Name: Rekonstrukcja kanału receptora glutaminianu bakteryjnego poprzez enkapsulację bezkomórkowego systemu ekspresji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj metodę emulsji kropli odwróconej do rekonstrukcji kanałów jonowych w syntetycznych komórkach z użyciem systemu ekspresji bezkomórkowej. Protokół umożliwia badanie białek błonowych i potencjałów czynnościowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

APL dziękuje za wsparcie od National Science Foundation (EF1935265), National Institutes of Health (R01-EB030031 i R21-AR080363) oraz Army Research Office (80523-BB)

Odczynniki i sprzęt użyte do tego badania znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Masowe reakcje CFE w obecności małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV)
<ol>
	<li>Przygotowanie do SUV-a 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać w dygestorii zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa dotyczącymi pracy z chloroformem.
	<ol>
		<li>Przygotować 5 mM 1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholiny (POPC) SUV w szklanej fiolce, przenosząc 76 μl 25 mg/ml roztworu podstawowego POPC rozpuszczonego w chloroformie.</li>
		<li>Delikatnie obracając szklaną fiolkę, wdmuchnąć delikatny strumień argonu do fiolki, aby utworzyć warstwę wysuszonych lipidów na dnie. Następnie przenieść szklaną fiolkę do eksykatora z luźno zakręconą nakrętką w celu odparowania nadmiaru chloroformu.</li>
		<li>Przechowywać szklaną fiolkę w eksykatorze przez 1 godzinę. Następnie dodaj 0,5 ml ultraczystej wody dejonizowanej, aby rozpuścić film lipidowy i wirować przez około 2 minuty.</li>
		<li>Skonfiguruj mini-aparat do wytłaczania, mocząc dwa wsporniki filtra w wodzie dejonizowanej i umieszczając je na każdym z wewnętrznych wsporników membrany. Następnie namocz filtr poliwęglanowy o długości fali 100 nm i umieść go między dwoma wewnętrznymi wspornikami membrany połączonymi zewnętrzną obudową ekstrudera i nakrętką ustalającą. Umieść tę konfigurację w stojaku ekstrudera.</li>
		<li>Przepłucz dwie gazoszczelne strzykawki o pojemności 1 ml 3 razy ultraczystą wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Załaduj próbkę mieszanki lipidowo-wodnej do jednej z gazoszczelnych strzykawek o pojemności 1 ml i umieść ją na jednym końcu mini ekstrudera za pomocą zacisków ramienia wahadłowego, aby utrzymać strzykawkę na miejscu. Włóż drugą strzykawkę do drugiego końca mini-ekstrudera i upewnij się, że jest całkowicie wciśnięta. 
		UWAGA: Podczas ładowania strzykawki mieszanką lipidów i wody, upewnij się, że w strzykawce nie ma powietrza przed przepuszczeniem jej przez mini-ekstruder.</li>
		<li>Delikatnie przepuścić mieszaninę lipidowo-wodną z oryginalnej strzykawki do pustej strzykawki przez mini-ekstruder. Powtórz ten krok 11 razy, aby utworzyć SUV-y. Przenieś SUV-y do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Roztwór SUV można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zespół reakcyjny CFE
	<ol>
		<li>Przygotować reakcję CFE, postępując zgodnie z protokołem ekspresji bezkomórkowej dostarczonym przez producenta z niewielkimi modyfikacjami szczegółowo opisanymi poniżej.</li>
		<li>Wymieszać 10 μL roztworu 1 (zawierającego aminokwasy, NTP, tRNA i substraty dla enzymów oraz niezbędny bufor), 1 μL roztworu 2 (białka w 20% glicerolu), 2 μL roztworu 3 (rybosom (20 μM)), odpowiednią ilość DNA kodującego dla rozpuszczalnego sfGFP-sfCherry(1-10)27 (zwanego dalej rozpuszczalnym sfGFP), WT-GluR0-sfGFP lub PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 par zasad), 1 μl mysiego inhibitora RNAzy i 4 μl 5 mM roztworu SUV dla białek błonowych lub 4 μl wody dla białek rozpuszczalnych.</li>
		<li>Doprowadzić końcową objętość reakcji do 20 μl, dodając ultraczystą wodę dejonizowaną. 
		UWAGA: Podczas montażu systemu CFE wszystkie elementy muszą być trzymane na lodzie. Wszystkie materiały są wrażliwe na temperaturę i mogą ulec degradacji, jeśli osiągną temperaturę pokojową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja i monitorowanie reakcji CFE
	<ol>
		<li>Przenieś roztwór CFE na 96-dołkową stożkową płytkę dolną w kształcie litery V. Aby zapobiec parowaniu w trakcie reakcji, przykryj płytkę folią uszczelniającą.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w czytniku płytek przez 4-5 godzin, monitorując reakcję CFE, mierząc sygnał GFP o wzmocnieniu 100 przy długościach fal wzbudzenia/emisji 488 nm/528 nm co 2 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Reakcje CFE zamknięte w GUV
<ol>
	<li>Przygotowanie zewnętrznego roztworu buforowego GUV
	<ol>
		<li>W probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wymieszać 1,5 μl 1 M spermidyny, 37,5 μl 100 mM ATP, 25 μl 100 mM GTP, 12,5 μl 100 mM CTP, 12,5 μL 100 mM UTP, 25 μL 1 M fosforanu kreatyny, 18 μL 1 M octanu magnezu, 93,33 μl 3 M glutaminianu potasu, 50 μl 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μl 332 mM kwasu folinowego, 100 μL 2 M glukozy i 50 μl z roztworu podstawowego 6 mM mieszaniny każdego z 20 aminokwasów (przygotowanych zgodnie z protokołem opisanym przez Sun et al.28).</li>
		<li>Doprowadzić ostateczną objętość roztworu do 1 ml, dodając ultra oczyszczoną wodę dejonizowaną. 
		UWAGA: Wszystkie elementy muszą być trzymane na lodzie. Dodaj mieszaninę aminokwasów na końcu, aby uniknąć wyczerpania aminokwasów28. Roztwór można podzielić na porcje w 330 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie mieszaniny lipidów w oleju 
	UWAGA: ten krok należy wykonać w dygestoriach zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa dotyczącymi pracy z chloroformem.
	<ol>
		<li>W dygestorium wymieszać 17,3 μl roztworu podstawowego POPC o stężeniu 25 mg/ml i 1,08 μl kopolimeru poli(butadienu)-b-poli(tlenku etylenu) (PEO-b-PBD) o stężeniu 50 mg/ml w szklanej fiolce o pojemności 15 ml. 
		UWAGA: Końcowy roztwór lipidów w oleju zawiera 0,5 mM lipidów z odpowiednio 95% i 5% POPC i PEO-b-PBD. PEO-b-PBD zastosowano w celu zwiększenia stabilności błony podczas ekspresji białka, ale utrzymywano go na niskim poziomie molowym, aby zmniejszyć tendencję kopolimeru do agregacji w micele oddzielone od cząsteczek lipidów29,30.</li>
