Name: Nieniszcząca kwantyfikacja aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych orzechach ziemnych (Arachis spp.) Nasiona (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych nasionach orzecha ziemnego Arachis spp. przy użyciu chromatografii cieczowej UPLC. Technika ta umożliwia identyfikację dzikich gatunków odpornych na Aspergillus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca otrzymała wsparcie finansowe od projektu USDA-ARS CRIS 6044-42000-011-00D oraz projektu CRIS 6044-21000-005-000-D. Dziękujemy Danowi Toddowi za wykonanie stojaka na minikolumny. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach handlowych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa USA.

1. Przygotowanie nasion do infekcji grzybowej
<ol>
	<li>Inkubować aflatoksigenny szczep Aspergillus flavus NRRL 3357 na skosie agaru ziemniaczano-dekstrozowego (PDA) w probówce przez 6 dni w temperaturze 30 °C. Zebrać&#160;zarzniki grzyba z probówki za pomocą 10 mL wody z Tween 20 (10 μL Tween w 1 L sterylnej wody destylowanej), przefiltrować przez watę szklaną umieszczoną w lejku i policzyć zarzniki za pomocą hemocytometru zgodnie z instrukcją obsługi.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę zarzników sterylną wodą do stężenia 1 0 zarzników/μL. Potwierdzić stężenie za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: Zawiesinę zarzników należy przygotować nie wcześniej niż 2 h przed eksperymentami infekcyjnymi.</li>
	<li>Delikatnie rozłupać strączki orzeszków ziemnych i usunąć łupiny. Umieścić nasiona w sterylnym zlewce tak, aby objętość nasion nie przekraczała 1/5 objętości zlewki, dodać 0,05% roztwór nadtlenku wodoru do około 70% objętości zlewki i pozostawić nasiona do namoczenia na 3 h.</li>
	<li>Odlać roztwór nadtlenku wodoru znasion i dodać do zlewki około 3-krotności objętości mieszaniny 80% etanolu z wodą (v/v), aby przykryć nasiona. Pozostawić na 1 min, a następnie dwukrotnie przepłukać nasiona równymi objętościami sterylnej wody destylowanej.</li>
	<li>Dodać&#160;5-krotność objętości 3% nadtlenku wodoru do zlewki z nasionami wysterylizowanymi etanolem i pozostawić na 5 min, następnie odlać ciecz i dwukrotnie przepłukać nasiona równymi objętościami sterylnej wody (Rysunek 2A).</li>
</ol>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig2.jpg" /> 
Rycina 2Przygotowanie nasion arakiidowych do inokulacji, inkubacji oraz ekstrakcji frakcji aflatoksyn i fitoaleksyn. (A) Sterylizacja namoczonych nasion 3% nadtlenkiem wodoru; (B) usuwanie łuski (skóry) z nasion; (C) odcięcie części osi embrionalnej; (D,E) wiercenie otworu w połowie kotyledonu za pomocą wiertła; (F) umieszczanie nawierconych części nasion na agarze; (G) aplikacji zarodników grzybów&#160;do wywierconego otworu. (H) szalka Petri z nasionami po inkubacji; (I) umieszczenie inkubowanych pojedynczych nasion (zdjęcie próbek kontrolnych) w wzmocnionych probówkach z koralikami; (J) dodanie odmierzonej objętości rozpuszczalnika ekstrakcyjnego; (K) rozdrabnianie próbek w homogenizatorze kulkowym; (L) wirowanie sproszkowanej zawiesiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="6">
	<li>Umieść nasiona na sterylnym ręczniku papierowym, usuń okrywę nasienną za pomocą pęsety i odetnij skalpelem około 1/3 nasiona zawierającą oś embrionalną (Rycina 2B,C).</li>
	<li>Utylizuj tę część nasiona lub wykorzystaj ją do wyhodowania rośliny w probówce z pożywką wzrostową (Rycina 1B,E).</li>
	<li>Podziel pozostałą część nasiona na dwa liście zasobne, umieść je w szalce Petriego, przykryj części nasiona wilgotnym sterylnym papierem filtracyjnym,&#160;załóż pokrywkę, aby zapobiec odwodnieniu i niezwłocznie przejdź do etapu inokulacji.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do właściwych eksperymentów przygotuj odpowiednią liczbę szalek Petriego z pożywką do inkubacji nasion, wlewając 26 mL 1,5% sterylnego agaru w wodzie do szalek o wymiarach 10 x 15 mm i pozostawiając je do zastygnięcia na noc.&#160;</li>
	<li>W środkowej części zewnętrznej strony każdego z pozostałych liści zasobnych wykonaj wgłębienie o głębokości 1,5-2 mm, wiercąc ręcznie w nasionu sterylnym ostrym wiertłem o średnicy 1,6-2,34 mm. Wykonanie wgłębienia zajmuje ok. 2-5 s (Rycina 2D,E).</li>
	<li>Umieść od 4&#160;do 6&#160;„nawierconych” fragmentów nasion w szalce Petriego z agarem i nanieś 2 μL zawiesiny o stężeniu 1 00 spor/μL do każdego nawierconego wgłębienia w połowie liścia zasobnego za pomocą pipety 10 μL. W przypadku nasion kontrolnych zamiast zawiesiny zarodników nanieś wodę sterylną (Rycina 2F,G).</li>
	<li>Przykryj wszystkie szalki Petriego pokrywkami i inkubuj w temperaturze 30 °C bez dostępu światła przez 72 h.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek i przygotowanie inkubowanych fragmentów nasion do analizy aflatoksyn i fitoaleksyn
<ol>
	<li>Po 72 h zebrać fragmenty nasion, usuwając je z agaru za pomocą pincety i umieszczając każdy z nich w opisanych probówkach z zakrętką o pojemności 7 ml, zawierających 13 cyrkonowych kulek ceramicznych (12 o średnicy 2,8 mm i 1 o średnicy 6,5 mm) (Rysunek 2H,Ja). 
	UWAGA: Na tym etapie, jeśli próbówki nie zostaną przetworzone natychmiast, można umieścić je w -80 &#176;C zamrażarce i przechowywano do 2 miesięcy przed dalszym przetwarzaniem.</li>
	<li>Fitooksyny i aflatoksyny są oznaczane w tym samym ekstrakcie z nasion. Do ekstrakcji, w zależności od wizualnej wielkości nasion (małe, średnie lub duże), należy dodać do fiolek z kulkami 2 lub 4 ml precyzyjnie odmierzonej mieszaniny metanolu z wodą (90:10, v/v) i homogenizować przy prędkości 5,5 m/s przez 45 s. Fiolki z rozdrobnionymi nasionami należy umieścić w wirówce i wirować przy 1860 &#215; g przez 3 min (Rycina 2J - L). 
	UWAGA: Poniższe istotne17,22 wyznaczono pochodne stilbenoidów (wszystkie w Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.-konfiguracja): resweratrol, arachydyna-1, arachydyna-2, arachydyna-3, 3&#8242;-izopentadienylo-3,5,4&#8242;-trihydroksystilben (IPD) oraz SB-1.</li>
	<li>W celu przeprowadzenia analiz aflatoksyn, przed rozpoczęciem wymagających eksperymentów, należy przygotować odpowiednią liczbę kolumn do oczyszczania w następujący sposób. Umieść pasującą porowatą rurkę polietylenową (20 &#956;L) frity do polipropylenowej kolumny o pojemności 1,5 ml za pomocą szklanej rurki odciętej pod kątem 90o kątem. Za pomocą specjalnie wykonanego czerpaka należy umieścić 50 mg żelu krzemionkowego z dodatkiem magnezu (przesiew 100-200 mesh) w kolumnie, a następnie zamknąć kolumnę identycznym fritem, dociskając go szklaną rurką (Rysunek 3A - E). 
	UWAGA: Taka ilość żelu krzemionkowego z magnezem zajmuje 75 &#956;L objętość, a wysokość warstwy adsorbenta wynosi 3 mm.</li>
</ol>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig3.jpg" /> 
Rycina 3Przygotowanie kolumn oczyszczających i filtrów. (A, B) Umieszczenie porowatego fritu w cylindrze; (C,D) napełnianie kolumny żelem krzemionkowym z magnezem; (E) pakowanie adsorbentu i wkładanie porowatego fritu górnego do kolumny. (F) Umieszczenie krążka z włókna szklanego o średnicy 1,5 mm na wierzchołku pipety Pasteura. (G,H) Przetłoczenie środka krążka za pomocą plastikowego lub drewnianego pręcika na dno cylindra pipety Pasteura i mocne zagęszczenie włókna szklanego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<ol start="4">
	<li>Na tym etapie przygotować odpowiednią liczbę filtrów wykonanych na zamówienie, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 3F - H.</li>
	<li>W przypadku analiz aflatoksyn, precyzyjnie odmierzyć do 0,5 mL aliquoty nadnadbudowy (uzyskanej zgodnie z opisem w kroku 2.2), przenieść ją do specjalnie przygotowanej minikolumny i pozwolić ekstraktowi spłynąć grawitacyjnie do szklanej fiolki o pojemności 4 mL. Przenieść 1,0 mL mieszaniny metanol-woda (90:10, v/v) na kolumnę, aby grawitacyjnie wypłukać zanieczyszczenia do tej samej fiolki 4 mL (Rysunek 4A).</li>
</ol>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig4.jpg" /> 
