Name: Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 16 s
Description: Poznaj mikroskopię dwufotonową do przyżyciowego obrazowania przeszczepionego płuca myszy. Ta metoda pozwala badać dynamiczne interakcje komórkowe i mechanizmy immunologiczne w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty z NIH 1P01AI11650 i Fundacji na rzecz Szpitala Żydowskiego Barnes. Dziękujemy Rdzeniowi Obrazowania In Vivo w Washington University School of Medicine.

Wszystkie procedury obchodzenia się ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee w Washington University School of Medicine.
1. Znieczulenie i intubacja
UWAGA: Ortotopowy przeszczep lewego płuca myszy jest wykonywany, jak opisano wcześniej20,21. Płuca myszy C57BL/6 (B6) o gramaturze 20-25 g są przeszczepiane biorcom witaminy B6 o tej samej płci i wieku. Klasa B6. Myszy reporterowe LysM-GFP są wykorzystywane jako biorcy w wybranych eksperymentach mających na celu wizualizację infiltracji neutrofili do przeszczepów płuc. Myszy biorcy można obrazować bezpośrednio po przeszczepie płuc.
<ol>
	<li>Ponownie znieczulić myszy za pomocą dootrzewnowego podawania ketaminy (80-100 mg / kg) i ksylazyny (8-10 mg / kg). Buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu (0,5-1,0 mg/kg) należy podawać podskórnie w celu dodatkowej kontroli bólu. Potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia szczypcem łapy. 
	UWAGA: Jeśli czas między przeszczepem płuc a planowanym obrazowaniem przyżyciowym jest krótszy niż dwie godziny, można ponownie podać znieczulenie z 50% początkowej dawki ketaminy.</li>
	<li>Usuń włosy z całej lewej klatki piersiowej za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia i wytrzyj klatkę piersiową, aby usunąć nadmiar przyciętych włosów.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną bez leku na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Ponownie zaintubuj mysz ustnie i tchawiczo za pomocą angiocewnika 20 G, jak opisano wcześniej21.</li>
	<li>Wietrzyć powietrzem z pomieszczenia o prędkości 120 oddechów/min i objętości oddechowej 0,5 cm³.</li>
	<li>Dostarczyć 1% izofluoranu dotchawiczo podczas całego zabiegu.</li>
	<li>Aby uwidocznić naczynia krwionośne podczas obrazowania, należy wstrzyknąć 20 μl niedocelowych kropek kwantowych (q-dots) o długości 655 nm w 50 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami dożylnie co najmniej 5 minut przed obrazowaniem.</li>
</ol>
2. Chirurgiczne przygotowanie lewego płuca do obrazowania
<ol>
	<li>Ustaw mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowej (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Trzykrotnie zdezynfekuj skórę klatki piersiowej mieszaniną 0,75% jodu i 70% etanolu.</li>
	<li>Ponownie otwórz lewą torakotomię (po przeszczepie płuc myszy) przez trzecią przestrzeń międzyżebrową (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Usuń część skóry i tkanki miękkiej z miejsca lewej torakotomii o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Przed resekcją żeber najpierw zaciśnij żebra na ~10 s, aby zakrzepić mikrokrążenie w celu uzyskania hemostazy (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 1C, D).</li>
	Wytnij części żeber od 3 do 5, aby stworzyć okno obrazowania wystarczająco duże, aby wydobyć płuco (~0,8 cm czaszkowo-ogonowo i ~1,0 cm przednio-tylnie, <silna klasa = "xfig">Rysunek 1D, E).<li></li>
	<li>Zatrzymać dodatkowe krwawienie z krawędzi żeber za pomocą elektrokoagulacji. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest uzyskanie hemostazy na krawędzi cięcia żeber, aby uniknąć nadmiernej utraty krwi w okresie obrazowania.</li>
	<li>Umieść mały guzek (4 cm x 4 cm gaza złożona wzdłużnie 3 razy) pod prawą klatką piersiową (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Za pomocą bawełnianych wacików podnieś przeszczep płuca z klatki piersiowej i umieść dolną część płuca na pasku gazy nasączonej solą fizjologiczną o wymiarach 1 cm x 3 cm (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1F). 
	UWAGA: Ten pasek gazy nasączonej solą fizjologiczną zapobiega przesuwaniu się płuc, utrzymuje wilgotne środowisko dla płuc, chroni płuco przed ostrymi krawędziami wyciętych żeber i oddziela płuca od ruchu serca. Po nałożeniu obwodowej komory obrazowania na płuco (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1G, H, opisany w sekcji 3), utrata ciepła i płynu z otwartej jamy klatki piersiowej powinna być minimalna w okresie obrazowania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komory obrazowania 
UWAGA: Komora obrazowania jest budowana na zamówienie (zobacz Rysunek 2A). Ta komora obrazowania składa się z płyty podstawy i płyty górnej, pomiędzy którymi mysz jest umieszczona i zabezpieczona sprężynowymi po obu stronach (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B). Na górnej płycie znajduje się okrągłe wycięcie o średnicy ~2 cm. W tym otworze z przodu górnej płyty umieszczono odpowiednio duży pierścień uszczelniający, który będzie chronił soczewkę obiektywu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Szkło nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm przykleja się do tylnej części górnej płyty za pomocą smaru o wysokiej podciśnieniowości, co zapewnia wodoszczelne uszczelnienie. To szkło nakrywkowe będzie służyć jako okienko obrazowania, przylegając do płuca poniżej i utrzymując media obrazowe (tj. wodę) powyżej. Upewnij się, że smar próżniowy nie dostał się do okrągłego okienka obrazowania. Szkło nakrywkowe będzie wymieniane przy każdym nowym eksperymencie obrazowania. Płyta podstawy jest podgrzewana do temperatury 35-37 °C za pomocą sondy temperatury termopary (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 2A).
<ol>
	<li>Umieść zaintubowaną mysz na płycie podstawy komory obrazowania z otwartą lewą klatką piersiową skierowaną do góry (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1G, H). Przymocuj mysz jedwabną taśmą do pyska, przednich łap i ogona (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1H i <silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Nałóż klej na dolną stronę szkła nakrywkowego przymocowanego do górnej płyty (szare kółko w <silna klasa="xfig">Rysunek 2C, na dole), pozostawiając 0,8-1,0 cm bezklejowego koła pośrodku. 
	UWAGA: Istnieje kompromis między rozmiarem okręgu bez kleju a ilością artefaktu ruchu; Dlatego zaleca się, aby okrąg nie przekraczał 1,0 cm średnicy.</li>