		<li>Ostrożnie wdmuchnąć delikatny strumień argonu do szklanej fiolki, obracając fiolkę w celu odparowania chloroformu.</li>
		<li>Odpipetować pipetą 1,2 ml lekkiego oleju mineralnego do szklanej fiolki o pojemności 15 ml zawierającej osuszone lipidy.</li>
		<li>Wymieszaj lipidy i olej, wirując z maksymalną prędkością przez 10-20 sekund. Rozpuszczona mieszanina kopolimerów lipidowych będzie wyglądać na mętną.</li>
		<li>Aby upewnić się, że wszystkie możliwe agregaty lipidowe w oleju są całkowicie rozpuszczone i rozproszone w oleju, umieść szklaną fiolkę w piecu w temperaturze około 50 °C na 20 minut, a następnie wiruj przez dodatkowe 10-20 s z maksymalną prędkością.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż i enkapsulacja reakcji CFE (<silna klasa="xfig">Rysunek 1 podsumowuje następujące kroki).
	<ol>
		<li>Przygotować 300 μl roztworu zewnętrznego GUV w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, mieszając 270 μl zewnętrznego roztworu buforowego CFE przygotowanego w kroku 2.1, 15 μl 5 M NaCl i 15 μl 4,5 M KCl. 
		UWAGA: Na tym etapie dodać 0,45 μl 1 M 1,4-ditiotreitolu (DTT) do roztworu zewnętrznego GUV. Celem dodania NaCl i KCl jest dostosowanie osmolalności roztworu zewnętrznego w celu dopasowania go do wewnętrznego roztworu CFE. Dokładna objętość NaCl i KCl zależy od pożądanej regulacji osmolalności. Można dodać NaCl lub KCl lub oba, aby dostosować osmolalność.</li>
		<li>Delikatnie odpipetować 300 μl mieszaniny lipidów w oleju na wierzchu zewnętrznego roztworu GUV. 
		UWAGA: Podczas dodawania mieszanki lipidów i oleju ważne jest, aby olej nie mieszał się z wodnym roztworem zewnętrznym. Po dodaniu powinna być widoczna granica między mieszaniną lipidów w oleju a zewnętrznym roztworem GUV.</li>
		<li>Inkubować granicę faz olej-woda w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby umożliwić utworzenie monowarstwy lipidowej i ustabilizowanie się na granicy faz.</li>
		<li>W międzyczasie postępuj zgodnie z sekcją 1.2.1, aby złożyć reakcję CFE zawierającą plazmidowe DNA kodujące warianty białka błonowego lub rozpuszczalny GFP. Zastąp 4 μl 5 mM roztworu SUV lub wody 4 μl 1 M sacharozy. Ta reakcja będzie wewnętrznym rozwiązaniem GUV. 
		UWAGA: Do pomiaru osmolalności roztworów wewnętrznych i zewnętrznych użyto osmometru. Osmolalność roztworu zewnętrznego została następnie odpowiednio dostosowana przez dodanie NaCl lub wody. Osmolalność reakcji CFE wynosi zwykle około 1600 mOsm/kg. Dodanie sacharozy do reakcji zwiększa wewnętrzną gęstość roztworu, umożliwiając w ten sposób pęcherzykom przemieszczanie się przez granicę faz olej-woda podczas etapu wirowania. Alternatywą dla sacharozy jest roztwór gradientu gęstości Opti-Prep.</li>
		<li>Dodać 600 μl mieszaniny lipidów i oleju do probówki mikrowirówki zawierającej reakcję CFE i energicznie pipetować w górę iw dół przez ~1 min, aby emulgować reakcję w roztworze lipid-in-oil i utworzyć monowarstwę lipidową wokół komórek syntetycznych. 
		UWAGA: Końcowy roztwór nie powinien mieć żadnych pęcherzyków i powinien wyglądać na nieprzezroczysty.</li>
		<li>Delikatnie odpipetować wewnętrzną emulsję roztworu na wierzchu warstwy oleju w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, w której ustawiono interfejs olej-woda. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie przeszkadzać ani nie destabilizować interfejsu.</li>
		<li>Wirować przez 10 minut przy 2.000 x g w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Prędkość wirowania została zoptymalizowana dla tego protokołu. Adir et al.31 podali inną prędkość wirowania.</li>
		<li>Po zakończeniu wirowania ostrożnie usuń nadmiar oleju i roztwór zewnętrzny z probówki mikrowirówki za pomocą pipetora. Usunąć roztwór zewnętrzny, aż pozostała objętość wyniesie około 100 μl. 
		UWAGA: Na dnie probówki mikrowirówki zwykle widoczne są osady GUV. Jednak brak widocznego granulatu nie musi oznaczać braku plonu GUV. Zamiast używać pipetora, nadmiar oleju z wierzchu roztworu zewnętrznego można usunąć przez aspirację. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że roztwór lipidów w oleju został całkowicie usunięty. Zanieczyszczenie olejem w roztworze GUV może powodować niską jakość obrazów.</li>
		<li>Zawiesić granulat GUV w pozostałych 100 μl roztworu, delikatnie pipetując w górę i w dół. Następnie przenieść roztwór GUV na czystą, 96-dołkową, przezroczystą płaską płytkę denną w celu inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Inkubacja i obrazowanie reakcji CFE w kapsułkach
<ol>
	<li>Przykryj płytkę folią uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5-6 godzin. Można użyć czytnika płytek i postępować zgodnie z krokiem 1.3.2, aby przygotować czytnik płytek do etapu inkubacji.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji umieść 96-dołkową płytkę na stoliku do obrazowania mikroskopu odwróconego wyposażonego w kamerę EMCCD (lub kamerę sCMOS), laser sterowany DAQ-MX (lub zintegrowany system sumowania laserowego) i konfokalny dysk wirujący CSU-X1 (lub konfokalny skaning laserowy). Skoncentruj się na dowolnym ROI zawierającym GUV i rejestruj obrazy o długości fali wzbudzenia 488 nm za pomocą obiektywu Plan-Apochromat 60 x/1,4 NA.</li>
	<li>Zapisz obrazy GUV w formacie .tiff.</li>
	<li>Otwórz obrazy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów (np. ImageJ lub Fidżi). Otwórz panel ustawień Jasność/Kontrast. Dostosuj jasność i kontrast do odpowiednich ustawień, które sprawią, że białka fluorescencyjne będą widoczne.</li>
	<li>Jeśli celem jest porównanie intensywności sygnału różnych białek ulegających ekspresji, najpierw ułóż poszczególne obrazy GUV zawierające różne białka, korzystając z panelu Obrazy do stosu znajdującego się w podmenu Obraz > Stosy. Następnie dostosuj jasność i kontrast wszystkich obrazów za pomocą panelu Jasność/Kontrast. </li>
</ol>