Rycina 4:&#160;Oczyszczanie ekstraktów z nasion i przygotowanie do analiz UPLC. (A)&#160;Sztalawa z kolumnami wypełnionymi. (B) Odparowanie rozpuszczalnika za pomocą N22 gaz z sześciu probówek o pojemności 4 ml z oczyszczonym ekstraktem wymytym z kolumn oczyszczających. (C) Chłodzenie fiolek i filtrów do temperatury poniżej zera w pojemnikach piankowych (1 i 2) z lodem przed i po dodaniu rozpuszczalnika do wstrzykiwania (MeOH-H2O)2(O 9:1, v/v) do fiolek o pojemności 4 ml. (D) Filtrowanie schłodzonego ekstraktu z fiolki o pojemności 4 ml do 400 &#181;L fiolka do autosamplera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="6">
	<li>Odrzuć połączone eluaty. Eluuj frakcję aflatoksyn grawitacyjnie z kolumny do czystej szklanej fiolki o pojemności 4 mL przy użyciu 1,2 mL mieszaniny aceton-acetonitryl-woda-88% kwas mrówkowy (65:31:3,5:0,5, v/v) (Rysunek 4A).</li>
	<li>Alternatywnie, eluuj aflatoksyny z kolumny 2,0 mL mieszaniny acetonitryl-woda-8% kwas mrówkowy (96:3,5:0,5, v/v) i wstrzyknij alykwot eluatu, do 2 μL, bezpośrednio do systemu ultrawydajnej chromatografii cieczowej (UPLC) (bez odparowywania rozpuszczalnika strumieniem N2). 
	UWAGA: W tym przypadku należy spodziewać się do 10-krotnie niższego granicy oznaczania aflatoksyn; w większości przypadków taki spadek czułości jest dopuszczalny, ponieważ stężenia aflatoksyn w nasionach zaszczepionych są często wysokie.</li>
	<li>Usuń rozpuszczalnik z fiolek strumieniem N2 w bloku grzewczym w temperaturze 45 °C. Zamknij fiolkę i umieść ją w pojemniku z kruszonym lodem na 30-45 s, aby zminimalizować odparowanie rozpuszczalnika dodawanego w następnym kroku. Umieść filtry wykonane na zamówienie w jednorazowych probówkach i włóż probówki do lodu w innym pojemniku, aby zminimalizować odparowanie rozpuszczalnika podczas filtracji (Rysunek 4B,C).</li>
	<li>Po odparowaniu rozpuszczalnika rozpuść suchą pozostałość w dokładnie odmierzonej ilości 0,25-1,0 mL mieszaniny metanol-woda (90:10, v/v) i mieszaj wstrząsarzu wortex przez 1-2 s. Umieść fiolki z oczyszczonymi ekstraktami w autopróbniku UPLC i wstrzyknij od 0,1 do 3,0 μL do systemu UPLC (Rysunek 5A,B). 
	UWAGA: Jeśli istnieje podejrzenie, że roztwór po wstrząsaniu wortexie zawiera zawieszone cząstki, przefiltruj roztwór przez schłodzony filtr (Rysunek 4D).</li>
</ol>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig5.jpg" /> 
Rycina 5Proces i wyniki analiz UPLC oczyszczonych ekstraktów. (A) Umieszczenie statywu z oczyszczonymi ekstraktami próbek w autoprobniku UPLC. (B) Przeprowadzanie analiz instrumentalnych, pozyskiwanie danych i interpretacja wyników. (C) UPLC czterech głównych aflatoksyn; główne analizowane piki, aflatoksyny B1 oraz B2 stanowią odpowiednio 0,04 i 0,04 ng. (D) UPLC aflatoksyn B1 oraz B2; pik 2 reprezentuje aflatoksynę B1 na poziomie 2 pg (z an 8 &#181;L ogniwo przepływowe). (E) UPLC&#160;oczyszczonego ekstraktu z nasiona zebranego z lokalnego pola arachidowego z dzikim Arachis gatunki. (F) UPLC ekstraktu z ziarna arakidoi po ekspozycji na alergen, oczyszczonego za pomocą minikolumny z zasadowym tlenkiem glinu. (G) UPLC ekstraktu z poddanych działaniu patogenów nasion arachidowych, oczyszczonego na kolumnie z Florisil; niebieski chromatogram przedstawia zanieczyszczenia wymywane z kolumny 1 ml mieszaniny metanol-woda (90:10 v/v); czarny chromatogram pokazuje piki aflatoksyn M1 oraz B1Poziom aflatoksyny B1 wynosi 48 ng/g. (H) A&#160;typowy chromatogram stilbenoidów z ziarna arakiisowego poddanego stresowi; skrót: IPD = 3&#8242;-izopentadienyl-3,5,4&#8242;-trihydroksystilben. Uwaga: Wszystkie stilbenoidy w ekstraktach z nasion znajdują się w Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.-konfiguracja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>&#160;
<ol start="10">
	<li>Do analiz fitoaleksyn z każdej probówki z koralikiem przenieś 20 μL nadsączu do powyższego filtra pipety Pasteura. Użyj gazu N2 z butli z azotem sprężonym, aby przyspieszyć filtrację do 40 μL fiolki autosamplera UPLC, a następnie zamknij fiolkę dopasowaną zakrętką z septem PTFE (Rysunek 4D).</li>
</ol>
3. Analizy aflatoksyn
<ol>
	<li>Do rozdziałów aflatoksyn w ekstraktach z nasion należy użyć systemu UPLC wyposażonego w autosampler, pompę czwórnicową, detektor fluorescencyjny oraz kolumnę UPLC BEH C18 3,0 mm x 10 mm, 1.7 &#181;m kolumna z dopasowaną prekolumną oraz postkolumnowy reaktor fotochemiczny (PHRED) ze standardową dzianą cewką z PTFE o średnicy wewnętrznej 0,25, przyciętą do 25% jej pierwotnej długości. 
	UWAGA: Instrument UPLC oraz powiązany sprzęt użyty przez autorów są wymienione w Tabela materiałów.</li>
	<li>Należy zastosować wodę (A), metanol (B) i acetonitryl (C) zgodnie z następującym gradientem: warunki początkowe: 62,7% A, 24% B, 13,3% C; zmiana liniowa do 30% A, 45% B, 25% C w czasie 3,75 min; zmiana do 0% A, 64,4% B, 35,6% C w czasie 3,751 min; utrzymanie warunków izokratycznych przez 3,249 min, następnie powrót do warunków początkowych w czasie 0,01 min i utrzymanie warunków izokratycznych przez 2,499 min przed kolejną injekcją. Prędkość przepływu ustawić na 0,45 mL/min, a czas analizy na 9,5 min. Temperaturę kolumny utrzymać na 40 &#176;C w kolumnowym podgrzewaczu systemu. W przypadku aflatoksyn B należy zastosować odpowiednio 362 nm i 440 nm jako długości fal wzbudzenia i emisji.1, B2, G1, G2, oraz M1 ilościowe oznaczenie. Struktury głównych aflatoksyn przedstawiono w Rycina 6A. 
	UWAGA: W warunkach eksperymentalnych jedynie aflatoksyny B1 oraz B2 powinny zostać wytworzone przez A. flavus NRRL 3357; jeśli A. parasiticus szczep jest wykorzystywany do inokulacji nasion, produkcji aflatoksyn B1, B2, G1, i G2 jest oczekiwany.</li>
	<li>Wyznaczyć stężenia aflatoksyn w odniesieniu do powierzchni pików odpowiadających standardów analitycznych (krzywa kalibracyjna), zgodnie z opisem w instrukcji obsługi oprogramowania. 
	UWAGA: Ponieważ procedura UPLC wykazuje szum linii bazowej przy wysokich ustawieniach czułości detektora fluorescencyjnego, granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) dla aflatoksyn są oceniane przy użyciu powszechnie akceptowanego stosunku sygnału do szumu wynoszącego 3:1 dla LOD i 10:1 dla LOQ. W rutynowym układzie doświadczalnym do analizy nasion fistaszków, opisanym w sekcjach 2 i 3, granice oznaczalności dla aflatoksyn G1 oraz B1 powinny wynosić mniej niż lub równo 0,8 i 0,08 ng/g dla aflatoksyn G2 oraz B2odpowiednio.</li>
</ol>
4. Analizy fitoaleksyn stilbenoidowych
<ol>
	<li>Do rozdziału stilbenoidów należy zastosować wodę (A), metanol (B) oraz 8% kwas mrówkowy (C) zgodnie z następującym gradientem: warunki początkowe, 53% A, 42% B, 5% C, zmiana liniowa do 35% A, 60% B, 5% C w ciągu 2,0 min, utrzymywanie warunków izokratycznych przez 4 min, zmiana do 0% A, 95% B, 5% C w ciągu 0,5 min, utrzymywanie warunków izokratycznych przez 2,5 min, następnie powrót do warunków początkowych w ciągu 0,1 min i utrzymywanie warunków izokratycznych przez 2,9 min przed kolejną iniekcją. Prędkość przepływu ustawić na 0,5 mL/min, a czas analizy na 12,0 min.</li>
	<li>Stężenia stilbenoidów należy wyznaczyć w odniesieniu do pól powierzchni pików odpowiadających wzorcom autentycznym (krzywa kalibracyjna) i/lub do opublikowanych współczynników ekstynkcji molowej, zgodnie z opisem w instrukcji obsługi oprogramowania. Struktury głównych fitoaleksyn pochodnych stilbenów przedstawiono na Rysunku 6B. 
	UWAGA: Rozdział fitoaleksyn przeprowadza się przy użyciu tego samego systemu, ale bez detektora fluorescencyjnego i reaktora PHRED. Zamiast tego do detekcji i ilościowego oznaczenia stilbenoidów z orzeszków ziemnych stosuje się detektor macierzy diodowej. Granica oznaczalności (LOQ) dla głównych stilbenoidowych fitoaleksyn nie ma znaczenia praktycznego, ponieważ stężenia stilbenoidów przewyższają stężenia aflatoksyn w tym samym ekstrakcie o kilka rzędów wielkości; po 3 dniach inkubacji stilbenoidy są wiarygodnie oznaczane ilościowo.</li>
</ol>