	<li>Opuść górną płytę, aż szkło nakrywkowe zetknie się z płucem, a klej dotknie powierzchni płuca (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1G). 
	UWAGA: Lewe płuco zostanie przyklejone do szkła nakrywkowego z czystym, bezklejowym okręgiem pośrodku, czyli obszarem, który zostanie zobrazowany.</li>
	<li>Przyłóż szkło nakrywkowe do płuca i napompuj płuco przez 1-2 sekundy, aby obszar kleju przylegał do otaczającej tkanki. Osiągnij napompowanie płuc poprzez zamknięcie rurki odpływowej z rurki dotchawiczej myszy do respiratora. 
	UWAGA: Nie należy pompować płuc dłużej niż 1-2 sekundy, ponieważ może to spowodować nadmierną barotraumę.</li>
	<li>Lekko cofnij górną płytkę, aby zmniejszyć nacisk na tkankę płucną. Upewnij się, że obszar płuca w okienku obrazowania nie porusza się wraz z wentylacją.</li>
	<li>Zabezpiecz oba końce górnej płyty, dokręcając nakrętkę skrzydełkową do każdej (patrz Rysunek 2B).</li>
</ol>
4. Obrazowanie dwufotonowe 
UWAGA: Do mikroskopii przyżyciowej powinien być używany mikroskop pionowy o stałym stopniu widzenia z obiektywem zanurzeniowym w wodzie >o aperturze numerycznej (NA) 20x lub 25x. Poniżej znajduje się konfiguracja użyta w tym badaniu dla B6 do B6. Przeszczep lewego płuca LysM-GFP z znakowaniem naczyń krwionośnych q-dot 655 nm. Stosując ten protokół, konfigurację mikroskopu, laserów i filtrów dichroicznych można dostosować w zależności od potrzeb konkretnego eksperymentu i zastosowanych reporterów fluorescencyjnych.
<ol>
	<li>Umieść całą komorę obrazowania z zaintubowaną myszą biorcą (B6 lewe płuco przeszczepione do B6. LysM-GFP z kropkami q 655 nm) na stolik mikroskopu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Stosuj filtry dichroiczne o długościach fal 480 nm, 560 nm i 635 nm, które odpowiednio oddzielą sygnały od reportera GFP, q-dots i sygnału generacji drugiej harmonicznej (SHG) (445 nm) generowanego przez kolagen. Filtry te można dostosować w zależności od konkretnego eksperymentu. 
	UWAGA: Sygnał SHG generowany przez kolagen wyznacza ciemne struktury przypominające kratery, które reprezentują pęcherzykowe przestrzenie powietrzne (patrz białe strzałki w <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Ustaw tytanowo-szafirowy laser impulsowy femtosekundowy na 890 nm (w zakresie bliskiej podczerwieni) w celu wzbudzenia. Użyj najniższej możliwej mocy lasera, aby uzyskać wystarczający sygnał. 
	UWAGA: Ustawienia lasera należy dostosować do konkretnego eksperymentu, aby zmaksymalizować separację sygnału.</li>
	<li>Nałóż ~ 1 ml wody, aby całkowicie pokryć szkło nakrywkowe na górnej płycie, które będzie utrzymywane na miejscu przez O-ring i próżniową uszczelkę smarową szkła nakrywkowego do górnej płyty (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1G i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C).</li>
	<li>Użyj obiektywu 20x >1.0 NA zanurzonego w wodzie w mikroskopie. Upewnij się, że soczewka obiektywu jest dostosowana do konkretnego eksperymentu. 
	UWAGA: Większa Ameryka Północna pozwala na lepsze zbieranie światła, wyższy kontrast i bardziej szczegółowe obrazy. Preferowane są cele zanurzenia w wodzie, ponieważ woda lub bufor są bardziej kompatybilne z tkankami biologicznymi.</li>
	<li>Opuść obiektyw mikroskopu do wody i skup się na powierzchni płuc</li>.
	<li>Włączyć grzałkę płyty bazowej i utrzymać temperaturę na poziomie 35-37 °C. 
	UWAGA: Jeśli istnieją obawy dotyczące niemożności utrzymania temperatury tkanki lub odpowiedniej perfuzji do płuc, można przymocować dwa dodatkowe rezystory w celu ogrzania górnej płytki oprócz płytki podstawy (patrz rysunek uzupełniający 1).</li>
	<li>Pobieraj stosy obrazów za pomocą wybranego oprogramowania do akwizycji. 
	UWAGA: Upewnij się, że pomieszczenie jest całkowicie ciemne podczas akwizycji, co może wiązać się z użyciem zasłon/żaluzji zaciemniających i strategicznego zakrycia wszystkich źródeł światła.</li>
</ol>
5. Akwizycja wideo
UWAGA: Następujące parametry mogą być dostosowane w zależności od konkretnego eksperymentu. Kroki 5.1-5.3 opisują konkretne parametry używane dla B6 do B6. Mysi przeszczep lewego płuca Lysm-GFP, który może być używany jako przewodnik referencyjny.
<ol>
	<li>Korzystając ze skanera dwukierunkowego o szybkości wideo, ustaw wymiary skanowania x-y na 512 x 512 pikseli.</li>
	<li>Korzystając z jednostki krokowej xyz, uzyskaj nagrania poklatkowe 21-stopniowego stosu z 10-klatkowym uśrednianiem na krok. Uzyskanie każdego stosu zajmuje około 20 s, co obejmuje czas potrzebny na uśrednienie klatek, ruch silnika krokowego i sprawdzenie jego położenia oraz opóźnienie 100 ms. 
	UWAGA: Dwukierunkowy skaner w mikroskopie użytym w tym badaniu działa z szybkością wideo 30 klatek/s. Może się to różnić w zależności od konkretnej konfiguracji mikroskopu.</li>
	<li>Uzyskaj 80 kolejnych stosów z, aby uzyskać obrazowanie poklatkowe migracji leukocytów w miąższu tkanki. Zajmuje to około ~27 min przy 20 s/stos. 
	UWAGA: Rozmiar stosu, uśrednianie klatek, moc lasera i całkowita długość nagrania poklatkowego powinny być zminimalizowane, aby zapobiec nadmiernej ekspozycji lasera na tkankę. Jeśli używane reportery fluorescencyjne są jasne (tj. GFP), a moc lasera jest niska, to powtarzanie 21-krokowego stosu z 10-klatkowym średnim skanem 512 x 512 pikseli, w odstępach 20 s przez ~27 minut jest dobrze tolerowane przez mysz. Jeśli pożądane są dłuższe okresy obrazowania, czas akwizycji na stos należy wydłużyć, aby utrzymać całkowitą ekspozycję lasera na tym samym poziomie (tj. 1 minuta na stos przez ~1,5 godziny). Ustawienia te będą musiały zostać zoptymalizowane w oparciu o używane reportery fluorescencyjne.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji pod koniec akwizycji obrazu. Aby poddać się eutanazji, znieczulij mysz ketaminą (80-100 mg / kg) i ksylazyną (8-10 mg / kg), a następnie zwichnięciem szyjki macicy. Typowe preparaty do obrazowania z łatwością utrzymują żywotność myszy do 2 godzin 
	UWAGA: Aby przedłużyć ten okres, może być wymagana dodatkowa suplementacja płynów, znieczulenie izofluranem i zwrócenie uwagi na regulację temperatury.</li>
	<li>Pełne renderowanie wideo za pomocą Imaris. Można również korzystać z innego oprogramowania do obrazowania (takiego jak ImageJ). 
	UWAGA: Obrazy mogą być przetwarzane po akwizycji przy użyciu poprawy kontrastu, wygładzania i arytmetyki kanałów w celu usunięcia przesłuchów kanałów.</li>
</ol>

