Ocena miar wyników łączności przepony przeponowej jednostki motorycznej szczura jako ilościowych biomarkerów zwyrodnienia i kompensacji neuronów ruchowych frenii
19 kwietnia 2024
W tym badaniu prezentujemy metodę in vivo do szacowania liczby i wielkości jednostek motorycznych w celu ilościowego określenia połączenia jednostki motorycznej membrany szczura. Opisano podejście krok po kroku do tych technik.
Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem normalnych i nieprzystosowawczych reakcji układu nerwowo-mięśniowego w kontekście zdrowia, starzenia się i choroby. W szczególności naszym celem jest zbadanie, w jaki sposób układ oddechowy reaguje na utratę neuronów ruchowych poprzez mechanizmy kompensacyjne, takie jak kiełkowanie uboczne. Obecnie różne techniki znakowania, takie jak znaczniki wsteczne, adenowirusy i immunohistochemia, są wykorzystywane do ilościowego określenia liczby innowacyjnych neuronów ruchowych w modelach zwyrodnieniowych gryzoni.
Techniki znakowania, choć cenne dla oceny neuronów ruchowych, mają ograniczenia w ocenie funkcjonalności jednostek motorycznych i nie nadają się do ocen podłużnych. Technika MuNI jest nieinwazyjnym podejściem w przedklinicznych badaniach na gryzoniach, które można stosować podłużnie do ilościowego określenia frenicznych jednostek motorycznych. Wdrożenie protokołu MuNI może znacząco wspomóc i przyspieszyć odkrycia w zakresie badań eksperymentalnych w kierunku testów klinicznych, szczególnie w zakresie nieinwazyjnej i podłużnej oceny upośledzenia nerwowo-mięśniowego nerwu przeponowego i mięśnia przeponowego.
Nasza eklektyczna grupa laboratoryjna koncentruje się na badaniu funkcji nerwowo-mięśniowych w zdrowiu i przedklinicznych modelach chorób neurodegeneracyjnych. Staramy się wykorzystać techniki translacyjne, aby lepiej zrozumieć, czy mechanizmy leżące u podstaw plastyczności można wykorzystać i dostosować do zachowania oddychania w celu poprawy jakości życia pacjentów z chorobami neurodegeneracyjnymi. Na początek ustaw znieczulonego i przygotowanego szczura do rejestracji złożonego potencjału czynnościowego mięśni.
Umieścić aktywną elektrodę igłową podskórnie nad linią śródobojczykową poniżej ostatniej granicy żeber. Następnie umieść referencyjną elektrodę igłową podskórnie pod kątem między wyrostkiem mieczykowatym a ostatnią chrząstką mostkowo-żebrową. Następnie użyj pary monopolarnych elektrod igłowych o rozmiarze 28 do stymulacji nerwu przeponowego na arkuszu szyjnym.
Umieść elektrodę podskórnie na bocznej szyi między przednimi i środkowymi mięśniami łuszczącymi się w odstępie około jednego centymetra. Upewnij się, że igły stymulujące są umieszczone na poziomie poniżej czwartego kręgu szyjnego. Następnie umieść jednorazową elektrodę powierzchniową na ogonie elektrody uziemiającej.
Aby rozpocząć, przygotuj i ustaw znieczulonego szczura do elektrofizjologii. Zastosuj jednofazowe katartyczne impulsy fali prostokątnej, aby stymulować nerw przeponowy do rejestrowania odpowiedzi CMAP. Stopniowo zwiększaj intensywność bodźca, aż amplituda odpowiedzi przestanie rosnąć.
Następnie zwiększ intensywność bodźca do około 120% poziomu wymaganego do maksymalnej odpowiedzi, aby zapewnić supramaksymalną stymulację i zarejestrować dodatkową odpowiedź. Zmierz i udokumentuj amplitudy międzyszczytowe CMAP w miliwoltach. Podawaj stymulację submaksymalną o czasie trwania 0,1 milisekundy z częstotliwością jednego herca.
