Name: Przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 48 s
Description: Poznaj protokół przygotowania próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej z użyciem techniki FIB-SEM. Ta metoda umożliwia rekonstrukcję nanostruktur 3D terminali fotoreceptorów myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Narodowego Programu Badań i Rozwoju Chin (2022YFA1105503), Państwowego Kluczowego Laboratorium Neuronauki (SKLN-202103), Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych Zhejiang (Y21H120019).

Protokoły opieki nad zwierzętami i ich użytkowania zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Wenzhou i były zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Stowarzyszenie Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO). Wszystkie myszy utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światła i 12-godzinnym cyklu ciemności i zaopatrywano je w standardową dietę karmową.
1. Sekcja i fiksacja siatkówki
<ol>
	<li>Znieczulić myszy (C57BL/6J, samiec, 8 tygodni, 20-25 g) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo 2,2,2-tribromoetanolu (0,25 mg/g masy ciała). Potwierdź głębokość znieczulenia, nie cofając tylnej łapy po uszczypnięciu palca u nogi lub nie odruchując mrugania. Następnie zwichnij kręg szyjny jeszcze pod narkozą, aby poddać zwierzę eutanazji. 
	UWAGA: Tribromoetanol został wybrany ze względu na jego dobrze udokumentowaną skuteczność w wywoływaniu szybkiego i niezawodnego znieczulenia u małych modeli zwierzęcych, szczególnie w przypadku zabiegów krótkoterminowych. Chociaż preferowane są środki znieczulające klasy farmaceutycznej, tribromoetanol oferuje szczególne zalety w niektórych protokołach, co czyni go odpowiednią alternatywą, jeśli jest odpowiednio przygotowany i podany. Podjęto wszelkie środki ostrożności, aby zapewnić jego bezpieczne i skuteczne stosowanie. Badanie to jest zgodne z względami etycznymi, zapewniając odpowiednie przygotowanie, podawanie i monitorowanie w celu ograniczenia potencjalnego ryzyka związanego z jego stosowaniem.</li>
	<li>Usuń oczy zakrzywionymi nożyczkami i zanurz je w mieszanym roztworze zawierającym 2% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu w buforze fosforanowym (PB, 0,1 M, pH 7,4).</li>
	<li>Usuń przedni odcinek i ciało szkliste z oczu za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Oderwij twardówkę dwoma kleszkami, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana od muszli ocznej.</li>
	<li>Szybko pokrój siatkówkę na paski o grubości 100 - 200 μm za pomocą brzytwy i przenieś paski siatkówki za pomocą pipety Pasteura do nowej probówki do mikrowirówki (EP) zawierającej 2% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu w buforze fosforanowym (PB, 0,1 M, pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) na rotatorze. Po zakończeniu umieścić probówki w temperaturze 4 °C na 24 godziny.</li>
</ol>
2. Przykładowy proces osadzania
<ol>
	<li>Po przemyciu 0,1 M buforu kakodylanu sodu (pH 7,4) 5 razy przez 15 minut każdy, inkubować paski siatkówki z roztworem zawierającym 1,5% żelazocyjanku potasu i 1% OsO4 (w PB, pH 7,4) w 0,1 M kakodylanu sodu z 4 mM CaCl2 przez 1,5 h w ciemności na lodzie. 
	UWAGA: Ciemna inkubacja i brak fosforanów mogą zapobiec wytrącaniu się osadów i artefaktom w próbce.</li>
	<li>Przemyj paski siatkówki 3 razy w ddH2O przez 10 minut każdy, a następnie potraktuj 1% tiokarbohydrazydem w ddH2O przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po przepłukaniu w ddH2O 3 razy przez 15 minut każdy, inkubować paski siatkówki w 2% OsO4 (w PB, PH 7,4) przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po przemyciu w ddH2O 3 razy przez 15 minut każdy, zanurzyć paski siatkówki w 1% wodnym octanie uranylu w ciemności w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia, po umyciu w ddH2O 3 razy po 15 minut, potraktuj paski siatkówki 0,66% azotanem ołowiu w kwasie L-asparaginowym (0,03 M, pH 5,5) przez 40 minut w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Po przemyciu w ddH2O 3 razy przez 15 minut każdy, odwodnić paski siatkówki rosnącym stężeniem etanolu 30%, 50%, 70%, 90% i 100% przez 20 minut w każdym roztworze.</li>
	<li>Paski siatkówki należy traktować mieszanym roztworem zawierającym równy etanol i aceton przez 20 minut, a następnie płukać acetonem 2 razy po 20 minut.</li>
	<li>Naciekać paski siatkówki w acetonie/żywicy zmieszanym w stosunku 7:3 w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc, a następnie acetonem/żywicą w proporcji 3:7 w ciemności przez 24 godziny w temperaturze 
	UWAGA: Dokładny skład żywicy jest następujący: Epon812 10,06 ml, DDSA 4 mL, MNA 5,94 ml i DMP-30 0,2 ml.</li>
	<li>Następnego dnia należy wymienić rurki i infiltrować paski siatkówki czystą żywicą przez 24 godziny w temperaturze 45 °C. Następnego dnia ponownie wymienić żywicę i zatopić paski siatkówki na 48 godzin w temperaturze 60 °C. 
	UWAGA: Celem zwiększenia temperatury jest poprawa penetracji.</li>
</ol>
3. Wybór obszaru zainteresowań
<ol>
	<li>Pokrój bloki żywicy na odcinki o grubości 1 μm, wybarwij skrawki 1% błękitu toluidynowego i obserwuj ogólną strukturę siatkówki pod mikroskopią świetlną, aby wybrać szorstkie obszary zainteresowania.</li>
	<li>Pokryj bloki żywicy platyną za pomocą napylarki, a następnie miel o grubości 70 nm za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ze skupioną wiązką jonów pod prądem 0,23 nA i napięciem przyspieszenia 30 kV.</li>
	<li>Wstępnie prześwietl sekcję za pomocą FIB-SEM z 2000-krotnym powiększeniem, aby zidentyfikować dokładne obszary zainteresowania.</li>
	<li>Zbieraj dane za pomocą FIB-SEM o prądzie wiązki 0,69 nA i napięciu przyspieszenia 2 kV. Pozostałe parametry są następujące: czas przebywania = 2 μs, rozmiar woksela = 1,8 nm x 1,8 nm x 15 nm.</li>
</ol>