Real-Time Monitoring of Cellular Dynamics in Mouse Lung Transplantation

Autorzy nie informują o żadnych istotnych ujawnieniach.

Wzbudzenie dwufotonowe zostało po raz pierwszy opisane w jej pracy doktorskiej przez Marię Göppert-Mayer w 1931 roku, która później otrzymała Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki za opisanie struktury powłoki jądrowej22,23. Tradycyjna mikroskopia fluorescencyjna opiera się na wzbudzeniu pojedynczych fotonów, przy czym długości fal wzbudzenia są krótsze i mają wyższą energię niż fale emisyjne. W przeciwieństwie do mikroskopii jednofotonowej, mikroskopia dwufotonowa polega na jednoczesnym wzbudzeniu przez dwa fotony, z których każdy ma większą długość fali niż emitowany sygnał fluorescencyjny 24,25,26. Ponieważ dwa pojedyncze fotony muszą się kolokalizować, aby wzbudzić pojedynczy punkt ogniskowy w tkance, wzbudzenie dwufotonowe odbywa się przestrzennie do małej objętości próbki, co pozwala na przekrój optyczny 24,25,26 i jest mniej fotowybielania powyżej i poniżej płaszczyzny zawierającej ognisko27. Prawdopodobieństwo jednoczesnego wzbudzenia przez dwa fotony jest bardzo niskie, dlatego do osiągnięcia intensywności wzbudzenia wymaganej dla sygnału emisji fluorescencji potrzebny jest femtosekundowy laser impulsowy 25,26,27. Laser wzbudzający znajduje się w zakresie bliskiej podczerwieni (700-1100 nm), którego zaletą jest mniejsze rozproszenie, co pozwala światłu wnikać głębiej w tkankę28. Głębokość obrazowania zależy od prędkości oscylacji i mocy lasera24. W obrębie płuc można uzyskać głębokość obrazowania ~500-600 μm17. Tak więc połączenie głębokości obrazowania i niskiego fotowybielania sprawia, że mikroskopia dwufotonowa doskonale nadaje się do obrazowania przyżyciowego narządów.
Mikroskopia dwufotonowa została zastosowana w wielu różnych tkankach i miejscach anatomicznych, takich jak skóra12,13, węzły chłonne29, śródbłonek żylny30, kora mózgowa10,11, nerki14,15 i wątroba31,32. Na przykład w skórze właściwej myszy obrazowanie dwufotonowe przyżyciowe zostało wykorzystane do opisania roju neutrofili po sterylnym urazie fizycznym12. W modelu zakrzepicy żylnej uwidoczniono monocyty krwi i neutrofile pełzające wzdłuż śródbłonka żyły głównejdolnej 30. Ludzki mikroglej został z powodzeniem zobrazowany in vivo po tym, jak został ksenoprzeszczepiony do modelu organoidu ludzkiego mózgu33. Dzięki ciągłemu postępowi w mikroskopii dwufotonowej, obrazowanie przyżyciowe jest możliwe na większych głębokościach, a nawet w narządach niestatycznych. Na przykład głębokości do 1000 μm zostały zobrazowane w korze nowej u myszy za pomocą wzmacniacza regeneracyjnego Ti:Al2O3 34.
Jednym z wyzwań związanych z obrazowaniem przyżyciowym w narządach klatki piersiowej jest stabilizacja obrazu. Ze względu na ruch bijącego serca i oddychanie płuc, artefakty ruchu mogą znacznie obniżyć jakość obrazu. Opracowano kilka metod stabilizacji do obrazowania serca i płuc, w tym klejenie narządu 4,7, stabilizację ssania-stabilizację 19,35,36,37 oraz korekcję ruchu a posteriori38. Nasza technika obrazowania płuc polega na przyklejeniu powierzchni płuca do stabilizowanego szkła nakrywkowego. Utrzymujemy płuca w stanie perfuzji, wentylacji i normotermii, co symuluje warunki występujące in vivo. W porównaniu z metodą ssąco-stabilizacyjną opisaną przez Looneya i wsp.19, protokół ten ma kilka zalet. Po pierwsze, nie wymagamy tworzenia specjalistycznego urządzenia ssącego. Zamiast tego nasza komora obrazowania i górna płyta mogą być zbudowane z materiałów łatwo dostępnych w laboratorium mikroskopowym. Dodatkowo, w porównaniu z urządzeniem ssącym (które ma średnicę wewnętrzną 4 mm), technika klejenia zastosowana w tym badaniu pozwala na uzyskanie większej powierzchni obrazowania (do 10 mm). Dzięki klejeniu obwodowemu obszar płuc w okręgu kleju jest odpowiednio ograniczony, a ruchy wentylacyjne są zminimalizowane. W porównaniu z techniką ssania, podejście ze szkłem nakrywkowym zapobiega wypukłej deformacji powierzchni płuc, która mogłaby wpływać na przepływ krwi w naczyniach włosowatych podopłucnowych. Do wad naszego systemu należy brak możliwości usunięcia szkiełka nakrywkowego bez naruszenia połączenia pleuroparenchymalnego. W związku z tym nie jest możliwe zobrazowanie płuca po raz drugi za pomocą zastosowanej tu techniki klejenia, podczas gdy technika ssania pozwala na obrazowanie seryjne. Dodatkowo zastosowanie torakotomii wiąże się z utratą normalnego ujemnego ciśnienia w klatce piersiowej, co w połączeniu z wentylacją nadciśnieniową nie jest fizjologiczne. Dodatkowe ograniczenia, ograniczenia obrazowania dwufotonowego omówiono poniżej.
Chociaż klatka piersiowa jest otwarta podczas obrazowania przyżyciowego, bardzo ważne jest, aby utrzymać ją jak najbliżej środowiska fizjologicznego. Płytka podstawy, na której leży mysz, jest utrzymywana w temperaturze 35-37 °C. Po podgrzaniu tylko płyty podstawy odkryliśmy, że temperatura rdzenia myszy (mierzona za pomocą sondy doodbytniczej) jest dobrze regulowana przez kilka godzin. Z naszego doświadczenia wynika, że ruchliwość i zachowanie komórek są widocznie zmienione tylko wtedy, gdy temperatura spada poniżej 32 °C, co jest mało prawdopodobne w przypadku tej konfiguracji. Jeśli wystąpią trudności w utrzymaniu normotermii tkankowej lub perfuzji płuc podczas początkowej konfiguracji tej komory obrazowania, można dołączyć dwa dodatkowe rezystory w celu ogrzania górnej płytki oprócz płyty podstawy (rysunek uzupełniający 1). Po zoptymalizowaniu komory obrazowania nie jest konieczne rutynowe monitorowanie wewnętrznej temperatury myszy podczas każdego eksperymentu obrazowania. Ponadto odkryliśmy, że połączenie gazy nasączonej solą fizjologiczną umieszczonej na otwartej jamie klatki piersiowej i okluzyjnego pierścienia kleju wokół obszaru płuca, który ma być obrazowany, skutecznie minimalizuje straty płynów podczas obrazowania.
Ważną kwestią techniczną jest uzyskanie dobrej hemostazy podczas resekcji żeber podczas tworzenia okna obrazowania klatki piersiowej. Części lewych żeber od 3do 5są recięte, a trwający krwotok z tych przeciętych żeber zagrozi przeżyciu myszy podczas obrazowania. Aby temu zaradzić, zalecamy najpierw zaciśnięcie żeber proksymalnie do miejsca, w którym mają zostać wycięte przez 10 sekund, aby zakrzepić mikrokrążenie (patrz ryc. 1C,D). Następnie, po resekcji żeber, przycięte krawędzie żeber należy obficie skoagulować za pomocą elektrokoagulacji. Wreszcie, bardzo ważne jest, aby umieścić lewe płuco na pasku gazy nasączonej solą fizjologiczną (patrz rysunek 1F) podczas obrazowania, aby zapobiec przebiciu płuca przez ostre krawędzie żeber. Dzięki tej kombinacji rozważań technicznych możemy uchwycić wyraźne filmy z transportu komórek odpornościowych w miąższu płuc przy minimalnym artefaktie ruchu przez kilka godzin bez uszkodzenia płuc lub utraty normalnych wzorców perfuzji.
