Name: Pomiary mikrotwardości kości zęba i wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Poznaj standaryzowany protokół pomiaru mikrotwardości szkliwa, zębiny i kości wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni. Metoda zwiększa wiarygodność badań twardych tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez JSPS KAKENHI JP21K09915 (MO) oraz National Institute of General Medical Sciences; T34GM145509 (MM) oraz Narodowy Instytut Badań Stomatologicznych i Twarzoczaszkowych; R01DE025255 i R21DE032156 (XH); R01DE029709, R21DE028715 i R15DE027851 (TK); R01DE027648 i K02DE029531 (MS).

Wszystkie procedury opisane w niniejszym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami dotyczącymi wykorzystania zwierząt kręgowców, zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Augusta University oraz na Nova Southeastern University, która posiada akredytację Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Należy odnotować, że dr Suzuki był zatrudniony na Augusta University, gdzie ukończono eksperymenty dotyczące fluorozy zębów u myszy.
1. Ekstrakcja siekaczy żuchwy w mysim modelu fluorozy zębów
<ol>
	<li>Podawać myszom C57BL/6 (samce, 5-tygodniowe) dietę wolną od fluorków od tygodnia przed rozpoczęciem podawania fluorków aż do zakończenia ich stosowania.</li>
	<li>Przygotować wodę z fluorkami, dodając NaF do wody destylowanej, a następnie przeprowadzając filtrację próżniową przy użyciu filtra 0,2 µm. Podawać zwierzętom wodę z NaF (0 ppm i 125 ppm; N=5/grupa) ad libitum przez 6 tygodni. Wymieniać wodę z fluorkami na świeżo przygotowaną partię co 2 dni.</li>
	<li>Po 6 tygodniach podawania wody z fluorkami przeprowadzić eutanazję zwierząt za pomocą CO2, a następnie dekapitację.</li>
	<li>Wyekstrahować półżuchwę wraz z siekaczem z każdej myszy. Aby pobrać półżuchwę z siekaczem, należy przeciąć mięśnie wokół żuchwy, nie przykładając nadmiernej siły.</li>
	<li>Umieścić półżuchwę w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy μ-CT (opcjonalnie). Oddzielić siekacz od żuchwy za pomocą skalpela (#15) i nożyczek, uważając, aby nie uszkodzić ani nie złamać preparatu.</li>
	<li>Przemyć wyizolowany siekacz PBS i przeprowadzić dehydratację poprzez zanurzenie go w alkoholu o rosnącym stężeniu (70% i 100% etanolu) przez 2-3 h. 
	UWAGA: Jeśli tkanka (np. miazga) nie zostanie dostatecznie odwodniona, może dojść do zahamowania impregnacji żywicą, co prawdopodobnie uniemożliwi prawidłową późniejszą ocenę.</li>
	<li>Po dehydratacji etanolem zatopić siekacz poziomo w żywicy. Przejść do kroku 3.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja kości jamistych szczęki w mysim modelu resorpcji kości periodontonalnej indukowanej ligaturą (L-PBR)
<ol>
	<li>Podaj myszy (C57BL/6, męska, w wieku 8-12 tygodni) dożylnie (i.p.) 0,8 mL ketaminy (100 mg/mL) + 0,1 mL ksylazyny (100 mg/mL) + 9,1 mL PBS jako środki znieczulające. Dawka wynosi 0,01 mL/g (masy ciała). Na oba oczy nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na podkładce grzewczej na 5-10 min. Oceń reakcje na ucisk ogona/palców oraz sprawność odruchu rogówkowego. Potwierdź, że mysz nie reaguje na bodźce uciskowe, a odruch jest nieobecny.</li>
	<li>Umieść mysz na stole zabiegowym i utrzymaj otwarty pysk za pomocą ligatury z jedwabnej nici chirurgicznej 5-0, przywiązanej do magnetycznego słupka na stole zabiegowym.</li>
	<li>Pod mikroskopem chirurgicznym, używając mikroportań, owiń ligaturę (pleciona nić jedwabna 6-0) wokół jednego z drugich trzonowców szczękowych (jedna warstwa). Aby zminimalizować różnice osobnicze w analizie, jedną stronę wykorzystaj jako stronę traktowaną, a drugą jako kontrolną.</li>
	<li>Zwiąż ligaturę, tworząc węzeł od strony podniebienia. Po zawiązaniu węzła odetnij pozostałą część ligatury tak krótko, jak to możliwe, aby nadmiar nici nie przeszkadzał w żuciu lub jedzeniu. Jest to istotne, aby zapobiec poluzowaniu się ligatury podczas żucia w kolejnym okresie obserwacji. 
	UWAGA: Nie pozostawiaj zwierzęcia bez nadzoru, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję brzuszną. Nie zwracaj zwierzęcia po zabiegu chirurgicznym do grupy pozostałych zwierząt aż do pełnego powrotu do zdrowia. Zachowaj warunki sterylne podczas okresu przeżycia.</li>
	<li>Udostępnij myszom pokarm i wodę ad libitum przez 2 tygodnie. Po 2 tygodniach od ligatury poddaj myszy eutanazji za pomocą CO2, a następnie dekapitacji.</li>
	<li>Wyodrębnij z każdej myszy obie strony szczęk (stronę z ligaturą i stronę kontrolną) wraz z trzonowcami. Aby pobrać szczęki z trzonowcami, przetnij mięśnie i kość wokół żuchwy górnej nożyczkami, nie stosując nadmiernej siły. Umieść każdą szczękę w PBS i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu analizy µCT (opcjonalnie).</li>
	<li>Oddziel kość jamistą z trzonowcami (od 1szego do 3iego) od szczęki za pomocą skalpela (#15) i nożyczek, nie uszkadzając i nie łamiąc preparatu.</li>
	<li>Umyj wyizolowaną kość jamistą w PBS, a następnie odwodnij i odtłuść poprzez zanurzenie w alkoholu o rosnącym stężeniu (etanol 70% i 100%) przez 2-3 h. 
	​UWAGA: Jeśli tkanka (np. miazga i kość) nie zostanie wystarczająco odwodniona, może dojść do zahamowania impregnacji żywicą, a późniejsza ocena może być niewłaściwa.</li>
	<li>Po odwodnieniu etanolem zatop kość jamistą poziomo w żywicy. Przejdź do kroku 3.</li>
	<li>Opcjonalnie: Przeprowadź ocenę µCT przed badaniem mikrotwardości.
	<ol>
		<li>Przed badaniem mikrotwardości wykonaj nieniszczącą analizę strukturalną (np. µCT) przy użyciu tej samej próbki, która zostanie użyta do badania mikrotwardości, jako ocenę uzupełniającą (Rycina 1). Informacje strukturalne (obraz 3D, gęstość mineralna, objętość) uzyskane przez µCT mogą pomóc w ocenie właściwości mechanicznych i jakości próbki, co może wpływać na wyniki mikrotwardości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Analiza gęstości przekroju zęba; efekty działania NaF na zębinę; wyniki tomografii komputerowej; plastry 2D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66583/66583fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy μCT szkliwa w siekaczach myszy z grupy kontrolnej i grupy traktowanej fluorkami. (A) Reprezentatywny obraz μCT w przekroju strzałkowym siekacza żuchwy. (B-D) Obrazy μCT w przekroju czołowym siekacza kontrolnego (NaF 0 ppm). (E-G) Obrazy μCT w przekroju czołowym siekacza traktowanego NaF (125 ppm). Przedstawiono reprezentatywną gęstość mineralną szkliwa (EMD) (g/cm3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66583/66583fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
3. Zatapianie próbek w żywicy
<ol>
	<li>Kontynuuj od kroku 1.7 (model fluorozy zębów) lub kroku 2.10 (model L-PBR).</li>
	<li>Pokryj wewnętrzną powierzchnię uchwytu do zatapiania (1 cal) cienką warstwą wazeliny. Przygotuj żywicę (żywicę do zatapiania utwardzaną na zimno) zgodnie z instrukcją. Wlej żywicę i utwardzacz do dołączonego plastikowego kubeczka w stosunku objętościowym 15:2 i ostrożnie wymieszaj drewnianą szpatułką przez co najmniej 2 min. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Umieść odwodniony i odtłuszczony siekacz (Rycina 2A) lub kość zębodołową z zębami trzonowymi (Rycina 2B) w orientacji poziomej i równolegle do dna uchwytu do zatapiania (1 próbka na uchwyt).</li>
	<li>Wlej wymieszaną żywicę (tylko niezbędną ilość, około 1,5 mL) do uchwytu do zatapiania, aby całkowicie pokryć próbkę. Unikaj dodawania nadmiaru żywicy, ponieważ utrudni to proces polerowania (Rycina 2C,D). Umieść uchwyt z próbką na płycie grzejnej w temperaturze 50 °C na co najmniej 8 h, aby wspomóc polimeryzację żywicy. Procedura ta zapewnia stabilne utrzymanie próbki. 
	UWAGA: W zależności od wielkości próbki dostosuj ilość żywicy tak, aby całkowicie ją pokryć. Nie wlewaj zbyt dużej ilości żywicy, w przeciwnym razie usunięcie jej nadmiaru zajmie więcej czasu.</li>
	<li>Po utwardzeniu wyjmij z uchwytu blok żywicy zawierający próbkę. Usuń nadlewki i wyrównaj płaszczyznę próbki oraz płaszczyznę przeciwległą tak, aby były równoległe i płaskie, używając zaawansowanej szlifierki-polerki z grubym, wodoodpornym papierem ściernym (ziarnistość 60/P60 i 120/P120) przy jednoczesnym chłodzeniu wodą. Utrzymaj wysokość próbki na poziomie około 3 mm dla siekacza i kości zębodołowej (Rycina 2E,F). 