Visualizing Retinal Synaptic Structures in 3D with Volume Electron Microscopy

<ol><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+in+molecular+structural+biology%3A+A+historical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey.</a> Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).</li>
<li>Varsano, N., Wolf, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+cellular+ultrastructure+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions.</a> Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).</li>
<li>Briggman, K. L., Bock, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+electron+microscopy+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structure and function of ribbon synapses.</a> Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).</li>
<li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).</li>
<li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+at+rod+and+cone+ribbon+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina.</a> Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).</li>
<li>Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+at+ribbon+synapses+in+the+retina+and+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea.</a> Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).</li>
<li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+synaptic+ribbons%3A+how+they+are+built+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).</li>
<li>Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+immunoprecipitated+synaptic+ribbons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Prot+Res%22%5BJournal%5D)">Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons.</a> J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).</li>
<li>Zampighi, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conical+tomography+of+a+ribbon+synapse%3A+structural+evidence+for+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion.</a> PLoS One. 6 (3), e16944(2011).</li>
<li>Barnes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+diversity+of+the+rod+spherule%3A+A+study+of+serially+reconstructed+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs.</a> Plos One. 11 (3), e0150024(2016).</li>
<li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, e25916(2017).</li>
<li>Crewe, A. V., Lin, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+backscattered+electrons+for+imaging+purposes+in+a+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope.</a> Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).</li>
<li>Richards, R. G., Gwynn, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Backscattered+electron+imaging+of+the+undersurface+of+resin-embedded+cells+by+field-emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy.</a> J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).</li>
<li>Wergin, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+thin+and+thick+sections+of+biological+tissue+with+the+secondary+electron+detector+in+a+field-emission+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope.</a> Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).</li>
<li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+%28OTO%29+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).</li>
<li>Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+of+specimen+preparation+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy.</a> Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity in the retina.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).</li>
<li>Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+EM+reconstruction+of+spinal+cord+reveals+wiring+specificity+in+speed-related+motor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits.</a> Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).</li>
<li>Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+electron+microscopy+and+neural+microcircuit+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis.</a> Front Neural Circuits. 12, 98(2018).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+approach+using+cryofixation+for+high-resolution+3D+analysis+by+FIB-SEM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM.</a> J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).</li>