Mikroskopia dwufotonowa została wykorzystana w płucach do badania modeli chorób zakaźnych i sterylnego stanu zapalnego. Jedna grupa wykorzystała obrazowanie dwufotonowe do zbadania ruchliwości i migracji komórek B pamięci rezydentnej po powtarzających się wyzwaniach płuc myszy wirusem grypy39. Dodatkowo mikroskopia dwufotonowa została wykorzystana w transplantacji skóry, nerek i wysp trzustkowych 40,41,42,43. Dzięki modelowi przeszczepu dawca i biorca mogą zostać zmienieni genetycznie w celu zbadania odpowiednich populacji komórek. Według naszej wiedzy, nasza grupa była pierwszą, która wykonała przyżyciowe obrazowanie dwufotonowe w mysich przeszczepach płuc4. Zaobserwowaliśmy szybką rekrutację i grupowanie neutrofili po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym za pośrednictwem przeszczepu, które zmniejszyło się wraz z farmakologicznym wyczerpaniem monocytówwe krwi 4. W kolejnych pracach wykazaliśmy, że monocyty pochodzące ze śledziony biorcy ułatwiają wynaczynienie neutrofili poprzez produkcję IL-1B44. Obrazowanie przyżyciowe w tych badaniach pozwoliło nam odkryć wcześniejsze regulatory wynaczynienia neutrofili jako możliwe cele terapeutyczne w celu zmniejszenia odpowiedzi zapalnej po przeszczepie45. Dodatkowo wykonaliśmy również obrazowanie przyżyciowe w bijącym sercu myszy po przeszczepieniu heterotopowym16. Uwidoczniliśmy rekrutację neutrofili do mięśnia sercowego i stwierdziliśmy, że ferroptotyczna śmierć komórek przeszczepu serca inicjuje stan zapalny po przeszczepie serca46. Zastosowaliśmy podobną technikę stabilizacji do przeszczepionych łuków aorty, aby uwidocznić transport monocytarny do blaszek miażdżycowych47. Badania te wykazały wykonalność i użyteczność obrazowania przyżyciowego niestatycznie przeszczepionych narządów klatki piersiowej.
Na koniec warto omówić metody wizualizacji różnych typów komórek i miąższu płuc. Do znakowania komórek stosuje się dwie główne metody - 1) transgeniczne szczepy myszy z mutacjami knock-in białek fluorescencyjnych i 2) znakowane fluorescencyjnie przeciwciała przeciwko komórkom barwionym. Powszechnie stosowane transgeniczne szczepy myszy do identyfikacji komórek odpornościowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej obejmują LysM-GFP dla neutrofili48, CX3Cr1-GFP dla różnych śródmiąższowych populacji makrofagów49,50, CCR2-GFP dla klasycznych monocytów51, CD19-tdTomato dla limfocytów B52 i Foxp3-GFP dla regulatorowych limfocytów T5. Warto zauważyć, że sam CX3Cr1 nie jest wystarczający do jednoznacznej identyfikacji komórek, ale może to być wspomagane przez morfologię i lokalizację komórek zgodną z morfologią i lokalizacją makrofagów śródmiąższowych. Makrofagi pęcherzykowe można obrazować bez znakowania ze względu na ich autofluorescencję53,54, charakterystyczną morfologię i zachowanie (tj. brak ruchliwości w rozdzielczości czasowej nagrań poklatkowych). W porównaniu z eozynofilami, które również są autofluorescencyjne, makrofagi pęcherzykowe są większe i znacznie jaśniejsze z wzbudzeniem 890 nm54. Alternatywnie, makrofagi pęcherzykowe można również znakować na podstawie ich funkcji fagocytarnej poprzez dopłucne podawanie agregatów barwnika54.
Wizualizacja komórek odpornościowych u biorców przeszczepów może być również osiągnięta przez wewnątrznaczyniowy transfer adoptywny komórek znakowanych fluorescencyjnie lub przez wstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał przeciwko specyficznym dla komórki markerom powierzchniowym18,55. Inną nieodłączną zaletą mikroskopii dwufotonowej jest SHG przez pewne dwójłomne struktury w tkance, takie jak kolagen56. Zjawisko to jest szczególnie przydatne w obrazowaniu płuc ze względu na wysoką zawartość kolagenu w workach pęcherzykowych, który działa jako wewnętrzny wskaźnik struktury pęcherzyków płucnych bez dodatkowych barwników fluorescencyjnych. Co więcej, pęcherzyki płucne są również otoczone naczyniami włosowatymi pęcherzyków płucnych oznaczonych kropkami q o długości 655 nm. Wreszcie, naczynia krwionośne można znakować za pomocą dożylnego wstrzyknięcia q-dots (zgodnie z opisem w niniejszym protokole) lub dextanu rodaminy B. Projektując eksperyment z mikroskopią dwufotonową w trybie przyżyciowym, zalecamy użycie nie więcej niż czterech różnych kanałów emisyjnych, aby zminimalizować ryzyko krwawienia i słabego rozróżnienia między kanałami.
Jednym z głównych ograniczeń opisanej przez nas techniki stabilizacji kleju jest niemożność usunięcia szkła nakrywkowego z płuca bez potencjalnego uszkodzenia tkanek i pozostałości kleju na powierzchni płuc. W związku z tym płuco można zobrazować tylko raz, a nie w wielu punktach czasowych w ciągu wielu dni. Aby rozwiązać ten problem, jedna grupa opisała półstałe okno obrazowania klatki piersiowej, które pozwala na seryjne obrazowanie płuc57. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że takie podejście nie pozwala na odpowiednią stabilizację płuc przez dłuższy czas obrazowania. Technika ta umożliwia obrazowanie płuc przez wiele godzin, co dostarcza kluczowych informacji na temat wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych po przeszczepie.
Inne ograniczenia obrazowania dwufotonowego obejmują wysokie koszty początkowe konfiguracji i wiedzy specjalistycznej wymaganej do konserwacji systemu. Pola skanowania są stosunkowo małe w porównaniu z obrazowaniem immunofluorescencyjnym. Uszkodzenia termiczne i fotologiczne mogą być znaczne bez starannej optymalizacji parametrów akwizycji. Funkcja rozproszenia punktu wzbudzenia dwóch fotonów jest szeroka, co nieco ogranicza rozdzielczość, zwłaszcza w wymiarze z. Ponadto obrazowanie dwufotonowe wymaga, aby komórki będące przedmiotem zainteresowania były znakowane fluorescencyjnie, a niektórych komórek nie można jednoznacznie oznaczyć pojedynczym markerem komórkowym. Liczba sygnałów, które mogą być obrazowane jednocześnie, jest często ograniczona do czterech lub mniej. Wreszcie, znieczulenie, operacja i obrazowanie mogą wywołać dodatkowe stany zapalne i zmiany fizjologiczne na szczycie przeszczepu płuc, które mogą zakłócić wyniki eksperymentalne i interpretacje, pomimo najlepszych wysiłków w celu utrzymania środowiska fizjologicznego. Przyszłe kierunki obejmują rozwój małoinwazyjnych metod obrazowania przyżyciowego (takich jak mniejsza torakotomia lub dostęp bronchoskopowy).
Podsumowując, przyżyteczna mikroskopia dwufotonowa jest nieocenionym narzędziem w badaniu wielu procesów chorobowych. W tym miejscu opisano wiarygodną technikę unieruchomienia płuc i obrazowania dwufotonowego, która pozwala na przyżyciową obserwację transportu komórkowego i dynamicznych interakcji między różnymi populacjami komórek po przeszczepieniu płuc u myszy. Technika ta poszerzyła naszą wiedzę na temat krajobrazu immunologicznego po przeszczepie i nadal będzie niezastąpionym narzędziem w badaniach nad przeszczepem płuc i innymi procesami chorobowymi płuc.

