Przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej
24 maja 2024
Ten protokół opisuje szczegółowe kroki przygotowania próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej, skupiając się na cechach strukturalnych końcówek fotoreceptorów siatkówki.
Skupiamy się na badaniu w nanoskali 3D cech strukturalnych końcówek fotoreceptorów w siatkówce myszy. Naszym głównym celem jest zaprojektowanie metody przygotowania próbki 3DEM, odpowiedniej dla małej objętości próbek biologicznych, a także zrekonstruowaliśmy końcową strukturę fotoreceptorów siatkówki za pomocą FIB-SEM. Korzystając z próbek 3DEM siatkówki metodą OTO, dokonaliśmy segmentacji i zrekonstruowaliśmy strukturę 3D czterech typów zakończeń fotoreceptorów, a następnie przeanalizowaliśmy relacje między ich składowymi.
Nasz protokół przygotowania próbki siatkówki jest przyjazny dla użytkownika, nie wymaga dodatkowego sprzętu i skraca czas przetwarzania. Może jednak wystąpić pewne rozmycie w szczegółach błon komórkowych, które postaramy się dostosować. W przyszłości mamy nadzieję na dalsze badanie funkcji każdego elementu w końcówce siatkówki i jego roli w aktywności synaptycznej w Aby rozpocząć, umieść uśpioną mysz na stole operacyjnym
.Za pomocą zakrzywionych nożyczek wytnij oczy w przyćmionym czerwonym świetle i natychmiast umieść je w roztworze utrwalającym. Po usunięciu przedniego odcinka i ciała szklistego z oka należy całkowicie odizolować siatkówkę. Pod mikroskopem preparacyjnym szybko pokrój siatkówkę na paski o grubości od 100 do 200 mikrometrów i przenieś je do nowej probówki mikrowirówki zawierającej roztwór utrwalający.
Inkubuj probówkę w rotatorze przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie umieść ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 24 godziny. Na początek zdobądź paski siatkówki dla myszy i umyj je pięć razy w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu przez 15 minut. Następnie inkubować paski z żelazocyjankiem potasu i roztworem tetratlenku osmu w ciemności na lodzie przez 1,5 godziny.
Umyj paski trzy razy w podwójnie destylowanej wodzie i inkubuj je z 1% tio-karbohydrazydem. Po spłukaniu wodą podwójnie destylowaną potraktuj kolejno paski siatkówki tetratlenkiem osmu, octanem uranylu i azotanem ołowiu. Odwodnić paski siatkówki za pomocą rosnących stężeń etanolu.
Następnie należy traktować paski siatkówki roztworem zawierającym równy etanol i aceton przez 20 minut, a następnie dwa płukania acetonem przez 20 minut każde. Sekwencyjnie inkubuj paski siatkówki w mieszaninach żywicy acetonowej w ciemności w temperaturze pokojowej. Naciekaj paski siatkówki czystą żywicą przez 24 godziny w temperaturze 45 stopni Celsjusza, a następnie świeżą żywicą przez 48 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Skaningowa mikroskopia elektronowa zakończeń fotoreceptorów siatkówki ze skupioną wiązką jonów przy użyciu tej metody zachowuje strukturę błony komórkowej i kontury pęcherzyków wyraźniej niż tradycyjna metoda podwójnego utrwalania.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół przygotowania próbek siatkówki do wolumetrycznej mikroskopii elektronowej, ze szczególnym uwzględnieniem analizy cech strukturalnych zakończeń fotoreceptorów w siatkówce myszy. Wykorzystując technikę skaningowej mikroskopii elektronowej z wiązką jonów skupionych (FIB-SEM), badacze dążyli do analizy nanostruktur 3D zakończeń fotoreceptorów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biofizyka
- mikroskopia elektronowa
Wstęp
- Metoda ta umożliwia badanie struktur komórkowych w skali nanometrycznej.
- Badanie podkreśla znaczenie zrozumienia zakończeń fotoreceptorów siatkówki.
- Wykorzystuje się technikę FIB-SEM ze względu na jej zdolność do dostarczania szczegółowych informacji strukturalnych.
- Protokół został opracowany tak, aby był intuicyjny i wydajny, co jest istotne w przypadku małych objętości próbek.
Cel badania
- Opracowanie zoptymalizowanej techniki przygotowania próbek do analizy siatkówki.
- Rekonstrukcja i analiza struktury 3D zakończeń fotoreceptorów.
- Analiza zależności pomiędzy komponentami zakończeń fotoreceptorów.
Zastosowane metody
- Wykorzystaną platformą jest wolumetryczna mikroskopia elektronowa z zastosowaniem FIB-SEM.
