Name: Modelowanie wysoce powtarzalnej ekspozycji na podmuch o niskim poziomie u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj metodę modelowania wielokrotnej ekspozycji na podmuch o niskim poziomie u myszy w celu badania długoterminowych skutków urazów pourazowych. Protokół wykorzystuje rurę uderzeniową do kontrolowanych badań neurobehawioralnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JSM otrzymało fundusze od Biura Badań i Rozwoju Laboratorium Biomedycznego Departamentu Spraw Weteranów Stanów Zjednoczonych (VA) (JSM, I01BX004896) oraz VA Northwest Mental Illness Research Education and Clinical Center, upoważnionej przez Kongres jednostki VA badającej uszkodzenia mózgu wywołane wybuchem i współistniejący stres pourazowy. JSM informuje o niepowiązanym finansowaniu z FY22 Traumatic Brain Injury and Psychological Health Research Program Translational Research Award (W81XWH-22-TBIPHRPTRA, numer nagrody HT94252310755). Autorzy dziękują Andrew Shutesowi-Davidowi za pomoc redakcyjną.

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z protokołem #1588223, zatwierdzonym przez Veterans Affairs Puget Sound Health Care System Institutional Animal Care and Use Committee oraz zgodnie z National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Opieka nad zwierzętami
UWAGA: Modele zwierzęce LLB są ograniczone wyłącznie przez ich dostępność i pojemność rurki uderzeniowej, aby dostosować się do ich rozmiaru. Opisana tutaj rurka uderzeniowa została zaprojektowana specjalnie do użytku z myszami.
<ol>
	<li>Użyj 3-4-miesięcznych samców lub samic myszy C57BL/6J lub innych zatwierdzonych szczepów/linii myszy zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Utrzymuj myszy w 12-godzinnym cyklu ciemnego światła w określonych obiektach wolnych od patogenów z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Myszy są zazwyczaj trzymane społecznie z 4 lub 5 w klatce. Utrzymuj temperaturę obiektu na poziomie 20-22 °C.</li>
	<li>Przynieś klatki zawierające myszy wybuchowe i pozorowane do pobliskiego obszaru przetrzymywania. Przynieś oddzielne puste klatki do przenoszenia pojedynczych myszy do i z pomieszczenia do obróbki strumieniowo-ściernej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie rurki uderzeniowej
<ol>
	<li>(Kontrola bezpieczeństwa) Upewnij się, że przeprowadzono niezbędne kontrole bezpieczeństwa dla konkretnego systemu. Upewnij się, że zasilanie gazem (helem) i zasilanie główne są wyłączone/odłączone.</li>
	<li>Przygotuj membrany zgodnie z potrzebami dla określonej liczby wybuchów o niskiej intensywności, które mają być przeprowadzone (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.1). Wytnij wymiary membrany zgodnie z wymaganiami dla konkretnej rury amortyzującej używanej w tym protokole:
	<ol>
		<li>Wytnij jeden arkusz plastikowej folii spożywczej na kwadrat o wymiarach 5.5 x 5.5 cala, aby uszczelnić szpulę, umożliwiając zwiększenie ciśnienia.</li>
		<li>Przytnij jeden arkusz standardowego papieru do kopiarki o wymiarach 8,5 x 11 cali (gramatura 75 g/m2) o wymiarach 5,5 x 11 cali; złóż powstały arkusz papieru na pół, aby utworzyć kwadrat o wymiarach 5,5 x 5,5 cala.</li>
		<li>Zaopatrzyć się w jeden arkusz membrany mylarowej o gramaturze 500 G (grubość 125 μm). 
		UWAGA: Arkusze te nie są pękane ani znacząco zdeformowane przez standardowe piaskowanie o niskiej intensywności i mogą być ponownie użyte na czas trwania jednodniowego zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Weź kwadrat folii spożywczej i kwadrat złożonego papieru i rozłóż je na płaskiej powierzchni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.2). Umieść złożony papier na wierzchu folii spożywczej i wyrównaj je ze sobą tak dobrze, jak to możliwe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.3). Aby przyspieszyć powtarzające się wybuchy, ułóż teraz wszystkie stosy membran.</li>
	<li>Włóż membranę mylarową między sterownik a szpulę, zwijając ją w małą rurkę (mniej więcej tak dużą jak palec wskazujący; <silna klasa="xfig">Rysunek 1.4,1.5). Włóż go całkowicie do mechanizmu i puść, aby mógł rozwinąć się na gumowej uszczelce, która oddziela sekcję zabieracza od szpuli. Popchnij szpulę w kierunku sterownika, aby zamocować arkusz mylaru na miejscu; Spowoduje to rozszczelnienie szpuli z napędzanej sekcji rury amortyzującej.</li>
	<li>Umieść palce pod górną połową folii spożywczej i ostrożnie zwiń zarówno folię spożywczą, jak i papier do siebie, upewniając się, że zwijają się razem, nie powodując niewspółosiowości (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1.6).</li>
	<li>Włóż stos membran między szpulę a napędzane sekcje rury amortyzującej (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1.7).</li>
	<li>Pozwól, aby stos membrany rozwinął się tak, aby plastikowa uszczelka była skierowana w stronę szpuli, a papier był skierowany w stronę napędzanej części rurki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1.8). 
	UWAGA: Ta orientacja stworzy hermetyczne uszczelnienie, dzięki czemu system będzie mógł być pod ciśnieniem.</li>
	<li>Zamknij zespół szpuli (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.9,1.10). W razie potrzeby dokręć ręcznie lub hydraulicznie, zabezpieczając zespół zabieraka-szpula-rurka amortyzatora, aby można było zwiększyć ciśnienie w systemie. (Kontrola bezpieczeństwa; <silna klasa="xfig">Rysunek 1.10) 
	UWAGA: W przypadku układów hydraulicznych należy upewnić się, że osiągnięto docelowe ciśnienie zespołu zamykającego, aby zapobiec przerwom w zapłonie, które mogą wymagać wymiany membrany i spowolnić proces ekspozycji LLB. Używamy hydrauliki do zamykania naszego zespołu przy 500 psi.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Włącz poduszkę grzewczą z obiegową wodą pod komorą anestezjologiczną, z temperaturą ustawioną na 37 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.11). Umieść chłonną wkładkę medyczną na wierzchu poduszki grzewczej.</li>
	<li>W pomieszczeniu do przetrzymywania wyjmij jedną mysz z klatki domowej i umieść ją w pustej klatce transferowej. Przynieś mysz w klatce do pomieszczenia wybuchowego.</li>
	<li>Ustaw natężenie przepływu tlenu na 1,0 l/min (l/min) i włącz system odkurzania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.12).</li>
	<li>Włącz izofluran na 5% (w celu wywołania szybkiej utraty przytomności) i skieruj przepływ do komory znieczulenia gryzoni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.13).</li>
	<li>Umieść mysz w komorze, aby wywołać znieczulenie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.14).</li>
	<li>Gdy mysz jest w pełni znieczulona i wykazuje stabilny oddech przez dodatkowe 30 sekund, sięgnij do komory i uderz mysz w ucho, aby uzyskać jednoznaczną, długoterminową identyfikację myszy przez pozostałą część badania. Wykonanie tego kroku teraz jest konieczne, aby uniknąć zakłóceń w czasie rekonwalescencji po wybuchu. Następnie nałóż sterylny lubrykant okulistyczny na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Wyjmij mysz z komory i włóż jej nos do stożka nosa (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.15). Przełączyć przepływ znieczulenia (np. izofluranu) z komory indukcyjnej na stożek nosowy.</li>
	<li>Użyj małych kawałków taśmy laboratoryjnej, aby lekko przymocować kończyny myszy do noszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.16).</li>
	<li>Po unieruchomieniu myszy, umieść drucianą opaskę zaciskową wokół każdej kończyny i mocno przekręć, przymocowując mysz do noszy na nadgarstkach i kostkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.17). Umieść większy krawat wokół klatki piersiowej, wiążąc go bardzo luźno, tak aby oddech myszy nie był ograniczony. Będzie to służyć jako drugorzędny mechanizm przytrzymujący w przypadku poluzowania się któregokolwiek z pasów przytrzymujących kończyny.</li>
	<li>Podnieś ogon myszy i umieść go pod lewą stopą, aby upewnić się, że nie zostanie przyciśnięty, gdy noszy jest wkładany do rurki amortyzującej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1.18).</li>
</ol>
4. Procedura LLB
<ol>
	<li>Otwórz sekcję ekspozycji na zwierzęta w rurze uderzeniowej i ustaw mysz tak, aby była skierowana w stronę nadciągającej fali uderzeniowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1.19).</li>
	<li>Zabezpiecz/zawieś nosze w sekcji dotyczącej ekspozycji zwierząt (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.20).</li>