Przeszczep płuc jest ostatnią opcją dla wielu pacjentów cierpiących na schyłkową niewydolność płuc; jednak długoterminowe przeżycie po przeszczepie płuc jest słabe w porównaniu z innymi przeszczepami narządów litych. Przeżywalność po 5 latach wynosi tylko ~60%-70%1, w porównaniu do 80%-90% w hearts2 i 85%-90% w nerkach3. Wiele powikłań po przeszczepie płuc, takich jak pierwotna dysfunkcja przeszczepu, odrzucenie za pośrednictwem przeciwciał i przewlekła dysfunkcja alloprzeszczepu płuc, wynika z odpowiedzi immunologicznej gospodarza na przeszczep allogeniczny. Na przykład, nasza grupa wykazała, że neutrofile są szybko rekrutowane do alloprzeszczepu płuc po indukowanym przeszczepem uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym i tworzą dynamiczne skupiska otaczające monocyty krwi4. Przesłuch między komórkami dawcy i biorcy jest odpowiedzialny za szkodliwe odpowiedzi alloimmunologiczne5,6,7, a możliwość badania tych dynamicznych interakcji komórkowych w żywym modelu zwierzęcym jest nieoceniona.
Mikroskopia dwufotonowa pozwala na obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości na głębokości do kilkuset mikronów przy minimalnym fotowybielaniu tkanek8,9. Jest stosowany w różnych tkankach i miejscach anatomicznych, w tym w korze nowej10,11, skin12,13 i kidney14,15. Ostatnio został dostosowany do niestatycznych narządów, takich jak płuca i serce4,16,17. W tym protokole opisujemy technikę obrazowania stabilizowanych, wentylowanych i perfundowanych przeszczepów płuc po mysim ortotopowym przeszczepie lewego płuca. Kluczową zaletą modelu przeszczepu jest możliwość oddzielnej manipulacji genetycznej dawcą i biorcą. Poszczególne populacje komórek można wizualizować za pomocą transgenicznych szczepów myszy z ekspresją białek fluorescencyjnych knock-in, adoptywnym transferem komórek znakowanych fluorescencyjnie5 lub dożylnym wstrzyknięciem przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie w celu związania markerów specyficznych dla komórki4,16,17,18.
Aby ustabilizować płuco podczas obrazowania, protokół ten polega na przyklejeniu płuca do szkła nakrywkowego, podczas gdy inne grupy opisały stabilizację ssania za pomocą specjalnie zaprojektowanego odwracalnego urządzenia próżniowego19. Nasz protokół ma kilka zalet, w tym większy obszar obrazowania i względną łatwość konfiguracji przy użyciu powszechnie dostępnych materiałów w laboratorium mikroskopowym (w tym szkła nakrywkowego i kleju). Ponieważ ta technika klejenia ogranicza płuca na górnej powierzchni, oczekuje się, że zmniejszy ruchy wentylacyjne i umożliwi głębsze obrazowanie. Ta technika obrazowania przyżyciowego pozwala na szczegółową obserwację zachowania i interakcji komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym, co przyczynia się do badania mechanizmów immunologicznych, które regulują reakcje zapalne i tolerogenne po przeszczepie płuc.