	​UWAGA: Jeśli próbka ma być analizowana za pomocą SEM po pomiarze mikrotwardości, jej grubość powinna wynosić około 3 mm, aby późniejsza obserwacja SEM nie została zakłócona. Mniejsze próbki są trudniejsze w obróbce szlifierką. W przypadku próbek przeznaczonych wyłącznie do pomiaru mikrotwardości wysokość może wynosić około 10-20 mm.</li>
	<li>Przytnij zewnętrzny kształt, aby uzyskać prostokątny blok żywicy z zaokrąglonymi rogami (orientacyjnie: szerokość 30 mm, długość 10 mm dla siekacza (Rycina 2G) oraz szerokość 10 mm, długość 5 mm dla kości zębodołowej (Rycina 2H)) za pomocą precyzyjnej piły tnącej.</li>
	<li>Po zakończeniu wstępnej korekty kształtu usuń zanieczyszczenia i cząsteczki z bloku żywicy za pomocą myjki ultradźwiękowej (około 1 min). Przejdź do kroku 4.</li>
</ol>
<img alt="Zalewanie zęba, proces cięcia; seria schematów; zalewanie żywicą dentystyczną, badanie anatomiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66583/66583fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat procedury zalewania żywicą i polerowania. (A) Odwodniony i odtłuszczony siekacz. (B) Odwodniona i odtłuszczona kość jamkowania w modelu L-PBR. (C, D) Siekacze i kość jamkowania zanurzone w żywicy. (E, F) Poprzez odcięcie nadmiaru żywicy łatwiejsze jest polerowanie powierzchni badanej tkanki. (G, H) Narożniki żywicy zaokrąglone na potrzeby procesu polerowania. Skróty: L-PBR = resorpcja kości przyzębia wywołana przez ligaturę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66583/66583fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Polerowanie próbek
UWAGA: Polerowanie próbek wykonuje się ręcznie, używając wodoodpornych papierów ściernych (od grubszych do drobniejszych), na zaawansowanej polerce-szlifierce przy stałym dopływie wody.
<ol>
	<li>Umieść gruby, wodoodporny papier ścierny (ziarnistość 600/P1200) na szlifierce. Połóż przycięty i oczyszczony blok żywiczny (z kroku 3.7) na papierze ściernym.</li>
	<li>Podlewając wodą, przytrzymaj blok żywiczny i poleruj powierzchnię pomiarową próbki na polerce (prędkość 1-10 x g). W tym czasie należy uważać, aby trzymać blok żywiczny tak, by powierzchnia pomiarowa była równoległa do podłoża. Aby zachować nienaruszoną powierzchnię pomiarową, sprawdzaj ją gołym okiem lub pod mikroskopem. 
	UWAGA: Należy pamiętać, że szlifierka obraca się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a jednostronny nacisk może doprowadzić do powstania powierzchni nierównoległej. Aby uzyskać powierzchnię równoległą, utrzymuj stałą prędkość obrotową szlifierki i ostrożnie dociskaj próbkę przez kilka sekund, a następnie obróć próbkę o 180° i dociskaj przez ten sam czas. Gruby papier ścierny może usuwać nie tylko żywicę, ale również materiał próbki.</li>
	<li>Zmień papier ścierny na ziarnistość 800/P2400 i połóż na nim blok żywiczny. Powtórz krok 4.2.</li>
	<li>Usuń zanieczyszczenia i cząsteczki z bloku żywicznego, używając myjki ultradźwiękowej (ok. 1 min). 
	UWAGA: Przed przejściem dalej zaleca się użycie myjki ultradźwiękowej w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń powierzchniowych, aby zapobiec zapychaniu się materiałów ściernych.</li>
	<li>Następnie przeprowadź polerowanie seryjne, używając coraz drobniejszych papierów ściernych; kolejność polerowania to 12 µm, 9 µm, 3 µm, 1 µm oraz 0.3 µm.</li>
	<li>Umieść folię polerską (12 µm) na stole polerki bez uruchamiania obrotu i połóż na niej blok żywiczny. 
	UWAGA: W tym doświadczeniu stół szlifierki jest odpowiedni do uzyskania płaskiej powierzchni w warunkach zalewania wodą. Alternatywnie można użyć dużego lustra płaskiego (lub podobnego), które zapewnia równoległość.</li>
	<li>Przy chłodzeniu wodnym ostrożnie poleruj ręcznie powierzchnię pomiarową próbki na folii polerskiej. Poruszaj próbką w pionie, poziomie i po przekątnej przez tę samą liczbę sekund przy jednoczesnym podawaniu wody, wykonując ruchy o długości 2 do 3 cm (1 cal). Po prawidłowo przeprowadzonym polerowaniu próbka żywiczna będzie przylegać do folii polerskiej.</li>
	<li>Usuń zanieczyszczenia i cząsteczki zgodnie z krokiem 4.4. Zmień papier ścierny na kolejny rozmiar zgodnie z kolejnością polerowania seryjnego (od 12 µm do 0.3 µm) i połóż na nim blok żywiczny.</li>
	<li>Podlewając wodą, przytrzymaj blok żywiczny i ostrożnie poleruj ręcznie powierzchnię próbki na folii polerskiej. Usuń zanieczyszczenia i cząsteczki zgodnie z krokiem 4.4.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.5 – 4.8, aby zakończyć polerowanie końcowe (0.3 µm). Po zakończeniu polerowania końcowego (0.3 µm) próbka powinna mieć powierzchnię o lustrzanym połysku (Rysunek 3A).</li>
	<li>Oczyść powierzchnię próbki etanolem (100%), aby ją odtłuścić i odwadniać, a następnie przechowuj bloki żywiczne w temperaturze pokojowej do czasu przeprowadzenia testów mikrotwardości. Podczas przechowywania unikaj nadmiernej wilgoci i kurzu. Przejdź do kroku 5.</li>
</ol>
5. Test mikrotwardości Vickersa
UWAGA: Wykonanie wgłębień na próbce o powierzchni lustrzanej przeprowadza się za pomocą twardościomierza mikro$. Badanie wykonuje się pod obciążeniem 25 g przez 10 s przy użyciu wkładki Vickersa.
<ol>
	<li>Test mikrotwardości Vickersa dla siekaczy (model fluorozy zębów) 
	UWAGA: Szkliwo można podzielić na trzy warstwy, licząc od zewnątrz (od strony jamy ustnej) do wewnątrz (od strony miazgi); mianowicie: warstwę powierzchowną, warstwę środkową oraz warstwę głęboką (styk szkliwa z dentyną, DEJ) (Rycina 3B)16W niniejszym protokole przebadano trzy warstwy szkliwa.
	<ol>
		<li>Ustaw siłę obciążenia na 25 g oraz czas obciążania na 10 s. Umieść blok żywiczny na stole.</li>
		<li>Wyznacz 6 punktów w każdej warstwie szkliwa (powierzchniowej, środkowej i w obrębie DEJ) oraz w zębinie w każdym regionie (szyjkowym, środkowym i w obrębie wierzchołka); Rycina 3B).</li>
		<li>Zmierz długość obu przekątnych (d1 i d2); Rysunek 3B) aby obliczyć wartość mikrotwardości Vickersa (HV; Rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie mikrotwardości Vickersa dla kości jamistej wyrostka zębodołowego (model L-PBR)
	<ol>
		<li>Ustaw siłę obciążenia na 25 g oraz czas obciążania na 10 s. Umieść blok żywiczny na stole preparatu.</li>
		<li>Wykonaj wgłębienia w 3–6 punktach po stronie mezjalnej i dystalnej kości jamowej, licząc od grzebienia żuchwowego. Wykonaj wgłębienia w kościach jamowych pomiędzy 1Proszę podać tekst źródłowy, który należy przetłumaczyć. oraz 2nd trzonowiec (biały kwadrat) oraz 2nd oraz 3rd molarne 
		UWAGA: W niniejszym protokole w przypadku kości kontrolnej (nienaruszonej) oceniono po 6 punktów po stronie bliższej i dalszej (łącznie 12 punktów), a w przypadku L-PBR po 3 punkty po każdej stronie (łącznie 6 punktów). Liczba punktów wżyleń zależy od stanu zmiany chorobowej (np. zbyt duża utrata tkanki kostnej ogranicza obszar wykonywania wżyleń).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Analiza szkliwa zębowego; schemat z badaniem mikrotwardości, z oznakした strefami: szyjkową, środkową i wierzchołkową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66583/66583fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obszary oceny mikrotwardości w siekaczu żuchwy. (A) Próbka powierzchni o polerze lustrzanym zawierająca siekacz żuchwy. (B) Odciski w każdym regionie: szyjkowym, środkowym i wierzchołkowym (NaF 0 ppm). (C) Trzy warstwy szkliwa: od DEJ, szkliwo wewnętrzne, środkowe i zewnętrzne. Skróty: D = dentyna, E = szkliwo, DEJ = granica szkliwno-zębinowa <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66583/66583fig03largev2.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe analizy mikrotwardości Vickersa porównujące stężenia NaF w obszarach szkliwa i zębiny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66583/66583fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Mikrotwardość Vickersa szkliwa traktowanego NaF lub nietraktowanego. Oceńiono mikrotwardość zębiny i trzech warstw szkliwa w każdym z obszarów: szyjkowym, środkowym i w obrębie wierzchołka. (A-C) grupa kontrolna i (D-F) traktowanie NaF (125 ppm). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Istotność różnic oceniono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Tukeya. Wartości p &lt; 0,05 uznano za istotne statystycznie. **p &lt; 0,005, ***p &lt; 0,0005, ****p &lt; 0,0001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66583/66583fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Microhardness Protocol for Evaluating Rodent Oral Disease