	<li>Zamknij szczelnie drzwi w sekcji dotyczącej ekspozycji zwierząt, upewniając się, że rurka przepływowa środka znieczulającego nie jest przyciśnięta przez drzwi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1.21).</li>
	<li>Zmniejsz znieczulenie do 2,5-3% izofluranu, 1 lpm przez pozostałą część sesji.</li>
	<li>Zasil system zgodnie z potrzebami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.22).</li>
	<li>Zlokalizuj i podłącz przewód zasilający sprężony hel gazowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.23,1.24).</li>
	<li>Opuść pomieszczenie do obróbki strumieniowo-ściernej, aby uzyskać dostęp do konsoli sterowania rurą strumieniowo-ścierną w sąsiednim pomieszczeniu i upewnij się, że w pomieszczeniu do obróbki strumieniowo-ściernej nie pozostał żaden personel ani zwierzęta. 
	UWAGA: Ochrona słuchu może być wymagana przez instytucję lub ze względu na warunki operacyjne. Takie warunki mogą obejmować układy rur uderzeniowych, w których konsola sterownicza znajduje się w tej samej otwartej przestrzeni co rura uderzeniowa.</li>
	<li>Z konsoli włącz oprogramowanie do akwizycji, aby zarejestrować zdarzenie wybuchu (patrz zielone pole w Rysunek 1.25). 
	UWAGA: W przypadku tych procedur zbieramy dane z czujników z częstotliwością próbkowania 20 kiloherców (kHz), które są następnie przetwarzane za pomocą oprogramowania LabView. Zalecamy pobieranie próbek z czujnika o częstotliwości ≥10 kHz, aby uzyskać wysokiej jakości krzywe czasu w funkcji ciśnienia.</li>
	<li>Odłącz wszelkie blokady bezpieczeństwa (np. sterowania zasilaniem, które są oznaczone zieloną strzałką w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.26).</li>
	<li>Zamknij oba otwory wentylacyjne gazu i pasywnie zwiększ ciśnienie w szpuli (Rysunek 1.27). Nie używaj strony kierowcy. Kontynuuj napełnianie, aż membrana pęknie samoistnie przy docelowym szczycie psi, określonym przez liczbę użytych arkuszy membrany.</li>
	<li>Zapisz ciśnienie szczytowe, czas trwania fazy dodatniej i impuls w lokalizacji zwierzęcia. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.28). Wyłącz mechanizm napełniania.</li>
	<li>Wróć do rurki uderzeniowej, odłącz przewód doprowadzający hel i wyłącz zasilanie obwodu sterowania strumieniem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.29).</li>
	<li>Aby przeprowadzić wielokrotne ekspozycje LLB na tym samym zwierzęciu, otwórz szpulę, wyjmij stos membran szpuli, a następnie zwiń i włóż kolejny stos membran szpuli (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1.30, 1.31, 1.32). Spłaszcz stos membran i ponownie zamknij zespół. 
	UWAGA: Aby modelować doświadczenie kliniczne związane z narażeniem na wybuch niskiego poziomu podczas empirycznie zdefiniowanego treningu SOF, wystawiamy myszy na działanie 5-6 LLB dziennie, ograniczając dzienne narażenie do konserwatywnej ~20 skumulowanej całkowitej psi45. Badania kładące nacisk na zależności mechanistyczne i dawka-odpowiedź mogą alternatywnie zdecydować się na użycie stałej liczby ekspozycji LLB ze zdefiniowanymi parametrami nadciśnienia na sesję.</li>
	<li>Po ostatnim LLB dla obecnego zwierzęcia, wyjmij je z rurki szokowej, pozostawiając znieczulenie włączone (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.33).</li>
	<li>Rozwiąż zwierzę, gdy jest pod narkozą. Wyjmij go z nosa anestezjologicznego, kładąc go na plecach na podgrzanej poduszce wodnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1.34).</li>
	<li>Gdy zwierzę zostanie umieszczone na poduszce wodnej, uruchom minutnik i zapisz czas, po którym mysz samodzielnie przewróci się na jego brzuszną stronę (tj. brzuch) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1.35). Zapisz ten czas jako czas prawy. Gdy mysz wyzdrowieje, włóż ją z powrotem do klatki domowej i kontynuuj monitorowanie w razie potrzeby.</li>
</ol>
5. Procedury wielodniowe
<ol>
	<li>Aby modelować rutynowe narażenie LLB na ładunki wyważające używane podczas treningu SOF Close Quarter Battle, wykonuj powtarzające się codzienne ekspozycje na myszach 5 dni w tygodniu (od poniedziałku do piątku) przez łącznie 15 dni w ciągu 3 standardowych tygodni pracy.</li>
</ol>
6. Zmiana szczytowego ciśnienia LLB
<ol>
	<li>Zwiększ ciśnienie szczytowe poprzez zastosowanie mocniejszych materiałów membranowych lub po prostu ułożenie dodatkowych membran. Na przykład użyj membrany Mylar Roll Clear 0,005 (500 G), aby wytworzyć szczytowe ciśnienie ~20 psi (gdy jest używana zarówno jako membrana napędowa, jak i szpula) lub membrany Mylar Roll Clear 0,002 (200 G), aby wytworzyć szczytowe ciśnienie ~10 psi.</li>
	<li>Dostosuj parametry dla czasu trwania fazy dodatniej i impulsu wybuchu do potrzeb eksperymentalnych. Aby dostosować czas trwania fazy dodatniej i impulsy, empirycznie określ warunki docelowe, podstawiając źródła sprężonego gazu47,49 lub zmieniając długość sterownika, gdy tylko jest to możliwe. Powyższy protokół wykorzystuje hel do wytworzenia ostrego ciśnienia szczytowego i kształtu fali podobnej do wyidealizowanej krzywej Friedlandera.</li>
</ol>
7. Pobieranie tkanek
UWAGA: Praktyki pobierania tkanek mogą być dostosowane do potrzeb eksperymentalnych.
<ol>
	<li>Znieczulić mysz poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe z 210 mg/kg pentobarbitalu.</li>
	<li>Umieść mysz w klatce dla myszy lub szczurów z prętami lub gotową siatką; umieść mysz w klatce w okapie</li>.
	<li>Gdy mysz przestanie reagować, połóż ją na plecach na prętach na górze klatki i zamknij jej pysk wokół jednego z prętów, aby pomóc jej pozostać na miejscu podczas perfuzji.</li>
	<li>Chwyć skórę brzucha, pociągnij ją do góry i użyj dużych nożyczek, aby wyciąć otwór w jamie brzusznej, uważając, aby nie przeciąć żadnego z narządów. Kontynuuj cięcie dalej wzdłuż podstawy żeber, aby umożliwić swobodniejsze artykulację klatki piersiowej.</li>
	<li>Za pomocą hemostatu podejdź do myszy z boku i chwyć tkankę bezpośrednio na klatce piersiowej, zwijając hemostat do tyłu, aby podstawa klatki piersiowej była ustawiona pod kątem w łatwo dostępnej pozycji. Użyj kleszczy lub podobnego narzędzia, aby przytrzymać hemostat na miejscu.</li>
	<li>Za pomocą małych nożyczek chirurgicznych ostrożnie przetnij przeponę, aby umożliwić dostęp do serca. Użyj kleszczy, aby delikatnie ustawić serce pod takim kątem, aby spód był skierowany bezpośrednio poza otwartą podstawę klatki piersiowej. Pracuj szybko, aby serce nadal biło podczas perfuzji.</li>
	<li>Jeśli pobierasz krew, przytrzymaj serce kleszczami i ostrożnie przebij prawą komorę za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml zakończonej igłą 0,5" 25 G. Włóż od dołu komory i wejdź wzdłuż, uważając, aby nie przebić przeciwnej strony komory. Delikatnie pociągnąć za strzykawkę, aż do pobrania 0,5-1,0 ml krwi lub zatrzymania przepływu, a następnie wyjąć strzykawkę.</li>
	<li>Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć małe nacięcie w prawym przedsionku, aby umożliwić odpływ krwi i perfuzyjnego. Przytrzymaj serce za pomocą kleszczy i ostrożnie włóż igłę motylkową 25 G do lewej komory, wkładając od dołu. Przytrzymaj igłę motylkową na miejscu za pomocą zacisku mocującego lub ręcznie.</li>
	<li>Perfon zwierzęcia.
	<ol>
		<li>Podłączyć strzykawkę zawierającą 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do igły motylkowej i uzupełnić ją z szybkością około 10 ml/min. Zwróć uwagę na blanszowanie wątroby jako oznakę prawidłowej perfuzji. Po opróżnieniu strzykawki należy odłączyć ją od igły motylkowej.</li>
		<li>W celu przygotowania tkanek do mikroskopii należy zastąpić pustą strzykawkę PBS strzykawką zawierającą 50 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF) lub 4% roztworu formaldehydu. Powtórz powyższe kroki, aby perfuzji z formaliną. 
		UWAGA: Należy zaobserwować, że perfundowana mysz drga podczas perfuzji; Powinno to skutkować rygorem lub sztywnością całego ciała po zakończeniu zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń igłę motylkową z serca i wyjmij mysz z prętów klatki w celu pobrania tkanki.</li>
	<li>Usuń i poddaj narządy docelowe sekcji w zależności od potrzeb; należy zachować ostrożność, aby wykonywać zabiegi na lodzie, gdy zbierane są świeże, nieutrwalone materiały.</li>
	<li>Błyskawiczne zamrożenie wszelkich nieutrwalonych tkanek, które zostały zebrane w ciekłym azocie, i przechowywanie ich w temperaturze -80 °C do czasu wykorzystania w protokołach oznaczania docelowych białek lub RNA.</li>
	<li>W przypadku utrwalonych tkanek wyjmij do oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej formaliną (jedna probówka na narząd).</li>
</ol>

