Name: Bezpośrednia identyfikacja mikrobiologiczna przy użyciu zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów w celu ułatwienia metody EUCAST RAST bez spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną identyfikację bakterii Gram-ujemnych z dodatnich hodowli krwi w celu wdrożenia metody EUCAST RAST. To podejście przyspiesza raportowanie wrażliwości na antybiotyki w zasobowo ograniczonych środowiskach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie zostało sfinansowane z grantu badawczego przyznanego dr Ayush Gupta przez AIIMS Bhopal. Doceniamy wkład techników laboratoryjnych i lekarzy rezydentów, którzy sumiennie wykonywali i czytali badania w godzinach rutynowych i nagłych.

Badanie, finansowane z grantu badawczego przyznanego dr Ayush Gupta przez AIIMS Bhopal, zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Etyki Człowieka (IHEC) vide list nr: IHEC- LOP/2022/IL072.
UWAGA: Próbka o objętości 5 ml została użyta na podstawie badań przeprowadzonych przez Quesada et al.25 oraz Munoz-Davila et al.27.
1. Standardowy protokół inokulum (SIP) do identyfikacji bakterii za pomocą aMIAST
<ol>
	<li>Nosić czyste rękawice, a wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego klasy IIa (BSC) zdezynfekować przegrodę +naBC wacikiem zawierającym 70% alkoholu izopropylowego.</li>
	<li>Pobrać około 1 ml mieszaniny krwi i bulionu za pomocą sterylnej strzykawki z igłą o sile 21 G.</li>
	<li>Dozuj 1 dużą kroplę mieszaniny krwi i bulionu z igły na powierzchnię pożywki z pożywki, a mianowicie SBA, CA i MA. Smugować płytki i inkubować płytki hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37 °C ± 2 °C w warunkach tlenowych przez 18–24 godzin.</li>
	<li>Po inkubacji zbadaj płytki pod kątem pojawienia się izolowanych kolonii w BSC i przejdź dalej w celu identyfikacji i AST przez aMIAST.</li>
	<li>Dla każdego izolatu należy umieścić probówkę polistyrenową aMIAST w stojaku na probówki aMIAST i wsypać do niej 3 ml sterylnego soli fizjologicznej za pomocą dozownika dołączonego do butelki z solą fizjologiczną.</li>
	<li>Dotknij trzech do pięciu morfologicznie podobnych kolonii sterylnym prostym drutem do zaszczepiania i przenieś inokulum bakteryjne do pierwszej probówki.</li>
	<li>Dostosuj zmętnienie za pomocą sterylnego soli fizjologicznej w zaszczepionej probówce w zakresie 0,47-0,63 McFarlanda za pomocą densytometru.</li>
	<li>Umieścić nasadkę kapilarną gram-ujemnej karty identyfikacyjnej aMIAST w pierwszej probówce.</li>
	<li>Umieść wybrane karty w odpowiedniej pozycji na kasecie. Inokulum w kasecie jest gotowe i trafia do aMIAST w dziale napełniania. 
	UWAGA: Wiek zawieszenia nie może przekroczyć 30 minut przed zaszczepieniem kart.</li>
	<li>Załaduj kasetę na swoje miejsce w komorze napełniania z kodem kreskowym próbki skierowanym do środka.</li>
	<li>Zamknij drzwi i naciśnij Fill na ekranie interfejsu użytkownika. Napełnianie to cykl 70 s. Po zakończeniu cyklu niebieska lampka kontrolna na systemie zacznie migać. Umieszczenie kart w systemie aMIAST powoduje rozprowadzenie inokulum w małych komorach kart przez maszynę.</li>
	<li>Wyjmij kasetę z komory napełniania, zamknij drzwi i umieść w komorze załadowczej. Kody kreskowe są automatycznie skanowane i sprawdzane z konserwacją wirtualnej elektronicznej listy roboczej kasety. Słomki są automatycznie zamykane, a karty są automatycznie ładowane do karuzeli. niebieska strzałka na aMIASTACH oznacza, że ładowanie zostało zakończone.</li>
	<li>Po zakończeniu usuń odpady kasety. Zapoznaj się z procedurą usuwania odpadów w literaturze produktu lub postępuj zgodnie z innymi standardowymi praktykami. Pozostałą część zawiesiny w probówkach należy wykorzystać do subhodowli na agarze CLED w celu sprawdzenia czystości izolatów.</li>
	<li>Odczytaj wyniki po zakończeniu analizy przez urządzenie.</li>
</ol>
2. Protokół bezpośredniego inokulum (DIP) do identyfikacji bakterii za pomocą aMIAST
<ol>
	<li>Nosić sterylne rękawice, a wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego oczyść przegrodę +naBC wacikiem zawierającym 70% alkoholu izopropylowego.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej strzykawki z igłą 21 G pobrać 5 ml podwielokrotności z mieszaniny krwi i bulionu +naBC i przenieść ją do probówki separatora surowicy (SST) po zdezynfekowaniu gumowej przegrody 70% alkoholem izopropylowym (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Odwirować tę porcję przez 10 minut przy sile 160 x g, aby osadzić krwinki w mieszaninie krwi i bulionu. Po pierwszym odwirowaniu obserwuj szwadron, w którym osiądą krwinki.</li>
	<li>Otworzyć nakrętkę fiolki znajdującą się w komorze bezpieczeństwa biologicznego i za pomocą sterylnej końcówki i pipety ostrożnie usunąć supernatant i przenieść go do nowej zwykłej fiolki do pobierania krwi (czerwona góra), zdejmując jej nakrętkę.</li>
	<li>Umieścić nakrętkę na fiolce i ponownie odwirować przez 10 minut przy 2000 x g. Po drugim odwirowaniu na dnie utworzy się osad bakteryjny.</li>
	<li>Odessać supernatant i wyrzucić go za pomocą sterylnej pipety i końcówki. Osad bakteryjny pozostanie na dnie probówki i zostanie użyty do zaszczepienia karty identyfikacyjnej aMIAST. 
	UWAGA: W pierwszym wirowaniu użyto probówki z separatorem surowicy przy 160 x g. Zostało to oparte na badaniach przeprowadzonych przez Quesada et al.25 oraz Munoz-Davila et al.27, gdzie pierwszy etap wirowania przeprowadzono w przybliżeniu przy odpowiednio 30 x g i 60 x g. Mieszanina krwi-bulion z +aBC została najpierw odwirowana z niską prędkością w SST w celu osadzenia krwinek.</li>
	<li>Umieść tubkę polistyrenową aMIAST w stojaku na probówki aMIAST i dodaj do niej 3 ml sterylnej soli fizjologicznej za pomocą dozownika dołączonego do butelki z solą fizjologiczną.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania pobrać osad bakteryjny z dna fiolki i zaszczepić go w probówce aMIAST</li>
	<li>Powtórz kroki 1.7-1.14.</li>
</ol>
3. AST według protokołu EUCAST RAST4
<ol>
	<li>Przechowywać niezaszczepione okrągłe płytki agarowe Muellera-Hintona (MHA) o średnicy 90 mm w gotowości w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Nosić sterylne rękawice, a wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego oczyść przegrodę +naBC wacikiem zawierającym 70% alkoholu izopropylowego.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej strzykawki odessać 125 μl ± 25 μl nierozcieńczonej mieszaniny krwi i bulionu z +naBC i dodać do każdej płytki MHA w środku.</li>
	<li>Delikatnie rozprowadź bulion na płytkach za pomocą sterylnego bawełnianego wacika w trzech kierunkach i nałóż ≤ 6 krążków przeciwdrobnoustrojowych na każdą płytkę.</li>
	<li>Inkubować płytki w inkubatorze tlenowym w temperaturze 35 °C± 1 °C przez 8 godzin. Po zakończeniu inkubacji należy obserwować czystość izolatu.</li>
	<li>Odczyt stref inhibicji po 8 godzinach ± 5 minutach. Interpretację wyników należy dokonać za pomocą tabeli punktów przerwania RAST dla krótkiej inkubacji po sprawdzeniu wyników identyfikacji bakterii w aMIAST.</li>
	<li>Zgłaszaj wyniki AspAT tylko wtedy, gdy izolat jest zidentyfikowany jako jeden z RR-GN, a na płytkach MHA i CLED rośnie jeden morfotyp.</li>
</ol>
4. Kontrola jakości
<ol>
	<li>Przeprowadzić wewnętrzną kontrolę jakości dla protokołu SIP systemu aMIAST zgodnie z instrukcjami producenta przy użyciu zalecanych szczepów referencyjnych.</li>
	<li>Przeprowadzaj wewnętrzną kontrolę jakości metody RAST co tydzień przy użyciu zalecanego szczepu referencyjnego E. coli, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Ułóż 4 sterylne szklane probówki w stojaku na probówki. Dozować 3 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do pierwszej probówki i 990 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej do drugiej, trzeciej i czwartej probówki.</li>
		<li>Wykonać 0,5 zawiesiny McFarlanda szczepu QC z izolowanych kolonii nocnej hodowli na pożywkach galaizacyjnych.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej pipety i końcówki przenieść 10 μl zawiesiny z pierwszej probówki do drugiej.</li>
		<li>Po wymieszaniu przenieść 10 μl zawiesiny z drugiej do trzeciej probówki, a następnie do ostatniej probówki.</li>
		<li>Z ostatniej probówki pobrać 1 ml inokulum za pomocą sterylnej strzykawki z igłą i dodać go do niezaszczepionego aBC.</li>
		<li>Jednocześnie dodać 5 ml sterylnej krwi owczej do aBC za pomocą sterylnej strzykawki z igłą i inkubować w CBCMS, aż oznaczy się dodatni z powodu zmiany koloru czujnika ciekłej emulsji u podstawy aBC.</li>
		<li>Powtórz kroki, jak wyjaśniono w krokach 1-3 dla identyfikacji odpowiednio przez SIP, DIP i RAST. Oczekiwane wyniki są takie, że szczep QC powinien być prawidłowo zidentyfikowany przez oba protokoły identyfikacji aMIAST, a średnice stref w płytkach RAST powinny mieścić się w określonym zakresie28.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Rozważ identyfikację mikrobiologiczną przy użyciu SIP jako złoty standard, a jeśli taka sama identyfikacja zostanie uzyskana przez DIP, uznaj ją za zgodną.</li>
	<li>Jeśli RR-GN, tj. jeden z kompleksów E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa i A. baumannii zidentyfikowany za pomocą SIP, jest niezgodny w DIP, należy to uznać za błąd główny (ME), podczas gdy odwrotność należy uznać za bardzo poważny błąd (VME), ponieważ może to spowodować wydanie raportu z błędną identyfikacją.</li>
	<li>Obliczyć współczynnik zgodności dla RR-GN jako stosunek całkowitej liczby zgodnych RR-GN do całkowitej liczby RR-GN zidentyfikowanych przez SIP pomnożony przez 100.</li>
	<li>Obliczać wskaźnik ME jako stosunek liczby +naBC zidentyfikowanych jako mające inny niż RR-GN do całkowitej liczby +naBC z RR-GN zidentyfikowanym przez SIP pomnożony przez 100.</li>
	<li>Obliczyć wskaźnik VME jako stosunek liczby +naBC błędnie zidentyfikowanych jako posiadające RR-GN w DIP do całkowitej liczby +naBC badanych za pomocą DIP pomnożony przez 100.</li>
	<li>Oblicz czas do identyfikacji izolacji (TTI) jako czas potrzebny do zidentyfikowania izolatu za pomocą obu protokołów od momentu oznaczenia posiewu krwi przez CBCMS.</li>
	<li>Oblicz różnice między DIP i SIP jako zmniejszenie TTI. Oblicz to tylko dla zgodnych +naBC o RR-GN. Zwróć uwagę na odpowiednie punkty czasowe z zegarów CBCMS i aMIAST.</li>
	<li>Zarządzaj danymi i analizuj je za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Użyj testu U Manna-Whitneya dla zmiennych ciągłych, uznając dwustronną wartość p ≤ 0,05 za statystycznie istotną.</li>
</ol>