<ol><li>Broitman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentation+hardness+measurements+at+macro-%2C+micro-%2C+and+nanoscale%3A+A+critical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Tribol+Lett%22%5BJournal%5D)">Indentation hardness measurements at macro-, micro-, and nanoscale: A critical overview.</a> Tribol Lett. 65 (1), 23(2017).</li>
<li>Lee, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirt6+activation+ameliorates+inflammatory+bone+loss+in+ligature-induced+periodontitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Sirt6 activation ameliorates inflammatory bone loss in ligature-induced periodontitis in mice.</a> Int J Mol Sci. 24 (13), 10714(2023).</li>
<li>Min, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+on+the+gradient+nanomechanical+behavior+of+dental+fluorosis+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res+Lett%22%5BJournal%5D)">Investigation on the gradient nanomechanical behavior of dental fluorosis enamel.</a> Nanoscale Res Lett. 13 (1), 347(2018).</li>
<li>Craig, R. G., Peyton, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+micro-hardness+of+enamel+and+dentin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The micro-hardness of enamel and dentin.</a> J Dent Res. 37 (4), 661-668 (1958).</li>
<li>Chun, K., Choi, H., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mechanical+property+and+role+between+enamel+and+dentin+in+the+human+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Biomech%22%5BJournal%5D)">Comparison of mechanical property and role between enamel and dentin in the human teeth.</a> J Dent Biomech. 5, (2014).</li>
<li>Suzuki, M., Everett, E. T., Whitford, G. M., Bartlett, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-phenylbutyrate+mitigates+fluoride-induced+cytotoxicity+in+alc+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">4-phenylbutyrate mitigates fluoride-induced cytotoxicity in alc cells.</a> Front Physiol. 8, 302(2017).</li>
<li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+dental+fluorosis+in+mmp20+%2B%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of dental fluorosis in mmp20 +/- mice.</a> J Dent Res. 90 (6), 788-792 (2011).</li>
<li>Wu, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+hardness+of+different+anatomical+regions+of+human+radius+and+its+impact+on+the+pullout+strength+of+screws%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Surg%22%5BJournal%5D)">Bone hardness of different anatomical regions of human radius and its impact on the pullout strength of screws.</a> Orthop Surg. 11 (2), 270-276 (2019).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+of+human+skeleton+hardness+obtained+using+the+micro-indentation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Surg%22%5BJournal%5D)">Atlas of human skeleton hardness obtained using the micro-indentation technique.</a> Orthop Surg. 13 (4), 1417-1422 (2021).</li>
<li>Ibrahim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hardness+an+important+indicator+of+bone+quality%2C+and+the+role+of+collagen+in+bone+hardness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Hardness an important indicator of bone quality, and the role of collagen in bone hardness.</a> J Funct Biomater. 11 (4), 85(2020).</li>
<li>Vandana, K. L., Srishti Raj, B., Desai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+fluorosis+and+periodontium%3A+An+original+research+report+of+in+vitro+and+in+vivo+institutional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Trace+Elem+Res%22%5BJournal%5D)">Dental fluorosis and periodontium: An original research report of in vitro and in vivo institutional studies.</a> Biol Trace Elem Res. 199 (10), 3579-3592 (2021).</li>
<li>Xia, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarriers+containing+%26%2334%3Bhypoxia-engine%26%2334%3B+for+simultaneous+enhanced+osteogenesis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Microcarriers containing &#34;hypoxia-engine&#34; for simultaneous enhanced osteogenesis and angiogenesis.</a> Chemical Engineering Journal. 456, 141014(2023).</li>
<li>Chiu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+biglycan+on+physico-chemical+properties+of+ligament-mineralized+tissue+attachment+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of biglycan on physico-chemical properties of ligament-mineralized tissue attachment sites.</a> Arch Oral Biol. 57 (2), 177-187 (2012).</li>
<li>Leong, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+adaptation+of+bone-pdl-tooth+complex%3A+Rattus-norvegicus+as+a+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Age-related adaptation of bone-pdl-tooth complex: Rattus-norvegicus as a model system.</a> PLoS One. 7 (4), e35980(2012).</li>
<li>Johnson, W. M., Rapoff, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microindentation+in+bone%3A+Hardness+variation+with+five+independent+variables%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">Microindentation in bone: Hardness variation with five independent variables.</a> J Mater Sci Mater Med. 18 (4), 591-597 (2007).</li>
<li>Kweon, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fam83h+overexpression+on+enamel+and+dentine+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of fam83h overexpression on enamel and dentine formation.</a> Arch Oral Biol. 58 (9), 1148-1154 (2013).</li>
<li>Boivin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mineralization+and+organic+matrix+in+the+microhardness+of+bone+tissue+from+controls+and+osteoporotic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The role of mineralization and organic matrix in the microhardness of bone tissue from controls and osteoporotic patients.</a> Bone. 43 (3), 532-538 (2008).</li>
<li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+evaluation+of+the+mineralized+apical+barrier+induced+by+a+calcium+hydroxide+paste+containing+iodoform%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endod%22%5BJournal%5D)">Microstructural evaluation of the mineralized apical barrier induced by a calcium hydroxide paste containing iodoform: A case report.</a> J Endod. 2 (2), 243-251 (2024).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B10+cells+alleviate+periodontal+bone+loss+in+experimental+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">B10 cells alleviate periodontal bone loss in experimental periodontitis.</a> Infect Immun. 85 (9), e00335(2017).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nlrp3+regulates+alveolar+bone+loss+in+ligature-induced+periodontitis+by+promoting+osteoclastic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Nlrp3 regulates alveolar bone loss in ligature-induced periodontitis by promoting osteoclastic differentiation.</a> Cell Prolif. 54 (2), e12973(2021).</li>
<li>Robinson, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+mice+with+elevated+c-type+natriuretic+peptide-dependent+guanylyl+cyclase-b+activity+have+increased+osteoblasts%2C+bone+mass+and+bone+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Male mice with elevated c-type natriuretic peptide-dependent guanylyl cyclase-b activity have increased osteoblasts, bone mass and bone strength.</a> Bone. 135, 115320(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Mikrotwardość jest wykonywana w celu oceny właściwości mechanicznych tkanek twardych, takich jak zęby i kości. Do tej pory opisano rozbieżne metody pomiaru mikrotwardości. Większość informacji pomiarowych, zwłaszcza przygotowanie próbek i miejsca wgłębień, może być niewystarczająca. Badanie to koncentrowało się na protokole mikrotwardości szkliwa i kości wyrostka zębodołowego w modelach fluorozy zębów i chorób przyzębia. Aby uzyskać spójne i dokładne wyniki, krytycznymi krokami w tym protokole są orientacja próbki w zatapianiu żywicy, utrzymywanie powierzchni oceny równolegle do podłoża, seryjne polerowanie powierzchni oceny w celu uzyskania lustrzanego wykończenia oraz obszary i miejsca wgłębień ustawione przez punkt odniesienia. Podczas procedur zatapiania i polerowania żywicy ważne jest, aby sprawdzić, czy powierzchnia oceny jest stale równoległa do podłoża, a powierzchnia jest nienaruszona na oko lub pod mikroskopem. Chociaż jest to opcjonalne, zachęca się do analizy μCT w celu określenia miejsc wgłębień.
W modelu fluorozy zębów leczenie NaF (125 ppm) utrudniało identyfikację struktury szkliwa od odcinka szyjki macicy do obszaru środkowego za pomocą μCT. Od zębiny można było odróżnić tylko szkliwo w okolicy końcówki (ryc. 1 i ryc. uzupełniający 1). Dlatego, aby ocenić mikrotwardość szkliwa w modelu fluorozy zębów, odpowiednie jest wgłębienie w obszarze końcówki. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami oceniano obszar końcówki szkliwa siekaczy w modelach fluorozy zębów 6,7. W modelu choroby przyzębia obserwacja 3D za pomocą μCT pomaga zidentyfikować resorpcję kości zarówno po stronie policzkowej, jak i podniebiennej (ryc. 5). Ma to kluczowe znaczenie dla zrozumienia wielkości ubytku kości i anatomicznego położenia kości wyrostka zębodołowego w celu określenia spójnych miejsc wgłębień dla mikrotwardości.
Poprzednie badanie wykazało pozytywną korelację między mikrotwardością a gęstością mineralną17. Nasze wyniki EMD za pomocą μCT i mikrotwardości szkliwa (HV; Rysunek 1 i Rysunek 4) są zgodne z badaniem. Wyniki te sugerują, że przybliżoną tendencję mikrotwardości można przewidzieć za pomocą μCT w sposób nieniszczący. Jednak gradientowe różnice w mikrotwardości między trzema warstwami szkliwa (rysunek 4B, C, F) są trudne do zidentyfikowania jako gradienty EMD za pomocą analizy μCT. W związku z tym badanie mikrotwardości można uznać za wyższą rozdzielczość niż μCT w celu wyjaśnienia stanów patologicznych. Protokół ten można również stosować do innych twardych tkanek zębów, w tym zębiny. Korzystając z tej samej próbki, wieloaspektowa ocena (SEM, SEM-EDX, mikro-XRF i spektroskopia Ramana) może zostać włączona do przepływu eksperymentalnego przed wgłębieniami mikrotwardości18. Ponieważ wgłębienia uszkadzają próbki, zacznij od badania nieniszczącego.
Jednym z krytycznych ograniczeń badania mikrotwardości jest to, że podczas przygotowywania próbki i wgłębiania na jej wartość ma wpływ kilka czynników. Aby zminimalizować czynniki subiektywne, konieczna jest optymalizacja miejsc wgłębień i standaryzacja protokołów pomiarowych, które są odpowiednie dla każdego stanu patologicznego lub modelu choroby. W tym badaniu zademonstrowaliśmy protokół mikrotwardości szkliwa dla modelu fluorozy zębów. Jednak modyfikacja i/lub optymalizacja protokołu może być konieczna w przypadku innych hipoplazji szkliwa, np. modelu amelogenesis imperfecta (AI), ponieważ patologia różni się w każdym modelu choroby. W modelu choroby przyzębia kość wyrostka zębodołowego jest główną tkanką docelową. Modele L-PBR mają duże zastosowanie w zakresie stosowania technik modyfikacji genetycznej u myszy. Do tej pory opublikowano wiele badań nad modelami L-PBR 19,20 . Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, żadne z badań nigdy nie dotyczyło mikrotwardości kości wyrostka zębodołowego w mysich modelach chorób przyzębia. Można to przypisać kilku czynnikom. Związek między mikrotwardością kości wyrostka zębodołowego a chorobami przyzębia nie jest jeszcze jasny. Test mikrotwardości jest technicznie trudny do wykonania w kości wyrostka zębodołowego myszy, zwłaszcza w zmianach resorpcyjnych kości (ze względu na trudności z ustaleniem miejsc wgłębień z powodu zniszczenia kości). Uzasadnione jest założenie, że ten ostatni czynnik jest czynnikiem, dla którego mikrotwardość nie została oceniona w modelach chorób przyzębia, mimo że wartość mikrotwardości jest zwalidowana jako parametr mechaniczny w kości udowej i innych kościach21. Ten ustandaryzowany protokół może ocenić właściwości mechaniczne kości wyrostka zębodołowego dotkniętej chorobą przyzębia i/lub model powrotu do zdrowia.
W tym raporcie przedstawiamy znormalizowany protokół oceny mikrotwardości szkliwa i kości wyrostka zębodołowego w modelu choroby jamy ustnej myszy. Otwiera to drzwi do przyszłej oceny utraty/regeneracji szkliwa i kości przyzębia w celu opracowania nowych strategii profilaktycznych i terapeutycznych w przypadku wad rozwojowych szkliwa i chorób przyzębia.