Cell-Free Expression of Membrane Proteins in Giant Unilamellar Vesicles

<ol><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li>
<li>Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tissue-scale+properties+with+synthetic+cells%3A+Forging+one+from+many%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many.</a> ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).</li>
<li>Powers, J., Jang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+biomimetic+functions+of+synthetic+cells+through+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis.</a> Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: Past, present and future.</a> ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).</li>
<li>Groaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+spatiotemporal+organization+and+dynamics+in+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Nanomed+Nanobiotech%22%5BJournal%5D)">Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells.</a> WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685(2021).</li>
<li>Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cell+as+a+platform+for+understanding+membrane-membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Membranes%22%5BJournal%5D)">Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions.</a> Membranes. 11 (12), 912(2021).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+crosslinker+competition+and+sorting+drive+emergent+GUV+size-dependent+actin+network+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture.</a> Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2021).</li>
<li>Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+photosynthetic+cell+producing+energy+for+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 1325(2019).</li>
<li>Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-regulated+and+bidirectional+communication+in+synthetic+cell+communities%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities.</a> ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).</li>
<li>Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+juxtacrine+signaling+between+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+and+tunable+performance+of+a+cell-free+biosensor+encapsulated+in+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles.</a> Science Advances. 9 (1), 6605(2023).</li>
<li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Protein+expression+in+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane Protein expression in cell-free systems.</a> Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).</li>
<li>Noireaux, V., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+age+of+cell-free+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">The new age of cell-free biology.</a> Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).</li>
<li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-sized+mechanosensitive+and+biosensing+compartment+programmed+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA.</a> Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).</li>
<li>Poddar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+stretching+activates+calcium+permeability+of+a+putative+channel+Pkd2+during+fission+yeast+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22MBoC%22%5BJournal%5D)">Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis.</a> MBoC. 33 (14), (2022).</li>
<li>Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+synthesis+in+cell-free+systems%3A+From+bio-mimetic+systems+to+bio-membranes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).</li>
<li>Dondapati, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+membrane+proteins+derived+from+eukaryotic+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems.</a> Front Pharmacol. 10, 917(2019).</li>
<li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis+and+reconstitution+using+mammalian+cell-free+lysates+enables+the+systematic+study+of+the+regulation+of+LINC+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly.</a> Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).</li>
<li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+study+of+liposome-assisted+synthesis+of+membrane+proteins+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system.</a> Sci Rep. 5 (1), 18025(2015).</li>
<li>Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+platforms+of+mammalian+cell-free+expressed+membrane+proteinsmembrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins.</a> Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).</li>
<li>Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+recruitment+of+ribosomes+in+protocells+recreates+a+translocon-independent+mechanism+of+proteorhodopsin+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis.</a> iScience. 24 (5), 102429(2021).</li>
<li>Steinküher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell-free+expression+of+membrane+proteins+by+tuning+ribosome+cotranslational+membrane+association+and+nascent+chain+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+potassium-selective+prokaryotic+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor.</a> Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Hsu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-triggered+DNA-mediated+membrane+fusion+in+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells.</a> Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).</li>
<li>Moghimianavval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+functional+membrane-membrane+interfaces+by+interspy%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy.</a> Small. 19 (13), 2202104(2023).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762(2013).</li>
<li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li>
<li>Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+conjugation+of+%28tri-%29+block+copolymers+to+liposomes+toward+the+construction+of+sterically+stabilized+vesicle+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems.</a> Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).</li>
<li>Adir, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+protein+producing+synthetic+cells+using+cell+free+bacterial+extracts%2C+liposomes+and+emulsion+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer.</a> J Vis Exp. (158), e60829(2020).</li>
<li>van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+giant+unilamellar+vesicle+production+for+artificial+cells+-+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions.</a> Small Methods. 7 (12), 2300416(2023).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+Not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).</li>
<li>Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-free+systems+for+structural+studies+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins.</a> Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (177), e63332(2021).</li>