<table><tbody><tr><td>0,75% powidon-jod</td><td>Aplicare</td><td>NDC 52380-0126-2</td><td>Do środka dezynfekującego</td></tr><tr><td>1-calowy cewnik dożylny 20G</td><td>Terumo</td><td>SROX2025CA</td><td>Do rurki dotchawiczej (ETT)</td></tr><tr><td>1-calowa taśma jedwabna</td><td>Durapore</td><td>3M ID 7100057168</td><td>Aby zabezpieczyć mysz w pozycji</td></tr><tr><td>20-krotne zanurzenie w wodzie długa soczewka obiektywu</td><td>Olympus</td><td>N20X-PFH</td><td></td></tr><tr><td>3M Klej</td> <td>VetbondMedi-Vet.com</td><td>10872</td><td>Do przyklejania szkła nakrywkowego do płuc</td></tr><tr><td>655 nm niedocelowych kropek kwantowych</td><td>ThermoFisher</td><td>Q21021MP</td><td>Do znakowania naczyń krwionośnych</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EX0281</td><td>Do środka dezynfekującego</td></tr><tr><td>Argent High Temp Fine Tip Długopis kauteryczny</td><td>McKesson</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>O-ring (2 cm)</td><td>Sklep z narzędziami</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>obrazowania na zamówienie komora</td></tr><tr><td>Śruba (2)</td><td>Sklep z narzędziami</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>komory obrazowania</td></tr> zbudowanej na zamówienie <tr><td>Mosiężna nakrętka kciukowa (2)</td><td>Sklep z narzędziami</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>komory obrazowania zbudowanej na zamówienie</td></tr><tr><td>Buprenorfina 1,3 mg / ml</td><td>Fidelis Zdrowie zwierząt</td><td>NDC 86084-100-30</td><td>Do kontroli bólu</td></tr><tr><td>Chameleon tytanowo-szafirowy femtosekundowy laser impulsowy</td><td>Coherent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (24 mm x 50 mm)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1202F63</td><td>Do niestandardowej komory obrazowania</td></tr><tr><td>Zakrzywiony zacisk na komary (1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>Dwukanałowy sterownik grzałki</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjne nożyczki (1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15040-11</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy stojący</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Gaza (przycięta do 1 cm x 3 cm)</td><td>McKesson</td><td>476709</td><td>Do umieszczenia pod lewym płucem</td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td><td>Dow Corning</td><td>N/A</td><td>Do przyklejenia szkła nakrywkowego do górnej płyty</td></tr><tr><td>Izofluran 1%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy 100 mg/ml</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Blacha (3 cm x 7 cm)</td><td>Sklep z narzędziami</td><td>N/A</td><td>Do zbudowanej na zamówienie komory obrazowania</td></tr><tr><td>Spiczaste aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Solon</td><td>56225</td><td>Do manipulowania płucami i do sekcji</td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia Power Pro Ultra</td><td>Oster</td><td>078400-020-001</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Maść do oczu weterynarza</td><td>Medi-Vet.com</td><td>11897</td><td>Aby zapobiec wysuszeniu oczu</td></tr><tr><td>Respirator dla małych zwierząt</td><td>Harvard Aparatura</td><td>55-0000</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze proste (1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Trzykanałowy sterownik migawki</td><td>Uniblitz</td><td>VMM-D3</td><td>Skaner rezonansowy</td></tr><tr><td>x.y.z Optyczny silnik krokowy</td><td>Prior Scientific</td><td>OptiScan II</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna 20 mg / ml</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Do kontroli bólu</td></tr></tbody></table>

przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Powikłania po przeszczepie płuc są w dużej mierze związane z reakcją układu odpornościowego gospodarza na przeszczep. Takie odpowiedzi immunologiczne są regulowane przez przesłuchy między komórkami dawcy i biorcy. Lepsze zrozumienie tych procesów opiera się na wykorzystaniu przedklinicznych modeli zwierzęcych i jest wspomagane przez możliwość badania transportu komórek odpornościowych wewnątrz przeszczepu w czasie rzeczywistym. Przyżyteczna mikroskopia dwufotonowa może być stosowana do obrazowania tkanek i narządów na głębokości do kilkuset mikronów przy minimalnym fotouszkodzeniu, co daje dużą przewagę nad jednofotonową mikroskopią konfokalną. Selektywne wykorzystanie myszy transgenicznych z ekspresją białka fluorescencyjnego specyficzną dla promotora i/lub adoptywnym transferem komórek znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym podczas przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej pozwala na dynamiczne badanie pojedynczych komórek w ich środowisku fizjologicznym. Nasza grupa opracowała technikę stabilizacji płuc myszy, która umożliwiła nam zobrazowanie dynamiki komórkowej w płucach naiwnych i ortotopowo przeszczepionych przeszczepach płuc. Technika ta pozwala na szczegółową ocenę zachowania komórek w obrębie układu naczyniowego i śródmiąższu, a także na badanie interakcji między różnymi populacjami komórek. Procedury tej można się łatwo nauczyć i dostosować do badania mechanizmów immunologicznych, które regulują reakcje zapalne i tolerogenne po przeszczepie płuc. Można go również rozszerzyć o badanie innych patogennych chorób płuc.

Po 1 h zimnego przechowywania niedokrwiennego w temperaturze 4 ˚C, ortotopowo przeszczepiliśmy lewe płuco od myszy B6 do myszy B6.LysM-GFP4, a następnie przeprowadziliśmy obrazowanie dwufotonowe in vivo, zgodnie z powyższym opisem. Obrazowanie wykonano w dwóch punktach czasowych po przeszczepieniu – 2 h (Rysunek 3A) oraz 24 h (Rysunek 3B). Naczynia krwionośne są znakowane na czerwono za pomocą kropek kwantowych (q-dots) wstrzykniętych bezpośrednio przed obrazowaniem. Dodatkowo, po 24 h możemy zwizualizować monocyty, które pochłonęły q-dots4. Zielono znakowane neutrofile pochodzące od biorcy można zaobserwować infiltrujące przeszczep płuca w odpowiadającym im filmie po 24 h od przeszczepienia (Supplementary Video 1). Pęcherzyki płucne są widoczne jako ciemne kratery ze względu na generowanie drugiej harmonicznej (SHG) z kolagenu (białe strzałki na Rysunku 3). Obserwujemy, że 24 h po przeszczepieniu w płucach znajduje się więcej neutrofili w porównaniu do 2 h po przeszczepieniu (Rysunek 3).
<img alt="Układ mikroskopii dwufotonowej: sekwencja przygotowania chirurgicznego myszy z urządzeniem obrazującym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie myszy do obrazowania dwufotonowego. (A) Ponowne otwarcie skóry nad lewą torakotomią. (B) Wycięcie skóry i tkanek miękkich nad lewą klatką piersiową. (C,D) Zaciśnięcie żeber kleszczykami na 10 s przed ich przecięciem. (E) Resekcja lewych żeber 3rd-5th w celu utworzenia okna o wymiarach ~0.8 cm w kierunku głowowo-ogonowym x 1,0 cm w kierunku przednio-tylnym. (F) Uniesienie lewego płuca z lewej klatki piersiowej i umieszczenie go na pasku gazy. (G) Komora obrazująca z oknem obrazującym umieszczona nad lewym płucem. (H) Komora obrazująca umieszczona na stoliku mikroskopu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Konfiguracja komory obrazowania z obiektywem 20x, myszą, płytką podstawową; schemat eksperymentu wzbudzenia optycznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Konfiguracja komory obrazowania. (A) Komora obrazowania umieszczona na stole mikroskopu. (B) Powiększony widok mechanizmu śruby z blaszką sprężystą do zabezpieczenia górnej płytki nad lewym płucem. (C) Przednia i tylna strona górnej płytki z nałożonym o-ringiem i szkiełkiem nakrywnym. Białe linie reprezentują obszar, w którym nakłada się smar próżniowy, aby przytwierdzić szkiełko nakrywne do górnej płytki. Szary okrąg reprezentuje pierścień kleju do nałożenia na szkiełko nakrywne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna tkanki wykazująca kropki kwantowe (q-dots) i komórki LysMGFP w odstępach 2 h i 24 h." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Dwufotonowe obrazowanie intravitalne przeszczepu lewego płuca myszy z linii B6 do myszy B6.LysM-GFP po 1 h zimnego przechowywania niedokrwiennego. Obrazowanie wykonano (A) 2 h i (B) 24 h po transplantacji. Kolor czerwony oznacza q-dots. Kolor zielony oznacza neutrofile biorcy B6.LysM-GFP. Kolor niebieski oznacza SHG z pęcherzyków bogatych w kolagen. Białe strzałki wskazują przestrzenie powietrzne pęcherzyków płucnych. Pasek skali reprezentuje 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Górna płyta z dwoma przymocowanymi rezystorami w celu zapewnienia dodatkowego ogrzewania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Wideo uzupełniające 1: Dwufotonowe obrazowanie time-lapse przeszczepionego lewego płuca myszy z linii B6 do myszy B6.LysM-GFP po 1 h zimnego przechowywania niedokrwiennego, wykonane 24 h po transplantacji. Kolor czerwony reprezentuje kropki kwantowe (q-dots). Kolor zielony reprezentuje neutrofile biorcy LysM-GFP. Kolor niebieski reprezentuje generację drugiej harmonicznej z pęcherzyków płucnych bogatych w kolagen. Pasek skali odpowiada 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