Evaluation of Wild Peanut Species for Resistance to Aflatoxin Accumulation

<ol><li>Janila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+breeding+for+introgression+of+fatty+acid+desaturase+mutant+alleles+%28ahFAD2A+and+ahFAD2B%29+enhances+oil+quality+in+high+and+low+oil+containing+peanut+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular breeding for introgression of fatty acid desaturase mutant alleles (ahFAD2A and ahFAD2B) enhances oil quality in high and low oil containing peanut genotypes.</a> Plant Sci. 242, 203-213 (2016).</li>
<li>Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-linear+relationships+between+aflatoxin+B1+levels+and+the+biological+response+of+monkey+kidney+vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells.</a> Toxins (Basel). 5 (8), 1447-1461 (2013).</li>
<li>American Association for Cancer Research: AACR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+chemicals+and+industrial+processes+associated+with+cancer+in+humans+based+on+human+and+animal+data%3A+IARC+Monographs+Volumes+1+to+20%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20.</a> Cancer Res. 40 (1), 1-12 (1980).</li>
<li>Turner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+epidemiology+of+chronic+aflatoxin+driven+impaired+child+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth.</a> Scientifica. , 21(2013).</li>
<li>Williams, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aflatoxicosis+in+developing+countries%3A+a+review+of+toxicology%2C+exposure%2C+potential+health+consequences%2C+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions.</a> Am. J. Clin. Nutr. 80 (5), 1106-1122 (2004).</li>
<li>van Egmond, H. P., Jonker, M. A. Worldwide regulations on aflatoxins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Egmond%2C+HP+%22Aflatoxinandfood+safety%22">Aflatoxinandfood safety</a>. Abbas, H. K. , Taylor and Francis. Baca Raton, Florida. 77-93 (2005).</li>
<li>European Commission. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commission+Regulation+%28EC%29+1525%2F98%5BTitle%5D)+AND+%22Off.+J.+Eur.+Comm.+L%22%5BJournal%5D)">Commission Regulation (EC) 1525/98.</a> Off. J. Eur. Comm. L. 201, 43-46 (1998).</li>
<li>Bressano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introgression+of+peanut+smut+resistance+from+landraces+to+elite+peanut+cultivars+%28Arachis+hypogaea+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Introgression of peanut smut resistance from landraces to elite peanut cultivars (Arachis hypogaea L).</a> PLoS ONE. 14 (2), e0211920(2019).</li>
<li>de Blas, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+smut+resistance+in+wild+Arachis+species+and+its+introgression+into+peanut+elite+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of smut resistance in wild Arachis species and its introgression into peanut elite lines.</a> Crop Sci. 59 (4), 1657-1665 (2019).</li>
<li>Mallikarjuna, N., Pande, S., Jadhav, D. R., Sastri, D. C., Rao, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introgression+of+disease+resistance+genes+from+Arachis+kempff-mercadoi+into+cultivated+groundnut%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Breeding%22%5BJournal%5D)">Introgression of disease resistance genes from Arachis kempff-mercadoi into cultivated groundnut.</a> Plant Breeding. 123 (6), 573-576 (2004).</li>
<li>Moretzsohn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+peanut+%28Arachis+hypogaea+L.%29+and+its+wild+relatives+based+on+the+analysis+of+hypervariable+regions+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome.</a> BMC Plant Biol. 4, 1-10 (2004).</li>
<li>Arias, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+to+screen+wild+peanut+species+for+aflatoxin+accumulation+and+genetic+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">New tools to screen wild peanut species for aflatoxin accumulation and genetic fingerprinting.</a> BMC Plant Biol. 18 (1), 170(2018).</li>
<li>Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationship+of+kernel+water+activity%2C+soil+temperature%2C+maturity%2C+and+phytoalexin+production+in+preharvest+aflatoxin+contamination+of+drought-stressed+peanuts%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts.</a> Mycopathologia. 105 (2), 117-128 (1989).</li>
<li>Paxton, J. D. Biosynthesis and accumulation of legume phytoalexins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxton%2C+JD+%22Mycotoxins+and+phytoalexins%22">Mycotoxins and phytoalexins</a>. Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. , CRC Press. Boca Raton, Florida. 485-499 (1991).</li>
<li>Cole, R. J., Dorner, J. W. Peanut phytoalexins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCole%2C+RJ+%22Mycotoxins+and+phytoalexins%22">Mycotoxins and phytoalexins</a>. Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. , CRC Press. Boca Raton, Florida. 501-509 (1991).</li>
<li>Subba Rao, P. V., Strange, R. N. Chemistry, biology, and role of groundnut phytoalexins in resistance to fungal attack. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSubba+Rao%2C+PV+%22Handbook+of+phytoalexin+metabolism+and+action%22">Handbook of phytoalexin metabolism and action</a>. Daniel, M., Purkayastha, R. P. , Marcel Dekker. New York. 199-227 (1995).</li>
<li>Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationship+of+phytoalexin+production+and+disease+resistance+in+selected+peanut+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes.</a> J. Agric. Food. Chem. 55 (6), 2195-2200 (2007).</li>
<li>Paxton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytoalexins%3A+a+working+redefinition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Phytoalexins: a working redefinition.</a> J. Phytopathol. 101, 106-109 (1981).</li>
<li>Mansfield, J. W. The role of phytoalexins in disease resistance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMansfield%2C+JW+%22Phytoalexins%22">Phytoalexins</a>. Bailey, J. A., Mansfield, J. W. , John Wiley. New York. 153-288 (1982).</li>
<li>Strange, R. N. Resistance: the role of the hypersensitive response and phytoalexins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrange%2C+RN+%22Plant+response+to+foliar+pathogens%22">Plant response to foliar pathogens</a>. Ayers, P. G. , Biosis Scientific. Oxford. 39-56 (1992).</li>
<li>Sobolev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+activity+of+peanut+%28Arachis+hypogaea%29+phytoalexins+and+selected+natural+and+synthetic+stilbenoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Biological activity of peanut (Arachis hypogaea) phytoalexins and selected natural and synthetic stilbenoids.</a> J. Agric. Food Chem. 59 (5), 1673-1682 (2011).</li>
<li>Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+production+of+phytoalexins+by+peanut+%28Arachis+hypogaea%29+kernels+in+response+to+invasion+by+Aspergillus+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus Species.</a> J. Agric. Food Chem. 56 (6), 1949-1954 (2008).</li>
<li>Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+stilbenoids+from+peanut+%28Arachis+hypogaea%29+seeds+challenged+by+an+Aspergillus+caelatus+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain.</a> J. Agric. Food Chem. 57 (1), 62-68 (2009).</li>
<li>Trucksess, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+column+coupled+with+solution+fluorometry+or+liquid+chromatography+postcolumn+derivatization+for+determination+of+aflatoxins+in+corn%2C+peanuts%2C+and+peanut+butter%3A+collaborative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts, and peanut butter: collaborative study.</a> J. AOAC Int. 74 (1), 81-88 (1991).</li>
<li>Dorner, J. W., Blankenship, P. D., Cole, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+two+immunochemical+assays+in+the+analysis+of+peanuts+for+aflatoxin+at+37+field+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Performance of two immunochemical assays in the analysis of peanuts for aflatoxin at 37 field laboratories.</a> J. AOAC Int. 76 (3), 637-643 (1993).</li>
<li>Stroka, J., Anklam, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+column+cleanup+with+liquid+chromatography+using+post-column+bromination+for+determination+of+aflatoxins+in+peanut+butter%2C+pistachio+paste%2C+fig+paste%2C+and+paprika+powder%3A+collaborative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder: collaborative study.</a> J. AOAC Int. 83 (2), 320-340 (2000).</li>
<li>Pal, A., Acharya, D., Saha, D., Roy, D., Dhar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+sample+cleanup+during+immunoassay%3A+a+simple+method+for+rapid+detection+of+aflatoxin+B1+in+food+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">In situ sample cleanup during immunoassay: a simple method for rapid detection of aflatoxin B1 in food samples.</a> J. Food Prot. 68 (10), 2169-2177 (2005).</li>
<li>Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid%2C+and+inexpensive+cleanup+method+for+quantitation+of+aflatoxins+in+important+agricultural+products+by+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid, and inexpensive cleanup method for quantitation of aflatoxins in important agricultural products by HPLC.</a> J. Agric. Food Chem. 55 (6), 2136-2141 (2007).</li>
<li>Sobolev, V. S., Dorner, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleanup+procedure+for+determination+of+aflatoxins+in+major+agricultural+commodities+by+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography.</a> J. AOAC Int. 85 (3), 642-645 (2002).</li>
<li>Levi, C. P., Borker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+green+coffee+for+potential+aflatoxin+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Survey of green coffee for potential aflatoxin contamination.</a> J. AOAC. 51 (3), 600-602 (1968).</li>
<li>Levi, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+study+on+a+method+for+detection+of+aflatoxins+B1+in+green+coffee+beans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Collaborative study on a method for detection of aflatoxins B1 in green coffee beans.</a> J. AOAC. 52 (6), 1300-1303 (1969).</li>
<li>Scott, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Note+on+analysis+of+aflatoxins+in+green+coffee%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Note on analysis of aflatoxins in green coffee.</a> J. AOAC. 51, 609(1968).</li>
