13C6-Znakowanie glukozy związane z LC-MS: Identyfikacja pierwotnych organów roślinnych w syntezie metabolitów wtórnych
22 marca 2024
Opracowana metoda znakowania 13C6-Glucose w połączeniu z chromatografią cieczową o wysokiej rozdzielczości spektrometrią mas jest wszechstronna i stanowi podstawę do przyszłych badań nad pierwotnymi organami i szlakami zaangażowanymi w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych, jak również kompleksowe wykorzystanie tych wtórnych metabolitów.
Naszym celem jest opracowanie uniwersalnej i trzywyrazowej metody identyfikacji narządów odpowiedzialnych za wytwarzanie chorych metabolików w roślinach leczniczych. Ta metoda integruje pewne znakowanie glukozy 6 z LC-MS i chorobą. Oferując cenę i przystępny sposób, aby określić, gdzie te ważne związki są syntetyzowane.
Najnowsze osiągnięcia koncentrują się na dynamice metabolitów, kwantyfikacji białek i eksploracji złożonych matryc biologicznych. Analiza spektrometrii wielopaleściowej mierzy magnetyczne jądrowe freelancerzy, spektroskopia, bioinformatyka i narzędzia do analizy danych mogą promować rozwój środków znakowania izotopów chemicznych. Głównym wyzwaniem tego eksperymentu są efekty metryczne.
Odciski innych pierwiastków lub związków w próbce mogą zakłócać pomiar izotopów węgla, prowadząc do efektów metrycznych, które mogą zniekształcić wyniki. Nasze wyniki otwierają drogę dla kilku nowych badaczy naukowych, w tym mechanizmów syntezy metabolicznej, regulacji genetycznej, wpływu czynników środowiskowych, transportu międzynarządowego, praktyk agrodydaktycznych. Na początek wytwarza 1,26 grama proszku Hoagland i 0,945 grama azotanu wapnia w czterech litrach wody.
Zanurz umyte 2-letnie sadzonki PPY w standardowym stężeniu 1 x 4 pożywki Hoaglanda na trzy dni. Następnie dodaj 0,2 grama glukozy w proszku izotopu węgla 13 do zlewki zawierającej 100 mililitrów oczyszczonej wody. Następnie ustaw zbiornik hydroponiczny i pompę tlenową.
Ustaw cztery zabiegi, z których pierwszy to karmienie bez karmienia, drugi to karmienie liści, trzeci to karmienie kłączy, a czwarty to karmienie przez nacięcie łodygi. Cztery kultury zabiegowe 1 i 2, hoduj sadzonki w normalnym pożywce Hoaglanda. Rozpyl pięć mililitrów 0,2% roztworu glukozy izotopu węgla 13 raz rano, po południu i wieczorem na liście Zabiegu 2.
W przypadku kultur poddanych działaniu substancji 3 i 4 przenieś sadzonki do pożywki Hoaglanda zawierającej 0,2% izotopu węgla 13 glukozy. W przypadku Leczenia 4 użyj skalpela, aby odciąć łodygi od środka, utrzymując nienaruszone wiązki naczyniowe. Pozwól sadzonkom być oznaczonym przez trzy dni ze zmianą pożywki co 1,5 dnia.
Po zakończeniu etykietowania dokładnie umyj zebrane organy roślinne, aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe. Zbieraj liście, łodygi, kłącza i korzenie osobno z każdego zabiegu. Pobrane próbki należy umieścić w odpowiednich kopertach.
Umieść oznaczone koperty w elektrycznym piecu do suszenia strumieniowego o stałej temperaturze. Za pomocą w pełni automatycznego szybkiego młynka do próbek zmiażdż wysuszone próbki na drobny proszek. Zważyć 30 miligramów każdej próbki w proszku i przenieść ją do probówki zawierającej dwa mililitry mieszaniny wody o stężeniu 75% etanolu.
Użyj myjki ultradźwiękowej CNC, aby przeprowadzić ekstrakcję ultradźwiękową w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po końcowej ekstrakcji połącz ze sobą roztwory. Odważyć trzy równoległe próbki.
Następnie rozpuść wysuszone próbki azotu w metanolu chromatycznym do końcowej objętości jednego mililitra. Na koniec przefiltruj próbkę przez filtr fazy organicznej o średnicy 0,22 mikrometra przed analizą spektrometrii mas. Stosunek izotopów węgla 13 do węgla 12 w traktowaniu 3 i 4 był znacznie wyższy niż w przypadku leczenia 2.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową metodę identyfikacji organów odpowiedzialnych za produkcję metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych. Poprzez połączenie znakowania 13C6-Glucose z wysokorozdzielczą spektrometrią mas sprzężoną z chromatografią cieczową, badanie ma na celu pogłębienie naszej wiedzy na temat szlaków syntezy metabolitów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia roślin
Wprowadzenie
- Metabolity wtórne odgrywają kluczową rolę w obronie roślin oraz w zdrowiu ludzi.