<li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+staining+method+%28OTO%29+for+enhancing+contrast+of+lipid-containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide-fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide+%28TCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH).</a> J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Wdrożyliśmy protokół przygotowania próbki Volume EM firmy OTO do analizy końcowej struktury fotoreceptorów w tkance siatkówki. Skupiono się na szczegółowym omówieniu całej procedury, począwszy od odwarstwienia i unieruchomienia siatkówki, a skończywszy na przedstawieniu wyników rekonstrukcji 3D zakończeń aksonów fotoreceptorów.
Charakterystyczną cechą tkanki siatkówki, w przeciwieństwie do tkanki mózgowej, jest brak różnic regionalnych. Siatkówka, składająca się z trzech warstw ciał komórek nerwowych i dwóch warstw połączeń synaptycznych, wykazuje regularną i hierarchiczną strukturę pomimo złożoności jej składników neuronalnych i synaptycznych20. Podczas preparowania siatkówki konieczne staje się upewnienie się, że cienkie paski są zminimalizowane, aby zagwarantować jednolity kontrast na kolejnych etapach przygotowania próbki. Zakończenia aksonów fotoreceptorów, krytyczne struktury będące przedmiotem zainteresowania, znajdują się w zewnętrznej warstwie splotowatej (OPL) siatkówki. Hierarchiczny i zorganizowany charakter siatkówki pozwala na efektywną lokalizację docelowych struktur, ułatwiając precyzyjne pobieranie próbek podczas EM i zapewniając dokładność późniejszych wyników rekonstrukcji 3D.
Objętość EM umożliwia trójwymiarową wizualizację lokalnych obwodów nerwowych i połączeń synaptycznych w siatkówce w nanoskali, z wykorzystaniem odcinków szeregowych21,22. Technika ta umożliwia automatyczne generowanie obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości, a FIB-SEM ma potencjał do ujawnienia skomplikowanych szczegółów zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych czynności. Dlatego utrzymanie stabilnego kontrastu obrazu w całym bloku ma kluczowe znaczenie podczas procesu przygotowania próbki. Aby uzyskać jednolitą przewodność, stosujemy metodę wstępnego zatapiania OTO, klasyczne podejście powszechnie uznawane za skuteczne w zwiększaniu kontrastu w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)18,23,24. Metoda ta polega na podwójnej powłoce osmowej w połączeniu z tiokarbohydrazydem, zapewniając optymalną przewodność masową dla dużych próbek. Dodatkowo, podwójna obróbka osmem przyczynia się do doskonałej ochrony struktur błon lipidowych, dodając warstwę precyzji do naszych badań. Próbki siatkówki są hierarchiczne, bloki tkanek są małe i łatwe do penetracji, a metoda OTO może utrzymać lepszy kontur błony komórkowej i jednolity kontrast obrazu.
Na sukces tego protokołu składa się kilka krytycznych czynników. Po pierwsze, szybki zbiór siatkówki i precyzyjny czas utrwalania mają kluczowe znaczenie dla utrzymania optymalnej struktury subkomórkowej. Po drugie, zapewnienie odpowiednich stężeń osmu i tiokarbohydrazydu jest niezbędne do zachowania kontrastu w strukturze błonowej obrazów z serii. W szczególności osm odgrywa kluczową rolę, wiążąc się z cząsteczkami lipidów, wzmacniając sygnał BSE.
Nasz protokół przygotowania próbki siatkówki jest przyjazny dla użytkownika, nie wymaga dodatkowego sprzętu i minimalizuje czas przetwarzania. Ta cecha podkreśla jego potencjalną przydatność do innych technik Volume EM, sugerując wszechstronność i łatwość przyjęcia w różnych konfiguracjach eksperymentalnych. Metoda opracowana w ramach projektu OTO znacznie zwiększa kontrast obrazów FIB-SEM. Jednak szczegóły dotyczące błony komórkowej, zwłaszcza struktury dwuwarstwowej, mogą nadal wydawać się nieco rozmyte. Nasz obecny schemat przygotowania próbek zakłada do pewnego stopnia poświęcenie drobnych szczegółów w strukturze komórki. Naszym celem jest opracowanie w przyszłości zoptymalizowanych metod, aby rozwiązać ten problem i go poprawić.