<li>Bicking, M. K. L., Kniseley, R. N., Svec, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled-column+system+for+quantitating+low+levels+of+aflatoxins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Coupled-column system for quantitating low levels of aflatoxins.</a> J. AOAC. 66 (4), 905-908 (1983).</li>
<li>Kamimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid+cleanup+method+for+analysis+of+aflatoxins+and+comparison+with+various+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid cleanup method for analysis of aflatoxins and comparison with various methods.</a> J. AOAC. 68 (3), 458-461 (1985).</li>
<li>Hoogenboom, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+testing+of+extracts+from+aflatoxin-contaminated+peanut+meal%2C+following+chemical+decontamination%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Addit.+Contam%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity testing of extracts from aflatoxin-contaminated peanut meal, following chemical decontamination.</a> Food Addit. Contam. 18 (4), 329-341 (2001).</li>
<li>Castro, L., Vargas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+aflatoxins+B1%2C+B2%2C+G1+and+G2+in+maize+using+Florisil+clean+up+with+thin+layer+chromatography+and+visual+and+densitometric+Quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cienc.+Tecnol.+Ailment.+Campinas%22%5BJournal%5D)">Determining aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in maize using Florisil clean up with thin layer chromatography and visual and densitometric Quantitation.</a> Cienc. Tecnol. Ailment. Campinas. 21, 115-122 (2001).</li>
<li>Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+Control+of+Aflatoxins+in+Peanut%3A+Method+to+Analyze+Mycotoxin+Production+and+Transgene+Expression+in+the+Peanut%2FAspergillus+Pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem.</a> J. Vis. Exp. (106), e53398(2015).</li>
<li>Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+among+aflatoxin+test+results+on+runner+peanuts+harvested+from+small+field+plots%5BTitle%5D)+AND+%22Peanut+Sci%22%5BJournal%5D)">Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots.</a> Peanut Sci. 31 (1), 59-63 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opierając się na naszych wcześniejszych doświadczeniach28, opracowaliśmy prostą, niedrogą, przyjazną dla środowiska procedurę chemiczną odpowiednią do eksploracji kolekcji dzikich plazm zarodkowych Arachis w celu identyfikacji gatunków odpornych na Aspergillus oraz określenia i scharakteryzowania nowych źródeł genetycznej odporności na tego oportunistycznego grzyba. Metoda ta opiera się na oczyszczaniu ekstraktu z nasion techniką ekstrakcji do fazy stałej (SPE) oraz kwantyfikacji aflatoksyn za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) i charakteryzuje się wystarczająco wysokim odzyskiem, precyzją i dokładnością. Proponowana metoda "Florisil" jest modyfikacją procedury czyszczenia pojedynczej minikolumny, która opiera się na unikalnej właściwości Florisil (żelu magnezowo-krzemionkowego) do silnego i selektywnego zatrzymywania aflatoksyn28. Podobnie jak w oryginalnej metodzie, próbki nasion ekstrahowano mieszaniną MeOH-H2 O, ale w innej proporcji 90:10 (v/v) w porównaniu z opublikowaną proporcją 80:20 (v/v). Ta zmiana zwiększyła natężenie przepływu rozpuszczalników przez kolumnę czyszczącą do 2,5 raza przy tym samym współczynniku odzysku aflatoksyny. Ta mieszanina metanolu i wody w proporcji 90:10 (v/v) zapewniła prawie 100% odzysk wzorców aflatoksyn B1, B2, G1 i G2 dodanych do rozpuszczalnika ekstrakcyjnego przy poziomach skoków odpowiadających 5-50 ng stężeń aflatoksyny w 1 g substratu, a także zapewniła wystarczająco wysoki odzysk z wzbogaconych próbek nasion orzeszków ziemnych (Tabela 1).
Wykazano, że aflatoksyny mogą być eluowane z adsorbentu Florisil tylko przy dużych ilościach acetonu30, acetonu i metanolu 31,32 oraz mieszanin acetonu i wody 33,34,35,36. W trakcie niniejszych badań odkryliśmy, że zakwaszony acetonitryl zachowuje się podobnie do acetonu pod względem zdolności do eluowania aflatoksyn z Florisilu. O ile nam wiadomo, ta właściwość acetonitrylu nie została opisana w literaturze. Odkrycie tej właściwości pozwala na wstrzykiwanie oczyszczonego ekstraktu bezpośrednio do systemu UPLC z pominięciem etapu odparowywania rozpuszczalnika, co znacznie skraca czas przygotowania. Nawet gdy acetonitryl został zmieszany z acetonem (aceton-acetonitryl-woda-88% kwas mrówkowy (65:31:3,5:0,5, v/v)), zapewniał gładkie, całkowite i szybkie usuwanie wody z oczyszczonych eluatów, znacznie skracając czas parowania rozpuszczalnika. Obecność acetonitrylu pozwoliła na użycie pojedynczego rozpuszczalnika, mieszaniny metanol-woda (90:10, v/v) w celu skutecznego usunięcia zanieczyszczeń z kolumny Florisil w porównaniu z opublikowaną metodą, w której wymagane były dwa dodatkowe rozpuszczalniki myjące, metanol i mieszanina chloroform-metanol. 28
Średnio standardowy odzysk aflatoksyny B1 wynosił ~ 98% przy użyciu 1,2 ml do elucji aflatoksyn. Ilość 50 mg Florisilu została dobrana tak, aby 1,2 ml rozpuszczalnika elucyjnego wypełniło minikolumnę do górnej części beczki i jednocześnie zapewniło zadowalający odzysk (Tabela 1). Takie podejście przyspiesza procedurę czyszczenia, ponieważ beczka kolumny musi być napełniona tylko raz. Na wczesnych etapach tego projektu nie było jasne, czy komercyjna frakcja Florisil o stosunkowo dużym rozmiarze cząstek, 100-200 mesh, będzie odpowiednia dla małej kolumny zawierającej tylko 3 mm warstwę adsorbentu. Dlatego zbadaliśmy różne frakcje Florisil uzyskane z komercyjnego produktu o oczkach 100-200 przy użyciu standardowych amerykańskich sit testowych 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 i >400 oczek. Wszystkie te frakcje zapewniły powtarzalne, niemal identyczne wyniki z zadowalającym odzyskiem. Chociaż frakcje o mniejszych rozmiarach cząstek wykazywały węższe pasma aflatoksyny w kolumnie pod wpływem światła UV, frakcje te nie były lepsze pod żadnym względem od komercyjnego produktu o siatce 100-200. Ponadto frakcja 100-200 mesh wykazała najkrótsze czasy elucji (8-12 min) dla całej procedury.
Gradientowe dostarczanie rozpuszczalnika UPLC pozwoliło na zadowalające oddzielenie aflatoksyn, a także na całkowite usunięcie zanieczyszczeń niepolarnych z kolumny (rysunek 5G). Takie podejście doprowadziło do bezbłędnej pracy kolumny i powtarzalnych wyników analiz setek próbek. Tożsamość aflatoksyn wymytych z kolumny Florisil została potwierdzona zgodnie z wcześniejszym opisem. 28 Zastosowana tutaj analityczna kolumna UPLC o średnicy 3 mm wykazała wyższą selektywność i bardziej niezawodne rozdzielanie aflatoksyn B1, B2, G1 i G2 przy wyższych stężeniach w porównaniu z kolumną o średnicy 2,1 mm o tym samym składzie chemicznym. Co więcej, żywotność kolumny 3 mm (ponad 1200 wtrysków) była znacznie wyższa niż kolumny 2,1 mm (do 800 wtrysków). Mimo, że kolumna 3 mm wymagała większej dawki fazy ruchomej (o 40% większej), ta wada została zniwelowana przez powyższe zalety kolumny.
Minikolumna Florisil była skuteczna w oczyszczaniu ekstraktów z nasion orzeszków ziemnych silnie zanieczyszczonych metabolitami Aspergillus (ryc. 5G); Takie nasiona zawierały również wysoki poziom fitoaleksyn stilbenoidowych, które były wytwarzane przez nasiona w odpowiedzi na inwazję grzybów. Wszystkie te zanieczyszczenia mogą przekraczać stężenie aflatoksyny w nasionach nawet 106-krotnie 22, co sprawia, że nasiona te stanowią wyzwanie dla analiz aflatoksyn. Rysunek 5G przedstawia brak pików interferujących na chromatogramie w czasie retencji aflatoksyny, co sprawiło, że wykrywanie i oznaczanie ilościowe aflatoksyn było nienaruszone na wszystkich badanych poziomach (tabela 1). Jak widać w tabeli 1, dokładność i precyzja metody były wystarczająco wysokie w badanym zakresie 1,0-50,0 ng/g, który jest również najbardziej krytycznym zakresem wykrywania aflatoksyn. Odzysk na różnych poziomach dla różnych genotypów dzikich orzeszków ziemnych był jednolity, a odchylenia standardowe dla pięciu różnych ekstrakcji były zasadniczo niskie.
Metoda została również przetestowana na nasionach orzeszków ziemnych, bawełny, kukurydzy i ryżu naturalnie zanieczyszczonych od zera do ekstremalnie wysokich poziomów - ponad 10 000 ng/g całkowitych aflatoksyn. Odzysk aflatoksyn B1, B2, G1 i G2 z kukurydzy, nasion bawełny i ryżu na poziomie 5 ng/g wahał się odpowiednio od 76,1% do 93,7%, od 77,1% do 86,6% i od 90,5% do 96,2%. Największemu odzyskowi aflatoksyn z ryżu towarzyszyła "czystość" eluentu, czyli praktycznie brak jakichkolwiek zanieczyszczeń. Co więcej, ryż stanowił najmniejszy pojedynczy badany obiekt, średnio 19 mg/nasiono.
Całkowity czas przygotowania pojedynczego ziarna orzeszków ziemnych (w tym łuskanie, ważenie, ekstrakcja, odwirowanie i oczyszczanie) przy użyciu kolumny Florisil nie przekraczał 20 minut. Koszt minikolumny Florisil jest >10 razy niższy niż w przypadku komercyjnych kolumn czyszczących. Dodatkowe oszczędności wynikają z zastosowania mniejszych ilości adsorbentów, rozpuszczalników i azotu gazowego w porównaniu z opublikowaną procedurą28. Minikolumna nie wymaga do działania urządzeń pompujących ani próżniowych i ma nieokreślony okres trwałości.
Badanie plazmy rozrodczej roślin pod kątem odporności na aflatoksyny jest wyjątkowo trudne, ponieważ akumulacja mikotoksyn nie przebiega zgodnie z normalnym rozkładem37,38; Aby przezwyciężyć to zjawisko, potrzebna jest duża liczba analiz aflatoksyn w pojedynczych nasionach. Oprócz zawartości aflatoksyny, informacje na temat ilościowego składu fitoaleksyny są bardzo cenne w świetle dużej ilości informacji, które można uzyskać z pojedynczego nasiona (rysunek 1A) i prześledzić do konkretnej rośliny (rysunek 1E). Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do badań przesiewowych setek akcesji, w tym ras lokalnych, zaawansowanych linii hodowlanych i elitarnych odmian orzeszków ziemnych. Metoda jest sugerowana do stosowania w programach badawczych przed hodowlą i hodowlą orzeszków ziemnych i może pomóc w scharakteryzowaniu genów orzeszków ziemnych pod kątem odporności na grzyby.