Stopniowo zwiększaj intensywność w krokach co 0,03 miliampera, aby wywołać przyrostowe reakcje, aż do uzyskania minimalnej odpowiedzi "wszystko albo nic". Następnie uzyskaj początkową odpowiedź o intensywności bodźca w zakresie od 2 do 10 miliamperów. Po zapisaniu pierwszej odpowiedzi przyrostowej uzyskaj dodatkowe przyrosty z coraz większą intensywnością bodźca w krokach co 0,03 miliampera.
Upewnij się, że początkowy ujemny szczyt odpowiedzi przyrostowych pokrywa się czasowo z ujemnym szczytem maksymalnej odpowiedzi CMAP. Biorąc pod uwagę udział membrany w oddychaniu, należy sprawdzić stabilność i brak frakcjonowania w każdej odpowiedzi przyrostowej, aby potwierdzić spójność w trzech zduplikowanych odpowiedziach. Obserwuj przyrostowe reakcje w czasie rzeczywistym i nakładaj je na poprzednie nagrania, aby uzyskać wizualne rozróżnienie.
Następnie upewnij się, że amplituda przyrostu wynosi co najmniej 25 mikrowoltów. Po zarejestrowaniu 10 odpowiedzi przyrostowych należy sprawdzić, czy amplituda każdego przyrostu nie przekracza jednej trzeciej całkowitej amplitudy odpowiedzi końcowej. Aby oszacować średnią amplitudę SMUP, uśrednij wartości 10 przyrostów.
Następnie podziel maksymalną amplitudę CMAP przez średnią amplitudę SMUP, aby określić MUNE. Siedem dni po doopłucnowym wstrzyknięciu CTB-SAP MUNE zmniejszył się do 60 funkcjonalnych jednostek motorycznych u dorosłych szczurów w porównaniu z 74 u szczurów kontrolnych. Amplituda CMAP pozostała względnie stabilna, co sugeruje, że możliwym mechanizmem kompensacyjnym jest kiełkowanie uboczne.
Membranę CMAP, SMUP i MUNE mierzono przez 28 dni po wstrzyknięciu. CMAP nie wykazał żadnej znaczącej zmiany. Średni wzrost SMUP dla szczurów CTB-SAP wynosił około 50 do 60%Zmiany były znaczące w czasie i przypisywane CTB-SAP.
MUNE było zmniejszone o około 40% u szczurów CTB-SAP, co wskazuje na znaczące efekty czasu i leczenia CTB-SAP.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę in vivo szacowania liczby i wielkości jednostek motorycznych w celu ilościowego określenia łączności jednostek motorycznych przepony szczura. Wykorzystując technikę MuNI, badanie analizuje mechanizmy kompensacyjne układu motorycznego oddechowego w odpowiedzi na utratę neuronów ruchowych, co ma znaczenie dla zrozumienia zaburzeń nerwowo-mięśniowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Fizjologia nerwowo-mięśniowa
Wstęp
- Badanie koncentruje się na prawidłowych i nieadaptacyjnych odpowiedziach układu nerwowo-mięśniowego.
- Analizuje ono, w jaki sposób oddechowy układ ruchowy kompensuje utratę neuronów ruchowych.
- Poprzednie techniki znakowania posiadały ograniczenia w ocenie funkcjonalności jednostek ruchowych.
Cel badania
- Opracowanie nieinwazyjnego podejścia do ilościowej oceny jednostek motorycznych nerwu przeponowego.
- Umożliwienie prowadzenia badań podłużnych nad upośledzeniem nerwowo-mięśniowym.
- Ułatwienie prowadzenia badań eksperymentalnych w kierunku testów klinicznych.
Zastosowane metody
- W badaniu zastosowano model in vivo z wykorzystaniem znieczulonych szczurów do rejestracji elektrofizjologicznych.