Twardość jest jedną z właściwości mechanicznych (np. elastyczność, twardość, lepkosprężystość i zachowanie przy pękaniu) i jest powszechnie używana do scharakteryzowania odporności na odkształcenia ściskające i pękanie lokalnego obszaru materiału. Test twardości statycznej wgłębienia jest najczęściej stosowaną metodą, w tym twardość Vickersa i twardość Knoopa1. Test twardości Vickersa jest realizowany poprzez wciśnięcie wgłębnika diamentowego w powierzchnię pod ustalonym obciążeniem testowym. Wgłębnik ma kształt piramidy, z kwadratową podstawą i kątem 136° między przeciwległymi powierzchniami. Mierzy się długość obu przekątnych utworzonych na badanej powierzchni, a średnią wykorzystuje się do obliczenia twardości, która jest określana przez stosunek F/A (gdzie F to siła, a A to pole powierzchni wgłębienia). Liczba mikrotwardości Vickersa (HV=F/A) jest zwykle wyrażana w kilogramach-siłach (kgf) na mm2 wgłębienia, przy czym 1 HV ≈ 0,1891 F/d2 (N / mm2). Twardość Knoopa składa się również z wgłębnika w kształcie rombu w kształcie kwadratu utworzonego przez dwa nierówne przeciwstawne kąty. Liczba twardości Knoopa (HK) jest równa stosunkowi przyłożonego obciążenia do rzutowanej powierzchni styku. Testy twardości dzielą się na testy mikrotwardości (mikrotwardości) i testy makrotwardości, w zależności od siły przyłożonej do badanego materiału. Testy mikrotwardości zazwyczaj wykorzystują obciążenia w zakresie 0,01-2 N (około 1-203 gf); tymczasem testy makro-wcięć używają ponad 10 N (10119 gf)1.
Do oceny cech twardych tkanek zębów w chorobach jamy ustnej, w tym kości zębów i wyrostka zębodołowego, do analizy strukturalnej stosuje się mikro-CT (μCT) i skaningową mikroskopię elektronową (SEM). μCT dostarcza informacji o obrazowaniu 3D (objętość i gęstość mineralna)2, a SEM tworzy obrazy mikrostruktury (pryzmat szkliwa i kość lacuna-kanalikowa)3. Równolegle do analizy strukturalnej za pomocą μCT i SEM, mikrotwardość jest jednym z parametrów informacyjnych do oceny, w jaki sposób zmiany strukturalne zmieniają właściwości mechaniczne kości zębów i wyrostka zębodołowego w chorobach jamy ustnej, np. wadach rozwojowych szkliwa i resorpcji kości przyzębia. Wartość mikrotwardości Vickersa ludzkiego szkliwa (HV = 283-374) jest około 4 do 5 razy wyższa niż zębiny (HV = 53-63)4,5. W modelach fluorozy zębów gryzoni mikrotwardość szkliwa znacznie zmniejsza się u siekaczy myszy traktowanych fluorem (HV = 136) w porównaniu ze szkliwem kontrolnym (HV = 334)6,7. Sugeruje to, że szkliwo fluorozowane jest bardziej miękkie i słabsze przy niższej zawartości minerałów i wyższej zawartości białka niż w szkliwie niefluorozowanym. Mikrotwardość służy do oceny właściwości mechanicznych kości. W kilku wcześniejszych badaniach analizowano mechaniczne zachowanie ludzkiej kości z różnych miejsc anatomicznych, w tym mikrotwardości kości długich8,9,10. Średnia mikrotwardość ludzkich fluorozowanych kości udowych wykazała znaczny spadek (HV = 222,4) w porównaniu z niefluorozowanymi kośćmi udowymi (HV = 294,4)11. Pomimo tego, że jest to użyteczny parametr, istnieje niedobór literatury opisującej mikrotwardość (albo Vickers12, albo Knoop13,14) kości wyrostka zębodołowego w chorobach jamy ustnej.
Do tej pory zgłoszono rozbieżne metody pomiaru mikrotwardości. Ponieważ wartości mikrotwardości różnią się15 w zależności od przygotowania próbki (polerowanie i płaska powierzchnia) oraz miejsca wgłębienia, różne protokoły mogą powodować rozbieżności między badaniami. Standaryzacja protokołu badania mikrotwardości jest niezbędna do spójnej i dokładnej oceny w modelach chorób jamy ustnej. W niniejszym badaniu przedstawiono ustandaryzowany protokół analizy mikrotwardości kości zęba i wyrostka zębodołowego w mysim modelu fluorozy zębów i modelu resorpcji kości przyzębia.

