Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy
19 kwietnia 2024
Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.
Celem naszych badań jest zrozumienie mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw uszkodzenia perfuzyjnego niedokrwiennego oraz reakcji zapalnych i tolerogennych po przeszczepie płuc. Chcemy zbadać dynamiczne interakcje między komórkami dawcy i biorcy. Obecnie wykorzystujemy kilka technik chirurgicznych i obrazowych w badaniach immunologii przeszczepu płuc u myszy.
Należą do nich ortotopowy przeszczep i retransplantacja lewego płuca, zaciskanie wnęki lewej płucy, nieinwazyjna pozytonowa tomografia emisyjna oraz dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe. Nasze badania ujawniają unikalne odpowiedzi immunologiczne w przeszczepionych płucach. Korzystając z zaawansowanych technik obrazowania, odkryliśmy, że monocyty biorcy sprzyjają infiltracji neutrofili w alloprzeszczepach płuc za pośrednictwem IL-1 beta.
Odkryliśmy również, że limfocyty T regulatorowe FOXP3 skupiają się w tych alloprzeszczepach i chronią przed odrzuceniem za pośrednictwem przeciwciał. Nasza technika jest łatwa do skonfigurowania dzięki materiałom łatwo dostępnym w laboratorium mikroskopowym, takim jak klej tkankowy i okulary nakrywkowe. Dodatkowo zapewnia większe pole widzenia w porównaniu z innymi technikami.
Nasze laboratorium jest zainteresowane zrozumieniem mechanizmów, które indukują i utrzymują tolerancję alloprzeszczepu płuc. Obrazowanie przyżyciowe pozwoli nam zobrazować interakcje między komórkami odpornościowymi podczas odrzucenia i tolerancji. Na początek umieść znieczuloną mysz, która przeszła przeszczep płuc, w prawej bocznej pozycji odleżynowa.
Przetrzyj skórę klatki piersiowej mieszanką 0,75% jodu i 70% etanolu. Ponownie otwórz lewą torakotomię przez trzecią przestrzeń międzyżebrową. Teraz usuń część skóry i tkanek miękkich z miejsca lewej torakotomii i otwórz torakotomię.
Zaciśnij żebra na 10 sekund, aby zakrzepić mikrokrążenie. Następnie wytnij części od trzeciego do piątego żebra, aby utworzyć okno obrazowania. Użyj wstrzykiwacza do elektrokoagulacji, aby zatrzymać krwawienie z krawędzi żeber.
Teraz umieść mały guzek złożonej gazy pod prawą klatką piersiową. Za pomocą bawełnianych wacików wyjmij przeszczep płuc z klatki piersiowej i umieść dolną część płuca na pasku gazy nasączonej solą fizjologiczną o szerokości jednego na trzy centymetry. Na początek umieść zaintubowaną mysz z otwartą torakotomią na płycie podstawy komory obrazowania z otwartą lewą klatką piersiową skierowaną do góry.
Za pomocą jedwabnej taśmy zabezpiecz mysz na pysku, przednich łapach i ogonie. Nałóż klej na dolną stronę szkła nakrywkowego przymocowanego do górnej płyty. Następnie opuść górną płytę, aż szkło nakrywkowe zetknie się z płucem, pozwalając klejowi dotknąć powierzchni płuc.
Przyłóż szklankę nakrywkową do płuca. Napompuj płuco przez jedną do dwóch sekund, aby obszar kleju przylegał do otaczającej tkanki. Umieść nakrętkę motylkową na każdej i zabezpiecz górną płytę.
W przypadku obrazowania dwufotonowego umieść całą komorę obrazowania za pomocą myszy na stoliku mikroskopu. Użyj filtrów dichroicznych, aby oddzielić sygnały od reportera GFP, kropki Q i kolagen generują sygnał SHG. Następnie ustaw laser impulsowy femtosekundowy z szafirem tytanowym na długość fali wzbudzenia 890 nanometrów przy najniższej możliwej mocy.
Nałóż jeden mililitr wody na szkło nakrywkowe na górnej płycie. Teraz opuść obiektyw zanurzenia w wodzie do wody i skup się na powierzchni płuc. Włącz grzałkę podstawy, utrzymując temperaturę w zakresie od 35 do 37 stopni Celsjusza.
Kupuj stosy obrazów za pomocą wybranego oprogramowania do akwizycji. Po 24 godzinach od przeszczepu w płucach było więcej neutrofili w porównaniu z dwiema godzinami po przeszczepie.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół obrazowania intravitalnego przeszczepionego lewego płuca myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Jego celem jest wyjaśnienie mechanizmów immunologicznych zaangażowanych w uszkodzenie reperfuzyjne oraz odpowiedzi następujących po transplantacji płuc.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia transplantacji
Wstęp
- Zrozumienie mechanizmów odpornościowych w transplantacji płuc jest kluczowe.