<li>Hwang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vesicles+enable+mechano-responsive+hydrogel+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation.</a> Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509(2023).</li>
<li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+polymersomes%3A+a+comparative+review+towards+cell+mimicking%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li>
<li>Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse-phase+method+revisited%3A+Rapid+high-yield+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+%28GUVs%29+using+emulsification+followed+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+A%3A+Physicochem+Eng+Asp%22%5BJournal%5D)">A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation.</a> Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).</li>
<li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li>
<li>Bailoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+out-of-equilibrium+metabolism+for+synthetic+cells%3A+A+membrane+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective.</a> ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Praktycznie każdy proces komórkowy, który zależy od przenoszenia cząsteczek lub informacji przez błonę komórkową, taki jak sygnalizacja komórkowa lub pobudzenie komórki, wymaga białek błonowych. W związku z tym rekonstytucja białek błonowych stała się głównym wąskim gardłem w realizacji różnych projektów komórek syntetycznych do różnych zastosowań. Tradycyjna rekonstytucja białek błonowych w błonach biologicznych za pośrednictwem detergentów wymaga metod generowania GUV, takich jak delikatne pęcznienie lub elektroformacja. Metody pęcznienia zwykle wytwarzają pęcherzyki o małych rozmiarach, a wydajność elektroformacji znacznie spada, gdy skomplikowane roztwory, co często ma miejsce w przypadku generowania komórek syntetycznych, są zamknięte w kapsułkach32. Dodatkowo detergenty rozpuszczają białko błonowe, a ich usunięcie podczas procesu rekonstytucji może powodować nieprawidłowe fałdowanie białek33,34. Z drugiej strony, przedstawione tutaj podejście opiera się na kotranslacyjnym włączaniu białka błonowego do dwuwarstwy lipidowej, która bardziej przypomina naturalny szlak biogenezy białek w komórkach22.
Z technicznego punktu widzenia przedstawiony protokół jest korzystny w porównaniu z innymi popularnymi metodami enkapsulacji, takimi jak elektroformacja i ciągła enkapsulacja 7,8,35,36 (cDICE), co ułatwia wdrożenie, ponieważ jedynym sprzętem laboratoryjnym wymaganym do generowania GUV jest wirówka. W przeciwieństwie do elektroformacji, metoda emulsji odwróconej pozwala na enkapsulację różnych kombinacji cząsteczek o różnych stężeniach. Dodatkowo, w porównaniu z oryginalną techniką emulsji odwróconej25, podejście to pozwala na uzyskanie bardziej stabilnych GUV, które nadają się do enkapsulacji lizatów CFE lub systemów PURE. Wyższa stabilność GUV wynika z obecności kopolimeru diblokowego w składzie membrany GUV37, a także długiej inkubacji granicy faz olej-woda, która pozwala na nasycenie granicy faz cząsteczkami lipidów. Wreszcie, w przeciwieństwie do podejść mikroprzepływowych, przedstawiony tutaj protokół nie wymaga małych kanałów i rurek. W związku z tym reakcja CFE może być zamknięta w kapsułki zaraz po jej zmontowaniu, a krótszy czas montażu GUV ze względu na brak przepływu i możliwe zatkanie zapobiega przedwczesnemu rozpoczęciu reakcji CFE. Chociaż demonstracja ekspresji białek błonowych w tym protokole jest wyłączna dla reakcji PUREfrex, można rozszerzyć tę metodę o syntezę białek przy użyciu różnych dostępnych systemów CFE, takich jak bakteryjne systemy CFE oparte na lizacie lub ssaki.
Przedstawione tutaj podejście ma ograniczenia, które wynikają z zależnego od ropy naftowej charakteru procesu powstawania GUV i zamiaru uzyskania stabilnych GUV. Podejście to jest zazwyczaj dłuższe w porównaniu z innymi metodami, takimi jak cDICE lub mikrofluidyka, ze względu na długi czas inkubacji granicy faz olej-woda, który jest wymagany do stabilizacji granicy faz i wysokiej wydajności GUV. Ponadto skład lipidowy ogranicza się przede wszystkim do POPC z małymi dawkami innych lipidów lub kopolimerów blokowych, podczas gdy inne metody, takie jak elektroformacja, są bardziej odpowiednie do włączania lipidów o różnych właściwościach fizycznych i chemicznych. Chociaż skład membrany GUV w tej metodzie jest mieszaniną POPC i PBD-PEO w celu maksymalizacji wydajności CFE, można przetestować możliwe różnice w składzie membrany GUV. Jednak dalsza optymalizacja parametrów może być wymagana w przypadku innych białek błonowych. Ponieważ emulgacja kropelek zachodzi poprzez ręczne pipetowanie, GUV generowane tą metodą są polidyspersyjne i mają dość niejednorodną wielkość. Co więcej, fakt, że lipidy rozpuszczają się w fazie organicznej, może czasami powodować tworzenie się warstwy oleju między dwoma płatkami membrany GUV lub zanieczyszczać komorę obrazowania olejem, co może być szkodliwe dla jakości obrazu. Możliwym obejściem problemu pozostałości oleju jest zastąpienie oleju mineralnego lotnym rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak eter dietylowy, jak wykazano w Tsumoto i wsp.38, polegając na odparowywaniu rozpuszczalnika wraz z wirowaniem podczas tworzenia GUV.
Chociaż w tej pracy nie ma demonstracji funkcji kanału, zainspirowanej wcześniejszymi testami używanymi do sondowania zrekonstruowanej mechano- lub światłoczułej funkcjonalności kanału, przedstawiono test oparty na mikroskopii fluorescencyjnej. Zgłasza się, że otwarcie kanału GluR0 zwiększa przewodność membranową dla jonów K+ 24. Ponieważ reakcje CFE zawierają już wysokie stężenie K+, typowe wskaźniki potasu nie będą odpowiednie do oceny funkcjonalności kanału. Ponieważ jednak napływ potasu zmienia potencjał błonowy, wrażliwe wskaźniki potencjału błonowego, takie jak DiBAC4(3)22 lub BeRST 139 , mogą zgłaszać aktywność GluR0 w obecności glutaminianu.
Udana rekonstytucja białek błonowych w komórkach syntetycznych otwiera liczne możliwości tworzenia komórek syntetycznych o niespotykanych dotąd zdolnościach, które bardziej naśladują komórki naturalne. Obecnie główną wadą ogniw syntetycznych jest ich niezdolność do reprodukcji i recyklingu energii. Jednak dzięki schematom odzyskiwania energii zależnym od światła i chemikaliów, które w dużym stopniu opierają się na białkach błonowych, można wyobrazić sobie długotrwałekomórki syntetyczne. Wykorzystanie systemów CFE pozwala na odtworzenie wielu białek błonowych, które mogą wspólnie wykonywać określone zadania. Na przykład, odtworzenie kanału jonowego bramkowanego ligandem, podobnego do opisanego tutaj GluR0, wraz z różnymi kanałami jonowymi bramkowanymi napięciem, może prowadzić do budowy pobudliwej, podobnej do neuronu komórki syntetycznej.