Accelerated Antimicrobial Susceptibility Testing in Blood Culture Bottles

<ol><li>Rudd, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+sepsis+incidence+and+mortality%2C+1990%E2%80%932017%3A+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990–2017: analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).</li>
<li>Ikuta, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mortality+associated+with+33+bacterial+pathogens+in+2019%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global mortality associated with 33 bacterial pathogens in 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> Lancet. 400 (10369), 2221-2248 (2022).</li>
<li>Liu, V. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+early+antibiotics+and+hospital+mortality+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The timing of early antibiotics and hospital mortality in sepsis.</a> Am J Resp Crit Care Med. 196 (7), 856-863 (2017).</li>
<li>European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology-EUCAST+rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+%28RAST%29+directly+from+positive+blood+culture+bottles.+Version+4.0%5BTitle%5D)+AND+%22EUCAST.+European+Committee+on+Antimicrobial+Susceptibility+testing%22%5BJournal%5D)">Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 4.0.</a> EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , Basel. (2023).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+standards+for+antimicrobial+susceptibility+testing.+33rd+ed%5BTitle%5D)+AND+%22CLSI.+Clinical+and+Laboratory+Standards+Institute%22%5BJournal%5D)">Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 33rd ed.</a> CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Wayne, PA. CLSI supplement M100 (2023).</li>
<li>European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology-EUCAST+rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+%28RAST%29+directly+from+positive+blood+culture+bottles.+Version+1.0%5BTitle%5D)+AND+%22EUCAST.+European+Committee+on+Antimicrobial+Susceptibility+testing%22%5BJournal%5D)">Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0.</a> EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , Basel. (2018).</li>
<li>European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zone+diameter+breakpoints+for+rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+%28RAST%29+directly+from+positive+blood+culture+bottles.+Version+1.0%5BTitle%5D)+AND+%22EUCAST.+European+Committee+on+Antimicrobial+Susceptibility+testing%22%5BJournal%5D)">Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0.</a> EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , Basel. (2018).</li>
<li>European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zone+diameter+breakpoints+for+rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+%28RAST%29+directly+from+positive+blood+culture+bottles.+Version+6.1%5BTitle%5D)+AND+%22EUCAST.+European+Committee+on+Antimicrobial+Susceptibility+testing%22%5BJournal%5D)">Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 6.1.</a> EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , Basel. (2023).</li>
<li>Soo, Y. T., Waled, S. N. M. B., Ng, S., Peh, Y. H., Chew, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+EUCAST+rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+%28RAST%29+directly+from+blood+culture+bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from blood culture bottles.</a> Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (5), 993-998 (2020).</li>
<li>Berinson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EUCAST+rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+%28RAST%29%3A+Analytical+performance+and+impact+on+patient+management%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST): Analytical performance and impact on patient management.</a> J Antimicrob Chemother. 76 (5), 1332-1338 (2021).</li>
<li>Strubbe, G., Messiaen, A. S., Vandendriessche, S., Verhasselt, B., Boelens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EUCAST+rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+%28RAST%29+compared+to+conventional+susceptibility+testing%3A+implementation+and+potential+added+value+in+a+tertiary+hospital+in+Belgium%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Clinica+Belgica%3A+Int+J+Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) compared to conventional susceptibility testing: implementation and potential added value in a tertiary hospital in Belgium.</a> Acta Clinica Belgica: Int J Clin Lab Med. 78 (5), 385-391 (2023).</li>
<li>Jasuja, J. K., Zimmermann, S., Burckhardt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+EUCAST+rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+%28RAST%29+for+positive+blood+cultures+in+clinical+practice+using+a+total+lab+automation%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) for positive blood cultures in clinical practice using a total lab automation.</a> Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (7), 1305-1313 (2020).</li>
<li>Martins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+antimicrobial+susceptibility+of+Enterobacteriaceae+by+disk+diffusion+directly+from+blood+culture+bottles+using+the+EUCAST+RAST+breakpoints%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glob+Antimicrob+Resist%22%5BJournal%5D)">Rapid antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae by disk diffusion directly from blood culture bottles using the EUCAST RAST breakpoints.</a> J Glob Antimicrob Resist. 22, 637-642 (2020).</li>
<li>Ekwall-Larson, A., Fröding, I., Mert, B., Åkerlund, A., Özenci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+performance+and+potential+clinical+utility+of+EUCAST+rapid+antimicrobial+susceptibility+testing+in+blood+cultures+after+four+hours+of+incubation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Analytical performance and potential clinical utility of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing in blood cultures after four hours of incubation.</a> Microbiol Spectr. 11 (2), e500122(2023).</li>
<li>Cerrudo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+EUCAST+rapid+antibiotic+susceptibility+breakpoints+and+screening+cut-off+values+directly+from+blood+cultures+for+the+inference+of+%CE%B2-lactam+resistance+mechanisms+in+Enterobacterales%5BTitle%5D)+AND+%22JAC-Antimicrob+Resist%22%5BJournal%5D)">Usefulness of EUCAST rapid antibiotic susceptibility breakpoints and screening cut-off values directly from blood cultures for the inference of β-lactam resistance mechanisms in Enterobacterales.</a> JAC-Antimicrob Resist. 5 (1), 017(2023).</li>
<li>Shan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+EUCAST+rapid+antimicrobial+susceptibility+test+for+enterobacterales-containing+blood+cultures+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test for enterobacterales-containing blood cultures in China.</a> J Clin Microbiol. 60 (4), e0255921(2022).</li>
<li>Jonasson, E., Matuschek, E., Kahlmeter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EUCAST+rapid+disc+diffusion+method+for+antimicrobial+susceptibility+testing+directly+from+positive+blood+culture+bottles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">The EUCAST rapid disc diffusion method for antimicrobial susceptibility testing directly from positive blood culture bottles.</a> J Antimicrob Chemother. 75 (4), 968-978 (2020).</li>
<li>Tayşi, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+the+EUCAST+rapid+antimicrobial+susceptibility+test+%28RAST%29+directly+from+positive+blood+culture+bottles+without+the+advanced+identification+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Implementation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test (RAST) directly from positive blood culture bottles without the advanced identification systems.</a> J Antimicrobial Chemotherapy. 77 (4), 1020-1026 (2022).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+study+evaluating+the+effect+of+a+%E2%80%98Diagnostic+Stewardship+Care-Bundle%E2%80%99+for+automated+blood+culture+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glob+Antimicrob+Resist%22%5BJournal%5D)">A prospective study evaluating the effect of a ‘Diagnostic Stewardship Care-Bundle’ for automated blood culture diagnostics.</a> J Glob Antimicrob Resist. 34, 119-126 (2023).</li>
<li>Siddiqui, F., Gupta, A., Purwar, S., Saigal, S., Sharma, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+study+to+reduce+turnaround+time+of+microbiologically+positive+blood+cultures+in+patients+with+sepsis+in+intensive+care+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A prospective study to reduce turnaround time of microbiologically positive blood cultures in patients with sepsis in intensive care unit.</a> Indian J Med Microbiol. 40 (4), 541-546 (2022).</li>
<li>Gherardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+the+Vitek-2+Compact+and+Phoenix+systems+for+rapid+identification+and+antibiotic+susceptibility+testing+directly+from+blood+cultures+of+Gram-negative+and+Gram-positive+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates.</a> Diagnostic Microbiol Infect Dis. 72 (1), 20-31 (2012).</li>
<li>Lemos, T. C., Cogo, L. L., Maestri, A. C., Hadad, M., Nogueira, K. daS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+possible+to+perform+bacterial+identification+and+antimicrobial+susceptibility+testing+with+a+positive+blood+culture+bottle+for+quick+diagnosis+of+bloodstream+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+da+Sociedade+Brasileira+de+Medicina+Tropical%22%5BJournal%5D)">Is it possible to perform bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing with a positive blood culture bottle for quick diagnosis of bloodstream infections.</a> Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 51 (2), 215-218 (2018).</li>
<li>Funke, G., Funke-Kissling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+BD+PHOENIX+automated+microbiology+system+for+direct+identification+and+susceptibility+testing+of+gram-negative+rods+from+positive+blood+cultures+in+a+three-phase+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of the BD PHOENIX automated microbiology system for direct identification and susceptibility testing of gram-negative rods from positive blood cultures in a three-phase trial.</a> J Clin Microbiol. 42 (4), 1466-1470 (2004).</li>
<li>Nimer, N. A., Al-Saa’da, R. J., Abuelaish, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+the+VITEK+2+system+for+a+rapid+and+direct+identification+and+susceptibility+testing+of+Gram+negative+rods+and+Gram-positive+cocci+in+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22East+Mediterr+Health+J%22%5BJournal%5D)">Accuracy of the VITEK 2 system for a rapid and direct identification and susceptibility testing of Gram negative rods and Gram-positive cocci in blood samples.</a> East Mediterr Health J. 22 (3), 193-200 (2016).</li>
<li>Quesada, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+VITEK-2+Compact+and+overnight+MicroScan+panels+for+direct+identification+and+susceptibility+testing+of+Gram-negative+bacilli+from+positive+FAN+BacT%2FALERT+blood+culture+bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Performance of VITEK-2 Compact and overnight MicroScan panels for direct identification and susceptibility testing of Gram-negative bacilli from positive FAN BacT/ALERT blood culture bottles.</a> Clin Microbiol Infect. 16 (2), 137-140 (2010).</li>
<li>De Cueto, M., Ceballos, E., Martinez-Martinez, L., Perea, E. J., Pascual, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+positive+blood+cultures+for+direct+identification+and+susceptibility+testing+with+the+Vitek+2+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of positive blood cultures for direct identification and susceptibility testing with the Vitek 2 system.</a> J Clin Microbiol. 42 (8), 3734-3738 (2004).</li>
<li>Munoz-Dávila, M. J., Yagüe, G., Albert, M., García-Lucas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+Vitek+2+identification+and+susceptibility+testing+of+Gram-negative+rods+directly+and+isolated+from+BacT%2FALERT-positive+blood+culture+bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of Vitek 2 identification and susceptibility testing of Gram-negative rods directly and isolated from BacT/ALERT-positive blood culture bottles.</a> Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 31 (5), 663-669 (2012).</li>
<li>European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+criteria+for+the+implementation+of+the+RAST+method.+Version+6.0%5BTitle%5D)+AND+%22EUCAST.+European+Committee+on+Antimicrobial+Susceptibility+testing%22%5BJournal%5D)">Quality control criteria for the implementation of the RAST method. Version 6.0.</a> EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , Basel. (2023).</li>
<li>Chen, J. R., Lee, S. Y., Yang, B. H., Lu, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+and+susceptibility+testing+using+the+VITEK+2+system+using+culture+fluids+from+positive+BacT%2FALERT+blood+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol%2C+Immunol+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid identification and susceptibility testing using the VITEK 2 system using culture fluids from positive BacT/ALERT blood cultures.</a> J Microbiol, Immunol Infect. 41 (3), 259-264 (2008).</li>
<li>Bruins, M. J., Bloembergen, P., Ruijs, G. J. H. M., Wolfhagen, M. J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+susceptibility+testing+of+Enterobacteriaceae+and+Pseudomonas+aeruginosa+by+direct+inoculation+from+positive+BACTEC+blood+culture+bottles+into+Vitek+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and susceptibility testing of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa by direct inoculation from positive BACTEC blood culture bottles into Vitek 2.</a> J Clin Microbiol. 42 (1), 7-11 (2004).</li>
<li>Lupetti, A., Barnini, S., Castagna, B., Nibbering, P. H., Campa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+and+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Gram-positive+cocci+in+blood+cultures+by+direct+inoculation+into+the+BD+Phoenix+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid identification and antimicrobial susceptibility testing of Gram-positive cocci in blood cultures by direct inoculation into the BD Phoenix system.</a> Clin Microbiol Infect. 16 (7), 986-991 (2010).</li>
<li>Barreales, A., Lara, M., Hernández, I., Díez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+and+susceptibility+testing+of+Gram-positive+cocci+in+BacT%2FALERT+blood+cultures+by+direct+inoculation+into+the+Vitek+2+system%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Esp+Quimioter%22%5BJournal%5D)">Rapid identification and susceptibility testing of Gram-positive cocci in BacT/ALERT blood cultures by direct inoculation into the Vitek 2 system.</a> Rev Esp Quimioter. 24 (3), 131-135 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z DIP, udało nam się zidentyfikować RR-GN ze znaczną dokładnością diagnostyczną. Średni TTI po pozytywnym oznaczeniu aBC wynosił tylko 507 min (~ 8,5 h). W związku z tym, w połączeniu z metodą EUCAST RAST do oznaczania AspAT, może ona zapewnić identyfikację izolatu po 8 godzinach odczytu AST. Podejście to ma potencjał do wdrożenia metody EUCAST RAST, eliminując potrzebę identyfikacji opartej na spektrometrii mas. Jest to dobrodziejstwo dla środowisk o ograniczonych zasobach, które chcą wdrożyć metodę EUCAST RAST w swoim rutynowym przepływie pracy, aby skrócić czas potrzebny na raportowanie kliniczne i obejść główne przeszkody w jej wdrożeniu.
Przed wprowadzeniem metody EUCAST RAST wielu autorów oceniało dokładność bezpośrednich testów z +aBC dla różnych systemów aMIAST 21,22,23,24,25,26,27,29,30,31. W tych badaniach protokoły testów bezpośrednich różniły się między etapem pojedynczej wirówki 29,30,31,32 a krokiem podwójnej wirówki 21,22,24,25,26,27 do wytwarzania osadu bakteryjnego. W metodzie jednoetapowej mieszaninę krwi i bulionu z +aBC odwirowano z dużą prędkością w probówce separatora surowicy (SST) w celu osadzenia bakterii powyżej warstwy żelu silikonowego. Osad służył do przygotowania inokulum do inokulacji kart identyfikacyjnych. W metodzie podwójnego wirowania mieszanina krwi i bulionu z +aBC była najpierw odwirowywana z niską prędkością w SST w celu osadzenia krwinek. Z tej probówki supernatant zawierający bakterie został usunięty i przeniesiony do nowej probówki i poddany szybkiemu wirowaniu. Z tej probówki supernatant był odrzucany, a osad służył do zaszczepienia odpowiednich kart identyfikacyjnych. W tych badaniach wskaźnik zgodności wahał się od 62% do 100%, ale ogólnie dokładność była wyższa w przypadku metody podwójnego wirowania.
Okazało się, że metoda jest prosta do wykonania i została podjęta w rutynowym laboratorium diagnostycznym z personelem składającym się >10 techników laboratoryjnych na zmianę, co dowodzi solidności metody. W ~94% (98/105) +naBC zawierających jeden z RR-GN, DIP prawidłowo zidentyfikował mikroorganizm. Wskaźnik zgodności dla różnych kategorii organizmów był również porównywalny, ponieważ wynosił odpowiednio 94%, 90%, 100% i 92,3% dla kompleksu E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa i A. baumannii. Odkryliśmy również, że ogólny wskaźnik zgodności dla każdego gram-ujemnego był nieoptymalny, ~77% (157/204). Jednak większość tych błędnych identyfikacji dotyczyła niefermentacyjnych Gram-ujemnych, takich jak Acinetobacter spp. inne niż kompleks baumannii, Pseudomonas spp. inne niż aeruginosa, Moraxella spp. i Sphingomonas paucimobilis, które są zwykle uważane za powszechne zanieczyszczenia skóry. Błędne identyfikacje z niefermentacyjnymi gram-ujemnymi zostały również odnotowane przez innych autorów21,23, co prawdopodobnie wynika z niskiej reaktywności tych bakterii w kartach identyfikacyjnych aMIAST.
Stwierdziliśmy znaczne zmniejszenie TTI bakterii w obrębie +naBC za pomocą DIP. Mediana TTI DIP była około 4 razy mniejsza niż mediana TTI SIP (507 min vs 2171 min), gdy została wykonana w rutynowym klinicznym laboratorium diagnostycznym. Ten TTI wynoszący ~8,5 h obejmował również odstęp między pozytywnym oznaczaniem aBC a wykonaniem inokulacji kartą aMIAST, ponieważ średni czas do wyizolowania analizy przez aMIAST wynosił tylko 5,45 h ± 1,6 h. Dodając średni czas do dodatniego wyniku wynoszący 728 min ± 301 min (~12 h) dla zgodnych +naBC w naszym badaniu, to podejście do identyfikacji bakterii może potencjalnie dać raport tego samego dnia po otrzymaniu aBC w rutynowym laboratorium diagnostycznym.
Istnieją również pewne ograniczenia związane z DIP. Po pierwsze, ze względu na to, że jest to zastosowanie preparatu inokulum poza wskazaniami rejestracyjnymi, wyniki należy uznać za wstępne, podobnie jak wyniki AST uzyskane przez EUCAST RAST. Niemniej jednak służy on głównemu celowi, jakim jest identyfikacja tylko RR-GN ze znaczną dokładnością diagnostyczną w odpowiednim czasie. Po drugie, istnieje praktyczna możliwość marnotrawstwa zasobów testowych, jak w przypadku około 60% +naBCs; nie bylibyśmy w stanie dokonać zgłoszenia ani z powodu zakażeń wielodrobnoustrojowych, ani identyfikacji osoby innej niż RRGN. To marnotrawstwo zasobów dotyczy każdej z nowszych zautomatyzowanych metod bezpośredniego wykrywania AspAT w posiewach krwi. Po trzecie, wskaźnik zakażeń wielodrobnoustrojowych i identyfikacja powszechnych zanieczyszczeń skóry były wyższe w tym badaniu ze względu na złe praktyki pobierania próbek. Po czwarte, nie potwierdziliśmy tożsamości badanych izolatów za pomocą spektrometrii mas, która jest obecnie złotym standardem identyfikacji bakterii.
Badanie to z powodzeniem wykazało, że nawet za pomocą testów fenotypowych możliwe jest raportowanie tego samego dnia dodatnich posiewów krwi, zwłaszcza w bakteriemii Gram-ujemnej. Ma to potencjał znacznego skrócenia czasu rozpoczęcia odpowiedniej terapii przeciwdrobnoustrojowej w krajach o niskich i średnich dochodach, gdzie diagnostyka mikrobiologiczna w celu identyfikacji bakterii i AspAT opiera się w dużym stopniu na konwencjonalnych testach fenotypowych. Podejście to powinno zostać zweryfikowane poprzez przeprowadzenie wieloośrodkowego badania, a jego potencjalny wpływ na wyniki leczenia pacjentów oraz jako narzędzie zarządzania środkami przeciwdrobnoustrojowymi powinny być przedmiotem przyszłych badań klinicznych w krajach o niskich i średnich dochodach.
Podsumowując, projekt DIP for aMIAST uzupełnia metodę EUCAST RAST, umożliwiając wczesną identyfikację RR-GN. Eliminuje to konieczność polegania na zaawansowanych technikach identyfikacji mikrobiologicznej i AST, ponieważ czas potrzebny na sporządzenie raportu przy użyciu tych podejść jest porównywalny z tym podejściem. W przypadku bakterii Gram-ujemnych raportowanie tego samego dnia jest możliwe do osiągnięcia za pomocą konwencjonalnych metod fenotypowych, jeśli są one maksymalnie zoptymalizowane. Może to potencjalnie skrócić czas trwania leczenia przeciwdrobnoustrojowego o szerokim spektrum działania i ułatwić zarządzanie środkami przeciwdrobnoustrojowymi w warunkach ograniczonych zasobów.

Sepsa, ważny globalny problem zdrowotny, jest definiowana jako zagrażająca życiu dysfunkcja narządów spowodowana rozregulowaną odpowiedzią gospodarza na infekcję. W badaniu Global Burden of Diseases oszacowano, że w 2017 r. na całym świecie było 48,9 miliona przypadków sepsy i 11 milionów zgonów związanych z sepsą, co stanowiło prawie 20% wszystkich zgonów na świecie1. Około 2/3 zakażeń krwi (BSI) powodujących śmiertelność jest spowodowanych przez patogeny bakteryjne Gram-ujemne2. Najczęstszymi przyczynami śmiertelności wśród osób Gram-ujemnych (GN) są Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii, które stanowią około 40% przypadków wśród 33 patogenów bakteryjnych2.
Posiewy krwi pozostają złotym standardem w diagnozowaniu BSI, a szybka identyfikacja drobnoustrojów wraz z wynikami testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) jest kluczem do zarządzania. Szacuje się, że prawdopodobieństwo zgonu wzrasta o 9% z każdym godzinnym opóźnieniem we wprowadzaniu odpowiednich środków przeciwdrobnoustrojowych w sepsie 3. Czas realizacji (TAT) mikrobiologicznie dodatnich raportów posiewu krwi z wynikami AST wynosi około 48-72 godzin przy użyciu dostępnych narzędzi mikrobiologicznych w warunkach ograniczonych zasobów, nawet w przypadku zautomatyzowanych systemów. W wyniku tego słabego TAT środki przeciwdrobnoustrojowe o szerokim spektrum działania są stosowane empirycznie, co przyczynia się do narastającego problemu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR). Uznając tę pilną potrzebę zmniejszenia TAT w technikach hodowli mikrobiologicznej sepsy, EUCAST i CLSI zmierzają w kierunku wykonywania AST bezpośrednio z pozytywnie oznaczonych butelek do hodowli krwi (+aBC)4,5.
W 2018 roku EUCAST po raz pierwszy wprowadził metodę szybkiego AST (RAST) do oznaczania AST metodą dyfuzji krążka Kirby'ego-Bauera w krótkich czasach inkubacji, tj. 4 h, 6 h i 8 h, bezpośrednio z +aBC6,7. Metoda jest obecnie zwalidowana do oznaczania AspAT dla +aBC zawierających jedną z 8 najczęstszych przyczyn BSI, a mianowicie E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa i kompleks A. baumannii wśród Gram-ujemnych oraz Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium i Streptococcus pneumoniae wśród Gram-dodatnich8. Wartości graniczne dla oznaczania AspAT w różnych odstępach czasu są podane dla poszczególnych gatunków drobnoustrojów wymienionych powyżej. W związku z tym, przed kategoryczną interpretacją wyników AST, konieczna jest identyfikacja mikrobiologiczna. Jednak norma RAST nie określa metody umożliwiającej identyfikację drobnoustrojów w tym czasie.
Większość badań oceniających metodę EUCAST RAST w ich warunkach wykorzystywała identyfikację mikrobiologiczną opartą na spektrometrii mas po krótkiej inkubacji na pożywkach platerowanych do identyfikacji mikroorganizmów9,10,11,12,13,14,15,16,17. Jednak instrumenty do spektrometrii mas nie są powszechnie dostępne, zwłaszcza w krajach o niskich i średnich dochodach (LMIC), co znacznie ogranicza potencjalną przydatność tej metody. Niewiele badań wykazało implementację tej metody w swoich ośrodkach bez użycia spektrometrii mas18,19,20. Tayşi et al.18 podali szeroką kategoryzację GN wśród Enterobacterales, Pseudomonas i Acinetobacter spp. na podstawie morfologii barwienia Grama i testu oksydazy przed interpretacją wyników AST. W innych badaniach przeprowadzonych przez Gupta et al.19 oraz Siddiqui et al.20, identyfikacja drobnoustrojów na poziomie gatunku została przeprowadzona poprzez przygotowanie osadu bakteryjnego z pozytywnie oznaczonej mieszaniny krwi-bulionu i zaszczepienie go w konwencjonalnych testach biochemicznych. Podczas gdy Tayşi i wsp.18 nie wypowiedzieli się na temat dokładności identyfikacji drobnoustrojów za pomocą ich podejścia, Gupta i wsp.19 poinformowali, że przy ich podejściu w 165/176 (94%) przypadkach, raportowany przez RAST gram-ujemny (RR-GN), tj. E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa i A. baumannii kompleks. Jednak przy tym drugim podejściu, odczyt wyników RAST odbywał się retrospektywnie przy użyciu punktów granicznych o średnicy strefy 8 godzin dopiero po pełnej inkubacji konwencjonalnych wyników biochemicznych, tj. 18-24 godzin po inokulacji, a średni czas raportowania wynosił około 2 dni.
Aby jeszcze bardziej zmniejszyć TAT raportów klinicznych, proponujemy alternatywną metodologię, która umożliwi wczesną identyfikację GN obecnego w +aBC za pomocą aMIAST. Przed wprowadzeniem systemów identyfikacji drobnoustrojów opartych na spektrometrii mas, te zautomatyzowane systemy identyfikacji były uważane za standard opieki nad identyfikacją drobnoustrojów, w których identyfikacja była możliwa dzięki zmianom kolorymetrycznym i/lub fluorometrycznym wywołanym przez bakterie testowe po zaszczepieniu w zminiaturyzowanych testach biochemicznych umieszczonych w kasecie i dopasowujących wyniki do ich bazy danych izolatów. Średni czas identyfikacji w tych systemach wynosi około 4 godzin do 8 godzin, jednak są one ograniczone przez fakt, że producenci zalecają nocny wzrost drobnoustrojów, zanim będzie można zaszczepić ich odpowiednie karty identyfikacyjne. Wymóg ten znacznie ogranicza ich przydatność w skracaniu czasu zgłaszania.
Niewiele badań oceniało metody bezpośredniej identyfikacji mikrobów z +aBC za pomocą tych zautomatyzowanych systemów21,22,23,24,25,26,27. W przypadku +aBC zawierających monomorficzny GN, większość badań wykazała doskonałą zgodność między bezpośrednią inokulacją z osadu bakteryjnego wykonanego z dodatniej mieszaniny krwi i bulionu a standardową inkubacją kolonii. Jednak w przypadku Gram-dodatnich wskaźników zgodności były nieoptymalne. Ponieważ średni czas do dodatniego wyniku +aBC wynosi od 8 godzin do 16 godzin, a identyfikacja GN trwa od ~ 4 godzin do 8 godzin w zautomatyzowanym systemie identyfikacji drobnoustrojów, stawiamy hipotezę, że stosując protokół bezpośredniej inokulacji w automatycznej identyfikacji drobnoustrojów, możemy zakończyć raportowanie kliniczne +aBC z GN o RR-GN w ciągu 24 godzin od otrzymania próbki.
Ustawienie dla badania 
Niniejsze badanie zostało przeprowadzone w klinicznym laboratorium bakteriologicznym liczącego 950 łóżek, akademickiego instytutu opieki trzeciego stopnia o znaczeniu krajowym (INI) w środkowych Indiach od stycznia do października 2023 r. Laboratorium wyposażone jest w system ciągłego monitorowania posiewów krwi (CBCMS) oraz aMIAST. Laboratorium bakteriologiczne działa przez całą dobę z dostępnością techników i mikrobiologów do przetwarzania i raportowania każdej pozytywnie oznaczonej butelki z posiewem krwi (+aBC).
Metody mikrobiologiczne stosowane tutaj 
Przebieg badania jest pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. +aBC wykazujące monomorficzne GN (+naBC) zostały przetworzone przez bezpośrednią inokulację odpowiednich kart identyfikacyjnych w celu umożliwienia identyfikacji i AST przy użyciu protokołu EUCAST RAST. Wyniki te porównano z metodą standardowej opieki (SoC) dla +aBCs, tj. subkulturacją na konwencjonalnych pożywkach galwanicznych przez agar z krwią owczą (SBA), agar czekoladowy (CA) i agar MacConkey (MA), inkubowane tlenowo przez 16 godzin do 24 godzin, a następnie karty identyfikacyjne i AST podawane przez aMIAST, gdy pojawią się izolowane kolonie. Z badania wykluczono posiewy krwi wykazujące ziarniaki Gram-dodatnie, pałeczki Gram-dodatnie, pączkujące komórki drożdży i ≥2 różne mikroorganizmy na początkowym barwieniu Grama lub pożywce galwanicznej.

<table><tbody><tr><td><DYSKI PRZECIW>PRZECIWDROBNOUSTROJOWE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amikacyna dysk 30 &micro; g</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD035-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Dysk amoksyclav (20/10 &mikro; g)</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD063-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Cefotaksym dysk 5 i mikro; g</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD295E-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Ceftazydym dysk 10 i mikro; g</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD062A-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>krążek cyprofloksacyny (5 &mikro; g)</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD060-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Krążek ko-trimoksazolu (23,75/1,25 &mikro; g)</td> <td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD010-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Dysk gentamycyny 10 i mikro; g</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD016-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Dysk imipenemowy 10 i mikro; g</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD073-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Lewofloksacyna krążek 5 i mikro; g</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD216-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Meropenem dysk 10 i mikro; g&nbsp;</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD727-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Krążek piperacyliny-tazobaktamu (30/6 &mikro; g)</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD292E-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Tobramycyna dysk 10 &mikro; g</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>SD044-1VL</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe&nbsp;</td></tr><tr><td>ATCC Escherichia coli 25922</td><td>Microbiologics, Minnesota, USA</td><td>0335A Zalecany</td><td>szczep bakterii Gram-ujemny do kontroli jakości w RAST</td></tr><tr><td>BacT-Alert 3D 480</td><td>bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francja</td><td>412CM8423</td><td>Ciągły zautomatyzowany system hodowli krwi</td></tr><tr><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego II Typ A2</td><td>Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, Indie</td><td>DFP-2/21-22/149</td><td>Do ochrony przed czynnikami niebezpiecznymi&nbsp; i zakaźnymi oraz do utrzymania kontroli jakości</td></tr><tr><td>Agar z krwią nr 2</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>M834-500G</td><td>Przygotowanie agaru z krwią i agaru czekoladowego</td></tr><tr><td>Model wirówki klinicznej SP-8BL</td><td>Laby Instruments, Ambala, Indie</td><td>HLL/2021-22/021</td><td>Wirowanie z niską i wysoką prędkością do separacji supernatantu</td></tr><tr><td>Dozownik S Analogowo regulowany dozownik butelkowy&nbsp;</td><td>BrandTech, Essex CT, Anglia</td><td>V1200</td><td>Dozowanie dokładnej ilości soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>agaru MacConkey&nbsp;</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>M008-500G</td><td>Pożywki różnicowe do fermentorów laktozy / bez fermentorów Mikropipety Gram-ujemne pałeczki</td></tr><tr><td>(100-1000 i mikro; L)</td> <td>Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, Indie</td><td>NJ478162</td><td>Przenoszenie supernatantu po pierwszym odwirowaniu, odrzucanie supernatantu po drugim odwirowaniu</td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet (200-1000 i mikro; L)</td><td>&lrm; Tarsons Products Pvt. Ltd., Kalkuta, Indie</td><td>521020</td><td>Przenoszenie supernatantu po pierwszym odwirowaniu, odrzucanie supernatantu po drugim odwirowaniu</td></tr><tr><td>Agar Muellera-Hintona&nbsp;</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>M173-500G</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe metodą Kirby-Bauera pętli dyfuzji</td></tr><tr><td>dysku Nichrom D-4</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>LA019</td><td>Do smug na pożywce hodowlanej</td></tr><tr><td>Drut prosty Nichrome</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>LA022</td><td>Do szczepienia kłutego</td></tr><tr><td>Sterylne rękawiczki Nulife</td><td>MRK healthcare Pvt Limited, Bombaj, Indie</td><td></td><td>Dla bezpieczeństwa środki ostrożności</td></tr><tr><td>Zwykła fiolka (fiolka z czerwoną nakrętką), vacutainer Advance BD</td><td>Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA</td><td>367815</td><td>Otrzymywanie granulatu po drugim odwirowaniu</td></tr><tr><td>Krew owcza</td><td>Labline Trading Co., Hyderabad, Indie</td><td>70014</td><td>Przygotowanie agaru z krwią i agaru czekoladowego</td></tr><tr><td>SST II, vacutainer Advance BD</td><td>Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA</td><td>367954</td><td>Separacja sklarowanego osadu w pierwszym wirowaniu</td></tr><tr><td>Sterylny wacik bawełniany (z drewnianym patyczkiem)</td><td>Himedia, Bombaj, Indie</td><td>PW005-1X500NO</td><td>Hodowla na trawniku bulionu z posiewów krwi do badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe</td></tr><tr><td>Sterylna jednorazowa strzykawka podskórna 5 ml / cc</td><td>Nihal Healthcare, Solan, Indie</td><td>2213805NB2</td><td>Przygotowanie porcji z zestawu</td></tr><tr><td>referencyjnego +aBC VITEK DensiCHEK McFarland</td><td>bioMérieux, Marcy d' Etoille, Francja</td><td>422219</td><td>Densytometr do sprawdzania zmętnienia zawiesiny</td></tr><tr><td>VITEK roztwór soli fizjologicznej (0,45% NaCl)</td><td>bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francja</td><td>V1204</td><td>Regulacja standardowego zmętnienia McFarland</td></tr><tr><td>Stojak na rurki VITEK&nbsp;</td><td>bioMérieux, Marcy d' Etoille, Francja</td><td>533306-4 REV</td><td>Stojak do prawidłowego umieszczenia probówek przed zaszczepieniem dowodu osobistego</td></tr><tr><td>Probówki VITEK</td><td>bioMérieux, Marcy d' Etoille, Francja</td><td></td><td>Probówki do przygotowania inokulum</td></tr><tr><td>VITEK-2 Compact 60</td><td>bioMérieux, Marcy d' Etoille, Francja</td><td>VKC15144</td><td>Automatyczna identyfikacja i system AST</td></tr><tr><td>VITEK-2 GN card</td><td>bioMerieux, Marcy d' Etoille, Francja</td><td>21341</td><td>Identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych</td></tr></tbody></table>

bezpośrednia identyfikacja mikrobiologiczna przy użyciu zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów w celu ułatwienia metody eucast rast bez spektrometrii mas

Direct Microbial Identification using An Automated Microbial Identification System to Facilitate the EUCAST RAST Method Without Mass Spectrometry

Sepsa Gram-ujemna (GN) to nagły przypadek medyczny, w którym leczenie w warunkach ograniczonych zasobów opiera się na konwencjonalnych technikach hodowli mikrobiologicznej, które dostarczają wyniki w ciągu 3-4 dni. Uznając to opóźnienie w czasie realizacji (TAT), zarówno EUCAST, jak i CLSI opracowały protokoły do określania wyników AST bezpośrednio z pozytywnie oznaczonych automatycznych butelek do posiewu krwi (+aBC). Protokół EUCAST rapid AST (RAST) został po raz pierwszy wprowadzony w 2018 r., w którym można podać punkty graniczne średnicy strefy dla czterech powszechnych czynników etiologicznych sepsy GN, tj. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i kompleksu Acinetobacter baumannii. Jednak te laboratoria kliniczne, które wdrożyły tę metodę w swoim rutynowym przepływie pracy, polegają na identyfikacji drobnoustrojów opartej na spektrometrii mas, która nie jest łatwo dostępna, co wyklucza jej wdrożenie w warunkach ograniczonych zasobów. Aby go obejść, oceniliśmy protokół bezpośredniego inokulum (DIP) przy użyciu komercyjnego zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów i testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (aMIAST), aby umożliwić wczesną identyfikację drobnoustrojów w ciągu 8 godzin od pozytywnego oznaczenia aBC. Oceniliśmy ten protokół od stycznia do października 2023 r. w celu zidentyfikowania czterech raportowanych GN RR-GN (RR-GN) w pozytywnie oznaczonym aBC. Wyniki identyfikacji mikrobiologicznej w DIP porównano ze standardowym protokołem przygotowania inokulum (SIP) w aMIAST. Spośród 204 +aBC z monomorficznym GN (+naBC), jeden z 4 RR-GN został zidentyfikowany w 105 +naBC przez SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 i kompleks A. baumannii: 26). Spośród nich 94% (98/105) zostało prawidłowo zidentyfikowanych przez DIP, podczas gdy poziomy błędu głównego i bardzo poważnego błędu wynosiły odpowiednio 6% (7/105) i 1,7% (4/240). W przypadku gdy DIP do identyfikacji drobnoustrojów przeprowadza się przy użyciu metody EUCAST RAST, wstępne raporty kliniczne mogą zostać dostarczone w ciągu 24 godzin od otrzymania próbki. Podejście to może przyczynić się do znacznego zmniejszenia TAT, umożliwiając wczesne wprowadzenie odpowiedniej terapii przeciwdrobnoustrojowej.

Ogólne wyniki 
W okresie badania 240 +naBC poddano identyfikacji metodą aMIAST z wykorzystaniem zarówno DIP, jak i SIP. Spośród nich 15% (36/240) +naBC okazało się polimikrobowych po całonocnej inkubacji na posiewanych mediach. Z 204 +naBC odsetek RR-GN zidentyfikowanych za pomocą SIP wyniósł 51,5% (105/204). Wśród nich 47,6% (50/105) stanowiły E. coli, 19% (20/105) K. pneumoniae, 8,6% (9/105) P. aeruginosa oraz 24,8% (26/105) kompleks A. baumannii. Szczegółowy opis wszystkich wyników identyfikacji metodą SIP znajduje się w Tabeli 1.
Dokładność diagnostyczna w identyfikacji drobnoustrojów 
Z 105 RR-GN, 98 (93,3%) i 99 (94,2%) były zgodne z DIP odpowiednio do poziomu gatunku i rodzaju. Wskaźniki zgodności dla poszczególnych organizmów wynosiły 94% (47/50) dla E. coli, 90% (18/20) dla K. pneumoniae, 100% (9/9) dla P. aeruginosa oraz 92,3% (24/26) dla kompleksu A. baumannii, co przedstawiono w Tabeli 1. W 7 +naBCs wyniki były niezgodne do poziomu identyfikacji gatunkowej przy użyciu DIP, z czego aMIAST albo nie zidentyfikował organizmu (3), albo zidentyfikował Non-RR-GN (4), jak pokazano w Tabeli 2. Ponieważ wyniki te nie skłoniłyby mikrobiologa klinicznego do sporządzenia raportu, uznano je za błędy główne (ME). Wskaźnik ME w naszym badaniu wynosił 6,7% (7/105) do poziomu identyfikacji gatunkowej. Proporcja non-RR-GN w aMIAST przy użyciu SIP wyniosła 48,5% (99/204). Spośród nich 60 (60,6%) było zgodnych z DIP do poziomu identyfikacji gatunkowej. Wśród 99 non-RR-GN, w 4 +naBCs przy użyciu DIP zidentyfikowano RR-GN, jak pokazano w Tabeli 2. Taka niezgodność mogłaby doprowadzić do błędu w raportowaniu i została uznana za błąd bardzo główny (VME). Całkowity wskaźnik VME przy użyciu DIP wyniósł 1,7% (4/240). Pełny opis wyników identyfikacji i błędów dla wszystkich bakterii gram-ujemnych przedstawiono w Uzupełniającej Tabeli 1.
Skrócenie czasu do izolacyjnej identyfikacji (TTI) 
TTI dla zgodnych +naBCs w metodzie DIP był istotnie krótszy niż TTI w metodzie SIP (mediana (IQR): 507,5 min (685-404) vs 2171 min (2532-1855), P2 vs P1, p&lt;0,00001 (test Mann-Whitneya)). Mediana różnicy w TTI między obydwoma protokołami wyniosła 1635 min (IQR: 1964-1299).
<img alt="Schemat procesu posiewu krwi, porównujący Protokół Bezpośredniego Inokulum i Protokół Standardowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66588/66588fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat badania: przedstawiający przebieg badania dla pozytywnie oznaczonego butelki z posiewem krwi z monomorficznymi bakteriami gram-ujemnymi, przetwarzanych zgodnie z Protokołem Standardowym oraz Protokołem Bezpośredniego Inokulum. Skróty: +aBC = pozytywnie oznaczona butelka z posiewem krwi, +naBC = pozytywnie oznaczona butelka z posiewem krwi z monomorficznymi bakteriami gram-ujemnymi, DIP = Protokół Bezpośredniego Inokulum, SIP = Protokół Standardowego Inokulum, SBA = agar z krwią owczą, CA = agar czekoladowy, MA = agar MacConkey, RR-GN = raportowane przez RAST bakterie gram-ujemne, TAT = czas oczekiwania na wynik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66588/66588fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Probówki z testem hemolizy próbki krwi, wyniki eksperymentu pokazujące różny stopień hemolizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66588/66588fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Protokół bezpośredniego zaszczepiania w celu identyfikacji bakterii: przedstawiająca zdjęcia fiolek podczas wykonywania protokołu bezpośredniego zaszczepiania. Skróty: +naBC = pozytywnie oznaczony flakon krwi z bakteriami gram-ujemnymi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66588/66588fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td rowspan="2">Gram-ujemne bakterie zgłaszane przez RAST</td>
			<td rowspan="2">Przebadane izolaty (n)</td>
			<td >Zgodne</td>
			<td >Błędna identyfikacja</td>
			<td >Brak identyfikacji</td>
		</tr >
		<tr >
			<td > n (%)</td>
			<td >n (%)</td>
			<td >n (%)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Suma</td>
			<td >105</td>
			<td >98 (93,3%)</td>
			<td >4 (3,8%)</td>
			<td >3 (2,8%)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Escherichia coli</td>
			<td >50</td>
			<td >47 (94%)</td>
			<td >1</td>
			<td >2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Klebsiella pneumoniae</td>
			<td >20</td>
			<td >18 (90%)</td>
			<td >1</td>
			<td >1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >kompleks Acinetobacter baumannii</td>
			<td >26</td>
			<td >24 (92,3%)</td>
			<td >2#</td>
			<td >0</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa</td>
			<td >9</td>
			<td >9 (100%)</td>
			<td >0</td>
			<td >0</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="5"># Jeden izolat został poprawnie zidentyfikowany na poziomie rodzaju, ale nie na poziomie gatunku (kompleks Acinetobacter baumannii zidentyfikowany jako A. haemolyticus)</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Wyniki identyfikacji bakterii w protokole bezpośredniego inokulum. Wyniki dotyczą wyłącznie raportowalnych w systemie RAST bakterii Gram-ujemnych. Skróty: n = licznik, % = procent.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">bakterie Gram-ujemne</td>
			<td rowspan="3">Całkowita liczba przebadanych izolatów</td>
			<td colspan="3">Poważny błąd</td>
			<td>Bardzo poważny błąd, n (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Numer</td>
			<td>Błędna identyfikacja</td>
			<td>Brak identyfikatora</td>
			<td>(zidentyfikowany jako)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n (%)</td>
			<td>n</td>
			<td>n</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>50</td>
			<td>3 (6%)</td>
			<td>1 (A. haemolyticus)</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klebsiella pneumoniae</td>
			<td>20</td>
			<td>2 (10%)</td>
			<td>1 (Ralstonia pickettii)</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acinetobacter baumannii kompleks</td>
			<td>26</td>
			<td>2 (7.7%)</td>
			<td>2 (A. hemolyticus, Cupriaviadus pauculus)</td>
			<td>-</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Salmonella spp.</td>
			<td rowspan="2">10</td>
			<td rowspan="2">ND</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>1 (10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E. coli)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Enterobacter cloacae kompleks</td>
			<td rowspan="2">8</td>
			<td rowspan="2">ND</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>1 (12.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E. coli)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Acinetobacter lwoffi</td>
			<td rowspan="2">14</td>
			<td rowspan="2">ND</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>1 (7.1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(kompleks A. baumannii)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sphingomonas paucimobilis</td>
			<td rowspan="2">9</td>
			<td rowspan="2">ND</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>1 (11.1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(*K. pneumoniae*)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">Skróty – n: licznik, %: procent, ID: identyfikacja, NA: nie dotyczy, </td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">W wyniku przeprowadzenia analizy z wykorzystaniem oprogramowania Prism, wykresy słupkowe przedstawiają średnie wartości wraz z błędami standardowymi średniej (SEM). Wszystkie dane zostały poddane testowi ANOVA, a istotność statystyczna została określona za pomocą testu t Studenta dla każdej pary porównawczej. P-wartości wskazano na wykresach w następujący sposób: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Acinetobacter, E: Escherichia, K: Klebsiella</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Szczegóły błędów głównych i bardzo głównych w protokole bezpośredniego szczepienia. Skróty: n = licznik, % = procent, ID = identyfikacja, NA = nie dotyczy, A = Acinetobacter, E = Escherichia, K = Klebsiella.
Tabela uzupełniająca 1: Szczegółowe wyniki identyfikacji organizmów w obu protokołach wraz z wynikami błędów w protokole z bezpośrednim inokulum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66588/Supplementary%20Table%201_RE.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

EUCAST opracował protokół bezpośredniego testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) dla automatycznych hodowli krwi. Jednak jego zależność od identyfikacji mikrobiologicznej opartej na spektrometrii mas można wyeliminować, stosując protokół bezpośredniego przygotowania inokulum w zautomatyzowanym systemie identyfikacji drobnoustrojów. Takie podejście może dostarczyć raporty AST w ciągu 24 godzin od pobrania próbki.

Bezpośrednia identyfikacja mikrobiologiczna przy użyciu zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów w celu ułatwienia metody EUCAST RAST bez spektrometrii mas

Gram-negative (GN) sepsis is a medical emergency where management in resource-limited settings relies on conventional microbiological culture techniques ...

Badania te mają na celu ocenę dokładności diagnostycznej Gram-ujemnych bezpośrednio z dodatnio płaskich butelek do hodowli krwi za pomocą zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów. Celem jest wykorzystanie go jako narzędzia do wczesnego raportowania klinicznego za pomocą metody szybkiego badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe EUCAST. Metoda EUCAST RAST została niedawno wprowadzona w 2018 r., aby umożliwić zgłaszanie wyników testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w ciągu czterech do ośmiu godzin od pozytywnego oznaczenia automatycznych butelek do posiewów krwi.Polega ona na wykonaniu metody dyfuzji krążków Kirby'ego-Bauera bezpośrednio z pozytywnie oznaczonej butelki i odczytaniu wyników po czterech, sześciu lub ośmiu godzinach. W przypadku raportowania klinicznego metodą EUCAST RAST identyfikacja drobnoustrojów jest warunkiem wstępnym do określenia kategorii interpretacyjnej wyników AST. Głównym wyzwaniem przy wdrażaniu tej metody jest wczesna identyfikacja mikroorganizmów w ciągu ośmiu godzin, zwłaszcza w warunkach ubogich w zasoby, w których brakuje spektrometrii mas.Odkryliśmy, że protokół inokulum bezpośredniego był w około 94% dokładny w identyfikacji Gram-ujemnego zgłaszanego przez RASTA, który obejmuje Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i kompleks Acinetobacter baumannii. To podejście polegające na bezpośredniej identyfikacji Gram-ujemnego było około cztery razy szybsze niż standardowe podejście do identyfikacji po całonocnej inkubacji. Skupimy się teraz na ocenie wpływu tego podejścia do raportowania klinicznego w sepsie Gram-ujemnej na wyniki pacjentów pod względem długości hospitalizacji i śmiertelności.Co więcej, może być również stosowany jako narzędzie do ograniczania stosowania środków przeciwdrobnoustrojowych w celu ułatwienia tortur przeciwdrobnoustrojowych. Aby rozpocząć, należy pobrać wymaz z przegrody automatycznej butelki do hodowli krwi zawierającej monomorficzne organizmy Gram-ujemne z 70% alkoholem izopropylowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej. Następnie pobrać jeden mililitr mieszaniny bulionu krwionośnego do sterylnej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 21.Naniec dużą kroplę mieszaniny na powierzchnię podanego podłoża. Po ułożeniu płytek inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Sprawdź płytki pod kątem izolowanych kolonii wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.Następnie należy rozlać trzy mililitry sterylnego roztworu soli fizjologicznej do probówki z butelką z dozownikiem. Teraz zbierz od trzech do pięciu morfologicznie podobnych kolonii za pomocą sterylnego prostego drutu do zaszczepiania. Przenieść inokulum do pierwszej probówki, użyć soli fizjologicznej i densytometru, aby dostosować zmętnienie zawiesiny w zakresie od 0,47 do 0,63 McFarlanda.Następnie umieścić nasadkę kapilarną gram-ujemnej karty identyfikacyjnej aMIAST w pierwszej probówce. Umieść wybrane karty na kasecie. Teraz załaduj kasetę na swoje miejsce w komorze napełniania z kodem kreskowym próbki skierowanym do wewnątrz.Zamknij drzwi i naciśnij wypełnienie na ekranie interfejsu użytkownika. Po zakończeniu cyklu napełniania niebieska lampka kontrolna na systemie zacznie migać. Teraz przenieś kasetę z komory napełniania do komory załadowczej.Usuń odpływ kasety po zakończeniu ładowania. Subkulturować pozostałą zawiesinę w probówkach na agarze CLED w celu sprawdzenia czystości izolatów. Standardowy protokół inokulum zidentyfikował 105 z 204 testowanych izolatów jako Gram-ujemne raportowane przez RASTA, z Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i kompleksem Acinetobacter baumanni jako głównymi zidentyfikowanymi organizmami.Aby rozpocząć, należy pobrać wymaz z przegrody automatycznej butelki do hodowli krwi zawierającej monomorficzne organizmy Gram-ujemne z 70% alkoholem izopropylowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej. Pobrać pięć mililitrów mieszaniny bulionu krwionośnego do sterylnej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 21. Następnie zdezynfekuj gumową przegrodę gumowej rurki separatora.Przenieść mieszaninę bulionu z krwi do probówki, odwirować próbkę o stężeniu 160 G przez 10 minut. Teraz ostrożnie odpipetować supernatant znajdujący się w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieść supernatant do nowej fiolki z czystą krwią.Umieścić zakręconą fiolkę w wirówce o stężeniu 2000 G na 10 minut. Teraz odessać supernatant sterylną pipetą. Następnie należy rozlać trzy mililitry sterylnego roztworu soli fizjologicznej do probówki z butelką z dozownikiem.Za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania pobrać granulat bakteryjny z dna fiolki i wprowadzić go do probówki aMIAST. Użyj sterylnego roztworu soli fizjologicznej i densytometru, aby wyregulować zmętnienie zawiesiny w zakresie od 0,47 do 0,63. Następnie umieścić nasadkę kapilarną gram-ujemnej karty identyfikacyjnej aMIAST w pierwszej probówce.Umieść wybrane karty odpowiednio na kasecie. Teraz załaduj kasetę na swoje miejsce w komorze napełniania z kodem kreskowym próbki skierowanym do wewnątrz, zamknij drzwiczki i naciśnij przycisk napełnij na ekranie interfejsu użytkownika. Po zakończeniu cyklu napełniania niebieska lampka kontrolna na systemie zacznie migać.Teraz przenieś kasetę z komory napełniania do komory załadowczej. Usuń odpływ kasety po zakończeniu ładowania. Subkulturować pozostałą zawiesinę w probówkach na agarze CLED w celu sprawdzenia czystości izolatów.Wyniki siedmiu dodatnich butelek z posiewem krwi zidentyfikowanych przy użyciu protokołu bezpośredniego inokulum były niezgodne aż do tego poziomu gatunku. Spośród 105 raportowalnych Gram-ujemnych wyników RAST zidentyfikowanych przez standardowy protokół inokulum, 98 zostało prawidłowo zidentyfikowanych przez protokół inokulum bezpośredniego. Spośród 99 Gram-ujemnych wyników nieraportowanych przez RASTA, Gram-ujemny raportowany przez RAST został zidentyfikowany w czterech butelkach z dodatnim posiewem krwi.Na początek umieść dwa niezaszczepione 90 milimetrowe Muellera na płytkach agarowych w komorze bezpieczeństwa biologicznego. W rękawiczkach wyczyść przegrodę automatycznej butelki do hodowli krwi zawierającej monomorficzne organizmy Gram-ujemne z 70% alkoholem izopropylowym. Za pomocą sterylnej strzykawki odessać od 100 do 150 mikrolitrów nierozcieńczonej mieszaniny bulionu krwionośnego z butelki do hodowli krwi.Dodaj próbkę do środka Muellera do płytki agarowej. Teraz użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby delikatnie rozprowadzić bulion na talerzach w trzech kierunkach. Następnie nałóż około sześciu lub mniej krążków przeciwbakteryjnych na każdą płytkę.Przenieś płytki do inkubatora tlenowego w temperaturze 35 stopni Celsjusza na osiem godzin. Po zakończeniu inokulacji należy obserwować czystość izolatu. Przeczytaj strefy hamowania w ciągu ośmiu godzin, daj lub poświęć pięć minut.Użyj tabeli punktów przerwania RAST do krótkiej inkubacji, aby zinterpretować wyniki. Po sprawdzeniu wyników identyfikacji bakterii w aMIAST. Do cotygodniowych badań kontroli jakości metodą RAST.Umieść cztery sterylne szklane probówki na stojaku na probówki. Wlej sterylną sól fizjologiczną do probówek. Następnie przenieś szczep QC z izolowanych kolonii nocnej kultury do pierwszej probówki, aby utworzyć zawiesinę 0,5 McFarlanda za pomocą sterylnej pipety i końcówki.Przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny z pierwszej rurki do drugiej rurki. Po wymieszaniu przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny z drugiej do trzeciej rurki, a następnie do ostatniej probówki. Następnie weź jeden mililitr inokulum z ostatniej probówki za pomocą sterylnej strzykawki.Przenieś inokulum do automatycznej butelki do hodowli krwi po pobraniu wymazu z przegrody 70% alkoholem izopropylowym. Równocześnie z oddzielną sterylną igłą dodaj pięć mililitrów sterylnej krwi w arkuszu do tej samej butelki z posiewem krwi. Inkubuj go w systemie ciągłego monitorowania posiewu krwi, aż oznaczy się pozytywnie.

direct-microbial-identification-using-an-automated-microbial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zastosowanie spektrometrii mas (MS) z laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) bezpośrednio do bulionu z hodowli krwi przyspiesza identyfikację bakterii. Przedstawiona metoda jest szybką i wiarygodną metodą identyfikacji bakterii Gram-ujemnych bezpośrednio z bulionu z posiewów krwi.

Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF

Szybki preparat bakteryjny z dodatniego posiewu krwi może być użyty jako próbka do zastosowań takich jak identyfikacja za pomocą MALDI-TOF, barwienie metodą Grama, testowanie wrażliwości na antybiotyki i test oparty na PCR. Wyniki mogą być szybko przekazywane klinicystom w celu poprawy wyników leczenia pacjentów cierpiących na infekcje krwi.

Przygotowanie osadu do hodowli krwi w celu szybkiej identyfikacji bakterii i badania wrażliwości na antybiotyki

Ta praca szczegółowo opisuje procedury szybkiej identyfikacji bakterii za pomocą MALDI-TOF MS. Procedury identyfikacji obejmują akwizycję widma, budowę bazy danych i analizy następcze. Przedstawiono dwie metody identyfikacji: opartą na współczynniku podobieństwa i metodę opartą na biomarkerach.

Wykorzystanie spektrometrii mas MALDI-TOF i niestandardowej bazy danych do scharakteryzowania bakterii występujących w unikalnym środowisku jaskiniowym (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

Przedstawiono metodę identyfikacji gatunków materiału botanicznego poprzez bezpośrednią analizę w czasie rzeczywistym - spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości i wielowymiarowa analiza statystyczna.

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie barwnika fluorescencyjnego estru succinimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) do identyfikacji i separacji różnych subpopulacji komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym na podstawie częstotliwości podziałów komórkowych.

Identyfikacja i izolacja wolno dzielących się komórek w ludzkim glejaku wielopostaciowym z wykorzystaniem karboksyfluoresceiny w postaci estru sukcynimidylowego (CFSE)

Opracowaliśmy prostą, niezawodną i stosunkowo tanią metodę intubacji dotchawiczej u myszy za pomocą bezpośredniej laryngoskopii przy użyciu otoskopu z wziernikiem 2,0 mm. Technika ta jest atraumatyczna i może być stosowana do powtarzania pomiarów w przewlekłych eksperymentach. Uważamy, że jest lepsza od tracheostomii lub wcześniej opisanych technik niechirurgicznych.

Intubacja dotchawicza u myszy za pomocą laryngoskopii bezpośredniej przy użyciu otoskopu

Techniki wielowymiarowe, w tym analiza głównych składowych (PCA), zostały wykorzystane do identyfikacji wzorców sygnatur zmian regionalnych w funkcjonalnych obrazach mózgu. Opracowaliśmy algorytm identyfikacji powtarzalnych biomarkerów sieciowych do diagnostyki chorób neurodegeneracyjnych, oceny progresji choroby oraz obiektywnej oceny efektów leczenia w populacjach pacjentów.

Identyfikacja wzorców kowariancji przestrzennej związanych z chorobą przy użyciu danych neuroobrazowych

Poznaj zautomatyzowaną identyfikację bakterii Gram-ujemnych z dodatnich hodowli krwi w celu wdrożenia metody EUCAST RAST. To podejście przyspiesza raportowanie wrażliwości na antybiotyki w zasobowo ograniczonych środowiskach.

Bezpośrednia identyfikacja mikrobiologiczna przy użyciu zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów w celu ułatwienia metody EUCAST RAST bez spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal

Bezpośrednia identyfikacja mikrobiologiczna przy użyciu zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów w celu ułatwienia metody EUCAST RAST bez spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów