Nieniszcząca kwantyfikacja aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych orzechach ziemnych (Arachis spp.) Nasiona

Zakres badań polegał na opracowaniu metody oznaczania ilościowego aflatoksyn i fitoaleksyny obronnej w tysiącach nasion orzeszków ziemnych w celu eksploracji dzikiej plazmy rozrodczej Arachis w celu identyfikacji gatunków odpornych na Aspergillus oraz określenia i scharakteryzowania nowych źródeł odporności genetycznej na ten patogen grzybowy. Nasza grupa badawcza odkryła, że najbardziej obiecującym podejściem do identyfikacji plazmy zarodkowej orzeszków ziemnych, która nie gromadzi aflatoksyny, jest przeprowadzenie holistycznej analizy każdego pojedynczego nasiona, w tym jego transkryptomiki, genomiki, fitoaleksyny i profili mikotoksyn. Opracowaliśmy protokoły analizy nasion dzikich i uprawnych orzeszków ziemnych, co oznacza wykorzystanie jednej czwartej pojedynczego nasiona do profilowania chemicznego.

Opracowanie wysokowydajnych metod skutecznego wysiewu nasion, ekstrakcji i dokładnej kwantyfikacji fitoaleksyny w próbkach nasion orzeszków ziemnych. Odkryliśmy wiele fitoaleksyny z orzeszków ziemnych i opracowaliśmy skuteczne i niedrogie metody analizy aflatoksyn, a także badań przesiewowych plazmy zarodkowej orzeszków ziemnych ze zmniejszoną akumulacją aflatoksyny lub bez niej. Metody obejmują genotypowanie i określenie żywotności nasion.

Po wyhodowaniu aflatoksynicznego Aspergillus flavus NRRL 3357 na agarze z dekstrozą ziemniaczaną przez sześć dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wymyj zarodniki grzybów z probówki za pomocą 10 mililitrów wody zawierającej Tween 20. Obracaj probówkę przez 20 sekund. Przefiltrować zawiesinę zarodników grzybów przez watę szklaną umieszczoną w lejku i użyć wirowego filtratu do rozcieńczenia.

Rozcieńczyć 100 mikrolitrów podwielokrotności przefiltrowanej zawiesiny w 9,9 mililitra wody. Po wirowaniu policz zarodniki za pomocą hemocytometru. Korzystając ze wzoru wyświetlanego na ekranie, oblicz objętość wody potrzebną do rozcieńczenia jednej objętości oryginalnej zawiesiny od skosu do 1 000 zarodników na mikrolitr.

Dodać jedną objętość oryginalnej zawiesiny do obliczonej ilości wody. Następnie delikatnie rozbij strąki orzeszków ziemnych i usuń łuski. Umieść nasiona w sterylnej zlewce.

Dodaj 0,05% roztwór nadtlenku wodoru, aż zlewka będzie pełna w 70%, pozwalając nasionom wchłonąć wodę przez trzy godziny. Zdekantować roztwór nadtlenku wodoru z nasion i dodać około trzy razy więcej niż 80% mieszaniny wody etanolowej, aby przykryć nasiona. Inkubować przez jedną minutę, a następnie dwukrotnie opłukać nasiona równą objętością sterylnej wody destylowanej.

Dodać pięciokrotną objętość 3% roztworu nadtlenku wodoru do zlewki i odstawić na pięć minut. Po zdekantowaniu roztworu nadtlenku wodoru opłucz nasiona dwukrotnie równą objętością sterylnej wody. Umieść bibułę filtracyjną o średnicy 90 milimetrów w pokrywce i zwilż bibułę jednym mililitrem sterylnej wody.

Umieść pokrywkę na naczyniu. Umieść nasiona na sterylnym ręczniku papierowym. Za pomocą kleszczy usuń skórkę nasion.

Umieść nasiona deskiny natychmiast na szalce Petriego, aby uniknąć odwodnienia. Odetnij około jednej trzeciej nasion zawierających oś zarodkową. Podziel nasiona na liścienie i za pomocą ostrego wiertła wiertło wbij około 1,5 do 2 milimetrów w głąb środka zewnętrznej strony każdego liścienia.

Umieść od czterech do sześciu wywierconych kawałków nasion na 1,5% naczyniu z agarem. Za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów dodaj dwa mikrolitry zawiesiny zarodników do wywierconej wnęki każdej połówki liścienia. Po przykryciu naczynia pokrywką inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza bez światła przez 72 godziny.

Po inkubacji nasion orzeszków ziemnych po zaszczepieniu zarodników Aspergillus flavus, użyj kleszczy, aby usunąć kawałki nasion z agaru. Umieść kawałki nasion w oznaczonych siedmiomililitrowych fiolkach z kulkami zawierającymi 13 ceramicznych kulek cyrkonowych. W celu ekstrakcji fitoaleksyny i aflatoksyn, w zależności od wielkości nasion, dodaj dwa lub cztery mililitry mieszaniny metanolu wodnego do fiolki z kulkami i sproszkowaj z prędkością 5,5 metra na sekundę przez 45 sekund.

Następnie odwirować przy 1,860 G przez trzy minuty i zebrać supernatant do świeżej fiolki. Do analizy aflatoksyn, za pomocą szklanego pręta przyciętego pod kątem 90 stopni, włóż porowatą frytę polietylenową do 1,5-mililitrowej kolumny polipropylenowej. Za pomocą specjalnie przygotowanej miarki dodaj 50 miligramów żelu magnezowo-krzemionkowego do kolumny.

Przykryj kolumnę identyczną frytą i dociśnij ją szklanym prętem. Dodaj 0,5 mililitra supernatantu do specjalnie zapakowanej mini kolumny i pozwól ekstraktowi spłynąć grawitacyjnie do czteromililitrowej szklanej fiolki. Dodaj jeden mililitr mieszaniny metanolu i wody do kolumny, aby wypłukać zanieczyszczenia grawitacyjnie do tej samej fiolki.

Po wyrzuceniu połączonych eluatów z fiolki, dodać 1,2 mililitra acetonu, wody acetonitrylowej, 88% mieszaniny kwasu mrówkowego do kolumny, aby wymyć frakcję aflatoksyny do czystej szklanej fiolki. Odparować rozpuszczalnik z fiolki w strumieniu azotu w bloku grzewczym o temperaturze 45 stopni Celsjusza. Po odparowaniu zakryć fiolkę i schłodzić ją w kruszonym lodzie przez jedną minutę.

Umieść wykonane na zamówienie filtry pipet Pasteura w jednorazowych probówkach i umieść je na lodzie, aby zminimalizować parowanie po filtracji. Suchą pozostałość rozpuścić w precyzyjnie odmierzonej mieszaninie metanolu i wody o objętości od 0,25 do 1,0 mililitra. Po wirowaniu przenieś podwielokrotność 0,2 mililitra do filtra.

Użyj azotu gazowego, aby przyspieszyć filtrację do 400-litrowej fiolki z automatycznym samplerem. Umieścić fiolkę w automatycznym próbniku UPLC i ustawić objętość wstrzyknięcia na 0,1 do 3,0 mikrolitrów. W przypadku fitoaleksyny przenieść 200 mikrolitrów supernatantu z siedmiomililitrowej fiolki wirówki do filtra pipetowego Pasteura.

Po przefiltrowaniu umieścić na fiolce pasujące wieczko z przegrodą politetrafluoroetylenową. W przypadku separacji aflatoksyn należy zastosować gradient przy użyciu wody, metanolu i acetonitrylu o określonym składzie procentowym i czasie pracy. Ustaw natężenie przepływu na 0,45 mililitra na minutę, a czas pracy na 9,5 minuty.

W systemowej grzałce kolumnowej ustaw temperaturę kolumny na 40 stopni Celsjusza. Aby określić ilościowo aflatoksyny, ustaw długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio na 362 i 440 nanometrów. Następnie, korzystając z metody krzywej kalibracyjnej i instrukcji oprogramowania UPCL, wykonaj analizę w celu określenia stężeń aflatoksyn w badanych próbkach.

Do oddzielenia nieruchomych stilbenoidów należy użyć gradientu składającego się z wody, metanolu i 88% kwasu mrówkowego o określonych warunkach procentowych i czasie. Ustaw natężenie przepływu na 0,5 mililitra na minutę, a czas pracy na 12 minut. Stosując metodę krzywej kalibracyjnej, należy oznaczyć stężenia stilbenoidów i porównać powierzchnie pików badanej próbki z czystymi autentycznymi wzorcami.

Metoda oznaczania ilościowego aflatoksyny oparta na UPLC pozwala na uzyskanie czułej oceny ilościowej aflatoksyny B1 z limitem dwóch pikogramów na wstrzyknięcie. Oczyszczony ekstrakt z nasion zebranych z dzikiego gatunku Arachis wykazał jednoznaczne oznaczenie ilościowe aflatoksyn. Podejście oparte na kolumnie z żelem magnezowo-krzemionkowym skutecznie usuwa zanieczyszczenia z frakcji aflatoksyny i wykazuje wysoką skuteczność oznaczania ilościowego w przeciwieństwie do poprzednich metod.

Ponadto metoda ta pomaga również w ilościowym oznaczaniu fitoaleksyny z orzeszków ziemnych.