Biologia syntetyczna oddolna zyskała coraz większe zainteresowanie w ciągu ostatniej dekady jako rozwijająca się dziedzina z licznymi potencjalnymi zastosowaniami w bioinżynierii, dostarczaniu leków i medycynie regeneracyjnej1,2. Rozwój komórek syntetycznych jako kamienia węgielnego oddolnej biologii syntetycznej, w szczególności, przyciągnął szerokie grono społeczności naukowych ze względu na obiecujące zastosowania komórek syntetycznych, a także ich właściwości fizyczne i biochemiczne podobne do komórek, które ułatwiają badania biofizyczne in vitro3,4,5,6. Komórki syntetyczne są często konstruowane w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych wielkości komórki (GUV), w których odtwarzane są różne procesy biologiczne. Rekonstytucja cytoszkieletu komórkowego7,8, regeneracja energii zależnej od światła9, komunikacja komórkowa10,11, oraz biosensing12 to przykłady prób rekonstrukcji zachowań podobnych do komórkowych w komórkach syntetycznych.
Podczas gdy niektóre procesy komórkowe opierają się na rozpuszczalnych białkach, wiele cech naturalnych komórek, takich jak wykrywanie i komunikacja, często wykorzystuje białka błonowe, w tym kanały jonowe, receptory i transportery. Głównym wyzwaniem w rozwoju komórek syntetycznych jest odtworzenie białek błonowych. Chociaż tradycyjne metody rekonstytucji białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych opierają się na oczyszczaniu za pośrednictwem detergentów, takie metody są pracochłonne, nieskuteczne w przypadku białek, które są toksyczne dla gospodarza ekspresji lub często nie nadają się do rekonstytucji białek błonowych w GUVs13.
Alternatywną metodą ekspresji białek są systemy ekspresji bezkomórkowej (CFE). Systemy CFE są potężnym narzędziem w biologii syntetycznej, które umożliwia ekspresję in vitro różnych białek przy użyciu lizatu komórkowego lub oczyszczonej maszynerii transkrypcyjno-translacyjnej14. Systemy CFE mogą być również zamknięte w GUV, co pozwala na podział na przedziały reakcji syntezy białek, które można zaprogramować do różnych zastosowań, takich jak tworzenie syntetycznych komórek zbierających światło9 lub biosensory mechanowrażliwe15,16. Analogicznie do metod ekspresji białek rekombinowanych, ekspresja białek błonowych jest wyzwaniem w systemach CFE17. Agregacja, nieprawidłowe fałdowanie i brak modyfikacji potranslacyjnej w systemach CFE są głównymi wąskimi gardłami, które utrudniają pomyślną syntezę białek błonowych przy użyciu systemów CFE. Trudność w oddolnej rekonstytucji białek błonowych przy użyciu systemów CFE wynika częściowo z braku złożonego szlaku biogenezy białek błonowych, który opiera się na peptydach sygnałowych, cząstkach rozpoznających sygnał, translokonach i cząsteczkach opiekuńczych. Jednak ostatnio wiele badań sugerowało, że obecność błoniastych struktur, takich jak mikrosomy lub liposomy, podczas translacji sprzyja skutecznej ekspresji białek błonowych18,19,20,21. Ponadto Eaglesfield i in. oraz Steinküher i wsp. odkryli, że włączenie specyficznych domen hydrofobowych znanych jako peptydy sygnałowe do N-końca białka błonowego może znacznie poprawić jego ekspresję22,23. Podsumowując, badania te sugerują, że wyzwanie związane z rekonstytucją białek błonowych w komórkach syntetycznych można pokonać, jeśli translacja białka zachodzi w obecności błony GUV i jeśli wykorzystany zostanie odpowiedni N-końcowy peptyd sygnałowy.
Tutaj przedstawiono protokół enkapsulacji syntezy białek za pomocą reakcji CFE z rekombinowanymi elementami (PURE) do rekonstytucji białek błonowych w GUV. Bakteryjny receptor glutaminianu < klasa sup = "xref">24 (GluR0) jest wybierany jako modelowe białko błonowe i badany jest wpływ jego N-końcowego peptydu sygnałowego na rekonstytucję błony. Wpływ peptydu sygnałowego proteorodopsyny, który, jak wykazano w celu poprawy skuteczności rekonstytucji białek błonowych przez Eaglesfield i wsp.22, jest badany poprzez konstruowanie zmutowanego wariantu GluR0 oznaczonego jako PRSP-GluR0 oraz porównanie jego ekspresji i lokalizacji błony z GluR0 typu dzikiego (określanego dalej jako WT-GluR0), który zawiera jego natywny peptyd sygnałowy. Protokół ten jest oparty na metodzie odwróconej emulsji25 z modyfikacjami, które sprawiają, że jest on niezawodny dla enkapsulacji CFE. W przedstawionej metodzie reakcje CFE są najpierw emulgowane przy użyciu roztworu lipid w oleju, który generuje kropelki o wielkości mikronów, które zawierają układ CFE i są stabilizowane przez monowarstwę lipidową. Kropelki emulsji są następnie nakładane warstwami na powierzchnię styku olej-woda, która jest nasycona kolejną monowarstwą lipidową. Kropelki emulsji są następnie zmuszane do przemieszczania się przez granicę faz olej-woda za pomocą siły odśrodkowej. W wyniku tego procesu kropelki uzyskują kolejną monowarstwę, tworząc w ten sposób dwuwarstwowy pęcherzyk lipidowy. GUV zawierające reakcję CFE są następnie inkubowane, podczas której białko błonowe ulega ekspresji i jest włączane do błony GUV. Chociaż protokół ten jest określony dla bezkomórkowej ekspresji GluR0, może być używany do bezkomórkowej syntezy innych białek błonowych lub różnych zastosowań w komórkach syntetycznych, takich jak rekonstytucja cytoszkieletu lub badania fuzji błonowej26.

