Bezpośrednia identyfikacja mikrobiologiczna przy użyciu zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów w celu ułatwienia metody EUCAST RAST bez spektrometrii mas
May 24th, 2024
EUCAST opracował protokół bezpośredniego testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) dla automatycznych hodowli krwi. Jednak jego zależność od identyfikacji mikrobiologicznej opartej na spektrometrii mas można wyeliminować, stosując protokół bezpośredniego przygotowania inokulum w zautomatyzowanym systemie identyfikacji drobnoustrojów. Takie podejście może dostarczyć raporty AST w ciągu 24 godzin od pobrania próbki.
Badania te mają na celu ocenę dokładności diagnostycznej Gram-ujemnych bezpośrednio z dodatnio płaskich butelek do hodowli krwi za pomocą zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów. Celem jest wykorzystanie go jako narzędzia do wczesnego raportowania klinicznego za pomocą metody szybkiego badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe EUCAST. Metoda EUCAST RAST została niedawno wprowadzona w 2018 r., aby umożliwić zgłaszanie wyników testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w ciągu czterech do ośmiu godzin od pozytywnego oznaczenia automatycznych butelek do posiewów krwi.
Polega ona na wykonaniu metody dyfuzji krążków Kirby'ego-Bauera bezpośrednio z pozytywnie oznaczonej butelki i odczytaniu wyników po czterech, sześciu lub ośmiu godzinach. W przypadku raportowania klinicznego metodą EUCAST RAST identyfikacja drobnoustrojów jest warunkiem wstępnym do określenia kategorii interpretacyjnej wyników AST. Głównym wyzwaniem przy wdrażaniu tej metody jest wczesna identyfikacja mikroorganizmów w ciągu ośmiu godzin, zwłaszcza w warunkach ubogich w zasoby, w których brakuje spektrometrii mas.
Odkryliśmy, że protokół inokulum bezpośredniego był w około 94% dokładny w identyfikacji Gram-ujemnego zgłaszanego przez RASTA, który obejmuje Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i kompleks Acinetobacter baumannii. To podejście polegające na bezpośredniej identyfikacji Gram-ujemnego było około cztery razy szybsze niż standardowe podejście do identyfikacji po całonocnej inkubacji. Skupimy się teraz na ocenie wpływu tego podejścia do raportowania klinicznego w sepsie Gram-ujemnej na wyniki pacjentów pod względem długości hospitalizacji i śmiertelności.
Co więcej, może być również stosowany jako narzędzie do ograniczania stosowania środków przeciwdrobnoustrojowych w celu ułatwienia tortur przeciwdrobnoustrojowych. Aby rozpocząć, należy pobrać wymaz z przegrody automatycznej butelki do hodowli krwi zawierającej monomorficzne organizmy Gram-ujemne z 70% alkoholem izopropylowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej. Następnie pobrać jeden mililitr mieszaniny bulionu krwionośnego do sterylnej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 21.
Naniec dużą kroplę mieszaniny na powierzchnię podanego podłoża. Po ułożeniu płytek inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Sprawdź płytki pod kątem izolowanych kolonii wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.
Następnie należy rozlać trzy mililitry sterylnego roztworu soli fizjologicznej do probówki z butelką z dozownikiem. Teraz zbierz od trzech do pięciu morfologicznie podobnych kolonii za pomocą sterylnego prostego drutu do zaszczepiania. Przenieść inokulum do pierwszej probówki, użyć soli fizjologicznej i densytometru, aby dostosować zmętnienie zawiesiny w zakresie od 0,47 do 0,63 McFarlanda.
Następnie umieścić nasadkę kapilarną gram-ujemnej karty identyfikacyjnej aMIAST w pierwszej probówce. Umieść wybrane karty na kasecie. Teraz załaduj kasetę na swoje miejsce w komorze napełniania z kodem kreskowym próbki skierowanym do wewnątrz.
Zamknij drzwi i naciśnij wypełnienie na ekranie interfejsu użytkownika. Po zakończeniu cyklu napełniania niebieska lampka kontrolna na systemie zacznie migać. Teraz przenieś kasetę z komory napełniania do komory załadowczej.
Usuń odpływ kasety po zakończeniu ładowania. Subkulturować pozostałą zawiesinę w probówkach na agarze CLED w celu sprawdzenia czystości izolatów. Standardowy protokół inokulum zidentyfikował 105 z 204 testowanych izolatów jako Gram-ujemne raportowane przez RASTA, z Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i kompleksem Acinetobacter baumanni jako głównymi zidentyfikowanymi organizmami.
Aby rozpocząć, należy pobrać wymaz z przegrody automatycznej butelki do hodowli krwi zawierającej monomorficzne organizmy Gram-ujemne z 70% alkoholem izopropylowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej. Pobrać pięć mililitrów mieszaniny bulionu krwionośnego do sterylnej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 21. Następnie zdezynfekuj gumową przegrodę gumowej rurki separatora.
