakteryjne wyhodowane w pożywkach zawierających 13C-glukozy jako stanowisko testowe i określiliśmy ilościowo syntezę białek de novo z 13C-glukozy. Aby zademonstrować zdolność platformy do identyfikacji komórek, wykorzystaliśmy mieszanki bakteryjne, w których każdy gatunek został znakowany za pomocą sond FISH ukierunkowanych na rRNA. Podejście to ułatwiło precyzyjną identyfikację pojedynczych komórek określonych szczepów bakterii, takich jak Escherichia coli (E. coli) i Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), oraz ich metabolizm. Protokół ten oferuje naukowcom potężne narzędzie do jednoczesnego profilowania metabolicznego i identyfikacji gatunków na poziomie pojedynczej komórki, obiecując pogłębienie naszej wiedzy na temat interakcji komórkowych, fizjologii i ich roli w złożonych środowiskach.

<table><tbody><tr><td>96% etanol</td><td>ThermoScientific</td><td>T032021000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek wapnia</td><td>Crystran</td><td>CAFP10-0,35</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza (U-13C6, 99%)</td><td>Cambridge Isotopic Laboratories</td><td>CLM-1396-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>formamid</td><td>ThermoScientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>Rosół Luria-Bertani&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>M9 Sole minimalne 5x</td><td>SIGMA</td><td>M6030-1KG</td><td></td></tr><tr><td>OPTIR instrument</td><td>Spektroskopia fototermiczna Corp.</td><td>mIRage LS</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraforaldehydu, 4% w PBS</td><td>ThermoScientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>roztwór poli-L-lizyny 0,1% (w/v)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(hydroksymetylo)aminometanu, 99+%</td><td>ThermoScientific</td><td>A11379.18</td><td></td></tr><tr><td>Trypic Rosół sojowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (optir-fish)

Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH)

Zrozumienie aktywności metabolicznej poszczególnych komórek w złożonych społecznościach jest kluczowe dla odkrycia ich roli w chorobach ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół jednoczesnej identyfikacji komórek i analizy metabolicznej za pomocą platformy OPTIR-FISH poprzez połączenie sond FISH znakowanych rRNA i substratów znakowanych izotopowo. Obrazowanie fluorescencyjne zapewnia identyfikację komórek poprzez specyficzne wiązanie sond FISH znakowanych rRNA, podczas gdy obrazowanie OPTIR zapewnia aktywność metaboliczną w pojedynczych komórkach poprzez indukowane izotopem przesunięcie ku czerwieni w widmach OPTIR. Wykorzystując bakterie hodowane z 13C-glukozą jako stanowisko testowe, protokół przedstawia hodowlę drobnoustrojów z znakowaniem izotopowym, fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH), przygotowanie próbki, optymalizację konfiguracji obrazowania OPTIR-FISH i pozyskiwanie danych. Pokazujemy również, jak przeprowadzać analizę obrazu i interpretować dane spektralne na poziomie pojedynczej komórki z dużą przepustowością. Ustandaryzowany i szczegółowy charakter tego protokołu znacznie ułatwi jego przyjęcie przez naukowców z różnych środowisk i dyscyplin w ramach szerokiej społeczności badawczej zajmującej się metabolizmem pojedynczych komórek.

