Immunokompetentny model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit

Nasze badania koncentrują się na rozwoju i wykorzystaniu immunokompetentnych platform narządów na chipie. Tworząc te fizjologicznie istotne, humanizowane modele in vitro, jesteśmy w stanie badać złożoną interakcję gospodarz-patogen. Tworzona przez nas wiedza może być wykorzystana do manipulacji i identyfikacji celów molekularnych w terapii chorób zakaźnych.

Jednym z kluczowych wyzwań jest utrzymanie żywej mikrobioty w warunkach homeostazy wraz z tkanką gospodarza in vitro. Obejmuje to odtworzenie organotypowej topografii 3D struktur krypt i kosmków oraz ich kolonizacji mikrobiologicznej. Platformy Intestine-on-chip rozwiązują ten problem, wykorzystując przepływ do kształtowania struktur organotypowych i zapobiegania nadmiernemu rozrostowi bakterii.

Zapewnia to stabilne warunki hodowli. W porównaniu z innymi dostępnymi platformami typu intestine-on-chip, nasz model umożliwia szczegółowe badanie ludzkiej odpowiedzi immunologicznej na patogeny dzięki włączeniu pierwotnych komórek odpornościowych rezydujących w tkance. Ponadto rozmiar modelu umożliwia wiele odczytów w jednym eksperymencie, co zmniejsza ogólny koszt i liczbę eksperymentów.

Nasze laboratorium koncentruje się na wykorzystaniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do opracowania systemów autologicznych, które umożliwiają medycynę spersonalizowaną. Na początek przygotuj rozcieńczenie 1:100 roztworu podstawowego kolagenu w DPBS z magnezem i wapniem. Dodać 350 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu podstawowego do odpowiedniej komory i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Przepłucz wszystkie komory dwa razy za pomocą 350 mikrolitrów DPBS z magnezem i wapniem, aby wypłukać pozostały kolagen i kwas octowy. Wyjmij wtyczki z jednego miejsca i przełącz je na drugą stronę. Po ponownym przepłukaniu komory dodaj do niej 350 mikrolitrów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka.

Wyjmij wtyczki z jednego miejsca i przełącz je na drugą stronę. Następnie dodaj 350 mikrolitrów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka do każdej komory. Weźmy HUVEC hodowane w pasażach 1-3 z 80 do 90% zbieżnością komórek w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka.

Następnie wyjmij pożywkę do hodowli komórkowych z kolby do hodowli komórkowych T25 i delikatnie umyj komórki trzema do pięciu mililitrami DPBS bez magnezu i wapnia. Po usunięciu roztworu dodać jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego trypsyny i inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki oderwą się od kolby. Przenieś odłączone komórki do probówki za pomocą dziewięciu mililitrów 5% FBS w PBS bez magnezu i wapnia Wirować w 350 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po przemieszczeniu supernatantu ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze pożywki do wzrostu komórek śródbłonka. Dodaj odpowiednią objętość komórek do komory i inkubuj biochipy w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach należy przeprowadzić wymianę pożywki w komorze zawierającej HUVEC na 350 mikrolitrów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka.

Jeśli w biochipach mikroprzepływowych pojawią się pęcherzyki powietrza, zamknij wszystkie porty biochipa poza portami dotkniętej komory. Przechyl wiór, aby przesunąć pęcherzyk powietrza blisko jednego końca wnęki. Z portu drugiego końca przepchnij 700 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych przez komorę, trzymając przeciwległe zatyczki.

Na początek dokładnie wyczyść wszystkie obszary inkubatora i pompy perystaltycznej środkiem dezynfekującym, aby zapewnić quasi-sterylne środowisko. Następnie przepłucz każdą rurkę 700 mikrolitrami PBS z magnezem i wapniem, a następnie 500 mikrolitrami pożywki kondycjonowanej C2 lub EC. Użyć rurki o krótkiej odległości od zamka luer do korka pompy perystaltycznej dla lewej wnęki, a rurki z drugą symetrią dla prawej wnęki.