- Specyficzne procedury obejmują pomiar złożonych potencjałów czynnościowych mięśni (CMAP) oraz szacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE).
- Kluczowe etapy obejmują rozmieszczenie elektrod, stymulację nerwu oraz rejestrację odpowiedzi.
Główne wyniki
- Wyniki wskazują na zmniejszenie wartości MUNE u szczurów traktowanych CTB-SAP, co sugeruje istotny wpływ utraty neuronów ruchowych.
- Amplituda CMAP pozostała stabilna, podczas gdy średnia wartość SMUP znacząco wzrosła w czasie.
- Kiełkowanie kolaterale zostało zidentyfikowane jako potencjalny mechanizm kompensacyjny.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje wykonalność techniki MuNI w ocenie łączności jednostek motorycznych przepony.
- Pozwala ono na poszerzenie wiedzy na temat mechanizmów kompensacyjnych w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych.
- Wyniki podkreślają potencjał badania funkcji mięśni oddechowych w modelach neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena łączności jednostek motorycznych przepony z wykorzystaniem CMAP, SMUP i MUNE dostarcza biomarkerów translacyjnych dla degeneracji nerwowo-mięśniowej i mechanizmów kompensacyjnych. Podejście to umożliwia podłużne, nieinwazyjne monitorowanie integralności neuronów ruchowych nerwu przeponowego, co zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznych modelach chorób neurodegeneracyjnych. Integracja tych pomiarów elektrofizjologicznych wzmacnia wczesne odkrycia i decyzje dotyczące portfela projektów skorygowane o ryzyko w przypadku terapii ukierunkowanych na układ oddechowy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia obiektywną ocenę integralności szlaków nerwowo-mięśniowych w układach istotnych dla przebiegu chorób.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez kwantyfikację odpowiedzi kompensacyjnych, takich jak kiełkowanie kolaterale.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych w strategiach ochrony oddechowych neuronów ruchowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowane, powtarzalne odczyty elektrofizjologiczne do opracowywania testów w modelach gryzoni.
- Dostarcza ilościowe wyniki (CMAP, SMUP, MUNE) odpowiednie do przesiewowego badania potencjalnych interwencji.
- Umożliwia podłużne śledzenie zmian w jednostkach ruchowych, co wspiera rzetelną ocenę związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje przedkliniczne biomarkery z punktami końcowymi translacyjnymi istotnymi dla zaburzeń oddechowych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
- Uzasadnia decyzje o kontynuacji badań z uwzględnieniem ryzyka poprzez kwantyfikację zarówno degeneracji, jak i kompensacji.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesną fazę odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz ilościowe opracowywanie biomarkerów integralności oddechowych neuronów ruchowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez funkcjonalnych i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w układach nerwowo-mięśniowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki elektrofizjologiczne w celu przygotowania testów.
- Analityka: Dostarcza obiektywnych pomiarów (CMAP, SMUP, MUNE) do porównań między różnymi stanami.
- Badania translacyjne: Pozwala na dopasowanie przedklinicznych biomarkerów do klinicznych punktów końcowych w zakresie układu oddechowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do podłużnej oceny nerwowo-mięśniowej w różnych modelach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje nieinwazyjne, podłużne oceny nerwowo-mięśniowe.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania mechanizmów kompensacyjnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów terapeutycznych ukierunkowanych na układ oddechowy z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii gryzoni oraz układów nerwowo-mięśniowych.
- Wymagana jest specjalistyczna aparatura do precyzyjnej stymulacji nerwów i rejestracji sygnałów.
- Niezbędna jest standaryzacja rozmieszczenia elektrod i protokołów stymulacji pomiędzy zespołami.
- Konieczna może być adaptacja metody dla różnych modelowych układów nerwowo-mięśniowych.
- Ocena funkcjonalna ogranicza się do łączności jednostek motorycznych i może wymagać zastosowania metod komplementarnych w celu przeprowadzenia kompleksowej ewaluacji.
