Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki
6 września 2024
Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.
Techniki jednocząsteczkowe są potężnymi narzędziami do badania mechaniki, koordynacji i składu układów chromatyny, dlatego naukowcy zawsze szukają lepszych metod generowania substratów nukleosomów. W tym miejscu opisujemy protokół tworzenia nukleosomów w poprzek DNA in situ w mikroskopie siły korelacyjnej i fluorescencji pojedynczej cząsteczki. Zazwyczaj substraty nukleosomów są wytwarzane przez składanie nukleosomów na DNA zawierającym silne sekwencje pozycjonujące za pomocą dializy solnej.
Chociaż ma to zalety, generuje sztucznie stabilne nukleosomy i jest ciężki w odczynnikach. Nasz protokół przygotowuje substraty nukleosomów do mikroskopii siłowej i fluorescencyjnej skorelowanej z pojedynczą cząsteczką bez określonych sekwencji DNA i przy użyciu znacznie mniejszej liczby odczynników, a wszystko to w ciągu kilku minut. Protokół ten umożliwia składanie nukleosomów na natywnych sekwencjach DNA, łatwą regulację gęstości nukleosomów, a także skrócenie czasu przygotowania i użycie odczynników.
Ponadto tworzenie nukleosomalnych pęt DNA in situ umożliwia prostszy przebieg eksperymentów oraz wygodę wbudowanej wizualizacji i manipulacji pojedynczymi cząsteczkami. Gdy jednolite i specyficzne pozycjonowanie nukleosomów nie jest istotną częścią eksperymentu, nasze odkrycia mogą pomóc naukowcom w bardziej efektywnym badaniu chromatyny i jej białek wydobywczych na poziomie pojedynczej cząsteczki. Dzięki zaoszczędzonemu czasowi i zasobom można przeprowadzić więcej eksperymentów w celu dalszego zbadania dodatkowych zmiennych i warunków.
Odpowiednie obszary badawcze, o których obecnie myślimy, obejmują mechanikę chromatyny, która jest regulowana przez warianty histonów i inne modyfikacje potranslacyjne. Zastanawiamy się również nad biofizycznymi zaangażowaniami i kinetyką innych białek wiążących chromatynę. I wreszcie, myślimy również o procesach składania wyższego rzędu napędzanych przez nukleosomy, takich jak kondensacja biomolekularna.
Aby rozpocząć, dodaj 500 mikrolitrów bezbiałkowego bufora obrazu do kanału trzeciego komórki przepływowej. Wymieszaj dwa nanomolary Saccharomyces cerevisiae Nap1 i dwa do pięciu nanomolowców oktamera histonów H4 znakowanego LD655 z 500 mikrolitrami buforu 1XHR. Dodaj tę mieszaninę do kanału czwartego komory przepływowej.
Przepłyń wszystkie kanały pod ciśnieniem 1,0 bara przez 30 sekund, aby przepłukać je próbkami. Ustaw przepływ na 0,2 bara i przesuń pułapki optyczne na kanał 1, aby złapać odpowiednią parę kulek pokrytych streptawidyną. Następnie przesuń pułapki optyczne na kanał 3.
Wyłącz przepływ i przeprowadź kalibrację siły dla pary koralików. Włącz czerwony laser konfokalny i skalibruj obszar obrazowania. Po ustawieniu przepływu na 0,2 bara przesuń pułapki optyczne na kanał 2, aby wychwycić biotynylowane DNA.
Następnie przesuń pułapki optyczne na kanał 3 i zatrzymaj przepływ. Zwiększ odległość między pułapkami optycznymi, aby rozciągnąć DNA i monitoruj powiązaną krzywą wymuszonej odległości, aby potwierdzić obecność pojedynczej uwięzi DNA. Dostosuj odległość między pułapkami optycznymi tak, aby napięcie DNA wskazywało około jednego pikonewtonu.
Włącz skanowanie linii, aby rozpocząć zbieranie kimografu przy włączonym czerwonym laserze. Następnie przenieś pułapki optyczne do kanału 4 z odpływem, aby utworzyć nukleosomy wzdłuż uwięzi DNA. Aby rozpakować nukleosomy, przesuń pułapki optyczne na kanał 3.
Ustawiając odczyt siły na zero i prędkość na 0,1 mikrometra na sekundę, odsuń pułapkę optyczną 1 od pułapki optycznej 2. Wymieszaj 10 nanomoli histonu łącznikowego H1.4 znakowanego Cy3 z 500 mikrolitrami bufora obrazu i dodaj do kanału 5. Po utworzeniu uwięzi DNA zawierającej nukleosomy, włącz zielony laser oprócz czerwonego lasera i przesuń pułapki optyczne do kanału 5, aby obrazować w czasie rzeczywistym wiązanie H1 z chromatyną.