- Zrozumienie ich syntezy może prowadzić do lepszego wykorzystania w zastosowaniach medycznych.
- Obecne metody badania tych metabolitów są często ograniczone.
- Postępy w spektrometrii mas stwarzają nowe możliwości analizy.
Cel badania
- Opracowanie uniwersalnej metody identyfikacji organów produkujących metabolity.
- Integracja znakowania glukozą z zaawansowanymi technikami spektrometrii mas.
- Ułatwienie badania dynamiki metabolitów oraz ich znaczenia biologicznego.
Zastosowane metody
- Technika znakowania glukozą 13C6.
- wysokorozdzielcza spektrometria mas sprzężona z chromatografią cieczową (LC-MS).
- Analiza złożonych matryc biologicznych.
- Narzędzia do analizy danych dla pomiarów znakowania izotopami chemicznymi.
Główne wyniki
- Identyfikacja kluczowych organów biorących udział w syntezie metabolitów wtórnych.
- Wgląd w dynamikę produkcji metabolitów.
- Opracowanie wszechstronnej metody możliwej do zastosowania w przypadku różnych roślin leczniczych.
- Potencjał dla przyszłych badań w celu pogłębionego zbadania szlaków metabolicznych.
Wnioski
- Opracowana metoda stanowi podstawę dla przyszłych badań.
- Pozwala ona na lepsze zrozumienie syntezy metabolitów wtórnych.
- Podejście to jest przystępne i może znaleźć szerokie zastosowanie w biologii roślin.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna identyfikacja głównych organów roślinnych odpowiedzialnych za syntezę metabolitów wtórnych jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka przy wyborze celu oraz optymalizacji alokacji zasobów w procesie odkrywania leków z produktów naturalnych. Integracja znakowania 13C6-glukozą z techniką LC-MS umożliwia precyzyjne mapowanie szlaków biosyntetycznych, co zwiększa pewność predykcyjną w zakresie produkcji metabolitów specyficznych dla danego organu. Podejście to wzmacnia ciągłość translacyjną od wczesnej fazy odkrywania po ocenę przedkliniczną terapeutyków pochodzenia roślinnego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę aktywności biosyntetycznej specyficznej dla organu w celu walidacji funkcjonalnej celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie przestrzennego pochodzenia kluczowych metabolitów wtórnych.
- Ułatwia selekcję portfela poprzez rozróżnienie produktywnych od nieproduktywnych źródeł tkankowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy organowe roślin do dalszych etapów kwantyfikacji metabolitów.
- Standaryzuje znakowanie izotopowe i odczyty LC-MS w celu opracowania powtarzalnych analiz.
- Umożliwia wiarygodne porównanie syntezy metabolitów w różnych wariantach doświadczalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie mapowania szlaków biosyntetycznych z celami w postaci metabolitów istotnych dla danej choroby w roślinach leczniczych.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkryć na poziomie organów po walidację przedkliniczną związków bioaktywnych.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju kandydatów na leki pochodzenia roślinnego w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta sytuuje znakowanie izotopowe i analitykę LC-MS na styku wczesnego etapu odkrywania oraz identyfikacji wiodących kandydatów na leki pochodzenia roślinnego.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących syntezy metabolitów specyficznych dla organów oraz lokalizacji szlaków metabolicznych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki stosunków izotopowych w celu przygotowania testów.
- Analityka: Zapewnia pomiary o wysokiej rozdzielczości stosunków 13C/12C oraz rozkładów pików jonów izotopowych.
- Badania translacyjne: Łączy mapowanie biosyntetyczne z przedkliniczną oceną metabolicznie aktywnych substancji farmakologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalny, adaptacyjny schemat pracy dla różnych systemów roślin leczniczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów na poziomie organu i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły znakowania izotopowego i LC-MS w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez skupienie się na produktywnych tkankach biosyntetycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację leadów pochodzenia roślinnego z uwzględnieniem ryzyka na podstawie zwalidowanego pochodzenia biosyntetycznego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie znakowania izotopami stabilnymi oraz analityki LC-MS.
- Wymaga dostępu do wysokorozdzielczej spektrometrii mas oraz infrastruktury do przygotowania próbek.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów znakowania, ekstrakcji i analizy pomiędzy zespołami.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla różnych gatunków roślin lub klas metabolitów.
- Efekty macierzowe oraz złożoność macierzy próbki mogą wpływać na dokładność pomiaru stosunku izotopów.