Celem naszych badań jest zrozumienie mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw uszkodzenia perfuzyjnego niedokrwiennego oraz reakcji zapalnych i tolerogennych po przeszczepie płuc. Chcemy zbadać dynamiczne interakcje między komórkami dawcy i biorcy. Obecnie wykorzystujemy kilka technik chirurgicznych i obrazowych w badaniach immunologii przeszczepu płuc u myszy.Należą do nich ortotopowy przeszczep i retransplantacja lewego płuca, zaciskanie wnęki lewej płucy, nieinwazyjna pozytonowa tomografia emisyjna oraz dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe. Nasze badania ujawniają unikalne odpowiedzi immunologiczne w przeszczepionych płucach. Korzystając z zaawansowanych technik obrazowania, odkryliśmy, że monocyty biorcy sprzyjają infiltracji neutrofili w alloprzeszczepach płuc za pośrednictwem IL-1 beta.Odkryliśmy również, że limfocyty T regulatorowe FOXP3 skupiają się w tych alloprzeszczepach i chronią przed odrzuceniem za pośrednictwem przeciwciał. Nasza technika jest łatwa do skonfigurowania dzięki materiałom łatwo dostępnym w laboratorium mikroskopowym, takim jak klej tkankowy i okulary nakrywkowe. Dodatkowo zapewnia większe pole widzenia w porównaniu z innymi technikami.Nasze laboratorium jest zainteresowane zrozumieniem mechanizmów, które indukują i utrzymują tolerancję alloprzeszczepu płuc. Obrazowanie przyżyciowe pozwoli nam zobrazować interakcje między komórkami odpornościowymi podczas odrzucenia i tolerancji. Na początek umieść znieczuloną mysz, która przeszła przeszczep płuc, w prawej bocznej pozycji odleżynowa.Przetrzyj skórę klatki piersiowej mieszanką 0,75% jodu i 70% etanolu. Ponownie otwórz lewą torakotomię przez trzecią przestrzeń międzyżebrową. Teraz usuń część skóry i tkanek miękkich z miejsca lewej torakotomii i otwórz torakotomię.Zaciśnij żebra na 10 sekund, aby zakrzepić mikrokrążenie. Następnie wytnij części od trzeciego do piątego żebra, aby utworzyć okno obrazowania. Użyj wstrzykiwacza do elektrokoagulacji, aby zatrzymać krwawienie z krawędzi żeber.Teraz umieść mały guzek złożonej gazy pod prawą klatką piersiową. Za pomocą bawełnianych wacików wyjmij przeszczep płuc z klatki piersiowej i umieść dolną część płuca na pasku gazy nasączonej solą fizjologiczną o szerokości jednego na trzy centymetry. Na początek umieść zaintubowaną mysz z otwartą torakotomią na płycie podstawy komory obrazowania z otwartą lewą klatką piersiową skierowaną do góry.Za pomocą jedwabnej taśmy zabezpiecz mysz na pysku, przednich łapach i ogonie. Nałóż klej na dolną stronę szkła nakrywkowego przymocowanego do górnej płyty. Następnie opuść górną płytę, aż szkło nakrywkowe zetknie się z płucem, pozwalając klejowi dotknąć powierzchni płuc.Przyłóż szklankę nakrywkową do płuca. Napompuj płuco przez jedną do dwóch sekund, aby obszar kleju przylegał do otaczającej tkanki. Umieść nakrętkę motylkową na każdej i zabezpiecz górną płytę.W przypadku obrazowania dwufotonowego umieść całą komorę obrazowania za pomocą myszy na stoliku mikroskopu. Użyj filtrów dichroicznych, aby oddzielić sygnały od reportera GFP, kropki Q i kolagen generują sygnał SHG. Następnie ustaw laser impulsowy femtosekundowy z szafirem tytanowym na długość fali wzbudzenia 890 nanometrów przy najniższej możliwej mocy.Nałóż jeden mililitr wody na szkło nakrywkowe na górnej płycie. Teraz opuść obiektyw zanurzenia w wodzie do wody i skup się na powierzchni płuc. Włącz grzałkę podstawy, utrzymując temperaturę w zakresie od 35 do 37 stopni Celsjusza.Kupuj stosy obrazów za pomocą wybranego oprogramowania do akwizycji. Po 24 godzinach od przeszczepu w płucach było więcej neutrofili w porównaniu z dwiema godzinami po przeszczepie.

intravital-two-photon-microscopy-of-the-transplanted-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania długoterminowego, wysokorozdzielczego, jednokomórkowego obrazowania nienaruszonego płuca w czasie rzeczywistym przy użyciu stabilizowanego próżniowo okna obrazowania.

Długotrwała mikroskopia przyżyciowa o wysokiej rozdzielczości w płucach z okienkiem obrazowania stabilizowanym podciśnieniowo

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

W tym badaniu prezentujemy protokół do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania intravital i analizy interakcji komórkowych w mysiej błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu wirusem grypy. Protokół ten będzie istotny dla naukowców badających dynamikę komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Tutaj prezentujemy protokół chirurgicznego wszczepienia na stałe stałego okna optycznego dla mysiej klatki piersiowej, który umożliwia wysokorozdzielcze, przyżyciowe obrazowanie płuc. Trwałość okienka sprawia, że dobrze nadaje się ono do badania dynamicznych procesów komórkowych w płucach, zwłaszcza tych, które powoli ewoluują, takich jak progresja przerzutowa rozsianych komórek nowotworowych.

Stałe okno do badania przerzutów raka do płuc

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Terapia komórkowa oferuje obiecujące leczenie dla pacjentów z przewlekłą chorobą płuc poprzez zastosowanie komórek progenitorowych do naprawy uszkodzonych tkanek i poprawy funkcji płuc. Ponieważ obrazowanie odgrywa kluczową rolę w śledzeniu integracji komórek, opisujemy tutaj śledzenie in vivo terapii komórkowej dla przewlekłej choroby płuc w modelu mysim z wykorzystaniem obrazowania cząstek magnetycznych.

Zobrazenie in vivo sterydowane obrazem śledzenia przeszczepowanych komórek macierzystych nabłonka odległych płuc w przypadku zwłóknienia płuc przy użyciu obrazowania z zastosowaniem cząstek magnetycznych

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj mikroskopię dwufotonową do przyżyciowego obrazowania przeszczepionego płuca myszy. Ta metoda pozwala badać dynamiczne interakcje komórkowe i mechanizmy immunologiczne w czasie rzeczywistym.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Przeglądaj więcej filmów