Przenieść mieszaninę bulionu z krwi do probówki, odwirować próbkę o stężeniu 160 G przez 10 minut. Teraz ostrożnie odpipetować supernatant znajdujący się w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przenieść supernatant do nowej fiolki z czystą krwią.
Umieścić zakręconą fiolkę w wirówce o stężeniu 2000 G na 10 minut. Teraz odessać supernatant sterylną pipetą. Następnie należy rozlać trzy mililitry sterylnego roztworu soli fizjologicznej do probówki z butelką z dozownikiem.
Za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania pobrać granulat bakteryjny z dna fiolki i wprowadzić go do probówki aMIAST. Użyj sterylnego roztworu soli fizjologicznej i densytometru, aby wyregulować zmętnienie zawiesiny w zakresie od 0,47 do 0,63. Następnie umieścić nasadkę kapilarną gram-ujemnej karty identyfikacyjnej aMIAST w pierwszej probówce.
Umieść wybrane karty odpowiednio na kasecie. Teraz załaduj kasetę na swoje miejsce w komorze napełniania z kodem kreskowym próbki skierowanym do wewnątrz, zamknij drzwiczki i naciśnij przycisk napełnij na ekranie interfejsu użytkownika. Po zakończeniu cyklu napełniania niebieska lampka kontrolna na systemie zacznie migać.
Teraz przenieś kasetę z komory napełniania do komory załadowczej. Usuń odpływ kasety po zakończeniu ładowania. Subkulturować pozostałą zawiesinę w probówkach na agarze CLED w celu sprawdzenia czystości izolatów.
Wyniki siedmiu dodatnich butelek z posiewem krwi zidentyfikowanych przy użyciu protokołu bezpośredniego inokulum były niezgodne aż do tego poziomu gatunku. Spośród 105 raportowalnych Gram-ujemnych wyników RAST zidentyfikowanych przez standardowy protokół inokulum, 98 zostało prawidłowo zidentyfikowanych przez protokół inokulum bezpośredniego. Spośród 99 Gram-ujemnych wyników nieraportowanych przez RASTA, Gram-ujemny raportowany przez RAST został zidentyfikowany w czterech butelkach z dodatnim posiewem krwi.
Na początek umieść dwa niezaszczepione 90 milimetrowe Muellera na płytkach agarowych w komorze bezpieczeństwa biologicznego. W rękawiczkach wyczyść przegrodę automatycznej butelki do hodowli krwi zawierającej monomorficzne organizmy Gram-ujemne z 70% alkoholem izopropylowym. Za pomocą sterylnej strzykawki odessać od 100 do 150 mikrolitrów nierozcieńczonej mieszaniny bulionu krwionośnego z butelki do hodowli krwi.
Dodaj próbkę do środka Muellera do płytki agarowej. Teraz użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby delikatnie rozprowadzić bulion na talerzach w trzech kierunkach. Następnie nałóż około sześciu lub mniej krążków przeciwbakteryjnych na każdą płytkę.
Przenieś płytki do inkubatora tlenowego w temperaturze 35 stopni Celsjusza na osiem godzin. Po zakończeniu inokulacji należy obserwować czystość izolatu. Przeczytaj strefy hamowania w ciągu ośmiu godzin, daj lub poświęć pięć minut.
Użyj tabeli punktów przerwania RAST do krótkiej inkubacji, aby zinterpretować wyniki. Po sprawdzeniu wyników identyfikacji bakterii w aMIAST. Do cotygodniowych badań kontroli jakości metodą RAST.
Umieść cztery sterylne szklane probówki na stojaku na probówki. Wlej sterylną sól fizjologiczną do probówek. Następnie przenieś szczep QC z izolowanych kolonii nocnej kultury do pierwszej probówki, aby utworzyć zawiesinę 0,5 McFarlanda za pomocą sterylnej pipety i końcówki.
Przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny z pierwszej rurki do drugiej rurki. Po wymieszaniu przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny z drugiej do trzeciej rurki, a następnie do ostatniej probówki. Następnie weź jeden mililitr inokulum z ostatniej probówki za pomocą sterylnej strzykawki.
Przenieś inokulum do automatycznej butelki do hodowli krwi po pobraniu wymazu z przegrody 70% alkoholem izopropylowym. Równocześnie z oddzielną sterylną igłą dodaj pięć mililitrów sterylnej krwi w arkuszu do tej samej butelki z posiewem krwi. Inkubuj go w systemie ciągłego monitorowania posiewu krwi, aż oznaczy się pozytywnie.
Przegląd
To badanie ocenia dokładność diagnostyczną identyfikacji bakterii Gram-ujemnych bezpośrednio z butelek z dodatnią hodowlą krwi z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu identyfikacji mikroorganizmów. Celem jest ułatwienie wczesnego raportowania klinicznego poprzez metodę szybkiego badania wrażliwości na antybiotyki EUCAST (RAST).
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Diagnostyka kliniczna
- Oporność na antybiotyki
Tło
- Metoda EUCAST RAST została wprowadzona w 2018 roku.
- Zezwala na raportowanie wyników badania wrażliwości na antybiotyki w ciągu czterech do ośmiu godzin.
- Metoda wykorzystuje technikę dyskusji dysków Kirby-Bauer.
- Identyfikacja mikroorganizmów jest niezbędna do interpretacji wyników AST.
Cel badania
- Ocenić dokładność identyfikacji bakterii Gram-ujemnych z hodowli krwi.
- Zaimplementować metodę EUCAST RAST dla szybszej raportacji klinicznej.
- Rozwiązać wyzwania w warunkach o ograniczonych zasobach bez spektrometru mas.
Zastosowane metody
- Zautomatyzowany system identyfikacji mikroorganizmów.
- Bezpośrednie przygotowanie inokulum z butelek z dodatnią hodowlą krwi.
- Metoda dyskusji dysków Kirby-Bauer.
- Odczytywanie wyników po czterech, sześciu lub ośmiu godzinach po zaznaczeniu.
Główne wyniki
- Wykazano dokładność diagnostyczną identyfikacji Gram-ujemnych.
- Ułatniono wczesne raportowanie wrażliwości na antybiotyki.
- Zidentyfikowano wyzwania w szybkiej identyfikacji mikroorganizmów.
- Wykazano potencjał zastosowania w warunkach o ograniczonych zasobach.
Wnioski
- Metoda EUCAST RAST może znacznie skrócić czas raportowania wyników AST.
- Wczesna identyfikacja mikroorganizmów jest kluczowa dla skutecznego leczenia.
- Potrzebne są dalsze badania, aby zoptymalizować metodę w różnych warunkach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accelerating Gram-negative pathogen identification and antimicrobial susceptibility testing (AST) is critical for timely intervention in sepsis, especially in resource-limited settings. The direct inoculum protocol (DIP) using automated microbial identification systems enables rapid, mass spectrometry-independent implementation of the EUCAST RAST method, reducing turnaround time from days to hours. This capability supports earlier, data-driven therapeutic decisions and enhances portfolio-wide predictive confidence in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid hypothesis testing of antimicrobial efficacy against clinically relevant Gram-negative pathogens.
- Supports functional validation of microbial targets by providing early, accurate identification data.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying pathogen identity prior to AST interpretation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microbial samples for downstream AST workflows without reliance on mass spectrometry.
- Improves assay reproducibility and standardization through automated identification and direct inoculum preparation.
- Enables high-throughput screening readiness by reducing sample processing time and manual intervention.
Translational & Preclinical Research
- Aligns rapid microbial identification with translational biomarker strategies for infectious disease models.
- Supports continuity from clinical isolate identification to preclinical AST validation.
- Reduces risk in advancing candidate antimicrobials by providing early, actionable data on pathogen susceptibility.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of clinical isolate acquisition and AST, bridging early discovery and translational research for infectious disease portfolios.
- Discovery Biology: Provides rapid, accurate identification to support hypothesis-driven AST studies.
- Screening: Delivers standardized, reproducible microbial inputs for quantitative AST readouts.
- Analytics: Generates zone diameter and identification data to enable robust statistical comparison of antimicrobial effects.
- Translational Research: Facilitates alignment of clinical and preclinical workflows by mirroring real-world diagnostic timelines.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, mass spectrometry-independent workflow adaptable across diverse laboratory settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in AST results by ensuring early, accurate pathogen identification.
- Operational Value: Standardizes and accelerates microbial identification, reducing manual labor and turnaround time.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions for antimicrobial candidates and supports capital-efficient R&D operations.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk and supports risk-adjusted prioritization of infectious disease assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in automated microbial identification systems and AST interpretation.
- Needs access to validated instrumentation and biosafety infrastructure for sample handling.
- Demands cross-team standardization of inoculum preparation and data interpretation protocols.
- Adaptable to settings lacking mass spectrometry, expanding accessibility in resource-limited environments.
- Accuracy and error rates must be monitored to ensure reliable clinical and R&D outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:15
Standard Inoculum Protocol (SIP) for Bacterial Identification Using an Automated Microbial Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing System(aMIAST)
4:22
Direct Inoculum Protocol (DIP) for Bacterial Identification Using an Automated Microbial Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing System(aMIAST)
6:52
Antimicrobial Susceptibility Test (AST) Using the EUCAST Rapid Antimicrobial Sensitivity Testing (RAST)
8:00
Quality Control Testing for Rapid Antimicrobial Sensitivity Testing (RAST)