Orzeszek ziemny (Arachis hypogaea L.) jest jedną z głównych roślin uprawnych na świecie. Jest on uprawiany w ponad 10 krajach, a całkowita produkcja przekracza 45 milionów ton1. Towary rolnicze, takie jak orzeszki ziemne, kukurydza i nasiona bawełny, są często atakowane przez gatunki z rodzaju Aspergillus, grzyby glebowe wytwarzające aflatoksyny2. Produkty te są szczególnie podatne na zanieczyszczenie aflatoksynami przed zbiorem, gdy warunki środowiskowe charakteryzują się wysokimi temperaturami i suszą. Aflatoksyny należą do najsilniejszych znanych kancerogenów3. Zanieczyszczają one jedną czwartą towarów rolniczych na świecie4, co sprawia, że około połowa populacji świata jest przewlekle narażona na działanie aflatoksyn5. Ze względu na ich wysoką kancerogenność i toksyczność, obecność aflatoksyn w żywności jest regulowana na najniższych praktycznie dopuszczalnych poziomach w większości krajów świata6.
Unia Europejska (UE) wprowadziła do prawa maksymalny poziom 2 ng/g dla aflatoksyny B1 oraz 4 ng/g dla całkowitej zawartości aflatoksyn (B1, B2, G1 i G2) w produktach przeznaczonych do spożycia przez ludzi7. Tak niskie limity wywierają znaczną presję na rolnictwo i przemysł spożywczy przetwarzający towary zanieczyszczone aflatoksynami. Monitorowanie aflatoksyn oraz przetwarzanie zanieczyszczonych orzeszków ziemnych można uznać za pasywną i kosztowną strategię zapobiegania przedostawaniu się aflatoksyn do łańcucha pokarmowego. Dlatego wszystkie główne segmenty&#160;przemysłu orzeszków ziemnych ponoszą ogromne straty w zyskach z powodu zanieczyszczenia aflatoksynami obecnych odmian orzeszka ziemnego, które często wykazują ograniczoną odporność na choroby grzybowe. Perspektywicznym podejściem do rozwiązania problemu aflatoksyn jest uzyskanie odmian orzeszka ziemnego odpornych na grzyby poprzez introgresję genów, czyli przeniesienie informacji genetycznej z odpornych dzikich gatunków orzeszka ziemnego do odmian elitarnych. W ostatnich latach8,9 dzikie gatunki orzeszka ziemnego zyskały znaczną uwagę jako źródła genetycznej odporności na choroby, ponieważ wąska baza genetyczna uprawnych orzeszków ziemnych nie może już zapewnić roślinom wymaganego poziomu cech odpornościowych10,1. Skuteczna introgresja z dzikich gatunków orzeszka ziemnego wymaga analiz tysięcy pojedynczych, małych i rzadkich&#160;nasion (Rysunek 1A) 12.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig1.jpg" /> 
Rycina 1Schemat analizy pojedynczych nasion. (A) Porównanie wielkości różnych odmian rynkowych fistaszka w stosunku do roślin dzikich Arachis gat. (1) Wirginia; (2) runner; (3) hiszpańska; (4) dzika Arachis spp. (B) Dziki Arachis spp. (płyta A, nasiono 4) przecięte na trzy sekcje, (5) połowa nasiona z osią embrionalną; ta część nasiona jest wykorzystywana do wyhodowania rośliny (E). (C) Części (6) i (7) są wiercone wiertłem, a (D) zaszczepione zarodnikami grzybów. Po inkubacji przez 72 h w 30 &#176;Cjedna z części nasion, (6) lub (7), jest wykorzystywana do analiz aflatoksyn i fitoaleksyn, a druga do sekwencjonowania RNA/transkryptomu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Odporność arachidowca na patogeny grzybowe jest silnie powiązana z fitoaleksynami13,14,15,16,17. Fitoaleksyny arachidowca są reprezentowane przez przeciwgrzybicze stilbenoidy, które są biosyntetyzowane i kumulowane w tkankach rośliny po ekspozycji na bodźce egzogenne, w szczególności na inwazję grzybów16,17,18. Szybka akumulacja odpowiednich stężeń fitoaleksyn w miejscu inwazji grzybowej hamuje wzrost grzyba i ma krytyczne znaczenie dla obrony rośliny19,20,21. Patogen przestaje rosnąć, gdy fitoaleksyny osiągną stężenia hamujące16,2. Rola stilbenoidów jako związków obronnych przeciwko grzybom produkującym aflatoksyny u arachidowca została oceniona ponad 30 lat temu w doświadczeniach polowych13. Doświadczenia te jednoznacznie potwierdziły hipotezę, że stilbenoidy arachidowca są kluczowym czynnikiem odporności w kontekście zanieczyszczenia aflatoksynami przed zbiorem. Dowody te opierają się na faktach, że stilbeny są naturalnie produkowane w uszkodzonych w polu orzeszkach ziemnych; stilbeny wykazują znaczną aktywność biologiczną przeciwko grzybom produkującym aflatoksyny; a zanieczyszczenie nasion aflatoksynami wykryto tylko wtedy, gdy arachidowce utraciły zdolność do syntezy fitoaleksyn w wyniku odwodnienia nasion wywołanego suszą. Inna seria doświadczeń polowych potwierdziła powiązanie między produkcją fitoaleksyn a odpornością genotypu arachidowca na istotne rolniczo choroby tej rośliny17.
Lepsze zrozumienie naturalnego mechanizmu odporności arapszywy na inwazję grzybów, opartego na fitoaleksynach, stanowi obiecującą strategię kontroli zanieczyszczenia aflatoksynami15,17. Dlatego, poza analizami aflatoksyn, istotne jest ilościowe oznaczenie fitoaleksyn w tych samych nasionach. Choć mechanizm ten nie został jeszcze w pełni zbadany i poznany, ma on kluczowe znaczenie dla hodowli i modyfikacji genetycznej roślin arapszywy w celu uzyskania nowych odmian odpornych na grzyby23. Pomimo istnienia różnych procedur analitycznych do oznaczania aflatoksyn w różnych produktach, nadal istnieje zapotrzebowanie na proste metody do specyficznych badań, szczególnie w sytuacjach, gdy metody tradycyjne nie spełniają wymagań analitycznych i ekonomicznych. Większość nowoczesnych metod oczyszczania stosowanych w przemyśle orzeszkowym, rolnictwie i laboratoriach prywatnych opiera się na przeciwciałach24 i urządzeniach do immunoanaliz25,26,27. Są one selektywne i czułe, lecz znacznie droższe niż minikolumny wypełnione powszechnymi adsorbentami. Ponadto żadna z tych metod nie została zaprojektowana do analizy próbek o masie zaledwie kilku miligramów. W oparciu o nasze wcześniejsze badania nad analitycznym zastosowaniem minikolumn wypełnionych żelem krzemionkowym z magnezem (Florisil)28, zmodyfikowaliśmy tę procedurę tak, aby dostosować ją do potrzeb obecnych i przyszłych programów przedhodowlanych oraz hodowlanych.
Celem niniejszej pracy było opracowanie niedestrukcyjnej, średnio wydajnej i przyjaznej dla środowiska metody ilościowego oznaczania aflatoksyn i fitoaleksyn w pojedynczych nasionach arakidy. Opracowano taką metodę. Jej zalety w stosunku do opublikowanych metod to wyższa czułość, możliwość analizy aflatoksyn i fitoaleksyn w ekstrakcie z jednego nasiona, brak konieczności ważenia próbek oraz niższy koszt dzięki mniejszym objętościom materiałów eksploatacyjnych. Schemat blokowy zintegrowanej metody przedstawiono na Rysunku 1. Analizy genetyczne oraz pozostałe etapy zostały opisane w tekście i przedstawione na rysunku, aby ukazać znaczenie proponowanej metody oraz sposób jej integracji z całą procedurą.