<table><tbody><tr><td>Pleciony szew jedwabny 6-0</td><td>Teleflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canica System chirurgii małych zwierząt</td><td>Kent Scientific Corporation&nbsp;</td><td>SURGI 5001</td><td></td></tr><tr><td>CarbiMet PSA 120/P120</td><td>Buehler</td><td>30080120</td><td></td></tr><tr><td>CarbiMet PSA 60/P60</td><td>Buehler</td><td>36080060</td><td></td></tr><tr><td>CarbiMet PSA 600/P1200</td><td>Buehler</td><td>36080600</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Micro Needle hilder</td><td>FST</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>Epofix do zatapiania na zimno</td><td>Żywica Mikroskopia elektronowa Science</td><td>CAT-1237</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowana myjka ultradźwiękowa serii Fisherbrand 112xx</td><td>Marka</td><td>Fisher FB11201</td><td></td></tr><tr><td>Dieta dla gryzoni bez fluoru</td><td>Bio Serv</td><td>F1515</td><td>&nbsp; AIN-76A, 1/2" Granulki</td></tr><tr><td>in-vivo microCT Skyscan 1176</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isomet 1000 Precison piła</td><td>Buehler</td><td>MA112180</td><td></td></tr><tr><td>Folia docierająca 0,3 i mikro; m</td><td>Maruto instrument co, LTD. Japonia</td><td>26-4203</td><td>Alternatywa&nbsp; A3-0,3 SHT, 3M USA</td></tr><tr><td>Folia docierająca 1 i mikro; m</td><td>Maruto instrument co, LTD. Japonia</td><td>26-4206</td><td>Alternatywa A3-1 SHT, 3M USA</td></tr><tr><td>Folia docierająca 12 i mikro; </td><td>m Maruto instrument co, LTD. Japonia</td><td>26-4211</td><td>Alternatywa A3-12 SHT, 3M USA</td></tr><tr><td>Folia docierająca 3 i mikro; m</td><td>Maruto instrument co, LTD. Japonia</td><td>26-4204</td><td>Alternatywa A3-3 SHT, 3M USA</td></tr><tr><td>Folia docierająca 9&micro; m</td><td>Maruto instrument co, LTD. Japonia</td><td>26-4201</td><td>Alternatywa A3-9 SHT, 3M USA</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica&nbsp;</td><td>Leica</td><td>LEIC M690</td><td></td></tr><tr><td>Metaserv 2000 Szlifierka o zmiennej prędkości obrotowej</td><td>Buehler</td><td>Nr: 557-MG1-1160</td><td></td></tr><tr><td>MicroCut PSA 1200/P2500</td><td>Buehler</td><td>36081200</td><td></td></tr><tr><td>MicroCut PSA P4000</td><td>Buehler</td><td>36084000</td><td></td></tr><tr><td>Tester mikrotwardości, ALPHA-MHT-1000Z&nbsp;</td><td>PACE Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SamplKups &nbsp; 1 cal</td><td>Buehler</td><td>Nr: 209178</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S299-100</td><td></td></tr><tr><td>West cott Nożyczki do ściegu</td><td>JEDMED</td><td>Kat. #25-1180</td><td></td></tr><tr><td>ZooMed Repti Thern Podgrzewacz podzbiornika (UTH)</td><td>Zoo Med Laboratories, Inc.</td><td>RH-4</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiary mikrotwardości kości zęba i wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni

Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models

Właściwość mechaniczna, mikrotwardość, jest oceniana w szkliwie zębów, zębinach i kościach w modelach chorób jamy ustnej, w tym fluorozy zębów i paradontozy. Mikrotomografia komputerowa (μCT) dostarcza informacji o obrazowaniu 3D (objętość i gęstość mineralna), a skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) tworzy obrazy mikrostruktury (szkliwo i kanalik kostny). Równolegle do analizy statyczno-wytrzymałościowej za pomocą μCT i SEM, mikrotwardość jest jednym z parametrów informacyjnych do oceny, w jaki sposób zmiany strukturalne wpływają na właściwości mechaniczne. Pomimo tego, że jest to użyteczny parametr, badania nad mikrotwardością kości wyrostka zębodołowego w chorobach jamy ustnej są ograniczone. Do tej pory opisano rozbieżne metody pomiaru mikrotwardości. Ponieważ wartości mikrotwardości różnią się w zależności od przygotowania próbki (polerowanie i płaska powierzchnia) oraz miejsc wgłębień, różne protokoły mogą powodować rozbieżności między badaniami. Standaryzacja protokołu mikrotwardości jest niezbędna do spójnej i dokładnej oceny w modelach chorób jamy ustnej. W niniejszej pracy przedstawiono ustandaryzowany protokół analizy mikrotwardości kości zęba i wyrostka zębodołowego. Użyte próbki są następujące: w przypadku modelu fluorozy zębów siekacze pobrano od myszy leczonych wodą zawierającą fluor / bez niej przez 6 tygodni; dla modelu resorpcji kości przyzębia indukowanej podwiązaniem (L-PBR) kości wyrostka zębodołowego z resorpcją kości przyzębia pobrano od myszy podwiązanych na 2. zębietrzonowe szczęki. Po 2 tygodniach od podwiązania pobrano szczękę. Twardość Vickersa analizowano w tych próbkach zgodnie ze znormalizowanym protokołem. Protokół zawiera szczegółowe materiały i metody zatapiania żywicy, seryjnego polerowania i miejsc wgłębień siekaczy i wyrostka zębodołowego. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwszy standaryzowany protokół mikrotwardości do oceny właściwości mechanicznych kości zębów i wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni.