Ogólny schemat analizy metabolicznej pojedynczych komórek drobnoustrojów z identyfikacją genetyczną za pomocą OPTIR-FISH przedstawiono na Rysunku 2. Reprezentatywne wyniki demonstrujące możliwości obrazowania metabolicznego pojedynczych komórek metodą OPTIR pokazano na Rysunku 3. W tym przykładzie wykorzystano komórki E. coli inkubowane z glukozą 12C lub 13C przez 24 h. Wykazano, że wbudowanie 13C do białek powoduje znaczne przesunięcie ku czerwieni pasm amidowych I i II białek (Rysunek 3A)17,18. W związku z tym wybrano dwie kluczowe liczby falowe reprezentujące białko 12C (1656 cm-1, normalne pasmo amidu I) oraz białko 13C (1612 cm-1, przesunięte pasmo amidu I) i pozyskano obrazy OPTIR przy tych dwóch wartościach. Przedstawiono również odpowiadające im obrazy w polu jasnym, aby zademonstrować morfologię komórek (Rysunek 3B,E). Bakterie w kształcie pałeczek można wyraźnie rozróżnić na poziomie pojedynczej komórki zarówno w obrazach pola jasnego, jak i OPTIR, co potwierdza wysoką rozdzielczość przestrzenną techniki OPTIR (Rysunek 3B-G). Dla komórek inkubowanych z glukozą 12C (Rysunek 3B-D) zaobserwowano wyższą intensywność przy 1656 cm-1, natomiast dla komórek inkubowanych z glukozą 13C zaobserwowano wyższą intensywność przy 1612 cm-1 (Rysunek 3E-G). Przesunięcie tego piku wskazuje na wbudowanie cięższych izotopów węgla do masy białek17. Ewaluację rozszerzono o ocenę zdolności metody OPTIR-FISH do rozróżniania taksonów bakteryjnych oraz ich aktywności metabolicznej w próbkach wielogatunkowych. Sztucznie zmieszano dwa gatunki bakterii powszechnie występujące w ludzkim mikrobiomie jelitowym: E. coli oraz B. thetaiotaomicron (B. theta). Komórki E. coli inkubowane z glukozą 13C poddano hybrydyzacji z sondą Gam42a-Cy5, celującą w 23S rRNA Gammaproteobacteria10. Komórki B. theta inkubowane z glukozą 12C poddano hybrydyzacji z sondą Bac303-Cy3, celującą w 16S rRNA większości gatunków z rodziny Bacteroidaceae11. Bardzo trudno jest rozróżnić te dwa gatunki na podstawie obrazów w polu jasnym, ponieważ oba mają kształt pałeczek (Rysunek 4A). Dlatego wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne zhybrydyzowanych sond było niezbędne do przypisania tożsamości taksonomicznej każdej analizowanej komórce bakteryjnej (Rysunek 4B). Po odjęciu obrazów OPTIR pozyskanych przy 1612 cm-1 od obrazów przy 1656 cm-1, zauważono, że część komórek w tej próbce dwugatunkowej wykazała dodatnie wartości różnicowe (Rysunek 4C), co wskazuje na wbudowanie izotopów 13C. Na podstawie warunków hodowli przypisaliśmy komórki z dodatnią wartością różnicową do E. coli, a z ujemną do B. theta. Przypisanie gatunków bakteryjnych zostało potwierdzone wynikami obrazowania fluorescencyjnego: komórki dające dodatnie wartości różnicowe wykazują kontrast Cy5, specyficzny dla E. coli, a komórki dające ujemne wartości różnicowe wykazują kontrast Cy3, specyficzny dla B. theta. Następnie obliczono stopień zastąpienia izotopowego, w tym przypadku nowo zsyntetyzowanego białka 13C z glukozy 13C (Rysunek 4D). Zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowano znaczącą różnicę w stopniu zastąpienia izotopowego pomiędzy dwoma gatunkami bakterii (test t dla par, p = 9.74 x 10-33). Ten zestaw danych podkreśla wykonalność zastosowania platformy OPTIR-FISH do badania metabolizmu w złożonym środowisku, w którym obecnych jest wiele gatunków w próbkach.