Tworzenie nukleosomów wzdłuż uwięzi DNA zostało zwizualizowane jako stacjonarne czerwone ogniska fluorescencyjne na skanie 2D i kimografie. Analiza fotowybielania wykazała jednoetapowe lub dwuetapowe zdarzenia fotowybielania, wskazujące na obecność mononukleosomów. Pod nieobecność Nap1, oktamer histonowy wiązał DNA, ale pozostawał w większości nieowinięty, na co wskazywało ciągłe napięcie.
Używając H2a znakowanego Cy3, uzyskano podobne wyniki składania nukleosomów, jak w przypadku H4 znakowanego LD655. Odwijanie nukleosomów zwiększało z czasem odległość uwięzi, widoczną na kimografie, i generowało wymuszone krzywe odległości z charakterystycznymi rozdarciami, które oznaczają odwijanie poszczególnych nukleosomów. Wiązanie histonu łącznikowego H1 z chromatyną było wskazane przez zielone ogniska fluorescencyjne z dwukolorowymi trajektoriami stacjonarnymi reprezentującymi wiązanie H1 z nukleosomami i zielonymi postrzępionymi trajektoriami reprezentującymi dyfuzyjne trajektorie H1.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół formowania nukleosomów na DNA in situ dla mikroskopii korelacyjnej sił i fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek. Metoda ta umożliwia montaż nukleosomów na natywnych sekwencjah DNA przy zmniejszonym zużyciu reagentów i czasie przygotowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biologia chromatyny
Tło
- Techniki pojedynczych cząsteczek są niezbędne do badania systemów chromatynowych.
- Tradcyjne metody montażu nukleosomów mogą tworzyć sztucznie stabilne struktury.
- Istnieje potrzeba bardziej wydajnych protokołów, które minimalizują zużycie reagentów.
- To badanie podejmuje ograniczenia istniejących metod przygotowania nukleosomów.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego protokołu montażu nukleosomów na DNA.
- Możliwość wizualizacji białek wchodzących w interakcje z chromatyną.
- Analiza zmian we właściwościach fizycznych nukleosomów.
Stosowane metody
- Formowanie nukleosomów na DNA in situ.
- Mikroskopii korelacyjnej sił i fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek.
- Dostosowanie gęstości nukleosomów na natywnych sekwencjah DNA.
- Zmniejszenie czasu przygotowania i zużycia reagentów.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia efektywny montaż nukleosomów bez wymogu specyficznych sekwencjah DNA.
- Daje możliwość regulacji gęstości nukleosomów.
- Znacząco mniejsze zużycie reagentów w porównaniu do tradcyjnych metod.
- Ułatwia dalsze eksperymenty w celu wizualizacji zachowania wiązania białek.
Wnioski
- Ta metoda poprawia badania systemów chromatynowych przy użyciu technik pojedynczych cząsteczek.
- Oferuje bardziej wydajne podejście do przygotowania nukleosomów.
- Protokół może prowadzić do lepszego zrozumienia dynamiki chromatyny.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient in situ nucleosome assembly for single-molecule force and fluorescence microscopy addresses a key bottleneck in chromatin research by enabling rapid, reagent-sparing substrate preparation. This capability enhances the throughput and flexibility of discovery-stage studies on chromatin mechanics, protein interactions, and higher-order assembly processes. The method supports predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking for chromatin-modifying therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin structure-function relationships under native-like conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing rapid testing of histone variants and post-translational modifications.
- Supports functional target validation for chromatin-binding proteins and epigenetic regulators.
- Improves predictive confidence by minimizing artifacts from artificial nucleosome positioning.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nucleosome substrates for downstream single-molecule screening workflows.
- Enables assay standardization and reproducibility by controlling nucleosome density and composition.
- Reduces reagent consumption, supporting scalable and cost-effective assay development.
- Facilitates reliable evaluation of compound effects on chromatin dynamics and protein binding.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant chromatin states by allowing assembly on native DNA sequences.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation for chromatin-targeted interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative single-molecule readouts.
- Offers predictive de-risking for higher-order chromatin assembly and biomolecular condensation studies.
Pipeline & Workflow Integration
This in situ assembly method integrates at the interface of early discovery and lead identification, streamlining the transition from hypothesis testing to quantitative single-molecule analysis.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing on chromatin mechanics and protein interactions with minimal setup time.
- Screening: Provides reproducible, quantitative nucleosome substrates for compound and protein screening assays.
- Analytics: Delivers force-distance and fluorescence readouts for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports alignment with disease-relevant chromatin configurations when using native DNA templates.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, reagent-efficient platform adaptable across chromatin research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin-targeted research.
- Operational Value: Standardizes nucleosome assembly, improves reproducibility, and minimizes reagent use.
- Strategic Value: Enables more experiments per resource unit, supporting capital-efficient portfolio progression.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of chromatin-modifying targets and modalities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule force and fluorescence microscopy.
- Needs access to optical trapping and confocal imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization for nucleosome density and labeling protocols.
- Adaptable to various DNA templates, but uniform positioning is not guaranteed.
- Best suited for studies where precise nucleosome positioning is not essential.