Po pobraniu z inkubatora biochipa z komórkami HUVEC i C2BBe1 należy przeprowadzić wymianę pożywki z 350 mikrolitrami na każdą komorę. Następnie przenieś wtyczki z dolnego do górnego miejsca. Dodaj 350 mikrolitrów świeżej pożywki do dolnej komory biochipa.

Następnie usuń wszystkie wtyczki i napełnij wszystkie porty do samej góry. Zaczynając od lewej wnęki, włóż adapter luer lock do portu biochipa, aby podłączyć pierwszą rurkę do prawego portu górnej komory. Następnie podłącz drugi przewód do lewego portu dolnej komory.

Następnie weź zbiornik i dodaj niewielką kroplę pożywki do hodowli komórkowych na dno zbiornika. Następnie włóż zbiornik po przeciwnej stronie pierwszej rurki i powtórz dla drugiej komory. Gdy wszystkie porty zostaną podłączone do rurki lub zbiornika, napełnij zbiorniki 3.5 mililitrami pożywki do hodowli komórkowych.

Następnie umieść luźną stronę rurki, do której przymocowana jest pokrywka, na górze zbiornika, aby zamknąć układ mikroprzepływowy każdej komory. Przetransportować biochip do pompy perystaltycznej. Za pomocą korków pompy perystaltycznej podłącz każdą rurkę do pompy perystaltycznej tak, aby medium przepływało ze zbiornika do wnęki i z powrotem przez pompę.

Następnie perfaktoruj każdą komorę z natężeniem przepływu 50 mikrolitrów na minutę. Po zakończeniu wstępnej perfuzji zatrzymaj pompę perystaltyczną. Zdejmij pokrywkę podłączoną do rurki każdego zbiornika i umieść ją na sterylnej chusteczce obok pompy.

Po usunięciu całego podłoża napełnij zbiorniki dwoma mililitrami świeżo przygotowanego podłoża. Ponownie podłącz rurkę w pokrywie i kontynuuj perfuzję kołową z natężeniem przepływu 50 mikrolitrów na minutę przez dodatkowe 24 godziny. Po zatrzymaniu pompy perystaltycznej otwórz zbiorniki wszystkich jam, opróżnij zbiorniki i odłącz rurki i zbiorniki od biochipa.

Umyj wnęki mikroprzepływowe 500 mikrolitrami zimnego PBS z magnezem i wapniem dwa razy w komorze. Dodaj 500 mikrolitrów lodowatego metanolu do wszystkich ubytków. Po otwarciu chipa należy przeciąć lub usunąć folię klejącą biochipa.

Przeciąć tkankę zawierającą błonę PET na pół, aby wybarwić ją równolegle za pomocą różnych immunopaneli. Za pomocą precyzyjnej pęsety przenieś każdy kawałek membrany do osobnego dołka w 24-dołkowej płytce z roztworem blokującym i przepuszczalnym. Następnie przenieś kawałki membrany na czyste szkiełko podstawowe w wilgotnej komorze.

Dodać 50 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego przygotowanego w roztworze barwiącym do każdego kawałka membrany. Po przeniesieniu próbek do płytki 24-dołkowej należy przemyć membrany dwukrotnie przez pięć minut roztworem do mycia, a następnie PBS zawierającym magnez i wapń. Używając fluorescencyjnego podłoża montażowego i szkła nakrywkowego, zamontuj elementy membrany na czystym szkiełku podstawowym i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu uzyskania mikroskopowego obrazowania.

Po pięciu dniach perfuzji jądrowe DNA wybarwione DAPI wykazało w pełni zróżnicowane makrofagi pochodzące z monocytów eksprymujące CD68 rozprzestrzeniające się po całej tkance naczyniowej. HUVEC utworzył zlewającą się warstwę wykazującą integralność tkanek poprzez tworzenie połączeń adherenowych, takich jak VE-Cadherin. Dodatkowo, czynnik von Willebranda jest silnie wyrażany przez HUVEC.

Po pięciu dniach perfuzji komórki C2BBe1 utworzyły spolaryzowane warstwy komórek nabłonkowych eksprymujących białka połączeniowe E-kadherynę i ZO-1. Trójwymiarowy wzrost struktur nabłonka przypominających kosmki i krypty można wykryć w sekcjach x i y stosu z po sześciu dniach perfuzji.