Shocktube Method to Model Highly Repetitive Low-Level Blast in Mice

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych do ujawnienia.

Nie możemy odpowiednio leczyć tego, czego nie rozumiemy w wystarczającym stopniu, a także nie rozumiemy jeszcze mechanizmów urazowych związanych z wysoce powtarzającą się ekspozycją na LLB. Wielu pracowników SOF zgłasza rozwój upośledzeń związanych ze zdrowiem, które uważa się za związane z wysoce powtarzającym się narażeniem na LLB w ciągu pięciu do dziesięciu lat służby operacyjnej50,51. U niektórych pracowników SOF rozwijają się efekty neurokognitywne podobne do ostrego urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) natychmiast po ekspozycji na LLB39. Ponadto klinicyści donoszą, że objawy wynikające z narażenia na wybuch są często oporne na tradycyjne metody leczenia, co może skłonić SOF i klinicystów do poszukiwania alternatywnych metod leczenia52,53. Pomimo częstego narażenia SOF na LLB i mechanizmy nadciśnienia45, nasilenia i oporności na leczenie wynikających z nich objawów oraz udokumentowanego wzorca blizn astroglejowych związanych z wybuchami51, długoterminowe wyniki zdrowotne pozostają stosunkowo nieznane. Klinicyści i dowództwo wojskowe polegają na badaniach modelowych, aby odkryć mechanizmy urazów i patofizjologię. Modele te mają kluczowe znaczenie dla opracowywania polityk i strategii mających na celu wczesną identyfikację, przerywanie, zapobieganie i leczenie procesu patologicznego.
Co najważniejsze, oczekuje się, że mysie modelowanie powszechnych wojskowych ekspozycji na LLB dostarczy informacji na potrzeby modeli przewidywania zdrowia. Praktyka kliniczna skorzystałaby na modelach predykcyjnych LLB, które identyfikują, kto może być najbardziej narażony na patologię związaną z wybuchem, które właściwości wybuchu wywołują najpoważniejsze skutki i jak proces chorobowy może ewoluować w zależności od przewlekłości, dawki lub swoistości narażenia na wybuch. W związku z tym modelowanie powtarzalnego narażenia na LLB jest niezbędne do opracowywania hipotez i prognoz dotyczących tego, jak narażenie wpłynie na wyniki zdrowotne SOF i innych członków Służby. Modele przewidywania i mechanizmów urazów będą stanowić podstawę do diagnostyki i leczenia, a także do podejmowania decyzji o powrocie do służby na podstawie objawów i narażenia.
Badanie TBI indukowanego przez blasty (bTBI) u myszy przyniosło znaczne postępy w ostatnich latach, szczególnie dzięki opracowaniu modeli, które przewidują wyniki po przewlekłym, powtarzającym się łagodnym bTBI u ludzi54,55. Podczas gdy badanie narażenia na wybuchy na średnim i wysokim poziomie przy użyciu rur uderzeniowych jest dobrze rozwinięte z setkami artykułówindeksowanych przez PubMed 46,56,57,58, użycie rur uderzeniowych w badaniach wybuchów w pobliżu rutynowych nadciśnieni w szkoleniu wojskowym (szczytowe ciśnienie <6 psi40) jest mniej rozwinięte, z mniej niż dziesięcioma artykułami zidentyfikowanymi w niedawnym wyszukiwaniu PubMed19,20, 22,23,26,27,28. Aby ułatwić rozwój tej niedostatecznie zbadanej dziedziny, prezentowany model koncentruje się na kluczowych kwestiach dotyczących stałego nadciśnienia LLB u myszy, odzyskiwania po wybuchu i monitorowania, zwracając jednocześnie uwagę na kilka wyraźnych zalet tego modelu w porównaniu z użyciem materiałów wybuchowych na otwartym polu. Rzeczywiście, twierdzimy, że opisany laboratoryjny model LLB może umożliwić opracowanie modeli predykcyjnych wyników klinicznych po przewlekłym, powtarzającym się LLB.
Model LLB oferuje krytyczne zalety w porównaniu z modelami wybuchów wybuchowych na otwartym polu, szczególnie pod względem dobrostanu zwierząt. Modele terenowe mogą skutkować śmiertelnością na poziomie 3-8% 25,36, podczas gdy ten laboratoryjny model LLB nie wykazuje żadnych strat. Rozróżnienie to ma kluczowe znaczenie, zwłaszcza podczas symulacji wysokiego skumulowanego narażenia typowego dla szkolenia wojskowego, gdzie praktycznie żaden uczestnik szkolenia nie doświadcza śmiertelnych skutków narażenia na LLB. Pozorny brak bezdechu lub innych przyczyn zgonu, takich jak śmiertelny uraz płuc, zapewnia wiarygodność i spójność modelu, pozycjonując go jako preferowany wybór w badaniach nad klinicznie istotnymi skutkami powtarzającego się LLB.
Ten protokół jest specyficzny dla "otwartej" rury amortyzującej o trzyczęściowej konstrukcji, składającej się z przetwornika, szpuli i sekcji napędzanych. Wysoce powtarzalne LLB mogą być osiągalne z innymi konstrukcjami rur uderzeniowych z odpowiednimi modyfikacjami protokołu. Otwarte konstrukcje rur uderzeniowych są często stosowane do badania neurourazów wywołanych wybuchem 46,47,48. Otwarta rurka uderzeniowa, z otwartym końcem wyjściowym, pozwala generowanej fali uderzeniowej swobodnie rozchodzić się wzdłuż rury, w której napotyka swój cel (np. Zwierzę badane) przed wyjściem z przeciwległego końca rury. Konstrukcja ta ułatwia odtworzenie i badanie względnie czystych nadciśnieni pierwotnego wybuchu, przybliżając właściwości eksplozji wybuchowych, jakie miałyby miejsce na otwartym polu48. W rezultacie, wierność empirycznie zmierzonej fali nadciśnienia wybuchowego jest porównywana z wyidealizowaną falą Friedlandera; Pozwala to na ocenę wydajności rury w celu wytworzenia określonego zdarzenia nadciśnienia. Do modelowania ekspozycji LLB używamy wcześniej opisanej48, specjalnie zbudowanej, otwartej rury wybuchowej, pierwotnie zaprojektowanej do odtwarzania efektów detonacji HLB ponad 200+ funtów trinitrotoluenu (TNT) w odległości dystansu ~25 stóp. Aby umożliwić wysokie nadciśnienie szczytowe, gaz jest sprężany do sterownika, który jest oddzielony od szpuli membraną, uszczelniając gaz w sterowniku. Szpula z kolei jest również oddzielona od sekcji otwartej inną membraną. Ta druga membrana umożliwia oddzielne zwiększanie ciśnienia w szpuli. System dwukomorowy umożliwia podciśnienie gazów w sterowniku powyżej normalnego punktu pęknięcia membrany. Dzieje się tak, ponieważ szpula pod ciśnieniem działa jak bufor, podtrzymując membranę na styku sterownika i szpuli, zapobiegając w ten sposób jej pęknięciu. Gdy operator rurki uderzeniowej pragnie wytworzyć falę uderzeniową przy docelowym ciśnieniu, elektroniczny zawór odprowadza gaz ze szpuli, szybko obniżając ciśnienie w szpuli i pozwalając gazowi pod nadciśnieniem w sekcji kierowcy na rozerwanie zarówno membrany sterownika, jak i szpuli i szybkie rozszerzenie się w dół rury, gdzie napotka zwierzę w strefie docelowej. Kluczową modyfikacją umożliwiającą badanie LLB w wysokowydajnych lampach tej konstrukcji jest to, że blokujemy sterownik i używamy szpuli tylko w połączeniu z membranami niskoprogowymi.
