Immunokompetentny model pęcherzyka płucnego na chipie do badania odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej pęcherzyków płucnych

Opracowaliśmy fizjologicznie istotne modele in vitro, aby odpowiedzieć na pytanie mechanistyczne w zakażeniach u ludzi. Skupiamy się na reakcji człowieka gospodarza, gdzie używamy tego modelu do analizy złożonej interakcji patogenu z gospodarzem w celu zidentyfikowania celów molekularnych i komórkowych dla opcji terapeutycznych w infekcjach u ludzi. Model typu organ-on-a-chip, taki jak model lung-on-chip, równoważy złożoność biologiczną z konkretnymi potrzebami badawczymi, oferując wgląd w regulację odpowiedzi ludzkiego gospodarza.

System ten naśladuje kompozycję komórkową in vivo i strukturę 3D, zapewniając bardziej zdefiniowane warunki i wysoką przepustowość niż eksperymenty na zwierzętach. W technologii lung-on-chip jednym z głównych wyzwań jest wybór odpowiednich typów komórek, które naśladują złożoną funkcjonalność płuc w celu uzyskania wyników badań nad infekcjami. Co więcej, kluczowe znaczenie ma wydłużenie ram czasowych eksperymentu poza tradycyjne modele in vitro.

Dźwignia to zdolność chipa do utrzymania żywotności komórek przy ciągłym przepływie składników odżywczych. W przypadku dłuższej obserwacji konieczny jest również eksperyment. Opracowaliśmy oparty na mikroprzepływach model wyrostka zębodołowego człowieka jako skuteczne narzędzie do naśladowania środowiska wyrostka zębodołowego człowieka.

Osiągnięto to poprzez zastosowanie perfuzji w celu naśladowania przepływu krwi, a także poprzez mechaniczną stymulację komórek śródbłonka, a także integrację interfejsu powietrze-ciecz dla komórek nabłonka poprzez wystawienie ich na działanie powietrza. Kolejnym krokiem jest rozszerzenie tego modelu na bardziej zaawansowaną platformę, taką jak model oparty na indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych. W ten sposób dążymy do przybliżenia zastosowania medycyny spersonalizowanej, szczególnie w kontekście testowania leków przeciwwirusowych oraz jako narzędzia do badań biomedycznych i rozwoju farmaceutycznego.

Na początek umieść model Biochip BBC002 na szklanej szalce Petriego i przepłucz wszystkie ubytki sterylnym 70% etanolem przez 45 minut. Następnie dwukrotnie przepłucz ubytki sterylną wodą podwójnie destylowaną. Za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów z niebieskimi końcówkami pokryj błonę Biochip górnej jamy sterylnym roztworem kolagenu dożylnie.

Inkubuj chip przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji dwukrotnie przepłukać dolną i górną komorę sterylnym PBS zawierającym magnez i wapń. Wypełnij górną komorę każdej jamy 250 mikrolitrami komórek śródbłonka lub pożywki EC zawierających penicylinę streptomycynę, a dolną komorę 150 mikrolitrami.

Przemyć zlewającą się hodowlę komórek śródbłonka żyły pępowinowej w kolbie T-25 z pięcioma mililitrami DPBS bez magnezu i wapnia PBS. Dodaj jeden mililitr 0,25 trypsyny i jeden milimolowy EDTA w PBS i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodaj pięć mililitrów PBS i 5% FCS, aby zatrzymać aktywność trypsyny.

W stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów odwirować zawiesinę o stężeniu 350 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki EC. Dodać 10 mikrolitrów od jednego do 10 rozcieńczonych zawiesin komórkowych do probówki mikrowirówki zawierającej 10 mikrolitrów niebieskiego barwnika trypanowego. Policz komórki ręcznie za pomocą komory Neubauera.

Po zliczeniu należy zastąpić pożywkę komórkową śródbłonka w górnej komorze Biochipa 200 mikrolitrami pożywki EC zawierającej 0,4 razy 10 do potęgi sześciu ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej. Umieść szklaną szalkę Petriego z biochipami w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Wykonuj codzienną wymianę pożywki z 300 mikrolitrami pożywki EC dla górnej komory i 200 mikrolitrami pożywki RPMI+ dla dolnej komory.