- Model biologiczny obejmuje paski siatkówki wyizolowane z uśpionych myszy.
- Szczegółowe etapy obejmują fiksację, traktowanie tetrotnkiem osmu oraz infiltrację żywicą.
- Metoda kładzie nacisk na określone czasy inkubacji i zapewnia zachowanie struktur komórkowych.
- Odnotowane trudności obejmują potencjalne rozmycie szczegółów błon komórkowych podczas obrazowania.
Główne wyniki
- W badaniu pomyślnie przeprowadzono segmentację i rekonstrukcję struktur 3D czterech typów zakończeń fotoreceptorów.
- Wyniki wskazują na lepszą konserwację struktur błon komórkowych w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Kluczowe wnioski podkreślają potencjał tej metody w przyszłych badaniach nad aktywnością synaptyczną.
Wnioski
- Niniejsza praca przedstawia skuteczny protokół przygotowania próbek siatkówki, który poprawia jakość obrazowania.
- Uzyskane informacje mogą pomóc w zrozumieniu mechanizmów neuronalnych zaangażowanych w interakcje synaptyczne.
- Metoda ta ma istotne znaczenie dla przyszłych badań w dziedzinie biologii siatkówki i neurofizjologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przygotowanie próbek do objętościowej mikroskopii elektronowej (Volume EM) tkanek siatkówki umożliwia wysokorozdzielczą wizualizację 3D architektury neuronalnej, bezpośrednio odpowiadając na wyzwanie związane z kwantyfikacją struktur synaptycznych w złożonych tkankach. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania i walidacji celów terapeutycznych, zapewniając dokładny kontekst w nanoskali dla analizy łączności synaptycznej i puli pęcherzyków. Uproszczony przebieg procedury wspomaga skalowalne i powtarzalne obrazowanie, które jest niezbędne dla translacyjnej neuronauki oraz portfeli badawczo-rozwojowych w sektorze neurofarmaceutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjne mapowanie 3D zakończeń synaptycznych fotoreceptorów w celu mechanistycznej minimalizacji ryzyka.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez wyjaśnienie organizacji subkomórkowej istotnej dla przekaźnictwa synaptycznego.
- Ułatwia badanie łączności neuronalnej w systemach istotnych dla przebiegu chorób w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane próbki siatkówki do dalszych etapów wysokoprzepustowego obrazowania (high-content imaging).
- Poprawia powtarzalność i standaryzację testu dzięki spójnemu przetwarzaniu próbek.
- Generuje ilościowe zestawy danych 3D odpowiednie do analizy porównawczej cech synaptycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników obrazowania strukturalnego z translacyjnym odkrywaniem biomarkerów w modelach neurodegeneracji.
- Zapewnia ciągłość od wglądów strukturalnych na etapie odkrywania do przedklinicznej walidacji celów synaptycznych.
- Wspiera postęp z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez dostarczenie wiarygodnych punktów końcowych morfologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół przygotowania próbek integruje się z continuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając wysokorozdzielczą analizę strukturalną – od wczesnego testowania hipotez, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: dostarcza trójwymiarowych danych ultrastrukturalnych do weryfikacji hipotez i wyjaśniania ścieżek w neurobiologii siatkówki.
- Screening: umożliwia uzyskanie powtarzalnych, wysokokontrastowych próbek do obrazowania ilościowego i analizy porównawczej.
- Analityka: wspiera segmentację i pomiar pul pęcherzyków synaptycznych oraz architektury zakończeń.
- Badania translacyjne: łączą odkrycia z modelami przedklinicznymi poprzez zestawienie punktów końcowych struktury z biomarkerami funkcjonalnymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: ustanawia zestandaryzowany protokół, który można dostosować do innych tkanek neuronalnych w zastosowaniach dla całego portfolio.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celów synaptycznych.
- Wartość operacyjna: Usprawnia przygotowanie próbek dzięki prostym krokom i minimalnym wymaganiom sprzętowym.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie rzetelnych, ilościowych danych 3D.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów neurofarmakologicznych z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane punkty końcowe strukturalne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w preparatyce siatkówki oraz w obsłudze próbek do mikroskopii elektronowej.
- Wymaga dostępu do aparatury FIB-SEM oraz infrastruktury do analizy obrazu.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności wyników w różnych badaniach.
- Metoda możliwa do adaptacji dla innych neuronalnych tkanek o małej objętości po optymalizacji protokołu.
- Potencjalne rozmycie szczegółów błon może wymagać dalszego doprecyzowania w zależności od konkretnych zastosowań.