<img alt="Analiza społeczności mikrobiologicznej; fluorescencyjna hybrydyzacja in situ; obrazowanie OPTIR; znakowanie izotopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat platformy OPTIR-FISH do jednoczesnej identyfikacji gatunków i analizy metabolizmu. Różne człony społeczności mikrobiologicznej mogą zostać zidentyfikowane poprzez specyficzne wiązanie sond rybosomalnego RNA mikroorganizmów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i wykryte poprzez obrazowanie fluorescencyjne przyłączonych fluoroforów. Aktywność metaboliczną można analizować poprzez hodowlę z podłożami izotopowymi i wykrywać za pomocą obrazowania OPTIR. Obrazowanie OPTIR wykrywa zmianę rozpraszania wywołaną przez absorpcję IR, a metoda OPTIR jest z natury kompatybilna z powszechnie stosowanymi narzędziami fluorescencyjnymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Diagram znakowania izotopowego i FISH; analiza kultury mikroorganizmów z użyciem OPTIR, piki widmowe, współczynnik zastąpienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Ogólny schemat analizy aktywności metabolicznej w pojedynczych komórkach z identyfikacją genetyczną metodą OPTIR-FISH. (AKomórki bakteryjne hodowano z substratami znakowanymi izotopowo.BFluorescencja in situ następnie przeprowadzono hybrydyzację in situ fluorescencyjną (FISH).C) Przygotowanie próbki na podłożu przezroczystym dla promieniowania IR. (DObrazy w jasnym polu pozwalają zidentyfikować obszary o optymalnej gęstości komórek.E,HWielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne różnych fluoroforów FISH pozwala zidentyfikować tożsamość genetyczną poszczególnych komórek zgodnie ze specyfikacją sond FISH lub pozostawia ją nieznaną.F,GKolejne obrazowanie wielospektralne OPTIR przy szczycie normalnym i przesuniętym wykazuje wbudowanie izotopowe w biomasę drobnoustrojów. Odnosząc się do widm OPTIR dla próbek nieznakowanych i w pełni znakowanych (współczynnik h), względny wkład regularnych (cProszę o podanie tekstu źródłowego do przetłumaczenia.) i izotopowe (cimożna było ilościowo określić składniki biologiczne. Syntezę białek z metabolizowanych substratów znakowanych izotopowo określono ilościowo przy użyciu „wskaźnika zastępowania izotopowego”.IDzięki metodzie OPTIR-FISH można przeprowadzić wysokoprzepustową analizę aktywności metabolicznej gatunków drobnoustrojów w złożonej populacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat spektroskopii OPTIR dla E. coli z wykorzystaniem glukozy ^12C/^13C, pokazujący przesunięcia pasm amidowych I/II." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne widma OPTIR i wyniki obrazowania. (A) Widma OPTIR dla komórek E. coli hodowlanych na glukozie 12C (cyjan) i glukozie 13C (pomarańczowy) obejmujące regiony amidu I i amidu II. Wyraźny przesunięty w stronę czerwieni pik amidu I (z 1656 cm-1 do 1612 cm-1) jest obserwowany dla komórek hodowlanych na glukozie 13C. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu i obrazy OPTIR komórek E. coli przy normalnym pasmie amidu I i przesuniętym pasmie amidu I w warunkach hodowli na glukozie 12C (B-D) i glukozie 13C (E-G). Paski skali: 10 µm. Rysunek zmodyfikowany za zgodą Bai i wsp.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Jasne pole, FISH, OPTIR E. coli i B. theta; wykres ilościowy izotopowy; mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66562/66562fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy i wyniki ilościowe z mieszanin bakteryjnych. E. coli inkubowano z 13C-glukozą, a następnie przeprowadzono hybrydyzację z sondą oligonukleotydową Gam42a-Cy5. Komórki B. theta inkubowano z 12C-glukozą, a następnie przeprowadzono hybrydyzację z sondą oligonukleotydową Bac303-Cy3. (A) Obraz w jasnym polu przedstawia morfologię mieszaniny komórek. (B) Dwukolorowy obraz fluorescencyjny pokazuje rozkład E. coli (czerwony) i B. theta (zielony). (C) Wynik odejmowania OPTIR (1612 cm-1-1656 cm-1) obrazuje metabolizm białek komórek bakteryjnych. (D) Ilościowe oznaczenie stopnia zastąpienia izotopowego reprezentujące nowo syntetyzowane białka 13C z 13C-glukozy. (Test t dla par: p = 9,74 x 10-33). Paski skali: 10 µm. Rysunek zmodyfikowany za zgodą Bai et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66562/66562fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

Understanding the metabolic activities of individual cells within complex communities is critical for unraveling their role in human disease. Here, we ...

Zakres naszych badań polega na opracowaniu i zastosowaniu OPTIR-FISH do identyfikacji pojedynczych komórek i analizy ich metabolizmu na poziomie pojedynczej komórki. Naszym celem jest zrozumienie, w jaki sposób poszczególne komórki oddziałują na siebie w złożonym środowisku oraz zrozumienie ich fizjologii i ról. Analiza metabolizmu na poziomie poszczególnych komórek, szczególnie w środowisku rodzimym, może dostarczyć bezcennych informacji na temat niejednorodnych, złożonych działań w systemach biologicznych.Jednak równoczesne zadanie różnicowania tożsamości komórkowej i wyjaśniania metabolizmu na poziomie pojedynczej komórki pozostaje wyzwaniem. Nasza zaawansowana platforma obrazowania wibracyjnego, optyczna fototermiczna podczerwień, oferuje badanie metabolizmu pojedynczych komórek. Jednocześnie jest naturalnie wysoce kompatybilny z dobrze znaną fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu identyfikacji gatunków drobnoustrojów.W związku z tym prosta integracja umożliwia jednoczesne metabolizm i identyfikację w tej samej rozdzielczości obrazowania. Na początek weź komórki bakteryjne utrwalone w paraformaldehydzie, odwiruj komórki w temperaturze 14 000 G przez 10 minut, a następnie usuń supernatant. Ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach 96% etanolu klasy analitycznej i inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Powtarzaj wirowanie przez pięć minut. Następnie usuń etanol i wysusz osad ogniwa na powietrzu. Teraz hybrydyzuj komórki w roztworze zawierającym znakowany fluorescencyjnie oligonukleotyd przez trzy godziny w temperaturze 46 stopni Celsjusza.Natychmiast po hybrydyzacji odwirować próbki w wirniku podgrzanym do 46 stopni Celsjusza przez 15 minut w maksymalnej dozwolonej temperaturze. Następnie przemyć próbki w buforze o odpowiedniej dokładności przez 15 minut w temperaturze 48 stopni Celsjusza. Po ponownym odwirowaniu próbki umyj komórki 500 mikrolitrami lodowatego PBS.Ponownie zawieś je w 20 mikrolitrach PBS i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia. Na początek weź standaryzowane preparaty z fluorkiem wapnia. Zanurz je w 70% etanolu na 15 minut i spłucz dwa razy wodą dejonizowaną.Przenieś czyste szkiełka do 0,1% roztworu poli-L-lizyny i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie spłucz szkiełka wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia. Następnie rozmrozić przygotowane próbki komórek w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.Aby uniknąć nadmiernej ilości kryształków soli z PBS podczas suszenia próbki, należy dwukrotnie umyć rozmrożone komórki wodą dejonizowaną. Odwirować przy 14 000 G przez 10 minut i usunąć supernatant. Ponownie wprowadź pierwotną objętość dejonizowanej wody do komórek i delikatnie je wiruj.Po umyciu odwirować komórki w stężeniu 14 000 G przez 10 minut w celu zagęszczenia próbek komórek bakteryjnych i usunięcia supernatantu. Delikatnie wirować pozostały roztwór przez około 30 sekund i nanieść od jednego do dwóch mikrolitrów tego roztworu na przygotowane szkiełko z fluorkiem wapnia.

optical-photothermal-infrared-fluorescence-situ-hybridization-optir

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.

Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

Technologie edycji genów umożliwiły badaczom generowanie mutantów danio pręgowanego w celu zbadania funkcji genów ze względną łatwością. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik do przeprowadzania równoległego genotypowania zarodków i kwantyfikacji sygnałów hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego. To bezstronne podejście zapewnia większą dokładność analiz fenotypowych opartych na hybrydyzacji in situ.

Genotypowanie i kwantyfikacja barwienia hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) to rozwijająca się technologia umożliwiająca obrazowanie kontrastów absorpcji optycznej in vivo z rozdzielczością i czułością na poziomie komórkowym. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcję wizualną dotyczącą protokołów eksperymentalnych OR-PAM, obejmującą konfigurację systemu, jego kalibrację, typowe procedury eksperymentalne in vivo oraz schematy obrazowania funkcjonalnego.

Trójwymiarowa mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej

Poznaj metodę OPTIR-FISH do identyfikacji pojedynczych komórek i analizy ich metabolizmu na poziomie jednej komórki. Technika łączy obrazowanie fototermiczne w podczerwieni z hybrydyzacją in situ fluorescencją.

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

Przeglądaj więcej filmów