- Uszkodzenie reperfuzyjne wpływa na wyniki przeszczepienia.
- Dynamiczne interakcje między komórkami dawcy i biorcy są istotne.
- Zaawansowane techniki obrazowania mogą ujawnić unikalne odpowiedzi immunologiczne.
Cel badania
- Zbadanie odpowiedzi immunologicznych w przeszczepionych płucach.
- Analiza oddziaływań między komórkami dawcy i biorcy.
- Wykorzystanie zaawansowanych technik obrazowania do analizy w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Ortotopowa transplantacja i retransplantacja lewego płuca.
- Zaklemowanie lewego wnęki płucnej.
- Nieinwazyjna tomografia emisyjna pozytonów.
- Dwufotonowe obrazowanie intravitalne.
Główne wyniki
- Monocyty biorcy promują infiltrację neutrofili w allograftach płuc.
- IL-1 beta odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej.
- W przeszczepionych płucach zaobserwowano unikalne odpowiedzi immunologiczne.
- Zaawansowane techniki obrazowania dostarczyły wglądu w dynamikę komórkową.
Wnioski
- Badanie to pogłębia zrozumienie immunologii przeszczepu płuc.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym jest cennym narzędziem do badania oddziaływań komórkowych.
- Dalsze badania mogą przyczynić się do poprawy wyników transplantacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Intrawitalna mikroskopia dwufotonowa przeszczepionych płuc myszy umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki komórek odpornościowych, co jest kluczowe dla zrozumienia odrzucania i tolerancji przeszczepu. Możliwość ta rozwiązuje istotny problem na etapie odkryć, dostarczając wglądu mechanistycznego w interakcje między komórkami dawcy i biorcy oraz w szlaki zapalne. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, wspierając decyzje uwzględniające ryzyko w zakresie strategii immunomodulacyjnych w portfolio badań nad transplantologią.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania leków i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację ruchu i interakcji komórek odpornościowych w obrębie przeszczepionej tkanki.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie szlaków zaangażowanych w odrzucanie i tolerancję przeszczepu.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów immunologicznych, takich jak monocyty, neutrofile i limfocyty T regulatorowe.
- Dostarcza dynamicznych dowodów pozwalających na nadanie priorytetu lub obniżenie priorytetu celom immunomodulacyjnym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy obrazowania in vivo do ilościowej oceny odpowiedzi immunologicznych.
- Umożliwia powtarzalny pomiar infiltracji i grupowania komórek w odpowiedzi na interwencje.
- Pozwala na standaryzację protokołów obrazowania w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Przygotowuje solidne platformy do oceny potencjalnych terapii celujących w szlaki immunologiczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele przedkliniczne do mechanizmów immunologicznych istotnych dla choroby, obserwowanych podczas transplantacji.
- Umożliwia podłużne śledzenie zachowania komórek odpornościowych po przeszczepie, co wspiera odkrywanie translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do walidacji przedklinicznej immunoterapii.
- Uzasadnia dostosowanie ryzyka w rozwoju kandydatów na leki w oparciu o dowody modulacji immunologicznej in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta technika obrazowania integruje etapy od wczesnego odkrycia po walidację przedkliniczną, łącząc badania mechanistyczne z badaniami translacyjnymi w immunologii transplantacji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących roli komórek odpornościowych w odrzucaniu i tolerancji przeszczepu.
- Screening: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki obrazowania w zakresie infiltracji i grupowania komórek odpornościowych.
- Analityka: Zapewnia wysokotreściowe dane o rozdzielczości czasowej do analizy porównawczej odpowiedzi immunologicznych.
- Badania translacyjne: Powiąże wyniki przedkliniczne z klinicznymi mechanizmami odpornościowymi istotnymi dla wyników transplantacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę obrazowania, którą można dostosować do innych modeli chorób płuc i chorób o podłożu immunologicznym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów immunologicznych i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność przepływów pracy w obrazowaniu in vivo.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go i redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach w portfelach immunologicznych.
- Wpływ na portfel: Umożliwia priorytetyzację strategii immunomodulacyjnych dla transplantacji i wskazań pokrewnych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu chirurgii małych zwierząt oraz zaawansowanych technik mikroskopowych.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopów dwufotonowych, transgenicznych linii myszy oraz oprogramowania do analizy obrazowania.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów obrazowania i interpretacji danych.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do innych układów narządowych i modeli chorób poprzez odpowiednie modyfikacje techniczne.
- Głębokość obrazowania oraz pole widzenia są ograniczone przez właściwości tkanki i aparaturę.