Model fluorozy zębów: Rycina 1 przedstawia reprezentatywne obrazy μCT siekaczy u myszy kontrolnych oraz myszy traktowanych fluorkami. W grupie kontrolnej (Rycina 1B-D) obszar szyjkowy wykazał niższą gęstość mineralną szkliwa (EMD) wynoszącą 1,188 g/cm3 (Rycina 1B) w porównaniu do obszaru środkowego (1,924 g/cm3) oraz wierzchołka (1,819 g/cm3; Rycina 1C,D). W szkliwie traktowanym fluorkami (Rycina 1E-G) tylko jedna z pięciu próbek została poddana ocenie EMD w obszarze szyjkowym (0,835 g/cm3; Rycina 1E oraz Rycina uzupełniająca 1). EMD we wszystkich obszarach uległa obniżeniu w porównaniu z grupą kontrolną (Rycina 1F,G). Niskie poziomy EMD były zgodne z niskimi wartościami mikrotwardości szkliwa. Jak pokazano na Rycynie 3, wykonano wcięcia w sześciu punktach w obrębie zębiny oraz trzech warstwach szkliwa (wewnętrznej, środkowej i zewnętrznej) w obszarach szyjkowym, środkowym i wierzchołkowym. W grupie kontrolnej mikrotwardość każdej warstwy szkliwa w obszarze szyjkowym była niższa niż w zębinie (Rycina 4A). W obszarach środkowym i wierzchołkowym mikrotwardość każdej warstwy szkliwa była znacznie wyższa niż mikrotwardość zębiny (Rycina 4B,C). W obrębie trzech warstw szkliwa mikrotwardość wzrastała od warstwy wewnętrznej do zewnętrznej w każdym z obszarów środkowego i wierzchołkowego (Rycina 4B,C). Zębina miała wartość mikrotwardości około 100 HV z niewielkimi różnicami w obszarach szyjkowym, środkowym i wierzchołkowym, podczas gdy mikrotwardość szkliwa znacząco różniła się w zależności od obszaru oraz trzech warstw szkliwa. Wyniki te sugerują, że mikrotwardość szkliwa różni się istotnie w zależności od miejsca wykonania wcięcia (obszaru i warstwy szkliwa). W zębie traktowanym fluorkami, w przeciwieństwie do grupy kontrolnej, mikrotwardość szkliwa była niższa niż zębiny nawet w obszarze środkowym (Rycina 4E). W obszarze wierzchołkowym mikrotwardość znacząco spadała od wewnętrznej do zewnętrznej warstwy szkliwa (Rycina 4F). Te różnice gradientu mikrotwardości między warstwami szkliwa są trudne do oceny na podstawie obrazów μCT.
model L-PBR: Rysunek 5A pokazuje μCT obrazy kości jamistej w modelu resorpcji kości okresu dziąsłowego indukowanej przez ligaturę (L-PBR). Reprezentatywna gęstość mineralna kości (BMD) (średnia z powierzchni przyśrodkowej i bocznej kości jamistej wokół drugiego trzonowca) wynosiła 0,76 g/cm³3 w kości kontrolnej i 0,61 g/cm3 w L-PBR. Poziomy resorpcji kości określono na podstawie odległości od połączenia cemento- emulatejnego (CEJ) do krawędzi grzebienia kostnego wyrostka zębodołowego (ABC). Długość CEJ-ABC była istotnie zwiększona w L-PBR w porównaniu z kością kontrolną (Rycina 5B). Rycina 6 pokazuje miejsca wżerów mikro twardości oraz odpowiadające im μCT obrazy. Od grzebienia kości jamistej wykonano pięć wcięć po każdej stronie przyśrodkowej i dystalnej (łącznie 10 miejsc) w kości kontrolnej pomiędzy 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. i 2nd zęb trzonowy zaznaczony białym kwadratem (Rysunek 6A). Trzy wcięcia po stronie bliższej i dalszej każdego zęba (łącznie 6 miejsc) zmierzono w L-PBR (Rysunek 6B). Wartości mikrotwardości Vickersa (HV) stanowiły średnią z wcień w kościach jamistych między 1Proszę podać tekst do tłumaczenia. oraz 2nd molarne (Rycina 6B; biały kwadrat), a pomiędzy 2nd i 3rd molarne (Rysunek 6B; niebieski kwadrat). Wartości BMD i HV kości jamistej wykazały tendencję spadkową w grupie L-PBR (dotkniętej chorobami okresu) w porównaniu z kontrolną (zdrową) kością jamistą.
<img alt="Analiza gęstości zębów; obrazy mikro-CT i wykres słupkowy porównujący wyniki grupy kontrolnej z grupą leczoną L-PBR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66583/66583fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywny obraz μCT oraz utrata kości w modelu L-PBR. (A) Reprezentatywne obrazy μCT w modelu L-PBR (grupa kontrolna i grupa L-PBR). Przedstawiono reprezentatywną gęstość mineralną kości (BMD; średnia ze stron mezjalnej i dystalnej kości jamistej wokół drugiego trzonowca) (g/cm3). (B) Odległość od mezjalnego i dystalnego CEJ drugiego trzonowca szczękowego do grzebienia kości jamistej w kierunku wierzchołkowym korzenia. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Istotność różnic oceniono za pomocą testu t. Wartości p &lt; 0,05 uznano za istotne statystycznie. **** p &lt; 0,0001. Skróty: L-PBR = resorpcja kości periodontalnej indukowana ligaturą; CEJ = połączenie cemento-emaliowe, ABC = grzebień kości jamistej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66583/66583fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa struktury kości, wartości twardości, z obrazowaniem szczegółowym; badanie porównawcze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66583/66583fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6Reprezentatywne wyniki mikrotwardości w modelu L-PBR. Reprezentatywne zdjęcia strony policzkowej miejsc wciskania (po lewej) oraz odpowiadające im μCT obraz (po prawej) przedstawiający (A) kontrolować kość jamną i (B) L-PBR. Białe kwadraty wskazują obszary wgnieceń w kości jamowej między M1 a M2. Niebieskie kwadraty wskazują obszary wgnieceń w kości jamowej między M2 a M3. Wartości mikrotwardości (HV) stanowią średnie z wgnieceń w obszarach oznaczonych białymi i niebieskimi kwadratami. M1: 1st molarne, M2: 2nd mola, M3: 3rd trzonowy. Skróty: L-PBR = resorpcja kości periodontu indukowana ligaturem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66583/66583fig06large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Rycina uzupełniająca 1: obraz μCT szkliwa poddanego działaniu NaF (przekrój wieńcowy). NaF (125 ppm) spowodował hipomineralizację szkliwa, która była szczególnie wyraźna w obszarach szyjkowych i środkowych. Tylko jedna próbka (próbka nr 1) z pięciu ledwo wykazywała obecność szkliwa w obszarach szyjkowych i środkowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66583/Fig%20S1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Mikrotwardość jest właściwością mechaniczną i parametrem informacyjnym do oceny patofizjologii tkanek twardych. Tutaj demonstrujemy znormalizowany protokół (przygotowanie próbki, polerowanie, płaska powierzchnia i miejsca wgłębień) do analizy mikrotwardości kości zębów i wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni, a mianowicie fluorozy zębów i resorpcji kości przyzębia wywołanej ligaturą.

Pomiary mikrotwardości kości zęba i wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni

The mechanical property, microhardness, is evaluated in dental enamel, dentin, and bone in oral disease models, including dental fluorosis and ...

W tym badaniu skupiliśmy się na ustaleniu dokładnych i spójnych testów mikrotwardości. Badanie mikrotwardości jest metodą tradycyjną. Na razie jednak metodologia ta nie jest wystarczająco opisana we wcześniejszych publikacjach.Jak wykazaliśmy w wyniku, natychmiastowa redukcja mikrotwardości zależy od miejsc wgłębień w wewnętrznej, środkowej i zewnętrznej warstwie szkliwa. Nasze wyniki sugerują, że miejsce wgłębienia jest ważne, aby zachować dokładne i spójne wyniki. Luka naukowa polega na tym, że wcześniejsze badania nie były wystarczająco opisane w metodach badania mikrotwardości, zwłaszcza w miejscach zmienności.Z tego powodu wyniki mikrotwardości nie są spójne między badaniami. Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy ten protokół w celu dokładnej i skutecznej oceny. Nasz ustalony protokół przyczyni się do postępu w testowaniu zmineralizowanych tkanek w szkliwie, zębinie i kości wyrostka zębodołowego w chorobach przyzębia, resorpcji kości i wszystkich modelach inwazji kości nowotworowych.Skupimy się na tym, jak czynniki środowiskowe wpływają na patologię zębowo-twarzową. Na przykład fluor i fluoroorganiczne PFAS. PFAS to wieczne chemikalia wytworzone przez człowieka.Nasz protokół mikrotwardości przyczyni się do oceny, w jaki sposób PFAS wpływają na właściwości mechaniczne tkanek mineralnych w rozwoju zębów, resorpcji kości przyzębia i inwazji kości raka jamy ustnej. Na początek pokryj wewnętrzną powłokę miseczki montażowej cienką warstwą wazeliny. Wlej żywicę i utwardzacz do plastikowego kubka.Użyj drewnianej szpatułki, aby ostrożnie wymieszać żywicę i utwardzacz przez co najmniej dwie minuty bez tworzenia się pęcherzyków. Następnie umieść próbki dentystyczne w orientacji poziomej równolegle do dolnej części miseczki montażowej. Wlej zmieszaną żywicę do kubka, aby przykryć próbkę.Teraz umieść kubek montażowy zawierający próbkę na płycie grzejnej w temperaturze 50 stopni Celsjusza na co najmniej osiem godzin. Po utwardzeniu żywicy usuń żywicę wraz z próbką z kubka montażowego. Usuń zadziory.Użyj zaawansowanej szlifierki i polerki z szorstkim, wodoodpornym papierem ściernym, aby ułożyć płaszczyznę próbki i przeciwną płaszczyznę boczną jako równoległą i płaską pod zalaniem wodą. Za pomocą precyzyjnej piły do cięcia przytnij zewnętrzny kształt bloku żywicy, aby uzyskać prostokąt z zaokrąglonymi rogami. Następnie użyj myjki ultradźwiękowej, aby usunąć zanieczyszczenia i cząstki z bloku.Aby wypolerować blok, umieść szorstki wodoodporny papier ścierny na szlifierce. Przenieś blok na papier ścierny. Teraz przytrzymaj blok i zalej go wodą.Jednocześnie wypoleruj powierzchnię oceny próbki na szlifierce polerskiej. Zmień papier ścierny na ziarnistość 800 P2400 i umieść na nim blok żywicy. Powtórz polerowanie pod wodą, zalewając ją.Wyczyść blok myjką ultradźwiękową. Następnie użyj drobniejszych papierów ściernych, aby wykonać seryjne polerowanie w podanej kolejności. Następnie umieść folię docierającą na stole polerki szlifierki bez obracania.Umieść blok żywicy na folii docierającej. Pod chłodzeniem wodnym ręcznie wypolerować powierzchnię ewaluacyjną próbki na folii docierającej. Przesuwaj blok próbki w pionie, poziomie i po przekątnej przez tę samą liczbę sekund pod wstrzyknięciem wody z ruchami od dwóch do trzech centymetrów.Usuń zanieczyszczenia i cząstki za pomocą myjki ultradźwiękowej. Następnie zmień papier ścierny na następny rozmiar przed wypolerowaniem na nim bloku żywicy. Podczas prawidłowego polerowania próbka żywicy przykleja się do folii docierającej.Po zakończeniu ostatecznego polerowania próbka powinna mieć powierzchnię o lustrzanym wykończeniu. Odtłuścić i odwodnić powierzchnię 100% etanolem. Ustaw siłę obciążenia testera mikrotwardości na siłę 25 gramów, a czas ładowania na 10 sekund.Umieść wypolerowany blok żywicy zawierający wbudowaną próbkę siekacza myszy na stoliku instrumentu. Wykonaj sześć punktów wgłębień na każdej warstwie szkliwa i w każdym obszarze zębiny. Zmierz długość dwóch przekątnych, aby obliczyć wartość mikrotwardości Vickersa.Następnie zastąp blok żywicy siekacza blokiem żywicy zawierającym kość wyrostka zębodołowego myszy. Teraz wykonaj od trzech do sześciu punktów wgłębień na każdej mezjalnej i dystalnej stronie kości od grzebienia wyrostka zębodołowego. Wciąć kości wyrostka zębodołowego między pierwszym i drugim zębem trzonowym oraz drugim i trzecim zębem trzonowym.Mikrotwardość wszystkich warstw szkliwa myszy kontrolnych była niższa niż zębiny w okolicy szyjki macicy. W obszarze środkowym i końcowym mikrotwardość szkliwa każdej warstwy była znacznie wyższa niż zębiny. Spośród trzech warstw szkliwa mikrotwardość wzrosła od wewnętrznej do zewnętrznej szkliwa w każdym obszarze środkowym i końcowym.Mikrotwardość szkliwa zębów poddanych fluoryzacji była mniejsza niż zębiny w środkowej części. Mikrotwardość zmniejszyła się znacznie od wewnętrznej do zewnętrznej warstwy szkliwa. Wartości mikrotwardości kości wyrostka zębodołowego dotkniętych chorobami przyzębia wykazywały mniejszą tendencję w stosunku do kości kontrolnych.

