Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Celem naszych badań jest zrozumienie mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw uszkodzenia perfuzyjnego niedokrwiennego oraz reakcji zapalnych i tolerogennych po przeszczepie płuc. Chcemy zbadać dynamiczne interakcje między komórkami dawcy i biorcy. Obecnie wykorzystujemy kilka technik chirurgicznych i obrazowych w badaniach immunologii przeszczepu płuc u myszy.

Należą do nich ortotopowy przeszczep i retransplantacja lewego płuca, zaciskanie wnęki lewej płucy, nieinwazyjna pozytonowa tomografia emisyjna oraz dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe. Nasze badania ujawniają unikalne odpowiedzi immunologiczne w przeszczepionych płucach. Korzystając z zaawansowanych technik obrazowania, odkryliśmy, że monocyty biorcy sprzyjają infiltracji neutrofili w alloprzeszczepach płuc za pośrednictwem IL-1 beta.

Odkryliśmy również, że limfocyty T regulatorowe FOXP3 skupiają się w tych alloprzeszczepach i chronią przed odrzuceniem za pośrednictwem przeciwciał. Nasza technika jest łatwa do skonfigurowania dzięki materiałom łatwo dostępnym w laboratorium mikroskopowym, takim jak klej tkankowy i okulary nakrywkowe. Dodatkowo zapewnia większe pole widzenia w porównaniu z innymi technikami.

Nasze laboratorium jest zainteresowane zrozumieniem mechanizmów, które indukują i utrzymują tolerancję alloprzeszczepu płuc. Obrazowanie przyżyciowe pozwoli nam zobrazować interakcje między komórkami odpornościowymi podczas odrzucenia i tolerancji. Na początek umieść znieczuloną mysz, która przeszła przeszczep płuc, w prawej bocznej pozycji odleżynowa.

Przetrzyj skórę klatki piersiowej mieszanką 0,75% jodu i 70% etanolu. Ponownie otwórz lewą torakotomię przez trzecią przestrzeń międzyżebrową. Teraz usuń część skóry i tkanek miękkich z miejsca lewej torakotomii i otwórz torakotomię.

Zaciśnij żebra na 10 sekund, aby zakrzepić mikrokrążenie. Następnie wytnij części od trzeciego do piątego żebra, aby utworzyć okno obrazowania. Użyj wstrzykiwacza do elektrokoagulacji, aby zatrzymać krwawienie z krawędzi żeber.

Teraz umieść mały guzek złożonej gazy pod prawą klatką piersiową. Za pomocą bawełnianych wacików wyjmij przeszczep płuc z klatki piersiowej i umieść dolną część płuca na pasku gazy nasączonej solą fizjologiczną o szerokości jednego na trzy centymetry. Na początek umieść zaintubowaną mysz z otwartą torakotomią na płycie podstawy komory obrazowania z otwartą lewą klatką piersiową skierowaną do góry.

Za pomocą jedwabnej taśmy zabezpiecz mysz na pysku, przednich łapach i ogonie. Nałóż klej na dolną stronę szkła nakrywkowego przymocowanego do górnej płyty. Następnie opuść górną płytę, aż szkło nakrywkowe zetknie się z płucem, pozwalając klejowi dotknąć powierzchni płuc.

Przyłóż szklankę nakrywkową do płuca. Napompuj płuco przez jedną do dwóch sekund, aby obszar kleju przylegał do otaczającej tkanki. Umieść nakrętkę motylkową na każdej i zabezpiecz górną płytę.

W przypadku obrazowania dwufotonowego umieść całą komorę obrazowania za pomocą myszy na stoliku mikroskopu. Użyj filtrów dichroicznych, aby oddzielić sygnały od reportera GFP, kropki Q i kolagen generują sygnał SHG. Następnie ustaw laser impulsowy femtosekundowy z szafirem tytanowym na długość fali wzbudzenia 890 nanometrów przy najniższej możliwej mocy.

Nałóż jeden mililitr wody na szkło nakrywkowe na górnej płycie. Teraz opuść obiektyw zanurzenia w wodzie do wody i skup się na powierzchni płuc. Włącz grzałkę podstawy, utrzymując temperaturę w zakresie od 35 do 37 stopni Celsjusza.

Kupuj stosy obrazów za pomocą wybranego oprogramowania do akwizycji. Po 24 godzinach od przeszczepu w płucach było więcej neutrofili w porównaniu z dwiema godzinami po przeszczepie.