Aby zapewnić wiarygodność i odtwarzalność eksperymentów LLB, podczas konfiguracji należy podjąć pewne działania. Kluczowe znaczenie ma szczelne zabezpieczenie rąk i nóg w nadgarstkach i kostkach. Minimalizuje to zmienność ruchów ciała i narażenie na wybuch oraz zapobiega niezamierzonym urazom, które mogłyby zakłócić wyniki. Dodatkowo, obracające się nadgarstki i kostki do wewnątrz pomagają skierować ruch przydatków w kierunku linii środkowej zwierzęcia, zmniejszając ryzyko dystalnych urazów, które mogą wpływać na późniejsze oceny sprawności motorycznej. Wyprostowanie głowy i krzywizna kręgosłupa jest kolejnym istotnym czynnikiem zapewniającym równomierną ekspozycję na podmuch u wszystkich badanych, ponieważ pomaga zmniejszyć potencjalne różnice w zakresie ruchu. Zwiększenie procentowej zawartości izofluranu stosowanego do znieczulenia jest zalecane w przypadku protokołów obejmujących wiele dni lub tygodni. Ta regulacja pomaga utrzymać stałą głębokość znieczulenia przez cały wydłużony czas trwania eksperymentu. Z naszego doświadczenia wynika, że zwiększenie stężenia izofluranu o 0,5% jest wystarczające do utrzymania odpowiedniego znieczulenia.
Jednak podanie znieczulenia przez stożek nosowy może nie być możliwe w przypadku wszystkich konstrukcji rur strumieniowo-wydmuchowych, zwłaszcza w przypadku tych z pełnymi obudowami, które nie pozwalają na wprowadzenie rurki do sekcji napędzanej. W takich przypadkach preferowane mogą być środki znieczulające do wstrzykiwań. Zalecamy określenie, ile czasu jest potrzebne do dostarczenia powtarzających się sekwencyjnych wybuchów, a następnie podanie wystarczającej ilości środka znieczulającego, aby utrzymać nieprzytomność przez cały zabieg. Podczas opracowywania tej zmodyfikowanej metody mogą być konieczne dodatkowe kontrole dobrostanu zwierząt, aby zapewnić prawidłowe utrzymanie znieczulenia. Ponadto stosowanie preparatów do wstrzykiwań może uniemożliwić monitorowanie odpowiedzi podostrej, takie jak zbieranie miar czasu korygowania.
Względy etyczne są najważniejsze w badaniach na zwierzętach, a ten laboratoryjny model LLB obejmuje kompleksowe protokoły odzyskiwania i monitorowania po wybuchu. Humanitarne punkty końcowe po ekspozycji na wybuch, w tym trudności w oddychaniu, niezdolność do wyprostowania się, stan niechodzący po 2-godzinnym okresie obserwacji, ruchy podobne do napadów, niezręczne ruchy, upośledzenie wzroku oraz oznaki krwawienia wewnętrznego lub złamań kończyn, są ściśle obserwowane. Warto zauważyć, że myszy wybuchowe LLB nie wykazywały żadnego z tych warunków w naszych eksperymentach. Jednak podczas HLB może dojść do złamań kończyn, często z powodu błędu operatora. Ograniczenie tego ryzyka polega na obracaniu rąk i stóp w kierunku linii środkowej zwierzęcia podczas zabezpieczania noszy. Ta technika zapobiega zamiataniu przydatków do tyłu przez podmuch wiatru i łamaniu związanych z nimi kości.
Zalety tego powtarzalnego modelu LLB wykraczają poza względy etyczne i obejmują aspekty praktyczne i metodologiczne. Jego laboratoryjna konstrukcja eliminuje potrzebę obchodzenia się z materiałami wybuchowymi, zwiększając w ten sposób bezpieczeństwo i dostępność. Model jest wysoce powtarzalny i konfigurowalny, co pozwala naukowcom wpływać na parametry ekspozycji poprzez stosowanie różnych typów gazów, ustawień urządzenia i wytrzymałości membrany. Hel, który został tutaj wybrany ze względu na jego zdolność do odtwarzania kinetyki eksplozji w polu otwartym49, może stanowić wiarygodną linię bazową 47,59,60. Regulacja ciśnienia szczytowego jest osiągana empirycznie poprzez modyfikację grubości lub wytrzymałości membrany retencyjnej, co umożliwia precyzyjne dostrojenie do określonych wymagań eksperymentalnych. Wreszcie, model LLB eliminuje wpływ zmian sezonowych lub pogodowych na dane, narażenie zwierząt i inne czynniki eksperymentalne. Ta spójność zapewnia solidne i wiarygodne wyniki, co sprawia, że ten powtarzalny model LLB jest nieocenionym narzędziem do badań podłużnych i wysoce powtarzalnych badań wybuchowych.
Zrozumienie neurotraumy związanej z wybuchem wymaga wyjaśnienia mechanizmów urazów, wskaźników intensywności wybuchu i wartości progowych. Jednak mechanizmy uszkodzenia ludzkiego mózgu w scenariuszach wybuchów są niepewne. Wcześniej proponowane kryteria obrażeń ludzi w następstwie narażenia na wybuch opierały się na badaniach na zwierzętach, jednak bezpośrednie zastosowanie tych badań do ludzi jest trudne ze względu na niekompletne kryteria skalowania wśród gatunków61. Skalowanie uszkodzeń płuc na podstawie masy ciała zwierzęcia jest wyjątkiem, biorąc pod uwagę obecność przyjętych kryteriów62,63. Proponowane prawa skalowania dla efektów mózgowych, oparte na ciele 64,65 lub masie mózgu66, pomijają jednak znane i nieznane różnice anatomiczne, zwłaszcza dotyczące struktur ochronnych wewnątrz i wokół mózgu. Masowe skalowanie przewiduje wyższe ryzyko urazów u gatunków o mniejszych ciałach, czemu zaprzeczają badania zarówno u ptaków 67,68,69, jak i u ludzi 70. Opracowanie dokładnych praw skalowania wymaga zatem empirycznego zrozumienia związku między intensywnością zewnętrznego wybuchu a wewnętrznymi skutkami dla mózgu u różnych gatunków. W przypadku LLB bardzo niewiele wiadomo na temat jednorazowego lub przewlekłego narażenia zarówno u modeli zwierzęcych, jak i u ludzi. W rezultacie, badania empiryczne potrzebne do poinformowania o rozwoju przyszłych praw skalowania w zakresie intensywności LLB mogą być katalizowane przez naszą metodę.
Podsumowując, ten laboratoryjny model rurki uderzeniowej stanowi znaczący postęp w badaniach nad przewlekłymi skutkami ekspozycji na LLB u myszy. Poprzez włączenie procedur modelowania stałych nadciśnieni, priorytetowego traktowania regeneracji i monitorowania po wybuchu oraz podkreślanie wyraźnych zalet w porównaniu z alternatywnymi modelami, ten laboratoryjny model LLB może stanowić wiarygodny i etyczny wybór dla pogłębienia naszej wiedzy na temat urazów związanych z przewlekłą ekspozycją na LLB.