Siatkówka jest gęsto wypełniona przeplatającymi się aksonami neuronalnymi i dendrytami, które tworzą między nimi synapsy1. Mikroskopia jest niezbędnym narzędziem do badania anatomii siatkówki, ponieważ ma drobne, skomplikowane i małe struktury. Chociaż mikroskopia elektronowa (EM) zapewnia niezrównaną moc badania ultrastruktury organelli subkomórkowych i dokładnej lokalizacji określonych białek na poziomie nanometrów2, tworzy obrazy ograniczone do płaszczyzny dwuwymiarowej (2D), co prowadzi do potencjalnej utraty kluczowych informacji.
Rozwój nowych technik mikroskopii elektronowej objętościowej o wysokiej rozdzielczości (Volume EM) wspiera dostarczanie bardziej wszechstronnych i wielkoskalowych trójwymiarowych (3D) informacji strukturalnych. Niektóre metody 3D EM zostały ostatnio sprawdzone przez innych3,4,5. 3D EM pozwala na rekonstrukcję kształtu neuronów i szczegółów połączeń, umożliwiając precyzyjną analizę ilościową interesujących struktur. Pokazuje to, że dane uzyskane przez tom EM są bardziej systematyczne, kompletne i dokładne.
Fotoreceptory siatkówki, stanowiące początkowe neurony w sygnalizacji wzrokowej6,7, ustanawiają synapsy z dendrytami dwubiegunowych i poziomych komórek drugiego rzędu w terminalu fotoreceptora, aby ułatwić sygnały pobudzające8,9. Te zakończenia, określane jako szypułki stożkowe i sferuli pręcikowe, obejmują trzy kluczowe elementy: mitochondria, wstążki synaptyczne i pęcherzyki synaptyczne. Podczas gdy poprzednie badania koncentrowały się głównie na ogólnej strukturze synaps wstęgowych, zauważalny był brak badań nad subtelną strukturą głównych składników, w tym mitochondriów, wstążek, pul pęcherzyków i ich organizacji przestrzennej w terminalach10,11,12,13. Precyzyjna i systematyczna analiza każdego składnika, wraz ze zrozumieniem ich wzajemnych powiązań w obrębie końcówek fotoreceptorów, jest niezbędna do rozwikłania organizacji przestrzennej i kompleksowego uchwycenia funkcji przetwarzania wzrokowego. W fotoreceptorach mitochondria są obecne głównie w segmencie wewnętrznym, ciele komórki i końcu. Skupiliśmy się tutaj na mitochondriach w końcowych fotoreceptorach. Skaningowa mikroskopia elektronowa ze skupioną wiązką jonów (FIB-SEM), rodzaj objętości EM szczycący się wysoką rozdzielczością (rozdzielczość x, y i z < 5 nm) i stosunkowo dużym strumieniem objętościowym4,14, jest potężnym narzędziem do dokładnej wizualizacji struktury 3D końcówek fotoreceptorów.
Zarówno FIB-SEM, jak i Serial Block Face Scanning Electron Microscope (SBF-SEM) są oparte na SEM objętościowym do uzyskiwania obrazu tkanek poprzez skanowanie powierzchni próbki. Ultrastrukturalne cechy powierzchni próbki ujawniają się poprzez kontrast utworzony przez intensywność elektronów wtórnych lub wstecznie rozproszonych (BSE), gdy wiązka elektronów skanuje próbkę15. Zasadniczo, wykrycie BSE lub elektronów wtórnych z powierzchni przekroju poprzecznego próbki tkanki zatopionej w żywicy w SEM pozwala na uzyskanie obrazów osadzonej próbki16,17. Gdy BSE lub elektrony wtórne są mniej generowane, można uzyskać informacje tylko o powierzchni próbki. Uzyskanie spójnego kontrastu i wysokiej jakości obrazów seryjnych wymaga wystarczającego osadzania metali ciężkich w próbce. W związku z tym określone protokoły przygotowania próbek mają kluczowe znaczenie dla późniejszej segmentacji, rekonstrukcji 3D i analizy w przypadku wykorzystania SEM do obrazowania seryjnego. Metoda osmowo-tiokarbohydrazydowo-osmowa (OTO) jest typowym schematem przygotowania próbki do mikroskopii elektronowej 3D próbek biologicznych, zachowując strukturę błon zawierających lipidy i utrzymując dobry kontrast18,19.
Tutaj opracowaliśmy metodę OTO do przygotowania próbek siatkówki do użycia objętości EM. Proces ten koncentruje się w szczególności na wypreparowaniu siatkówki, określeniu optymalnego czasu utrwalenia tkanki siatkówki oraz wyszczególnieniu konkretnych procedur i środków ostrożności w przygotowaniu próbek 3D. Dodatkowo, segmentacja i rekonstrukcja 3D struktury docelowej są integralnymi krokami w tej rozszerzonej aplikacji. Siatkówka, będąca małą i trudną strukturą do pozyskiwania materiałów, wymaga szybkich i precyzyjnych operacji dla EM, z ustalonymi czasami i świeżymi odczynnikami przygotowanymi do natychmiastowego użycia.