Po umyciu monocytów jednym mililitrem PBS, inkubuj je we wstępnie podgrzanym PBS zawierającym lidokainę i EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez siedem minut. Zebrać i odwirować komórki w temperaturze 350 G przez siedem minut. Po ponownym wymieszaniu w jednym mililitrze RPMI+ policz ogniwa, jak pokazano wcześniej.

Wysiew 0,1 razy 10 do mocy sześciu monocytów zawieszonych w 200 mikrolitrach RPMI+ w dolnej komorze. Umieść porty Biochip skierowane w dół, tak aby komórki przyczepiły się do membrany. Przed podłączeniem wysterylizowanej rurki do Biochipa, najpierw przepłucz rurkę 200 mikrolitrami PBS, a następnie 200 mikrolitrami pożywki EC.

Po przepłukaniu górnej i dolnej komory świeżo przygotowanym podłożem do hodowli komórkowych, należy włożyć zbiornik po stronie wylotowej Biochipa i podłączyć zbiornik wraz z rurką do wlotu Biochipa. W celu perfuzji medium okrągłego podłącz rurkę do zbiornika i Biochip. Teraz napełnij zbiornik 500 mikrolitrami pożywki EC.

Połącz Biochip z rurką, aby rozpocząć obfitość przy natężeniu przepływu 21 mikrolitrów na minutę. Następnego dnia zatrzymaj obfitość i opróżnij zbiorniki. Pod sterylną szafką bezpieczeństwa odpipetuj 500 mikrolitrów pożywki EC do zbiorników i delikatnie przepłucz dolną komorę 200 mikrolitrami pożywki RPMI+.

Następnie ponownie uruchom perfuzję z natężeniem przepływu 21 mikrolitrów na minutę. Aby ustalić granicę faz powietrze-ciecz od 12 do 14 dnia, otwórz korki w dolnej komorze i ostrożnie wchłoń pożywkę, aż widoczny będzie pęcherzyk powietrza. Po upewnieniu się, że cała ciecz z kanału i komory została usunięta, ostrożnie zamknij porty.

napełnić zbiornik świeżo przygotowanym naczyniowym podłożem EC i kontynuować hodowlę profuzji tylko w górnej komorze do 14 dnia. Odłącz Biochip od systemu przepływowego. Po wyjęciu rurki zbadaj warstwy komórek z Biochipa pod mikroskopem pod kątem zbiegu komórek.

Przemyj wnęki Biochip PBS, aby usunąć pożywkę do hodowli komórkowych. Dodaj 300 mikrolitrów 4% roztworu paraformaldehydu w PBS do górnej komory i 200 mikrolitrów do dolnej komory. Po 10 minutach inkubacji przemyć komorę trzykrotnie PBS.

W celu przepuszczalności dodaj 300 mikrolitrów 0,25% Triton X-100 w PBS i inkubuj przez 30 minut. Po przemyciu PBS pobrać pipetą 300 mikrolitrów 3% albuminy surowicy bydlęcej w PBS w obu komorach i inkubować przez godzinę. Do barwienia immunofluorescencyjnego należy przygotować 50 mikrolitrów roztworów przeciwciał przy użyciu 3% BSA dla każdej membrany, stosując odpowiednie proporcje rozcieńczenia.

Aby uzyskać dostęp do komórek w Biochipie, należy wykonać dokładne nacięcie na zewnątrz wnęki i usunąć folię łączącą. Za pomocą skalpela wytnij membranę, usuwając krawędzie przypieczętowane do Biochipa. Po podzieleniu membrany na dwie części, zbierz kawałki membrany za pomocą pęsety i umieść je na mikroskopijnym szkiełku w celu barwienia.

Dodaj 50 mikrolitrów roztworu przeciwciała do każdego kawałka błony i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Po trzykrotnym umyciu membrany PBS, dodaj kroplę medium montażowego na oznaczony szkiełko i umieść odpowiednią membranę. Dodaj kroplę medium montażowego na wierzch membrany i umieść szklankę nakryciową.

Barwienie immunofluorescencyjne ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej wykazało zmiany morfologiczne i ekspresję białka markerowego po 14 dniach kohodowli. Po stronie naczyniowej ekspresja VE kadheryny na granicach komórek śródbłonka sugerowała zbieganie się i tworzenie bariery śródbłonka. Po stronie nabłonka oceniano ekspresję E-kadheryny i białka A środka powierzchniowo czynnego, co wskazuje na integralność i funkcję nabłonka pęcherzyków płucnych.