<table><tbody><tr><td>Filtr poliwęglanowy 100 nm</td><td>STERLITECH</td><td>1270193</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Clear Płyta dolna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1M Hybrydowy czytnik wielomodowy</td><td>Agilent</td><td>11-120-533</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan kreatyny</td><td>Millipore Sigma</td><td>10621714001</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Skaner konfokalny</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Średni gradient gęstości (Optiprep)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D1556</td><td>Opcjonalnie do przełączania z sacharozą w roztworze wewnętrznym</td></tr><tr><td>Filtr obsługuje</td> mikroprobówki <td>Avanti</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand (1,5 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy sól wapniowa hydrat</td><td>Millipore Sigma</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Milipore Sigma</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Kamera Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3&nbsp;</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy sól potasowa monohydrat</td><td>Millipore Sigma</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Lekki olej mineralny</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Octan magnezu tetrahydrat&nbsp;</td>Zestaw mini-ekstrudera <td>Millipore Sigma</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>(w tym uchwyt na strzykawkę i stojak na ekstruder)</td>Mikroskop odwrócony <td>Avanti</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX21</td><td></td></tr><tr><td>Olympus PlanApo N 60x Mikroskop olejowy Obiektyw&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>1-U2B933&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PEO-b-PBD</td><td>Źródło polimeru</td><td>P41745-BdEO</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plazmidowe DNA</td><td>Domowe</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-sfGFP-sfWiśniowe (1-10) plazmidowe DNA</td><td>Domowe</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP plazmidowe DNA</td><td>Domowy</td> lipid <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>POPC w chloroformie&nbsp;</td><td>Avanti</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>PUREfrex 2.0</td><td>Cosmo Bio USA</td><td>GFK-PF201</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw roztworów rybonukleotydów</td><td>New England BioLabs</td><td>N0450</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy, mysi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>RTS Próbnik aminokwasów</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>VAPRO Oscylometr ciśnienia pary Model 5600</td><td>ELITechGroup</td><td>VAPRO 5600</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstrukcja kanału receptora glutaminianu bakteryjnego poprzez enkapsulację bezkomórkowego systemu ekspresji

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

Systemy ekspresji bezkomórkowej (CFE) są potężnymi narzędziami w biologii syntetycznej, które umożliwiają biomimikrę funkcji komórkowych, takich jak biodetekcja i regeneracja energii w komórkach syntetycznych. Rekonstrukcja szerokiego zakresu procesów komórkowych wymaga jednak pomyślnego odtworzenia białek błonowych w błonie komórek syntetycznych. Podczas gdy ekspresja rozpuszczalnych białek jest zwykle skuteczna w powszechnych systemach CFE, rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych komórek syntetycznych okazała się wyzwaniem. W tym artykule przedstawiono metodę rekonstytucji modelowego białka błonowego, bakteryjnego receptora glutaminianu (GluR0), w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV) jako modelowych komórkach syntetycznych opartych na enkapsulacji i inkubacji reakcji CFE wewnątrz komórek syntetycznych. Wykorzystując tę platformę, wykazano wpływ zastąpienia N-końcowego peptydu sygnałowego GluR0 peptydem sygnałowym proteorodopsyny na udaną kotranslacyjną translokację GluR0 do błon hybrydowych GUV. Metoda ta zapewnia solidną procedurę, która pozwoli na bezkomórkową odtworzenie różnych białek błonowych w komórkach syntetycznych.