<table><tbody><tr><td>2,2,2-tribromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>acetonu</td> Science <td>10000</td><td></td></tr><tr><td>Amira 6.8</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-2661</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology</td><td>GP10590</td><td></td></tr><tr><td>Epon żywica</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>Helios NanoLab 600i dwuwiązkowy SEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma</td><td>56-84-8</td><td></td></tr><tr><td>Azotan ołowiu</td><td>Sigma</td><td>10099-74-8</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>Składnik buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>Składnik buforu fosforanowego</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>TED PELLA</td><td>4008-160501</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Science</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan sodu</td><td>Sigma</td><td>6131-99-3</td><td></td></tr><tr><td>Napylarka</td><td>Leica</td><td>ACE200</td><td></td></tr><tr><td>Tiokarbohydrazyd</td><td>Sigma</td><td>2231-57-4</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>TED PELLA</td><td>CA96049</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

Objętość mikroskopii elektronowej (Objętość EM) stała się potężnym narzędziem do wizualizacji struktury 3D komórek i tkanek z dokładnością nanometrów. W obrębie siatkówki różne typy neuronów tworzą połączenia synaptyczne w wewnętrznej i zewnętrznej warstwie splotowatej. Podczas gdy konwencjonalne techniki EM dostarczyły cennych informacji na temat organelli subkomórkowych siatkówki, ich ograniczenie polega na dostarczaniu danych obrazowych 2D, które mogą utrudniać dokładne pomiary. Na przykład ilościowe określenie wielkości trzech odrębnych pul pęcherzyków synaptycznych, kluczowych dla transmisji synaptycznej, jest wyzwaniem w 2D. Volume EM oferuje rozwiązanie, dostarczając dane 3D o dużej skali i wysokiej rozdzielczości. Warto zauważyć, że przygotowanie próbki jest krytycznym krokiem w tomie EM, znacząco wpływającym na klarowność i kontrast obrazu. W tym kontekście przedstawiamy protokół przygotowania próbki do rekonstrukcji 3D zakończeń aksonów fotoreceptorów w siatkówce. Protokół ten obejmuje trzy kluczowe kroki: rozwarstwienie i stabilizację siatkówki, procesy osadzania próbki oraz wybór obszaru zainteresowania.