<table><tbody><tr><td>Aceton, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 2,1 x 5mm Van-Guard kolumna wstępna</td><td>Waters Corporation</td><td>186003975</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 3 x 100mm kolumna</td><td>Waters Corporation</td><td>186004661</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 2,1 x 100mm</td><td>kolumna Waters Corporation</td><td></td><td></td>186002352</tr><tr><td>Aflatoksyny B1, B2, G1 i G2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9441-1VL</td><td>Rozpuścić zawartość handlowej fiolki w 5 ml metanolu w celu uzyskania 5 &mikro; g/ml dla aflatoksyn B1 i G1 oraz 1,5 &mikro; g / ml dla B2 i G2</td></tr><tr><td>Aflatoksyna B1 (1 mg)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A6636-1 mg</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoksyna B2 (1 mg)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9887-1 mg</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoksyna G1 (1 mg)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A0138-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoksyna G2 (1 mg)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A0263-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Aflatoksyna M1 (10 &mikro; g)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>CRM46319</td><td></td></tr><tr><td>Agar, granulowany (2 kg)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>BD214510</td><td></td></tr><tr><td>Zasadowy tlenek tlenku glinu (60-325 oczek)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A941-500</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże podstawowe</td><td>Murashige i Skoog</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Koralik Ruptor 24&nbsp;</td><td>Zlewka Omni International</td><td>19-042E</td><td></td></tr><tr><td>(1000 ml)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>Zlewka 10001L</td><td></td></tr><tr><td>(250 ml)</td><td>Zlewka Corning (Pyrex)</td><td>1000250</td><td></td></tr> (<tr><td>400 ml)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1000400</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka (600 ml)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1000600</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze, skalpel</td><td>Pióro</td><td>#10</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka (LSE Compact)</td><td>Corning</td><td>Model: 6755</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka, mikro</td><td></td><td>Corning Model: 6770</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki ceramiczne (2,8 mm)Koraliki ceramiczne</td> <td>Omni International</td><td>19-646</td><td></td></tr><tr><td>(6,5 mm)</td><td>Omni International</td><td>19-682</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie serii Chromeleon 7</td><td>Wiertło Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kyocera</td><td>07896</td> Wiertło <td>1,6 mm</td></tr><tr><td></td><td>Kyocera</td><td>07357</td><td>2,0 mm</td></tr><tr><td>Wiertło</td><td>Kyocera</td><td>07985</td><td>2,34 mm</td></tr><tr><td>Etanol (200 proof)</td><td>Dekon Labs</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>Parownik, azot</td><td>organimation</td><td>11106</td><td>6-pozycyjny</td></tr><tr><td>Excel, Microsoft</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna (#4)</td><td>Cytiva Whatman</td><td>1004-090</td><td></td></tr><tr><td>Nóż do bibuły filtracyjnej, stal nierdzewna (ID 11,5mm)</td><td>Nieznany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny, włókno szklane</td><td>Cytiva Whatman</td><td>934-AH</td><td></td></tr><tr><td>Kolba (2800mL)</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>44202XL</td><td></td></tr><tr><td>Florisil (100-200 mesh)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F101-500</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Integra Lifescience ( Miltex)</td><td>PM-0300</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (88%, ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka (-80oC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSX70086D</td><td></td></tr><tr><td>Lejek (15 x 80mm)</td><td>DWK Nauki Przyrodnicze (Kimax)</td><td>2902060</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan (średni)</td><td>Caisson Labs&nbsp;</td><td>G024</td><td></td></tr><tr><td>Pręt szklany (na zamówienie)</td><td>Wełna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szklana</td><td>na zamówienie Corning (Pyrex)</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść, skalpel&nbsp;</td><td>Hemocytometr Feather</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td>30%, Certyfikowany ACS</td></tr><tr><td>Wiadro na lód, okrągłe z pokrywką</td><td>Inkubator</td><td>Corning 432122</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Percival</td><td>136VL</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech SCIENCE Marka Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>8.2" x 4.39"</td></tr><tr><td>Kimtech SCIENCE Marka Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34256</td><td>16.4" x 14.43"</td></tr><tr><td>Fartuch laboratoryjny</td><td>Cenmed</td><td>B113660SBXL</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini stojak kolumnowy (na zamówienie)</td><td>Mikser</td><td></td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>, dotykowy (maxi mix II)</td><td>Thermolyne</td><td>37600 (model 231)</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe&nbsp;</td><td>Microflex</td><td>XC310M</td><td></td></tr><tr><td>Gazowy azot, sprężony (ultra wysoka czystość)</td><td>Jones Ręcznik papierowy do spawania</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Georgia-Pacific</td><td>20023 (D400)</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-636-AB15</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda pH/ATC</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-620-111</td><td></td></tr><tr><td>Reaktor</td> <td>fotochemiczny PhCRWoda (Vicam)</td><td>600001222</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta, Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>Pipetor 9"</td></tr><tr><td>(1 mL) (Odniesienie 2)</td><td>Pipettor Eppendorf</td><td>4924000088</td><td></td></tr><tr><td>(10 &mu; L) (Odniesienie)</td><td>Eppendorf</td><td>022470051D</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet: 10 &mu; L, 200 &mu; L, 1 ml</td><td>Eppendorf</td><td>F144054M</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor (200 &mikro; L)(Ergofit)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-146-679</td><td></td></tr><tr><td>Talerze, Petri (100x15mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Agar Ziemniaczany Dekstroza (500g)</td><td>Becton Dickinson&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>BD213400</tr><tr><td>Wzmocniona rurka z kulkami (2 ml)</td><td>Omni International</td><td>19-660</td><td></td></tr><tr><td>Wzmocniona rurka z koralikami (7 ml)</td><td>Repipettor Omni International</td><td>19-651</td><td></td></tr><tr><td>, Dozownik III (10 ml)</td><td>Brandtech</td><td>4701141</td><td></td></tr><tr><td>Resweratrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5010-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Szufelka (na zamówienie)</td><td>Wykonane</td><td></td><td></td> na zamówienie</tr><tr><td>słoik z nakrętką (250 ml)&nbsp;</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>1395250</td><td></td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy, kulisty (200-400 mesh)&nbsp;</td><td>Supelco</td><td>97727-U</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>SPE ekstrakt czysta kolumna polipropylenowa 1,5 ml&nbsp;</td><td>Amerykańskie materiały chromograficzne</td><td>SP-5122382</td><td></td></tr><tr><td>SPE ekstrakt czyste fryty PP (do minikolumny 1,5 ml)</td><td>Amerykańskie materiały chromotograficzne</td><td>SP-3119414</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr, widzialny w promieniowaniu UV</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-385-351 (Genesys 50)</td><td></td></tr><tr><td>Probówka</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>982516X</td><td>16x125mm</td></tr><tr><td>Probówka (jednorazowa)(16x125mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-31</td><td></td></tr><tr><td>Probówka (jednorazowa)(150x250mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-34</td><td></td></tr><tr><td>Detektor Thermo Vanquish DAD (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-D11-A-01</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish Fluourescense detector (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-D51-A Pompa</td><td></td></tr><tr><td>czwartorzędowa Thermo Vanquish F (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-P20-A</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-A10-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbat 20) (klasa enzymatyczna)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Nasadki na fiolki (4 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4015-75A</td><td></td></tr><tr><td>Nasadki na fiolki (autosampler)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4010-60A</td> Fiolki i nakrętki <td></td></tr><tr><td>(16 ml)</td><td>Fiolki Thermo Scientific</td><td>B7800-4</td><td></td></tr><tr><td>, szklane (4mL)Fiolki</td> <td>Fisher Scientific</td><td>C4015-1</td><td></td></tr><tr><td>, polipropylenowe (autosampler) (400mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4010-11</td><td></td></tr><tr><td>Woda, Optima&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

nieniszcząca kwantyfikacja aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych orzechach ziemnych (arachis spp.) nasiona

Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds

Aflatoksyny są wysoce rakotwórczymi metabolitami wtórnymi niektórych gatunków grzybów, szczególnie Aspergillus flavus. Aflatoksyny często zanieczyszczają ważne gospodarczo towary rolne, w tym orzeszki ziemne, stwarzając wysokie ryzyko dla zdrowia ludzi i zwierząt. Ze względu na wąską bazę genetyczną odmiany orzeszków ziemnych wykazują ograniczoną odporność na patogeny grzybowe. W związku z tym wiele gatunków dzikich orzeszków ziemnych z tolerancją na Aspergillus otrzymało znaczną uwagę naukowców jako źródło odporności na choroby.
Badanie plazmy zarodkowej roślin pod kątem odporności na aflatoksyny jest trudne, ponieważ akumulacja aflatoksyn nie przebiega zgodnie z rozkładem normalnym, co dyktuje potrzebę analiz tysięcy pojedynczych nasion orzeszków ziemnych. Wystarczająco uwodnione nasiona orzeszków ziemnych (Arachis spp.), po zakażeniu przez gatunki Aspergillus, są zdolne do wytwarzania biologicznie aktywnych stylbenów (stilbenoidów), które są uważane za obronne fitoaleksyny. Stylbeny z orzeszków ziemnych hamują rozwój grzybów i produkcję aflatoksyn. Dlatego tak ważne jest, aby przeanalizować te same nasiona pod kątem stilbenoidów z orzeszków ziemnych, aby wyjaśnić naturę odporności/podatności nasion na inwazję Aspergillus. Żadna z opublikowanych metod nie oferuje analiz pojedynczych nasion na obecność aflatoksyn i/lub fitoaleksyn stylbenowych.
Próbowaliśmy zaspokoić zapotrzebowanie na taką metodę, która jest przyjazna dla środowiska, wykorzystuje tanie materiały eksploatacyjne oraz jest czuła i selektywna. Ponadto metoda jest nieniszcząca, ponieważ wykorzystuje tylko połowę nasion i pozostawia nienaruszoną drugą połowę zawierającą oś zarodkową. Taka technika pozwala na kiełkowanie i wzrost rośliny orzeszków ziemnych do pełnej dojrzałości z tych samych nasion, które są używane do analizy aflatoksyn i stilbenoidów. Zintegrowana część tej metody, ręczne wyzwanie nasion za pomocą Aspergillus, jest krokiem ograniczającym, który wymaga więcej czasu i pracy w porównaniu z innymi etapami metody. Metoda ta została wykorzystana do eksploracji dzikiej plazmy zarodkowej Arachis w celu identyfikacji gatunków odpornych na Aspergillus oraz określenia i scharakteryzowania nowych źródeł genetycznej odporności na ten patogen grzybowy.

Opracowana metoda oznaczania ilości aflatoksyn w nasionach stanowi kluczowy element całej procedury oceny odporności dzikich gatunków arahisji na akumulację aflatoksyn. Specjalnie przygotowane minikolumny i filtry zapewniają znaczne oszczędności i upraszczają całą procedurę dzięki wyeliminowaniu dużych objętości rozpuszczalników, kosztownych i zbędnych komercyjnych filtrów 0,22 lub 0,45 µm oraz urządzeń pompowych. Metoda analizy aflatoksyn charakteryzuje się wysokim odzyskiem, dokładnością i precyzją w badanym zakresie 1,0-50,0 ng/g aflatoksyn w zmielonych nasionach, co przedstawiono w Tabeli 1. Próbki silnie zanieczyszczone rozcieńczano do wartości mieszczącej się w zakresie liniowym. Rysunek 5C przedstawia rozdział podstawowy czterech głównych aflatoksyn: B1, B2, G1 i G2 w czasie elucji wynoszącym 5 min, co jest dopuszczalne, ponieważ etapem ograniczającym całą procedurę jest inokulacja nasion arahisji grzybami, a nie analiza UPLC.
Proponowana metoda jest wystarczająco czuła, z granicą oznaczania wynoszącą 2 pg dla aflatoksyny B1 (Rysunek 5D). Wysoka czystość ekstraktów pozwala na jednoznaczną kwantyfikację aflatoksyn, co widać na chromatogramie UPLC (Rysunek 5E) oczyszczonego ekstraktu z nasion zebranych z pola z dzikim gatunkiem Arachis. Wcześniej opublikowana metoda minikolumnowa29 nie pozwala na osiągnięcie satysfakcjonującej czystości w przypadku nasion fistaszka zainfekowanych grzybami (Rysunek 5F) w porównaniu z proponowaną metodą (Rysunek 5G). Z Rysunku 5F wynika, że aflatoksyny B2, G1 i G2 nie mogą być wiarygodnie wykrywane i kwantyfikowane ze względu na obecność wysokich stężeń zanieczyszczeń interferujących, z których wiele, eluowanych po aflatoksynach, to fitoaleksyny stilbenoidowe i metabolity grzybowe. W przeciwieństwie do tego, Rysunek 5G wykazuje wysoką wydajność kolumny z żelu krzemionkowego z magnezem w usuwaniu zanieczyszczeń z frakcji aflatoksyn. Niebieski chromatogram przedstawia zanieczyszczenia interferujące, które są wypłukiwane z kolumny 1 mL mieszaniny metanol-woda (90:10); czarny chromatogram pokazuje nieprzesłonięte piki aflatoksyn M1 i B1. Ten chromatogram reprezentuje ekstrakt z nasion zainfekowanego dzikiego gatunku. Poziom aflatoksyny B1 wynosi 48 ng/g.
Ilościowe oznaczenie fitoakleksyn fistaszkowych stanowi wartościowe uzupełnienie analiz aflatoksyn w tych samych nasionach, które mogą być naturalnymi nasionami z pola lub nasionami zainfekowanymi grzybem. Rycina 5H przedstawia typowy chromatogram obronnych stilbenoidów fistaszka z zainfekowanego nasiona. Rozdział związków uzyskano przy użyciu tej samej kolumny analitycznej, która jest stosowana do analiz aflatoksyn. Kolumna oraz wybrane warunki chromatograficzne zapewniają satysfakcjonujący rozdział pików, umożliwiając wiarygodne ilościowe oznaczenie stilbenoidów. Ocena zależności między aflatoksynami a fitoaleksynami w zainfekowanych nasionach wykracza poza zakres niniejszej prezentacji, a opisana metoda jest tutaj sugerowana jako potencjalne narzędzie badawcze, które jest wykorzystywane w laboratorium autorów od kilku lat i okazało się użyteczne.

<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig6.jpg" /> 
Rycina 6:&#160;Struktury głównych aflatoksyn oraz fitoaleksyn z arahisznu pochodnych stilbenów. (A) Struktury głównych aflatoksyn: 1, B1; 2, B2; 3, G1; 4, G2.&#160;(B) Struktury głównych fitoaleksyn z fistaszka pochodnych stilbenów: 6, resweratrol; 7arachidyna-1; 8arachidina-2; 9, arachidyna-3; 10, IPD (3&#8242;-izopentadienylo-3,5,4&#8242;-trihydroksystilben); 11, SB-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Poziom wzbogaceniaa 
			(ng/g)</td>
			<td colspan="4">Aflatoksyny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1</td>
			<td>B2</td>
			<td>G1</td>
			<td>G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td>
			<td>85.87 (0.97)</td>
			<td>82.33 (0.67)</td>
			<td>86.63 (2.89)</td>
			<td>84.01 (0.86)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>91.43 (2.76)</td>
			<td>87.32 (0.47)</td>
			<td>88.08 (2.08)</td>
			<td>87.73 (0.77)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>81.21 (3.16)</td>
			<td>85.33 (1.98)</td>
			<td>81.76 (4.66)</td>
			<td>88.46 (3.24)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Odzysk aflatoksyn z nasion peanut przy użyciu kolumny Florisil i 1,2 mL mieszaniny elucyjnej frakcji aflatoksyn. [średnia (SD), %; n = 5]. Próbki zmielone bez zawartości aflatoksyn (50 g) odmiany peanut Georgia 06G zostały równomiernie wzbogacone za pomocą mikrosyrigi roztworem standardowym aflatoksyn na poziomie 50, 5 lub 1 ng/g i pozostawione w temperaturze pokojowej na 16 h. a Poziomy wzbogacenia podano dla aflatoksyn B1 i G1; dla aflatoksyn B2 i G2 należy zastosować mnożnik 0,33.

Demonstrujemy średnioprzepustową metodę ilościowego oznaczania aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych nasionach orzeszków ziemnych przy użyciu ultra wydajnej chromatografii cieczowej. Metoda ta została opracowana specjalnie do analiz dzikich gatunków pajęczaków zagrożonych przez aflatoksynogenne gatunki Aspergillus.

Nieniszcząca kwantyfikacja aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych orzechach ziemnych (Arachis spp.) Nasiona

Aflatoxins are highly carcinogenic secondary metabolites of some fungal species, particularly Aspergillus flavus. Aflatoxins often contaminate ...