Narażenie na wybuch o niskim poziomie (LLB) występuje, gdy osoby lub budowle doświadczają stosunkowo niskiej siły wybuchu, zazwyczaj wynikającej z małych wypadków przemysłowych, kontrolowanych wyburzeń lub niektórych działań szkoleniowych wojskowych. W przeciwieństwie do tego, narażenie na wybuch na wysokim poziomie (HLB) pociąga za sobą narażenie na intensywne i potencjalnie destrukcyjne wielkości siły wybuchowej, powszechnie spotykane w walkach wojskowych, atakach terrorystycznych lub przypadkowych eksplozjach na dużą skalę. Podstawowa różnica między LLB i HLB polega zatem na intensywności zdarzeń wybuchowych, a co za tym idzie, na zdolności osób narażonych do tolerowania powtarzających się narażeń przed doznaniem obrażeń fizycznych lub funkcjonalnych. W związku z tym skutki ekspozycji na HLB wydają się być bardziej oczywiste niż skutki ekspozycji na LLB. Z tego powodu osoby ze znaczną ekspozycją na LLB mogą być narażone na zwiększone ryzyko powoli rozwijających się urazów lub deficytów, które pozostają niewykryte, dopóki ich skumulowane skutki nie staną się zauważalne.
Trwające badania mają na celu pogłębienie naszego zrozumienia, w jaki sposób właściwości ekspozycji na wybuch, takie jak intensywność lub powtarzalność, mogą powodować obrażenia, abyśmy mogli lepiej kierować profilaktyką i leczeniem. W medycynie wojskowej zrozumienie klinicznych implikacji narażenia na wybuch ma ogromne znaczenie, w związku z czym potrzebne są modele zwierzęce zdolne do informowania o tych wynikach. Chociaż modele zwierzęce pomogły wyjaśnić skutki HLB, skutki ekspozycji na LLB pozostają w dużej mierze niedostatecznie zbadane. Liczne badania modelowe badają skutki nadciśnienia wybuchu bliskiego lub wyższego niż 10 funtów na cal kwadratowy (psi) ciśnienia szczytowego1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, ale niewiele raportów skupia się na poziomach ciśnienia w zakresie od 1 do 7 psi19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36, które są bardziej powszechne w środowiskach szkolenia wojskowego37,38,39,40 i zbliżają się do historycznego progu 4 psi dla bezpiecznego narażenia środowiskowego. W związku z tym szersze rozpowszechnienie metod badania często stosowanych ciśnień szczytowych LLB może pomóc w katalizowaniu szybkich spostrzeżeń klinicznych do zastosowania w medycynie wojskowej i optymalizacji sił.
Znaczący związek między ryzykiem zawodowym LLB a różnymi diagnozami klinicznymi wyłania się z badań epidemiologicznych wojskowych LLB41,42,43,44. Badania te potwierdzają słabo zdefiniowaną zależność zależną od dawki, przy czym powtarzające się narażenie na LLB wykazuje podwyższone ryzyko41. Sugeruje to, że zwiększenie skumulowanego narażenia na wybuch odgrywa kluczową rolę w kształtowaniu wyników klinicznych w warunkach wojskowych.
Poprzednie badania modelowania LLB poniżej 10 psi głównie używały materiałów wybuchowych lub systemów rur uderzeniowych do zbadania skutków ekspozycji. Chociaż modele te zazwyczaj badają skutki od jednej do trzech ekspozycji, to jednak przyczyniły się do lepszego zrozumienia mechanistic19,20,30,31, neuropathological29,31,33, oraz konsekwencje behawioralne19,20,23,25,32,34, związane z ekspozycją na wybuchy o niskiej intensywności, które są typowe dla środowiska szkolenia wojskowego.
Badania badające pojedyncze LLB generowane przez materiały wybuchowe na otwartym polu wykazały dowody na subtelne patologie mózgu i zmiany w zachowaniu, często związane ze stresem pourazowym. Woods i współpracownicy24 nie byli w stanie wykryć mikroskopijnego uszkodzenia mózgu przy 2,5-5,5 psi, ale wykryli ilościowe zmiany w glikosfingolipidach tkanki mózgowej za pomocą spektrometrii mas. Korzystając z tych samych ciśnień szczytowych i projektu eksperymentalnego, Rubovitch i współpracownicy25 zaobserwowali zmiany w zachowaniu po wybuchach, które wystąpiły przy podobnym braku patologii mózgu, gdy mierzono je za pomocą mikroskopii świetlnej. Jednak w późniejszym badaniu patologicznym jednoznaczne ultrastrukturalne uszkodzenie mieliny, mitochondriów, neuronów i układu nerwowo-naczyniowego mózgu zostało zidentyfikowane za pomocą mikroskopii elektronowej29,30,31,32,33 u myszy narażonych na LLB o ciśnieniu 6,7 psi. Co ciekawe, kilka badań LLB z użyciem materiałów wybuchowych na otwartym polu o ciśnieniu ~10 psi i mniejszym zgłasza około 3-8% śmiertelności po pojedynczej ekspozycji25,36.
Podobne wyniki zostały wcześniej odnotowane w kilku badaniach z użyciem laboratoryjnych rurek szokowych. W badaniach oceniających pojedyncze LLB wytwarzane przez rurki uderzeniowe znaleziono dowody na uszkodzenie cytoszkieletu nerwowego i zmiany we wzorcach wypalania neuronów powstałe po ekspozycji na pojedynczy blast 1,7 psi class22. Przy 4 psi stwierdzono, że dysfunkcja ciała modzelowatego towarzyszy deficytom neurobehawioralnym u szczurów narażonych na LLB23. W porównaniu z czasem trwania wybuchu mierzonym w powietrzu, Chavko i współpracownicy27 odkryli, że czas trwania dodatniej fazy nadciśnienia był znacznie dłuższy w mózgach szczurów narażonych na 5,8 psi. Biosygnatury podobnych reakcji na urazy mogą być poparte badaniem na myszach po ekspozycji na 7,5 psi, w którym Ahmed i współpracownicy35 zgłaszają wykrywalne zmiany w surowicy poziomów określonych białek zapalnych, metabolicznych, naczyniowych i uszkodzeń nerwowych do miesiąca po ekspozycji. Co ciekawe, badanie to wykazało również 4,5% śmiertelność po 24 godzinach od ekspozycji.
W badaniach oceniających trzy LLB rurki szokowej podczas pojedynczej 20-minutowej sesji ekspozycji, LLB między 1,4 a 8,7 psi powodowały zależne od psionii wzrosty ciśnienia śródczaszkowego (ICP) u szczurów, przy czym obserwowalne zmiany ICP trwały dłużej dla niższych psi20 i powodowały zmiany poznawcze19,20. Korzystając ze świń, ta sama grupa ustaliła, że trzy ekspozycje LLB o ciśnieniu 4 psi z różnych urządzeń wojskowych były wystarczające do wywołania neuropatologii histologicznej, gdy zwierzęta zostały umieszczone w pozycjach strzelców symulujących użycie sprzętu przez ludzi21.
Te badania łącznie ilustrują różnorodne skutki ekspozycji na LLB, które mogą wystąpić w warunkach ograniczonej ekspozycji i okresów rekonwalescencji. Wydaje się, że powtarzająca się ekspozycja na LLB wywołuje trwałe deficyty poznawcze i behawioralne, podkreślając potrzebę zniuansowanego zrozumienia skumulowanych efektów, abyśmy mogli lepiej określić, kiedy te efekty mogą stać się klinicznie znaczące; Jest to szczególnie istotne dla stażystów wojskowych, którzy są narażeni na wysoki poziom powtarzalnego LLB. Aby to osiągnąć, potrzebne są nowe badania, ponieważ obecna literatura nie modeluje odpowiednio doświadczeń klinicznych związanych z rutynowym narażeniem podczas treningu wojskowego, które przekracza jeden do kilku wybuchów w ciągu kilku dni.
Siły Operacji Specjalnych (SOF) mogą znosić znaczne i bardzo powtarzalne LLB podczas rutynowych ekspozycji. Niedawne badanie szacuje, że reprezentatywne narażenie zanonimizowane na wszystkich pozycjach w zespole naruszającym wejście do materiału wybuchowego wynosi nawet 184 skumulowane szczytowe psi w ciągu jednego tygodnia treningowego42. Jest to częściowo oparte na konserwatywnym szacunku 6 ładunków wyważających używanych dziennie, ze średnim ciśnieniem szczytowym 4 psi każdy, mierzonym za pomocą manometrów przeciwwybuchowych zamontowanych na personelu; Nie uwzględnia granatów błyskowych i innych urządzeń45. Rutynowy cykl treningowy może trwać kilka tygodni. Aby ułatwić badanie klinicznych doświadczeń LLB, takich jak te ze szkoleń członków SOF, przedstawiamy laboratoryjno-rurkowy model wysoce powtarzalnej ekspozycji na LLB. Metoda, oparta na sprawdzonych pneumatycznych systemach rur uderzeniowych46,47,48, pozwala na wysoce powtarzalne badania ciśnień 2 psi i wyższych. Procedura nie jest zależna od czynników zewnętrznych, takich jak pogoda, nie powoduje zaobserwowanej śmiertelności i jest przeprowadzana w laboratorium. W rezultacie, metoda ta umożliwia ciągłą, codzienną powtarzającą się ekspozycję na LLB u tych samych osób w badaniach trwających od tygodni do miesięcy, ułatwiając dochodzenie w sprawie szkolenia wojskowego z najwyższą dokładnością.