microhardness-measurements-on-tooth-alveolar-bone-rodent-oral-disease

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wydłużenie czasu posiłku reprezentuje ustno-twarzowe zachowanie nocyceptywne u gryzoni, podobne do zachowania ochronnego u ludzi z bólem ustno-twarzowym. Jedzenie jest zachowaniem, które nie wymaga treningu ani manipulacji zwierzętami, wymaga udziału kory mózgowej i nie konkuruje z innymi zachowaniami wywołanymi eksperymentalnie, co odróżnia ten test od alternatywnych pomiarów odruchowych lub instrumentalnych.

Czas trwania posiłku jako miara ustno-twarzowych odpowiedzi nocyceptywnych u gryzoni

W tym badaniu omówione zostanie użycie urządzenia do ładowania in situ w połączeniu z mikro-rentgenowską tomografią komputerową do biomechaniki stawów włóknistych. Odczyty doświadczalne identyfikujące się z ogólną zmianą biomechaniki stawów będą obejmowały: 1) siłę reakcyjną w funkcji przemieszczenia, tj. przemieszczenie zęba w obrębie zębodołu i jego reakcję reakcyjną na obciążenie, 2) trójwymiarową (3D) konfigurację przestrzenną i morfometrię, tj. zależność geometryczną zęba względem zębodołu...

In situ Obciążenie kompresyjne i korelacyjne nieinwazyjne obrazowanie stawu włóknistego kość-więzadło przyzębia-ząb

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Opisujemy krok po kroku metodę bezpośredniego pokrywania miazgi na zębach myszy w celu oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny in vivo.

Opracowanie modelu bezpośredniego pokrywania miazgi do oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny u myszy

Tutaj prezentujemy protokół miejscowego wywoływania wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy. Pokazujemy, jak wywiercić otwór w zębie myszy i odsłonić jego miazgę, aby wywołać miejscowy stan zapalny. Przedstawiono również metody analityczne mające na celu zbadanie charakteru tego zapalenia, takie jak mikrotomografia komputerowa i histologia.

Wywoływanie wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia indukowanego przez ligaturę modelu mysiego zapalenia przyzębia obejmującego wiele zębów trzonowych szczęki, co skutkuje większymi obszarami zaangażowanej tkanki dziąsłowej i kości do późniejszej analizy, a także zmniejszeniem zużycia przez zwierzęta. Opisano również technikę oceny neutrofili w jamie ustnej w sposób analogiczny do osób badanych u ludzi.

Solidny model mysiego zapalenia przyzębia indukowany ligaturą do oceny neutrofili jamy ustnej

Przedstawiamy protokół generowania ruchów zębów ortodontycznych u myszy oraz metody wizualizacji 3D włókien kolagenowych i naczyń krwionośnych więzadła przyzębia bez sekcji.

Obrazowanie 3D włókien kolagenowych PDL podczas ortodontycznego ruchu zębów w mysim modelu żuchwy

Tutaj demonstrujemy krok po kroku łatwy do opanowania, ortodontyczny protokół ruchu zębów operowany na mysim modelu szczęki. Dzięki wyraźnemu wyjaśnieniu każdego kroku i wizualnej demonstracji, naukowcy mogą opanować ten model i zastosować go do swoich potrzeb eksperymentalnych za pomocą kilku modyfikacji.

Opracowanie mysiego modelu ortodontycznego szczęki

Tutaj prezentujemy protokół do badania ortodontycznego ruchu zębów (OTM), służący jako odpowiedni model do badania mechanizmów adaptacji kości, resorpcji korzeni i reakcji komórek kostnych na bodźce mechaniczne. Ten obszerny przewodnik zawiera szczegółowe informacje na temat modelu OTM, akwizycji mikrotomografii komputerowej i późniejszej analizy.

Badanie ruchów zębów ortodontycznych u myszy

To badanie opisuje zmodyfikowaną metodę podwiązania nylonu 6-0 do wywoływania zapalenia przyzębia u myszy, która jest wysoce powtarzalna i stanowi alternatywę dla badaczy do badania chorób przyzębia od ich rozwoju do patologicznych konsekwencji.

Mysi model zaawansowanego zapalenia przyzębia wywołanego przez ligaturę nylonową w drugim górnym zębie trzonowym

Poznaj standaryzowany protokół pomiaru mikrotwardości szkliwa, zębiny i kości wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni. Metoda zwiększa wiarygodność badań twardych tkanek.

Pomiary mikrotwardości kości zęba i wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni

Przeglądaj więcej filmów