Zakres badań polegał na opracowaniu metody oznaczania ilościowego aflatoksyn i fitoaleksyny obronnej w tysiącach nasion orzeszków ziemnych w celu eksploracji dzikiej plazmy rozrodczej Arachis w celu identyfikacji gatunków odpornych na Aspergillus oraz określenia i scharakteryzowania nowych źródeł odporności genetycznej na ten patogen grzybowy. Nasza grupa badawcza odkryła, że najbardziej obiecującym podejściem do identyfikacji plazmy zarodkowej orzeszków ziemnych, która nie gromadzi aflatoksyny, jest przeprowadzenie holistycznej analizy każdego pojedynczego nasiona, w tym jego transkryptomiki, genomiki, fitoaleksyny i profili mikotoksyn. Opracowaliśmy protokoły analizy nasion dzikich i uprawnych orzeszków ziemnych, co oznacza wykorzystanie jednej czwartej pojedynczego nasiona do profilowania chemicznego.Opracowanie wysokowydajnych metod skutecznego wysiewu nasion, ekstrakcji i dokładnej kwantyfikacji fitoaleksyny w próbkach nasion orzeszków ziemnych. Odkryliśmy wiele fitoaleksyny z orzeszków ziemnych i opracowaliśmy skuteczne i niedrogie metody analizy aflatoksyn, a także badań przesiewowych plazmy zarodkowej orzeszków ziemnych ze zmniejszoną akumulacją aflatoksyny lub bez niej. Metody obejmują genotypowanie i określenie żywotności nasion.Po wyhodowaniu aflatoksynicznego Aspergillus flavus NRRL 3357 na agarze z dekstrozą ziemniaczaną przez sześć dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wymyj zarodniki grzybów z probówki za pomocą 10 mililitrów wody zawierającej Tween 20. Obracaj probówkę przez 20 sekund. Przefiltrować zawiesinę zarodników grzybów przez watę szklaną umieszczoną w lejku i użyć wirowego filtratu do rozcieńczenia.Rozcieńczyć 100 mikrolitrów podwielokrotności przefiltrowanej zawiesiny w 9,9 mililitra wody. Po wirowaniu policz zarodniki za pomocą hemocytometru. Korzystając ze wzoru wyświetlanego na ekranie, oblicz objętość wody potrzebną do rozcieńczenia jednej objętości oryginalnej zawiesiny od skosu do 1 000 zarodników na mikrolitr.Dodać jedną objętość oryginalnej zawiesiny do obliczonej ilości wody. Następnie delikatnie rozbij strąki orzeszków ziemnych i usuń łuski. Umieść nasiona w sterylnej zlewce.Dodaj 0,05% roztwór nadtlenku wodoru, aż zlewka będzie pełna w 70%, pozwalając nasionom wchłonąć wodę przez trzy godziny. Zdekantować roztwór nadtlenku wodoru z nasion i dodać około trzy razy więcej niż 80% mieszaniny wody etanolowej, aby przykryć nasiona. Inkubować przez jedną minutę, a następnie dwukrotnie opłukać nasiona równą objętością sterylnej wody destylowanej.Dodać pięciokrotną objętość 3% roztworu nadtlenku wodoru do zlewki i odstawić na pięć minut. Po zdekantowaniu roztworu nadtlenku wodoru opłucz nasiona dwukrotnie równą objętością sterylnej wody. Umieść bibułę filtracyjną o średnicy 90 milimetrów w pokrywce i zwilż bibułę jednym mililitrem sterylnej wody.Umieść pokrywkę na naczyniu. Umieść nasiona na sterylnym ręczniku papierowym. Za pomocą kleszczy usuń skórkę nasion.Umieść nasiona deskiny natychmiast na szalce Petriego, aby uniknąć odwodnienia. Odetnij około jednej trzeciej nasion zawierających oś zarodkową. Podziel nasiona na liścienie i za pomocą ostrego wiertła wiertło wbij około 1,5 do 2 milimetrów w głąb środka zewnętrznej strony każdego liścienia.Umieść od czterech do sześciu wywierconych kawałków nasion na 1,5% naczyniu z agarem. Za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów dodaj dwa mikrolitry zawiesiny zarodników do wywierconej wnęki każdej połówki liścienia. Po przykryciu naczynia pokrywką inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza bez światła przez 72 godziny.Po inkubacji nasion orzeszków ziemnych po zaszczepieniu zarodników Aspergillus flavus, użyj kleszczy, aby usunąć kawałki nasion z agaru. Umieść kawałki nasion w oznaczonych siedmiomililitrowych fiolkach z kulkami zawierającymi 13 ceramicznych kulek cyrkonowych. W celu ekstrakcji fitoaleksyny i aflatoksyn, w zależności od wielkości nasion, dodaj dwa lub cztery mililitry mieszaniny metanolu wodnego do fiolki z kulkami i sproszkowaj z prędkością 5,5 metra na sekundę przez 45 sekund.Następnie odwirować przy 1,860 G przez trzy minuty i zebrać supernatant do świeżej fiolki. Do analizy aflatoksyn, za pomocą szklanego pręta przyciętego pod kątem 90 stopni, włóż porowatą frytę polietylenową do 1,5-mililitrowej kolumny polipropylenowej. Za pomocą specjalnie przygotowanej miarki dodaj 50 miligramów żelu magnezowo-krzemionkowego do kolumny.Przykryj kolumnę identyczną frytą i dociśnij ją szklanym prętem. Dodaj 0,5 mililitra supernatantu do specjalnie zapakowanej mini kolumny i pozwól ekstraktowi spłynąć grawitacyjnie do czteromililitrowej szklanej fiolki. Dodaj jeden mililitr mieszaniny metanolu i wody do kolumny, aby wypłukać zanieczyszczenia grawitacyjnie do tej samej fiolki.Po wyrzuceniu połączonych eluatów z fiolki, dodać 1,2 mililitra acetonu, wody acetonitrylowej, 88% mieszaniny kwasu mrówkowego do kolumny, aby wymyć frakcję aflatoksyny do czystej szklanej fiolki. Odparować rozpuszczalnik z fiolki w strumieniu azotu w bloku grzewczym o temperaturze 45 stopni Celsjusza. Po odparowaniu zakryć fiolkę i schłodzić ją w kruszonym lodzie przez jedną minutę.Umieść wykonane na zamówienie filtry pipet Pasteura w jednorazowych probówkach i umieść je na lodzie, aby zminimalizować parowanie po filtracji. Suchą pozostałość rozpuścić w precyzyjnie odmierzonej mieszaninie metanolu i wody o objętości od 0,25 do 1,0 mililitra. Po wirowaniu przenieś podwielokrotność 0,2 mililitra do filtra.Użyj azotu gazowego, aby przyspieszyć filtrację do 400-litrowej fiolki z automatycznym samplerem. Umieścić fiolkę w automatycznym próbniku UPLC i ustawić objętość wstrzyknięcia na 0,1 do 3,0 mikrolitrów. W przypadku fitoaleksyny przenieść 200 mikrolitrów supernatantu z siedmiomililitrowej fiolki wirówki do filtra pipetowego Pasteura.Po przefiltrowaniu umieścić na fiolce pasujące wieczko z przegrodą politetrafluoroetylenową. W przypadku separacji aflatoksyn należy zastosować gradient przy użyciu wody, metanolu i acetonitrylu o określonym składzie procentowym i czasie pracy. Ustaw natężenie przepływu na 0,45 mililitra na minutę, a czas pracy na 9,5 minuty.W systemowej grzałce kolumnowej ustaw temperaturę kolumny na 40 stopni Celsjusza. Aby określić ilościowo aflatoksyny, ustaw długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio na 362 i 440 nanometrów. Następnie, korzystając z metody krzywej kalibracyjnej i instrukcji oprogramowania UPCL, wykonaj analizę w celu określenia stężeń aflatoksyn w badanych próbkach.Do oddzielenia nieruchomych stilbenoidów należy użyć gradientu składającego się z wody, metanolu i 88% kwasu mrówkowego o określonych warunkach procentowych i czasie. Ustaw natężenie przepływu na 0,5 mililitra na minutę, a czas pracy na 12 minut. Stosując metodę krzywej kalibracyjnej, należy oznaczyć stężenia stilbenoidów i porównać powierzchnie pików badanej próbki z czystymi autentycznymi wzorcami.Metoda oznaczania ilościowego aflatoksyny oparta na UPLC pozwala na uzyskanie czułej oceny ilościowej aflatoksyny B1 z limitem dwóch pikogramów na wstrzyknięcie. Oczyszczony ekstrakt z nasion zebranych z dzikiego gatunku Arachis wykazał jednoznaczne oznaczenie ilościowe aflatoksyn. Podejście oparte na kolumnie z żelem magnezowo-krzemionkowym skutecznie usuwa zanieczyszczenia z frakcji aflatoksyny i wykazuje wysoką skuteczność oznaczania ilościowego w przeciwieństwie do poprzednich metod.Ponadto metoda ta pomaga również w ilościowym oznaczaniu fitoaleksyny z orzeszków ziemnych.

non-destructive-spe-uplc-based-quantification-aflatoxins-stilbenoid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Szkodliwość grzybów infekujących nasiona w uprawach zbóż skłoniła do licznych wysiłków badawczych mających na celu lepsze zrozumienie interakcji między rośliną a patogenem. Aby badać interakcje nasion z grzybami w warunkach laboratoryjnych, opracowaliśmy niezawodną metodę ilościowego określania reprodukcji grzybów, biomasy oraz skażenia mikotoksynami przy użyciu bioassayów na ziarnach.

Ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy

Pokazujemy metodę analizy aflatoksyn i ekspresji transgenów w nasionach orzeszków ziemnych, które zawierają sygnały interferencji RNA do wyciszania genów syntezy aflatoksyn u grzyba Aspergillus flavus. Kontrola mikotoksyn w roślinach za pośrednictwem RNAi nie została wcześniej zgłoszona.

Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Udało nam się ustalić metodę izolacji RNA z nasion roślin zawierających duże ilości olejów, białek i polifenoli, które mają działanie hamujące izolację RNA o wysokiej czystości. Nasza metoda jest odpowiednia do monitorowania ekspresji genów z transkryptami niskiego poziomu w nasionach.

Skuteczna metoda izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion do zastosowania w ilościowej analizie transkryptomu

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół długotrwałej elektrostatycznej chromatografii odpychającej-hydrofilowej z tandemową spektrometrią mas (LERLIC-MS/MS). Jest to nowatorska metodologia, która po raz pierwszy umożliwia kwantyfikację i charakterystykę izoform deamidacji glutaminy i asparaginy za pomocą proteomiki typu shotgun.

LERLIC-MS/MS do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun

Tutaj prezentujemy metodę bezpośredniego pomiaru poziomów ładowania transferowego RNA z oczyszczonego RNA Escherichia coli, a także sposób porównywania względnych poziomów transferowego RNA, lub dowolnego innego krótkiego RNA, w różnych próbkach na podstawie dodania komórek impulsowych wyrażających gen odniesienia.

Kwantyfikacja liczebności i poziomów naładowania transferowych RNA w Escherichia coli

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda korekty polimerazy DNA i testu naprawy DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF o wysokiej rozdzielczości i strategii przedłużania pojedynczego nukleotydu. Test okazał się bardzo specyficzny, prosty, szybki i łatwy do wykonania w przypadku korekty i naprawy łatek krótszych niż 9-nukleotydy.

Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF

Opisujemy trzy eksperymentalne metody oceny hipopigmentacyjnej aktywności substancji chemicznych in vitro: kwantyfikacja 1) komórkowej aktywności tyrozynazy i 2) zawartości melaniny, oraz 3) pomiar melaniny za pomocą barwienia melaniny komórkowej i analizy obrazu.

Kwantyfikacja aktywności hipopigmentacyjnej in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Ilościowe Multiplex Immunoprecipitation (QMI) wykorzystuje cytometrię przepływową do czułego wykrywania różnic w obfitości docelowych interakcji białko-białko między dwiema próbkami. QMI można wykonać przy użyciu niewielkiej ilości biomateriału, nie wymaga genetycznie modyfikowanych znaczników i może być dostosowany do dowolnej wcześniej zdefiniowanej sieci interakcji białek.

Kwantyfikacja dynamiki sieci interakcji białek za pomocą multipleksowanej koimmunoprecypitacji

Poznaj metodę kwantyfikacji aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych nasionach orzecha ziemnego Arachis spp. przy użyciu chromatografii cieczowej UPLC. Technika ta umożliwia identyfikację dzikich gatunków odpornych na Aspergillus.

Nieniszcząca kwantyfikacja aflatoksyn i fitoaleksyn stilbenoidowych w pojedynczych orzechach ziemnych (Arachis spp.) Nasiona

Przeglądaj więcej filmów