Przed enkapsulacją reakcji CFE, dwa warianty GluR0-sfGFP zawierające natywne i proteorhodopsinowe peptydy sygnałowe (sekwencje peptydów sygnałowych przedstawiono w Supplementary Table 1) oraz rozpuszczalne sfGFP wyprodukowano indywidualnie w reakcjach objętościowych, a ich ekspresję monitorowano poprzez wykrywanie sygnału sfGFP za pomocą czytnika płytek (Figure 2A). Białka błonowe eksponowano w obecności lub przy braku 100 nm SUVs. Dodatkowo, wykorzystując krzywą kalibracyjną korelującą sygnał sfGFP z jego stężeniem (Supplementary Figure 1), oszacowano stężenia syntetyzowanych białek (Supplementary Table 2). Wyraźnie widać, że rozpuszczalne sfGFP wykazywało najwyższą ekspresję spośród trzech białek, co sugeruje, że ekspresja białek błonowych obciąża system CFE, spowalniając tym samym reakcję i obniżając jej wydajność. Ponadto średnio reakcje wykazujące ekspresję białek błonowych w obecności SUVs wykazywały wyższy sygnał sfGFP w porównaniu do reakcji bez SUVs. Obserwacja ta jest zgodna z wynikami Steinkühera i wsp., którzy wykazali, że ekspresja białek błonowych zmniejsza zdolność systemów CFE do produkcji białek23. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę pomyślną demonstrację ekspresji białek w objętościowej reakcji CFE, można założyć, że enkapsulowane CFE będzie również syntetyzować białka wewnątrz GUVs. 
Następnie poszczególne reakcje CFE zamknięto w GUV za pomocą metody emulsji odwróconej, aby wyexpronować warianty GluR0, mianowicie WT-GluR0, PRSP-GluR0 oraz rozpuszczalne sfGFP. Podczas gdy WT-GluR0, zawierający natywny peptyd sygnałowy GluR0, wykazał doskonałą ekspresję i lokalizację błonową (Rysunek 2B, panel lewy), jego odpowiednik, PRSP-GluR0, posiadający N-końcowy peptyd sygnałowy proteorodopsyny, nie wykazał tak silnej lokalizacji błonowej. Stwierdzono, że PRSP-GluR0 jest bardziej podatny na agregację i tworzenie punktowych skupień (Rysunek 2B, panel środkowy). Zgodnie z oczekiwaniami, rozpuszczalne sfGFP zostało wyexpronowane w GUV i pozostało w ich lumenie (Rysunek 2B, panel prawy; obrazy grup GUV znajdują się w Rysunku uzupełniającym 2).
<img alt="Tworzenie pęcherzyków z diblockowego kopolimeru; schemat montażu PEO-PBD z wykorzystaniem etapów wirowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66595/66595fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Kroki eksperymentalne emulsji odwróconej. (1) Etapy od 2.3.1 do 2.3.3 protokołu są zwizualizowane, aby zademonstrować tworzenie się monowarstwy lipidowej na granicy fazy mieszaniny lipidowo-olejowej i zewnętrznego roztworu buforowego. (2) Przedstawiono wizualizację kroku 2.3.5 protokołu, obrazującą tworzenie się monowarstwy lipidowej wokół emulsyficowanych kropel kapsułkujących wewnętrzny roztwór CFE. (3) Krok 2.3.6 protokołu pokazuje dodanie monowarstwowych GUV do probówki do mikrowirówki z monowarstwą lipidową na granicy fazy mieszaniny lipidowo-olejowej i zewnętrznego roztworu buforowego. (4) Przedstawiono krok 2.3.7, w którym wirowanie prowadzi do powstania osadu GUV w roztworze zewnętrznym. (5) Pokazano krok 2.3.8, wskazujący proces usuwania nadmiaru mieszaniny lipidów w oleju oraz roztworu zewnętrznego. (6) Na koniec przedstawiono krok 2.3.9, w którym osad GUV zostaje resuspendowany w roztworze zewnętrznym, a GUV są gotowe do inkubacji, a następnie do obrazowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/66595fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywe wzrostu fluorescencji i obrazy mikroskopowe; ekspresja białek w różnych warunkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66595/66595fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ekspresja białek w reakcjach CFE w objętości całkowitej oraz w GUV zawierających reakcje CFE. (A) Odczyty fluorescencji poszczególnych reakcji CFE w objętości całkowitej z ekspresją WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP oraz rozpuszczalnego sfGFP. Wykres dla rozpuszczalnego sfGFP przedstawia sygnał z reakcji o objętości 2,5 µL (standardowa objętość reakcji wynosi 20 µL), aby uniknąć przesycenia pomiarów czytnika płytek. Dane przedstawiono jako średnia ± S.D, n = 3. (B) Lewo: Reprezentatywny obraz konfokalny GUV zawierającej reakcję CFE z ekspresją WT-GluR0-sfGFP. Środek: Reprezentatywny obraz konfokalny GUV zawierających reakcję CFE z ekspresją PRSP-GluR0-sfGFP. Prawo: Reprezentatywny obraz konfokalny GUV zawierającej reakcję CFE z ekspresją rozpuszczalnego sfGFP. Paski skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/66595fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Krzywa kalibracyjna sygnału sfGFP oraz odpowiadająca jej analiza regresji liniowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Reprezentatywny obraz konfokalny grup GUVs wykazujących ekspresję (od lewej) WT-GluR0-sfGFP, (środek) PRSP-GluR0-sfGFP oraz (od prawej) rozpuszczalnego sfGFP. Pasek skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Sekwencja aminokwasowa peptydów sygnałowych typu dzikiego i proteorodopsyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Stężenie zsyntetyzowanych białek w reakcjach CFE w skali masowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66595/Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje metodę odwróconej emulsji używaną do hermetyzacji systemu ekspresji bezkomórkowej (CFE) w gigantycznym pęcherzyku jednowarstwowym (GUV) w celu zbadania syntezy i włączenia modelowego białka błonowego do dwuwarstwy lipidowej.

Rekonstrukcja kanału receptora glutaminianu bakteryjnego poprzez enkapsulację bezkomórkowego systemu ekspresji

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

Nasz protokół dotyczy rekonstytucji białka błonowego w dwuwarstwie lipidowej komórki syntetycznej wykonanej metodą emulsji z odwróconymi kroplami. Zaletą stosowania metody emulsji z odwróconymi kroplami jest jej zdolność do generowania syntetycznych komórek, które zapewniają stabilne środowisko do bezkomórkowej ekspresji białek błonowych. Nasz protokół oferuje naukowcom w tej dziedzinie solidną metodę syntezy białek błonowych wewnątrz syntetycznych komórek przy użyciu bezkomórkowego systemu ekspresji.Moje laboratorium pracuje nad odtworzeniem różnych kanałów jonowych w komórkach syntetycznych poprzez odtworzenie potencjału czynnościowego przez dobrze zdefiniowany zestaw kanałów jonowych. Na początek wdmuchnij delikatny strumień argonu do szklanej fiolki zawierającej lipidy POPC, delikatnie obracając fiolkę. Gdy lipidy wyschną w postaci filmu na dnie fiolki, luźno ją zakryć, a następnie przenieść do eksykatora.Po godzinie dodaj 0,5 mililitra ultraczystej wody dejonizowanej, aby rozpuścić film lipidowy. Mieszaj roztwór przez dwie minuty. Następnie namocz dwa wsporniki filtra w wodzie dejonizowanej.Umieść je na każdym z wewnętrznych wsporników membrany. Następnie umieść 100-nanometrowy filtr poliwęglanowy między dwoma wewnętrznymi wspornikami membrany, połączonymi zewnętrzną obudową ekstrudera i nakrętką ustalającą. Umieść konfigurację w stojaku ekstrudera, aby zakończyć ustawianie mini aparatu do wytłaczania.Następnie załaduj mieszaninę lipidów z wodą do gazoszczelnej strzykawki o pojemności jednego mililitra. Użyj klipsów ramienia wahadłowego, aby przymocować strzykawkę do jednego końca mini ekstrudera. Włóż drugą strzykawkę do drugiego końca mini ekstrudera, upewniając się, że jest całkowicie wciśnięta.Teraz przepuścić przez aparat mieszaninę lipidów z wodą z oryginalnej strzykawki do pustej strzykawki. Po powtórzeniu wytłaczania 11 razy, przenieś SUV-y do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Aby złożyć protokół ekspresji bezkomórkowej, pipetuj roztwory od 1 do 3, plazmid DNA kodujący rozpuszczalny sfGFP lub warianty receptora glutaminianu sfGFP.mysie RNAse i roztwór SUV do fiolki. Dodaj ultraczystą wodę dejonizowaną, aby doprowadzić objętość reakcji do 20 mikrolitrów. Przenieś bezkomórkowy roztwór do odciągania na 96-dołkową stożkową płytkę z dnem w kształcie litery V.Inkubować płytkę w czytniku płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu godzin. Ustaw czytnik płytek z wzmocnieniem 100, wzbudzeniem 485 nanometrów, emisją 528 nanometrów, czasem pracy wynoszącym pięć godzin i pomiarem interwałowym jednego odczytu na każde dwie minuty. Mierz sygnał GFP co dwie minuty, aby monitorować reakcję bezkomórkową w czasie rzeczywistym.Rozpuszczalny sfGFP miał najwyższą ekspresję spośród wszystkich trzech białek. Na początek przygotuj zewnętrzny roztwór buforowy GUV w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej. Wymieszaj ze sobą spermidynę, ATP, GTP, CTP, UTP, fosforan kreatyniny, octan magnezu, glutaminian potasu.HEPES, wodorotlenek potasu, kwas folinowy, glukoza i zapas aminokwasów. Dodaj ultra oczyszczoną wodę dejonizowaną, aby doprowadzić ostateczną objętość roztworu do jednego mililitra.Następnie w dygestorium dodaj 17,3 mikrolitra roztworu podstawowego POPC do 15-mililitrowej szklanej fiolki. W tym celu odpipetuj 1,08 mikrolitra kopolimeru PEO-b-PBD. Ostrożnie wdmuchnąć delikatny strumień argonu do szklanej fiolki, obracając fiolkę w celu odparowania chloroformu.Następnie odpipetować 1,2 mililitra lekkiego oleju mineralnego do szklanej fiolki. Wiruj lipid i olej z maksymalną prędkością przez 10 do 20 sekund. Umieść szklaną fiolkę w piekarniku w temperaturze około 50 stopni Celsjusza na 20 minut, a następnie wiruj przez dodatkowe 10 do 20 sekund z maksymalną prędkością.Następnie odpipetować 270 mikrolitrów roztworu zewnętrznego GUV do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. W tym celu odpipetuj 15 mikrolitrów po pięć molowych chlorków sodu i 4,5-molowych chlorków potasu. Delikatnie odpipetować 300 mikrolitrów mieszaniny lipidów i olejów na wierzchu zewnętrznego roztworu GUV.Po inkubacji złóż reakcję CFE, pipetując roztwory od 1 do 3, plazmid DNA kodujący rozpuszczalny sfGFP lub warianty receptora glutaminianu sfGFP, mysiego, RNAse i jedną sacharozę molową do fiolki. Dodaj ultraczystą wodę dejonizowaną, aby doprowadzić objętość reakcji do 20 mikrolitrów. Dodać 600 mikrolitrów mieszaniny olejów lipidowych do probówki mikrowirówki zawierającej 20-mikrolitrową mieszaninę reakcyjną.Energicznie pipetować w górę i w dół przez jedną minutę, aby zemulgować reakcję. Delikatnie nałóż emulsję wewnętrzną na warstwę oleju w tubce. Wirować przez 10 minut w temperaturze 2 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie ostrożnie odpipetuj nadmiar oleju i zewnętrzny roztwór z probówki mikrowirówki. Delikatnie wymieszać granulat GOV z pozostałym roztworem, aby go ponownie zawiesić. Przenieść roztwór GOV do czystej, 96-dołkowej, przezroczystej płytki z płaskim dnem w celu inkubacji.Przenieść zapieczętowaną płytkę do czytnika płytek w celu inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do sześciu godzin. Po inkubacji umieścić płytkę w odwróconym mikroskopie konfokalnym. Skoncentruj się na obszarze zainteresowania zawierającym GUV.Następnie uchwyć obrazy na długości fali wzbudzenia 488 nanometrów. Zapisz obrazy w formacie TIFF. Otwórz obrazy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów.Kliknij panel ustawień jasności/kontrastu, aby go otworzyć. Następnie dostosuj jasność i kontrast, aby białka fluorescencyjne były widoczne. Bezkomórkowe reakcje ekspresji receptora glutaminianu dzikiego typu zamknięte w GUV wykazały doskonałą ekspresję i lokalizację błony.Receptor PRSP-glutaminianu był podatny na agregację i tworzenie punktów punktowych. Rozpuszczalny sfGFP wyrażano w GUVS i pozostawał w świetle GUV.

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Ten artykuł opisuje metody znakowania spinów kierowanych przez miejsce i odtwarzania pentamerycznych kanałów bramkowanych ligandem do badań elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Protokół ten można dostosować do dowolnego białka błonowego. Opisana tutaj metoda rekonstytucji może być również stosowana do pomiarów patch-clamp prądów makroskopowych i jednokanałowych w zdefiniowanym układzie lipidowym.

Znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Poznaj metodę emulsji kropli odwróconej do rekonstrukcji kanałów jonowych w syntetycznych komórkach z użyciem systemu ekspresji bezkomórkowej. Protokół umożliwia badanie białek błonowych i potencjałów czynnościowych.

Rekonstrukcja kanału receptora glutaminianu bakteryjnego poprzez enkapsulację bezkomórkowego systemu ekspresji

Przeglądaj więcej filmów