<table><tbody><tr><td>Termiczna recyrkulacyjna pompa ciepła Adroit (120 V)</td><td>Parkland Scientific</td><td>HTP-1500</td><td></td></tr><tr><td>Papier do kopiowania, gramatura 75 g/m2</td><td>Zszywki</td><td>897804</td><td></td></tr><tr><td>jednorazowe niebieskie wkładki chłonne</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td></td></tr><tr><td>Forane Roztwór do inhalacji</td><td>MedLine</td><td>10019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Hel</td><td>Linde</td><td>UN1046</td><td></td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna (1")</td><td>VWR</td><td>89098-076</td><td></td></tr><tr><td>LabView software</td><td>Emerson</td><td>V 2011</td><td></td></tr><tr><td>Tlen medyczny</td><td>Centralne zaopatrzenie spawalnicze</td><td>UN1072</td><td></td></tr><tr><td>Mylar, grubość 0,005</td><td>Tapp Plastics</td><td>22934</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa folia spożywcza</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3687</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe opaski zaciskowe& nbsp;</td><td>VWR</td><td>11215-940</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczna rura uderzeniowa (z sekcjami sterownika i szpuli; obszar docelowy wielkości dla myszy, czujniki ciśnienia częstotliwości próbkowania 20 kHz, oprogramowanie sterujące i akwizycyjne)</td><td>BakerRisk, San Antonio, Teksas</td><td>niestandardowa</td><td></td></tr><tr><td>podkładka grzewcza wielokrotnego użytku o dużej wytrzymałości (12" x 18")</td><td>Parkland Scientific</td><td>121218</td><td></td></tr><tr><td>Nożycowa, dziurkacz do uszu gryzoni</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750076-2</td><td></td></tr><tr><td>Przesuwne komory górne do tradycyjnych waporyzatorów</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-0530SM</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator VetFlo Isofluran</td> Kent <td>Scientific</td><td>VetFlo-1210S</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie wysoce powtarzalnej ekspozycji na podmuch o niskim poziomie u myszy

Modeling Highly Repetitive Low-level Blast Exposure in Mice

Narażenie na wybuchy jest znaczącym czynnikiem ryzyka urazów mózgu wśród osób narażonych. Chociaż wpływ dużych wybuchów na mózg jest dobrze poznany, skutki mniejszych wybuchów, takich jak te, które występują podczas szkolenia wojskowego, są mniej zrozumiałe. To niewielkie, nisko nasilone narażenie na wybuch różni się również znacznie w zależności od okupacji wojskowej i tempa szkolenia, przy czym niektóre jednostki doświadczają niewielu ekspozycji w ciągu kilku lat, podczas gdy inne doświadczają setek w ciągu kilku tygodni. Modele zwierzęce są ważnym narzędziem w identyfikacji zarówno mechanizmów urazu, jak i długoterminowych klinicznych zagrożeń dla zdrowia wynikających z narażenia na wybuchy o niskim natężeniu. Modele zdolne do podsumowania tego szerokiego zakresu narażenia są niezbędne do informowania o wynikach ostrych i przewlekłych urazów w tych rozbieżnych profilach ryzyka.
Chociaż wyniki po kilku ekspozycjach na wybuchy na niskim poziomie są łatwo modelowane do badań mechanistycznych, przewlekłe ekspozycje, które występują w trakcie kariery, mogą być lepiej modelowane przez paradygmaty urazów spowodowanych wybuchem z powtarzającymi się ekspozycjami, które występują często przez tygodnie i miesiące. Przedstawiono tutaj metody modelowania wysoce powtarzalnej ekspozycji na wybuchy o niskim poziomie u myszy. Procedury opierają się na uznanych i szeroko stosowanych pneumatycznych modelach rur uderzeniowych ekspozycji na wybuch w otwartym polu, które można skalować w celu dostosowania parametrów nadciśnienia oraz liczby lub interwału ekspozycji. Metody te mogą być następnie wykorzystane do umożliwienia badań mechanistycznych lub podsumowania rutynowych ekspozycji na wybuchy w badanych grupach klinicznych.

Podczas badania wyników eksperymentalnych u myszy po narażeniu na działanie sił wybuchu, rejestracja i charakterystyka zdarzenia poprzez analizę ciśnienia w funkcji czasu jest kluczowa dla oceny sukcesu eksperymentu. Metoda ta, polegająca na pomiarze dynamicznych zmian ciśnienia podczas wybuchu, pomaga badaczom zrozumieć wpływ blastów na systemy biologiczne.
W udanych eksperymentach zapisy ciśnienia wykazują wyraźny i kontrolowany wzorzec fali. Wzrost ciśnienia jest gwałtowny i osiąga wartości szczytowe w przewidzianym czasie (Rysunek 2). Następujący po nim spadek ciśnienia przebiega według przewidywalnej krzywej, czego przykładem jest przebieg fali Friedlandera, co wskazuje na efektywną dyssypację energii. W zakresie oceny urazów w eksperymentach LLB nie stwierdzono żadnych widocznych oznak obrażeń, nawet podczas przeprowadzania wysoce powtarzalnej ekspozycji na LLB z maksymalnie sześcioma blastami występującymi w ciągu 15-20 min (Rysunek 3). Jednak analiza czasów odzyskania równowagi po powtarzalnej ekspozycji na LLB wskazuje, że myszy poddane blastom szybciej odzyskują przytomność niż mysze z grupy sham (Rysunek 4). Zatem powtarzalna LLB prowadzi do odtwarzalnych zmian w ostrych reakcjach pobudzenia neurobehawioralnego po ekspozycji.
Nieoptymalne eksperymenty mogą wykazywać nieregularne profile ciśnienia. Przypadki, w których ciśnienia szczytowe są nieoczekiwanie obniżone, mogą wskazywać na przedwczesny lub powolny upływ gazu, co zapobiega gwałtownemu rozprężaniu się gazu wzdłuż napędzanej sekcji rury uderzeniowej w celu uderzenia w zwierzę w obszarze celu. Przedwczesna utrata ciśnienia gazu jest często wynikiem niewłaściwego uszczelnienia sekcji sterownika lub szpuli. Może to wynikać z wad membrany lub niewystarczającego dokręcenia zespołu sterownik-szpula-rura uderzeniowa. W takich przypadkach próbki biologiczne mogą wykazywać zredukowane oznaki urazu.
Interpretacja danych polega na powiązaniu profili ciśnienia w czasie z obserwowanymi odpowiedziami biologicznymi. Pomyślne eksperymenty wykazują, że wybrane parametry blastu, takie jak ciśnienie szczytowe i czas trwania, wywołują oczekiwane lub ustalone odpowiedzi biologzne poddawane badaniu. Korelacje między konkretnymi cechami ciśnienia a wynikami biologicznymi pomagają w ustaleniu związków przyczynowo-skutkowych. Protokół ten umożliwia prowadzenie badań podłużnych ze względu na brak zaobserwowanych strat zwierząt w punktach czasowych badania wynoszących nawet 6 miesięcy po ostatnim LLB (Rysunek 5).
Zakres wyników klinicznych po ekspozycji na LLB jest subtelny i słabo poznany. Powtarzająca się ekspozycja na LLB była historycznie uważana za podprogową pod kątem uszkodzeń zarówno u ludzi, jak i u myszy. Potwierdza to szybki powrót do prawidłowej lokomocji, zachowania i aktywności fizycznej po ekspozycjach przy ciśnieniu 2-5 psi. Jednak brak przytłaczających ostrych objawów neurosensorycznych lub zmian behawioralnych nie wyklucza istnienia negatywnych, podstępnych efektów. Ponieważ fenotypy związane z LLB są w najlepszym razie subtelne, pełen zakres efektów jest obszarem aktywnych badań i może wymagać znacznego czasu lub powtórzeń, aby wywołać klinicznie istotne skutki.
<img alt="Proces eksperymentalny z użyciem rury uderzeniowej; schemat przedstawiający przygotowanie zwierząt, konfigurację sprzętu i kolejne kroki procedury." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66592/66592fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Kroki proceduralne dla modelu rury uderzeniowej w przypadku powtarzającego się LLB u myszy. Po etapach przygotowania rury uderzeniowej (Kroki 1-10) oraz przygotowania zwierząt (Kroki 11-18), myszy są poddawane jednemu lub kilku LLB (Kroki 19-32), a następnie są usuwane z rury (Krok 33). Następnie myszy są kładzione na plecach na ogrzewanej podkładce (Krok 34). Czas, po którym zwierzę obraca się na stronę brzuszną, jest zapisywany jako czas powrotu do pozycji wyprostowanej (Krok 35). Skrót: LLB = Low-level blast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66592/66592fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres psi w funkcji liczby arkuszy, wykresy zaniku przejściowego; analiza dla 1–4 arkuszy, pokazująca zmiany psi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66592/66592fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne krzywe ciśnienie-czas dla ekspozycji blisko 4 psi. (A) Addytywne stosy zapewniają liniowe ciśnienia szczytowe w zakresie 2–4,5 peak psi. Reprezentatywne profile ciśnienia w funkcji czasu (milisekundy), uśrednione z 3–6 wybuchów w rurze falowej (kolor czerwony), w porównaniu z idealnymi krzywymi Friedlandera (kolor niebieski) dla (B) 1 arkusza, (C) 2 arkuszy, (D) 3 arkuszy oraz (E) 4 arkuszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66592/66592fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres punktowy analizujący czas ekspozycji na eksperyment; grupowanie danych według liczby ekspozycji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66592/66592fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Odstęp międzyosobniczy. Przygotowanie i wykonanie pojedynczego blastu zajmuje średnio 9,8 ± 1,9 min (średnia ± błąd standardowy średniej (sem)). Dodatkowe ekspozycje na blast wymagają dodatkowych 1,7 ± 0,4 min na zdarzenie (średnia ± sem). Kropki reprezentują wyniki od poszczególnych zwierząt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66592/66592fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres znormalizowanych czasów prostowania w zależności od dnia badania; przedstawiono efekty wybuchu i interakcje." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66592/66592fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Codzienne czasy prostowania podczas 3 tygodni wysoce powtarzalnych ekspozycji na LLB. Wykres przedstawia znormalizowane względem grupy sham czasy prostowania w ciągu 3 tygodni ekspozycji na LLB. Myszy z grupy LLB były poddawane 6 codziennym ekspozycjom na wybuchy, co dało łącznie 90 ekspozycji na LLB w ciągu 15 dni. Średnie parametry nadciśnienia wynosiły (± sem) 3,05 ± 0,07 peak psi, 0,94 ± 0,04 czas trwania fazy dodatniej oraz 2 ± 0,1 psi * msec impulsu. Wartości p odzwierciedlają wyniki dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). Skrót: LLB = Low-level blast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66592/66592fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres prawdopodobieństwa przeżycia, krzywa Kaplana-Meiera dla grupy Sham vs. LLB w okresie 200 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66592/66592fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
Rycina 5: Wpływ laboratoryjnego modelu rury szokowej LLB na ubytki zwierząt po wielokrotnej ekspozycji na LLB. Wskaźniki ubytków dla myszy z grupy sham (N = 24) i LLB (N = 32) od pierwszej ekspozycji na LLB (dzień 1), przez wszystkie ekspozycje w badaniu (do dnia 19.), aż po 6-miesięczny okres rekonwalescencji (dzień 199). W obserwowanym okresie nie stwierdzono istotnych różnic w wskaźnikach ubytków między grupą sham a grupą LLB. Myszy LLB poddano średnio 62 ekspozycjom przy średnim szczytowym ciśnieniu 4,78 ± 0,01 peak psi i impulsie 3,16 ± 0,023 psi∙ms. Ekspozycje przeprowadzano 5 dni w tygodniu (tj. od poniedziałku do piątku) przez 3 kolejne tygodnie, aby zamodelować niedawno opisane ekspozycje na nadciśnienie SOF podczas rutynowych szkoleń z forsowania przeszkód45. Skróty: LLB = Low-level blast; SOF = Special Operations Forces. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66592/66592fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przedstawione tutaj są metody wytwarzania powtarzających się ekspozycji na wybuchy o niskiej intensywności przy użyciu myszy.

Modelowanie wysoce powtarzalnej ekspozycji na podmuch o niskim poziomie u myszy

Exposure to explosive blasts is a significant risk factor for brain trauma among exposed persons. Although the effects of large blasts on the brain are ...

Nasze badania koncentrują się na długoterminowych skutkach powtarzającego się narażenia myszy na wybuchy o niskim natężeniu. Naszym celem jest określenie długoterminowych skutków tego narażenia podczas szkolenia wojskowego. W przypadku badań na zwierzętach efekty wybuchu o niskim poziomie są subtelne, a zespoły badawcze często używają technik takich jak mikroskopia elektronowa, aby wykryć różnice między myszami blastycznymi i pozorowanymi.Nasza praca sugeruje, że zwiększona powtarzalność wybuchu sprawia, że różnice te są łatwiejsze do wykrycia przy użyciu bardziej dostępnych technik mikroskopowych. Obecnie istnieje bardzo ograniczona literatura zarówno na temat ekspozycji na wybuchy o niskim natężeniu, które są również nazywane wybuchami o niskiej intensywności, jak i modeli, które wykorzystują te ekspozycje przez wiele dni. Opracowaliśmy nasz protokół tak, aby zawierał wiele wybuchów na niskim poziomie przez wiele dni, aby wyeliminować te luki.Zacznij od przeprowadzenia kontroli bezpieczeństwa, upewniając się, że dopływ helu gazowego i zasilanie główne są wyłączone. Aby przygotować membrany na wybuchy o niskiej intensywności, pokrój jeden arkusz plastikowej folii spożywczej na kwadrat o wymiarach 5.5 na 5.5 cala. Przytnij również jeden arkusz standardowego papieru do kopiarki o wymiarach 8,5 na 11 cali do rozmiaru 5,5 na 11 cali i złóż ten arkusz papieru na pół, aby utworzyć kwadrat.Zaopatrz się w jeden arkusz membrany Mylar o gramaturze 500 G i grubości 125 mikrometrów. Następnie weź kwadrat folii spożywczej i kwadrat złożonego papieru i rozłóż je na płaskiej powierzchni. Umieść złożony papier na wierzchu folii spożywczej i wyrównaj je ze sobą.Zwiń membranę Mylar do małej rurki i włóż ją między sterownik a szpulę. Puść membranę, aby mogła oprzeć się o gumową uszczelkę, oddzielając sterownik od szpuli. Popchnij szpulę w kierunku sterownika, aby zamocować arkusz Mylar na miejscu.Spowoduje to rozszczelnienie szpuli z napędzanej części rurki amortyzatora. Umieść palce pod górną połową folii spożywczej i ostrożnie zwiń ze sobą folię spożywczą i papier. Włóż stos membrany między szpulę a napędzane sekcje rurki amortyzatora.Pozwól, aby stos membran rozwinął się tak, aby plastikowa uszczelka była skierowana w stronę szpuli, a papier był skierowany w stronę napędzanej części tuby. Zamknij zespół szpuli i dokręć, aby zabezpieczyć zespół rurki amortyzatora szpul kierowcy. Zwiększ ciśnienie w rurze amortyzatora do 500 funtów na cal kwadratowy.Zacznij od sprawdzenia - uderz mysz w ucho w celu identyfikacji i umieść jej nos w stożku nosa w celu przedłużonego znieczulenia. Użyj taśmy laboratoryjnej, aby przymocować kończyny myszy do noszy. Umieść drucianą opaskę wokół każdej kończyny i mocno skręć, mocując mysz do noszy w nadgarstkach i kątach.Umieść większy krawat wokół klatki piersiowej, wiążąc go luźno. Podnieś ogon myszy i umieść go pod lewą stopą, aby zapobiec przytrzaśnięciu. Następnie otwórz sekcję rurki uderzeniowej poświęconą ekspozycji na zwierzęta i ustaw mysz tak, aby była skierowana w stronę nadciągającej fali uderzeniowej.Zabezpiecz nosze w sekcji dotyczącej ekspozycji na zwierzęta. Następnie szczelnie zamknij drzwi, upewniając się, że drzwi nie przygniatają rurki przepływowej środka znieczulającego. Zmniejsz znieczulenie do 2,5 do 3% izofluranu z jednym litrem tlenu na minutę.Następnie włącz system. Podłączyć do przewodu zasilającego sprężony hel gazowy. Opuść pomieszczenie do obróbki strumieniowo-ściernej, aby uzyskać dostęp do konsoli rury sterującej strumieniem w sąsiednim pomieszczeniu.Na konsoli włącz oprogramowanie do akwizycji, aby nagrać zdarzenie wybuchu. Odłącz blokadę bezpieczeństwa, zamknij oba otwory wentylacyjne gazu i pasywnie zwiększ ciśnienie w szpuli. Kontynuuj napełnianie, aż membrana pęknie przy docelowym ciśnieniu.Wyłącz mechanizm napełniania, a następnie zapisz ciśnienie szczytowe, czas trwania fazy dodatniej i impuls w miejscu zwierzęcia. Wróć do rurki amortyzującej. Odłącz przewód doprowadzający hel i wyłącz zasilanie obwodu sterowania strumieniem.Aby przeprowadzić wielokrotne naświetlanie LLB na tym samym zwierzęciu, otwórz szpulę, wyjmij i wymień stos membran szpuli. Po zakończeniu ekspozycji LLB wyjmij zwierzę z rurki szokowej, pozostawiając włączone znieczulenie. Rozwiąż zwierzę pod narkozą i połóż je na plecach na podgrzanej poduszce wodnej.Zapisz czas, po którym mysz przewróci się na brzuszną stronę, jako czas wyprostowania. Po odzyskaniu zdrowia przywróć mysz do jej klatki domowej. Eksperymenty mające na celu zbadanie wpływu wybuchów wybuchowych na myszy oceniano za pomocą analizy ciśnienia w funkcji czasu, przy czym udane eksperymenty charakteryzowały się kontrolowanym wzorcem fal z gwałtownym wzrostem ciśnienia i przewidywalnym spadkiem.Nie zaobserwowano żadnych jawnych obrażeń w eksperymentach z wybuchami na niskim poziomie, nawet po wielu wybuchach. Analiza czasu korygowania wykazała, że powtarzająca się ekspozycja na LLB prowadziła do szybszego powrotu do zdrowia u myszy blast niż u osób z grupy kontrolnej, co wskazuje na zmiany neurobehawioralne pobudzenia. Co więcej, korelacja profili ciśnienia w czasie z reakcjami biologicznymi pomogła ustalić związki przyczynowo-skutkowe, wspierając badania podłużne bez utraty zwierząt przez okres do sześciu miesięcy po ekspozycji.

modeling-highly-repetitive-low-level-blast-exposure-in-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Yang, Z., et.al. Model powtarzającego się wstrząsu głowy u myszy. J. Vis. Exp. (2016). Ten film demonstruje wywoływanie powtarzających się wstrząsowych urazów głowy u myszy za pomocą elektromagnetycznego urządzenia uderzeniowego. Zabieg polega na umieszczeniu końcówki uderzenia między szwami międzyczołowymi i lambdoidalnymi na czaszce znieczulonej myszy i użyciu końcówki sondy w celu precyzyjnego ustawienia głębokości uderzenia. Uderzenie jest dostarczane z kontrolowaną prędkością i...

Modelowanie powtarzających się wstrząsowych urazów głowy w modelu mysim

Przedstawiono protokół oceny zmian w poziomach uszkodzeń DNA i zdolności do naprawy DNA, które mogą być wywołane przez przewlekłe napromienianie in vivo niskimi dawkami limfocytów śledziony myszy, poprzez pomiar fosforylowanego histonu H2AX, markera pęknięć dwuniciowych DNA, za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar uszkodzeń i naprawy DNA w splenocytach myszy po przewlekłej ekspozycji in vivo na bardzo niskie dawki promieniowania beta i gamma

Wstrząśnienie mózgu jest najczęstszym rodzajem urazowego uszkodzenia mózgu. W związku z tym powtarzalny model zwierzęcy wstrząsu mózgu, który odtwarza ważne cechy urazu u pacjentów, może zapewnić środki do badania wstrząsu mózgu w rygorystyczny, kontrolowany i skuteczny sposób.

Model powtarzającego się wstrząsu głowy u myszy

Opisujemy metodę wykorzystującą ukierunkowane promieniowanie obwodowe do wywołania u myszy zachowania przypominającego zmęczenie. Wybrana, nieśmiertelna dawka napromieniania prowadzi do tygodniowego ograniczenia dobrowolnej aktywności związanej z bieganiem po kółkach.

Mysi model zmęczenia wywołanego promieniowaniem obwodowym

To badanie opisuje udane wygenerowanie nowego modelu zwierzęcego przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) poprzez wielokrotne wystawianie myszy na działanie wysokich stężeń ozonu.

Generowanie modelu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc u myszy poprzez powtarzającą się ekspozycję na ozon

Prezentujemy tutaj protokół modelu fali uderzeniowej dla gryzoni w celu zbadania neurobiologicznych i patofizjologicznych skutków łagodnego do umiarkowanego urazowego uszkodzenia mózgu. Stworzyliśmy zasilany gazem, laboratoryjny zestaw wyposażony w czujniki ciśnienia, co pozwala na niezawodne i powtarzalne generowanie łagodnych lub umiarkowanych urazowych uszkodzeń mózgu wywołanych wybuchem.

Model fali uderzeniowej o niskiej intensywności do przedklinicznej oceny łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u gryzoni

Ten protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu krzemicy poprzez wielokrotne wystawienie na działanie zawiesin krzemionki za pomocą kroplówki z nosa. Model ten może wydajnie, wygodnie i elastycznie naśladować patologiczny proces krzemicy u ludzi z wysoką powtarzalnością i oszczędnością.

Mysi model krzemicy utworzony przez wielokrotne wdychanie krystalicznego pyłu krzemionkowego

Protokół opisuje badanie ogólnoustrojowych i miejscowych skutków skórnych ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe B u myszy.

Badanie przewlekłej ekspozycji myszy na promieniowanie ultrafioletowe B

Wideookulografia jest bardzo ilościową metodą badania sprawności motorycznej oczu, a także uczenia się motorycznego. W niniejszym materiale opisujemy sposób przeprowadzania wideookulografii u myszy. Zastosowanie tej techniki u myszy zdrowych, leczzonych farmakologicznie lub modyfikowanych genetycznie stanowi potężne narzędzie badawcze do zgłębiania fizjologii leżącej u podstaw zachowań motorycznych.

Wideookulografia u myszy

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Poznaj metodę modelowania wielokrotnej ekspozycji na podmuch o niskim poziomie u myszy w celu badania długoterminowych skutków urazów pourazowych. Protokół wykorzystuje rurę uderzeniową do kontrolowanych badań neurobehawioralnych.

Modelowanie wysoce powtarzalnej ekspozycji na podmuch o niskim poziomie u myszy

Przeglądaj więcej filmów