Rycina 1A przedstawia obraz zakończeń fotoreceptorów siatkówki przygotowanych tradycyjną metodą chemicznej podwójnej fiksacji, a Rycina 1B przedstawia obraz zakończeń fotoreceptorów siatkówki przygotowanych metodą OTO. W obu przypadkach próbki pobrano za pomocą FIB-SEM. Wyraźnie widać, że zastosowanie metody OTO pozwala na maksymalne zachowanie struktury błony komórkowej, a widoczne są nawet kontury pęcherzyków. Ponadto kontrast obrazów uzyskanych metodą OTO jest wyraźniejszy.
Rysunek 2 przedstawia schemat eksperymentalny zastosowany do rekonstrukcji cech ultrastrukturalnych zakończeń fotoreceptorów. Rekonstrukcja skupiła się na czterech typach zakończeń fotoreceptorów, w tym na pedykułach czopków M, pedykułach czopków S, sferulach pręcików typu rod1 oraz sferulach pręcików typu rod2. Główny nacisk położono na kluczowe komponenty, takie jak mitochondria, wstążki synaptyczne oraz pule pęcherzyków synaptycznych w obrębie zakończeń fotoreceptorów.
Rysunek 3 przedstawia zrekonstruowane mitochondria i wstęgi synaptyczne w zakończeniach fotoreceptorów pręcikowych. Warto zauważyć, że wstęgi synaptyczne w sferulach pręcików typu rod2 mają charakterystyczny kształt podkowy, zazwyczaj z jedną wstęgą na sferulę. Co więcej, Rysunek 2 podkreśla obecność dwóch mitochondriów w sferulach pręcików, które zajmują stałą pozycję w przestrzeni centralnej zakończeń, powyżej wstęg synaptycznych. Wszystkie struktury zostały obrysowane ręcznie, strona po stronie.
<img alt="Obrazy z mikroskopii elektronowej, A-B, porównanie ultrastruktury komórek, organelle komórkowe, duże powiększenie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przykłady obrazów pobranych za pomocą FIB-SEM dla tradycyjnej metody chemicznej podwójnej fiksacji oraz metody OTO. (A) Tradycyjna metoda chemicznej podwójnej fiksacji. (B) Metoda OTO. Pasek skali: 1000 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przetwarzanie obrazów z mikroskopii elektronowej: dopasowanie, segmentacja, renderowanie 3D, analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat rekonstrukcji 3D zakończeń fotoreceptorów przy użyciu metody FIB-SEM. Po dopasowaniu z wykorzystaniem oprogramowania do wizualizacji danych 3D, obrazy seryjne zostały ręcznie poddane segmentacji i renderowaniu w celu przeprowadzenia dalszej analizy. (A) Oryginalne obrazy seryjne. (B) Obrazy po dopasowaniu. (C) Obrazy po segmentacji. (D) Obrazy po rekonstrukcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig02large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Ilustracja struktury komórkowej; obrazowanie w nanoskali; podkreślenie komponentów podkomórkowych; mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Rekonstrukcja 3D. Reprezentatywne obrazy rekonstrukcji 3D przedstawiają zakończenia fotoreceptorów w kolorze białym, mitochondria w kolorze pomarańczowym i wstążki synaptyczne w kolorze niebieskim. Pasek skali: 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje szczegółowe kroki przygotowania próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej, skupiając się na cechach strukturalnych końcówek fotoreceptorów siatkówki.

Przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

Skupiamy się na badaniu w nanoskali 3D cech strukturalnych końcówek fotoreceptorów w siatkówce myszy. Naszym głównym celem jest zaprojektowanie metody przygotowania próbki 3DEM, odpowiedniej dla małej objętości próbek biologicznych, a także zrekonstruowaliśmy końcową strukturę fotoreceptorów siatkówki za pomocą FIB-SEM. Korzystając z próbek 3DEM siatkówki metodą OTO, dokonaliśmy segmentacji i zrekonstruowaliśmy strukturę 3D czterech typów zakończeń fotoreceptorów, a następnie przeanalizowaliśmy relacje między ich składowymi.Nasz protokół przygotowania próbki siatkówki jest przyjazny dla użytkownika, nie wymaga dodatkowego sprzętu i skraca czas przetwarzania. Może jednak wystąpić pewne rozmycie w szczegółach błon komórkowych, które postaramy się dostosować. W przyszłości mamy nadzieję na dalsze badanie funkcji każdego elementu w końcówce siatkówki i jego roli w aktywności synaptycznej w Aby rozpocząć, umieść uśpioną mysz na stole operacyjnym.Za pomocą zakrzywionych nożyczek wytnij oczy w przyćmionym czerwonym świetle i natychmiast umieść je w roztworze utrwalającym. Po usunięciu przedniego odcinka i ciała szklistego z oka należy całkowicie odizolować siatkówkę. Pod mikroskopem preparacyjnym szybko pokrój siatkówkę na paski o grubości od 100 do 200 mikrometrów i przenieś je do nowej probówki mikrowirówki zawierającej roztwór utrwalający.Inkubuj probówkę w rotatorze przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie umieść ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 godziny. Na początek zdobądź paski siatkówki dla myszy i umyj je pięć razy w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu przez 15 minut. Następnie inkubować paski z żelazocyjankiem potasu i roztworem tetratlenku osmu w ciemności na lodzie przez 1,5 godziny.Umyj paski trzy razy w podwójnie destylowanej wodzie i inkubuj je z 1% tio-karbohydrazydem. Po spłukaniu wodą podwójnie destylowaną potraktuj kolejno paski siatkówki tetratlenkiem osmu, octanem uranylu i azotanem ołowiu. Odwodnić paski siatkówki za pomocą rosnących stężeń etanolu.Następnie należy traktować paski siatkówki roztworem zawierającym równy etanol i aceton przez 20 minut, a następnie dwa płukania acetonem przez 20 minut każde. Sekwencyjnie inkubuj paski siatkówki w mieszaninach żywicy acetonowej w ciemności w temperaturze pokojowej. Naciekaj paski siatkówki czystą żywicą przez 24 godziny w temperaturze 45 stopni Celsjusza, a następnie świeżą żywicą przez 48 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza.Skaningowa mikroskopia elektronowa zakończeń fotoreceptorów siatkówki ze skupioną wiązką jonów przy użyciu tej metody zachowuje strukturę błony komórkowej i kontury pęcherzyków wyraźniej niż tradycyjna metoda podwójnego utrwalania.

preparation-of-retinal-samples-for-volume-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Obrazowanie tkanki siatkówki może dostarczyć informacji o pojedynczej komórce, której nie można uzyskać tradycyjnymi metodami biochemicznymi. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków siatkówki od danio pręgowanego do obrazowania konfokalnego. Fluorescencyjne czujniki kodowane genetycznie lub barwniki wskaźnikowe umożliwiają wizualizację wielu procesów biologicznych w różnych typach komórek siatkówki.

Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Opisujemy metodę skutecznego oddzielania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) od siatkówki w ludzkich oczach i generowania całych płaskich komórek RPE/naczyniówki do analiz histologicznych i morfometrycznych RPE.

Wydajne i spójne generowanie płaskich nabłonków barwnikowych siatkówki/naczyniówki z ludzkich oczu do analizy histologicznej

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną i skomplikowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nadaje się do zastosowań, które obejmują analizę synaps w dojrzałych organoidach siatkówki.

Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Poznaj protokół przygotowania próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej z użyciem techniki FIB-SEM. Ta metoda umożliwia rekonstrukcję nanostruktur 3D terminali fotoreceptorów myszy.

Przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów