Przewidywanie docelowego białka i walidacja związku małocząsteczkowego

Nasze badania koncentrują się na celach białkowych, przewidywaniu i walidacji związków drobnocząsteczkowych. Zastosowany tutaj eksperyment pokazuje metodę dokowania molekularnego w połączeniu z podobnym testem przesunięcia termicznego w celu przewidywania i walidacji interakcji między małymi cząsteczkami a celami białkowymi. Etapy TSA są skomplikowane, a wszelkie błędy podczas operacji mogą mieć duży wpływ na wyniki.

Nasz protokół łączy predykcję z weryfikacją, skutecznie redukując zarówno czasochłonność, jak i koszty ekonomiczne. Co więcej, instrumenty i materiały eksperymentalne są łatwe do wyboru. Wreszcie, oznaczone próbki TSA są łatwe do przygotowania i przetestowania, co zapewnia odtwarzalność próbek.

Aby rozpocząć, pobierz struktury krystaliczne ksantozyny i KEAP1. Po przetworzeniu struktur przejdź do sekcji Zadania i wybierz opcję Dokowanie liganda. Wybierz Siatka receptorów jako z pliku i kliknij Przeglądaj.

Następnie kliknij Pulpit. Otwórz folder dokowania Molecular i kliknij dwukrotnie plik 2FLU z siatką ślizgową. Wybierz siatkę ślizgową 2FLU.

zip i kliknij przycisk Otwórz. Teraz kliknij Użyj ligandów z plików. Następnie kliknij Przeglądaj i wybierz Pulpit.

Wybierz folder dokowania molekularnego i otwórz plik ligprep_1. Następnie wybierz wyjście ligprep_1. maegz i kliknij przycisk Otwórz.

Przejdź do Ustawień i wybierz opcję precyzja jako XP. Zmodyfikuj nazwę zadania, aby ślizgać się. XP_2FLU, a następnie kliknij przycisk Uruchom.

Aby wyświetlić wyniki dokowania, kliknij Plik i wybierz Opcje importu struktur. Przejdź do pulpitu i otwórz folder dokowania molekularnego. Następnie wybierz plik doc_XP_2FLU do ślizgania.

Wybierz plik maegz z doc_XP1_pv ślizgu i kliknij przycisk Otwórz. Następnie kliknij dwukrotnie kropkę w obszarze roboczym, aby wybrać ligand.

Wybierz sitemap_1_protein. Kliknij tabelę i przesuń maksymalnie w prawo, aby wyświetlić wynik dokowania. Aby zwizualizować wyniki 2D, wybierz opcję sitemap_1_protein, jak pokazano wcześniej.

Kliknij Interakcja liganda. Wybierz opcję Widok i zaznacz pole Legenda LID. Następnie kliknij Plik.

Wybierz Zapisz zrzut ekranu i wprowadź 6 000 jako szerokość. Odznacz pole przezroczystego tła i kliknij OK. Zapisz plik na pulpicie jako 2D-xanthatin-2FLU.

Analiza dokowania molekularnego pozwoliła przewidzieć interakcję między ksantaniną a białkiem KEAP1. Na początek dodaj surowe komórki 264,7 do 100-milimetrowego naczynia hodowlanego i inkubuj z 6 mililitrami DM-EM w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności 95% i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, odessaj stare podłoże.

Następnie umyj komórki dwa razy 2 mililitrami PBS ogrzanego do temperatury pokojowej. Następnie dodaj 2 mililitry PBS do każdego naczynia zawierającego komórki i wymieszaj je. Zbierz komórki do dwóch 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek, a następnie odwiruj w temperaturze 377G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 2 mililitrach PBS. Teraz zamroź probówki do mikrowirówek w ciekłym azocie, aż utworzy się białe ciało stałe i natychmiast rozmroź w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odwirować probówki o stężeniu 12 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnie weź dwie probówki do mikrowirówek, jedną ze 100 mikromolową ksantofoniną, a drugą z równą objętością dimetylosulfotlenku. Dodać 450 mikrolitrów odwirowanego supernatantu do każdej probówki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przenieś 60 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki do mikrowirówki do 14 probówek PCR.

Podgrzewaj probówki jednocześnie w różnych temperaturach przez trzy minuty, z dwiema probówkami PCR w każdej temperaturze. Następnie umieść probówki w wirówce. Teraz weź 48 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki i dodaj go do nowej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Dodać 12 mikrolitrów buforu ładującego białko SDS-PAGE do każdej probówki. Podgrzewać wirowane próbki w łaźni wodnej w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Aby rozpocząć, przygotuj żel SDS-PAGE.

Odwirować rozmrożony marker i przygotowane próbki do komórkowego testu przesunięcia termicznego. Dodaj 2,5 mikrolitra markera do pierwszego dołka i 20 mikrolitrów próbek do każdego z pozostałych dołków. Następnie uruchom żel pod napięciem 80 woltów.

Następnie dodaj 850 mililitrów ultraczystej wody, 100 mililitrów bezwodnego etanolu i 50 mililitrów buforu do szybkiego transferu do zlewki i dobrze wymieszaj. Przyciąć membranę z polifluorku winylidenu lub PVDF zgodnie z rozmiarem żelu i oznaczyć go. Następnie zanurz go w metanolu na 30 sekund, aby go aktywować.

Umieść zaciski transferowe, podkładkę z gąbki i trzy warstwy bibuły filtracyjnej do transferu w tacy zawierającej bufor transferowy. Po zakończeniu elektroforezy wylej roztwór do elektroforezy z urządzenia do elektroforezy i wyjmij płytkę. Delikatnie usuń żel plastikowym nożem i przetnij go, aby wyraźnie uwidocznić marker białkowy i białka docelowe.

Po umyciu żelu w roztworze transbłonowym połóż go płasko na bibule filtracyjnej. Zanurz aktywowaną membranę PVDF w roztworze transferowym. Przytrzymaj oznaczoną stronę pęsetą i przykryj żel stroną zadrukowaną do dołu.

Następnie umieść zmontowany zestaw transferowy w zbiorniku transferowym. Dodaj pozostały roztwór transbłonowy do kasety transbłonowej. Dostosuj prąd i czas, a następnie naciśnij uruchom, aby rozpocząć transfer w temperaturze pokojowej.

Teraz dodaj sześć mililitrów 5% roztworu BSA z TBST do pudełka inkubacyjnego. Po zakończeniu transferu wyjmij membranę PVDF z zestawu, jednocześnie zaciskając stronę znacznika i umieść ją w pudełku inkubacyjnym. Po wyjęciu roztworu BSA z pudełka inkubatora dodać 6 mililitrów przeciwciała pierwszorzędowego.

Umieść pudełko inkubacyjne w piankowym pudełku z okładami z lodu na noc, potrząsając. Następnego dnia zbierz przeciwciało pierwszorzędowe w probówce i przemyj membranę 6 mililitrami roztworu TBST. Następnie dodaj 6 mililitrów przeciwciała wtórnego do pudełka inkubacyjnego.

Pod koniec inkubacji zebrać przeciwciało drugorzędowe i przemyć błonę pięciokrotnie TBST, jak pokazano wcześniej. Wymieszać równe objętości odczynników chemiluminescencyjnych A i B. Otwórz system obrazowania żelu. Kliknij Samples, sprawdź kalibrację i poczekaj na zakończenie kalibracji.

Następnie kliknij Marker i sprawdź kalibrację. Teraz podnieś pęsetą stronę znacznika paska i całkowicie zanurz w roztworze odczynnika chemiluminescencyjnego. Clamp jedną stronę markera, aby umieścić pasek stroną zadrukowaną do dołu w wywoływarce i zamknij pokrywę termowizora.

Ustaw czas ekspozycji na jedną sekundę i kliknij przycisk Przechwyć. Kliknij Zapisz. Nazwij obraz i zapisz go jako plik TIFF.

Test przesunięcia termicznego w komórkach wykazał, że ksantacyna znacząco zmienia stabilność termiczną białka KEAP1 w zakresie temperatur od 48 do 57 stopni Celsjusza w porównaniu z grupą dimetylosulfotlenku.