Name: Immunokompetentny model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj zaawansowany model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej. Ta metoda umożliwia badanie interakcji gospodarz-patogen w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wspierana finansowo przez Collaborative Research Center PolyTarget 1278 (numer projektu 316213987) dla V.D.W. i A.S.M. A.F. i A.S.M. dodatkowo dziękują za wsparcie finansowe Klastra Doskonałości "Balance of the Microverse" w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860. Pragniemy podziękować Astrid Tannert i Laboratorium Biofotonicznemu i Obrazowaniu w Jenie (JBIL) za udostępnienie nam ich konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego ZEISS LSM980. Rysunek 1C i rysunek 2 zostały utworzone za pomocą Biorender.com.

Enhanced Intestine-on-Chip Platform for Immunological Insight

<ol><li>Alonso-Roman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-chip+models+for+infectious+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ-on-chip models for infectious disease research.</a> Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).</li>
<li>Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+natural+killer+cells+in+a+microfluidically+perfused+liver+on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Functional integration of natural killer cells in a microfluidically perfused liver on-a-chip model.</a> BMC Res Notes. 16 (1), 285(2023).</li>
<li>Raasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidically+supported+biochip+design+for+culture+of+endothelial+cell+layers+with+improved+perfusion+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions.</a> Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).</li>
<li>Deinhardt-Emmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+with+Staphylococcus+aureus+after+primary+influenza+virus+infection+leads+to+damage+of+the+endothelium+in+a+human+alveolus-on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Co-infection with Staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model.</a> Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).</li>
<li>Kaden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+%26+characterization+of+expandable+human+liver+sinusoidal+endothelial+cells+and+their+application+to+assess+hepatotoxicity+in+an+advanced+in+vitro+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Generation & characterization of expandable human liver sinusoidal endothelial cells and their application to assess hepatotoxicity in an advanced in vitro liver model.</a> Toxicology. 483, 153374(2023).</li>
<li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+immunocompetent+intestine-on-chip+model+as+in+vitro+platform+for+functional+and+microbial+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional immunocompetent intestine-on-chip model as in vitro platform for functional and microbial interaction studies.</a> Biomaterials. 220, 119396(2019).</li>
<li>Hoang, T. N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+aspergillosis-on-chip%3A+A+quantitative+treatment+study+of+human+aspergillus+fumigatus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection.</a> Biomaterials. 283, 121420(2022).</li>
<li>Kaden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+intravenous+caspofungin+administration+using+an+intestine-on-chip+reveals+altered+Candida+albicans+microcolonies+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modeling of intravenous caspofungin administration using an intestine-on-chip reveals altered Candida albicans microcolonies and pathogenicity.</a> Biomaterials. 307, 122525(2024).</li>
<li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nat Commun. 7, 11535(2016).</li>
<li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li>
<li>Mosig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+functions+of+monocyte+subsets+in+familial+hypercholesterolemia%3A+Potential+function+of+cd14%2B+cd16%2B+monocytes+in+detoxification+of+oxidized+ldl%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Different functions of monocyte subsets in familial hypercholesterolemia: Potential function of cd14+ cd16+ monocytes in detoxification of oxidized ldl.</a> FASEB J. 23 (3), 866-874 (2009).</li>
<li>Peterson, M., Mooseker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeieton+of+the+c2bbe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line%2C+caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeieton of the c2bbe clones of the human intestinal cell line, caco-2.</a> J Cell Sci. 102, Pt 3 581-600 (1992).</li>
<li>Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+morphogenesis+controlled+by+transepithelial+morphogen+gradient+and+flow-dependent+physical+cues+in+a+microengineered+gut-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip.</a> iScience. 15, 391-406 (2019).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integr Biol (Camb). 5 (9), 1130-1140 (2013).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
<li>Karra, N., Fernandes, J., James, J., Swindle, E. J., Morgan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+membrane+properties+on+cell+growth+in+an+%27airway+barrier+on+a+chip%27%5BTitle%5D)+AND+%22Organs-on-a-Chip%22%5BJournal%5D)">The effect of membrane properties on cell growth in an 'airway barrier on a chip'.</a> Organs-on-a-Chip. 5, 10025(2023).</li>
</ol>

M.R. jest dyrektorem generalnym Dynamic42 GmbH i posiada udziały w spółce. A.S.M. jest doradcą naukowym Dynamic 42 GmbH i posiada udziały w spółce.

Przedstawiony protokół szczegółowo opisuje niezbędne kroki do wygenerowania immunokompetentnego modelu jelita na chipie. Opisaliśmy konkretne techniki i możliwe metody odczytu, takie jak mikroskopia immunofluorescencyjna, analiza cytokin i metabolitów, cytometria przepływowa, analiza białkowa i genetyczna oraz pomiar przepuszczalności.
Opisany model składa się z pierwotnych HUVEC, makrofagów pochodzących z monocytów i komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów współhodowanych z warstwą 3D komórek nabłonka jelitowego reprezentujących aspekty populacji wydzielających śluz, absorpcyjnych, enteroendokrynnych i podobnych do komórek Pabeth, jak opisano wcześniej 6,14. Podczas wykonywania kroków protokołu należy pamiętać o kilku krytycznych punktach. Na wszystkich etapach należy zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków powietrza w układzie mikroprzepływowym. Dlatego zawsze pipetuj odwrotnie (pobieraj objętość od drugiego oporu i dozuj tylko do pierwszego zatrzymania) podczas obchodzenia się z biochipem lub rurką. Aby zapobiec wysokiemu ciśnieniu lub siłom ścinającym działającym na komórki w biochipie, należy zawsze delikatnie pipetować i zamykać przeciwległą komorę podczas pipetowania w biochipie (np. podczas wymiany pożywki w górnej komorze należy zamknąć dolną komorę odpowiednimi zatyczkami). Biochip umożliwia wysiewanie komórek po dwóch stronach membrany PET. W związku z tym model można ustawić ze strukturami przypominającymi kosmki jelitowe pod membraną PET lub rosnącymi na błonie w górę. W zależności od zainteresowania badawczego, jedna lub druga orientacja komórek ma pewne korzyści w zakresie interakcji fizycznej, takie jak wspomaganie grawitacyjne przyłączania komórek krążących zawieszonych w ośrodku przepływowym.
Ze względu na przepływ ośrodka mikroprzepływowego, spolaryzowane komórki jelitowe tworzą trójwymiarową tkankę przypominającą struktury przypominające krypty i kosmki, które kształtują głęboką barierę tkankową wierzchołkową przez gęstą sieć połączeń ścisłych i połączeń adherenowych6. Dodatkowo, zintegrowane wrodzone komórki odpornościowe zwiększają funkcję bariery jelitowej i pozwalają na szczegółowe badanie odpowiedzi cytokin i komórek odpornościowych na różne bodźce, w tym odpowiedzi immunologiczne specyficzne dla dawcy 3,6. Model ten stanowi fizjologicznie istotną platformę do badania komensalów mikrobiologicznych (np. Lactobacillus rhamnosus6) i patogenów (np. Candida albicans 6,8 ) ludzkiego jelita. Model wykorzystano do zbadania mechanizmów zmian składu mikrobiologicznego jelit i regulacji odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej6. W badaniu wykazaliśmy, jak odtworzyć fizjologiczną tolerancję immunologiczną światła jelita i wspierać homeostatyczną kolonizację przez żywe mikroorganizmy. Co więcej, wstępna kolonizacja luminalnej strony modelu probiotykiem Lactobacillus rhamnosus zmniejszyła inwazję tkankową Candida albicans i ograniczyła jej translokację do przedziału naczyniowego, podobnie jak w sytuacji in vivo. Badanie dowiodło potencjału modelu w zakresie badania interakcji mikrobiologicznych, odpowiedzi immunologicznych i mechanizmów patogenności jelita w fizjologicznie istotnych warunkach in vitro.
Mimo to ta platforma chipowa ma ograniczenia, a mianowicie wykorzystanie komórek jelitowych pochodzących z raka, które nie są w pełni zdolne do reprezentowania ludzkiego jelita, oraz wykorzystanie pierwotnych komórek śródbłonka i komórek odpornościowych. Warunki hodowli hipoksyjnej można ustalić, hodując model w inkubatorze do hipoksji w warunkach perfuzji, aby lepiej odzwierciedlić sytuację in vivo ludzkiego jelita.
W porównaniu z innymi platformami OoC, takimi jak model "gut-on-a-chip" opublikowany przez Kima i wsp.14,15, początkowa liczba komórek tworzących prezentowany model tkankowy jest około 10-krotnie wyższa. Umożliwia to na przykład jednoczesną analizę do trzech paneli barwienia immunofluorescencyjnego w ramach pojedynczego eksperymentu. Większa liczba komórek dodatkowo usprawnia analizy punktów końcowych, w tym cytometrię przepływową, analizę western blot i inne standardowe, gotowe testy, które wymagają supernatantów do hodowli komórkowych, takich jak profilowanie cytokin i pomiar dehydrogenazy mleczanowej (LDH). Uzyskanie wielu odczytów z jednego eksperymentu zmniejsza ogólne koszty i czas eksperymentu. Gotowe rozwiązania sprzętowe od szerokiego spektrum producentów są dostępne dzięki ustandaryzowanej platformie biochipów, która obejmuje interfejsy przemysłowe i ślady (mikroskopijny format szkiełka chipa, porty w formacie luer lock i wyrównane na matrycy 96-dołkowej). Obejmuje to również wiele membran z różnych materiałów i o różnych rozmiarach porów. Wielkość porów może wpływać na wzrost komórek i integralność tkanek16, a także na migrację komórek.
Podsumowując, protokół ten przedstawia szczegółowy i adaptowalny model jelita na chipie, który replikuje kluczowe elementy środowiska jelitowego człowieka. Stanowi skalowalną i skuteczną platformę do prowadzenia szeroko zakrojonych badań nad mikrobiotą jelitową i tkanką jelitową gospodarza, ze szczególnym uwzględnieniem odpowiedzi immunologicznych gospodarza i patofizjologii jelit. W związku z tym model jest w stanie wypełnić lukę między tradycyjnymi modelami in vitro a biologią człowieka, co czyni go niezbędnym narzędziem do dogłębnych badań nad biologią jelit.

Systemy Organ-on-Chip (OoC) reprezentują nową technikę hodowli komórek 3D, która jest w stanie wypełnić lukę między konwencjonalną hodowlą komórkową 2D a modelami zwierzęcymi. Platformy OoC zazwyczaj składają się z jednego lub więcej przedziałów zawierających komórki specyficzne dla tkanek hodowane na szerokiej gamie rusztowań, takich jak membrany lub hydrożele1. Modele są w stanie naśladować jedną lub więcej zdefiniowanych funkcji organotypowych. Pompy umożliwiają ciągłą mikroprzepływową perfuzję pożywki do hodowli komórkowych w celu usunięcia produktów przemiany materii komórkowej, zaopatrzenia w składniki odżywcze i czynniki wzrostu w celu poprawy różnicowania komórkowego oraz odtworzenia niezbędnych warunków in vivo. Dzięki integracji komórek odpornościowych, systemy OoC mogą naśladować ludzką odpowiedź immunologiczną in vitro2. Do tej pory zaprezentowano szeroką gamę narządów i jednostek funkcjonalnych1. Systemy te obejmują modele układu naczyniowego3, lung4, liver2,5 oraz intestine6, które mogą być ułatwione do testowania leków5,7 i badań nad infekcjami6,8.
Prezentujemy tutaj model ludzkiego jelita na chipie, integrujący ludzkie komórki nabłonkowe, tworzący organotypową topografię 3D struktur podobnych do kosmków i krypt w połączeniu z wyściółką śródbłonka i makrofagami rezydującymi w tkankach. Model jest hodowany w mikroprzepływowo perfundowanym biochipie w formacie szkiełka mikroskopowego. Każdy biochip składa się z dwóch oddzielnych wnęk mikroprzepływowych. Każda wnęka jest podzielona porowatą membraną z politereftalanu etylenu (PET) na górną i dolną komorę. Sama błona służy również jako rusztowanie dla komórek do wzrostu z każdej strony. Pory błony umożliwiają przesłuchy komórkowe i migrację komórek między warstwami komórek. Dostęp do każdej komory można uzyskać za pomocą dwóch żeńskich portów wielkości luer lock. Opcjonalnie dodatkowy port o rozmiarach mini-luer lock może zapewnić dostęp do górnej lub dolnej komory (Rysunek 1).
Platforma OoC oferuje wiele odczytów, które można uzyskać z jednego eksperymentu. Intestine-on-chip jest dostosowany do łączenia perfundowanej hodowli komórek 3D, analizy ścieków i mikroskopii fluorescencyjnej w celu oceny ekspresji markerów komórkowych, tempa metabolizowania, odpowiedzi immunologicznej, kolonizacji i infekcji drobnoustrojów oraz funkcji bariery3,6,8. Model obejmuje rezydujące w tkance komórki odpornościowe i bezpośredni kontakt żywych mikroorganizmów z tkanką gospodarza, co jest zaletą w porównaniu z innymi opublikowanymi modelami9. Co więcej, komórki nabłonkowe samoorganizują się w trójwymiarowe struktury, które zapewniają fizjologicznie istotny interfejs dla kolonizacji żywym mikrobiotą6.

<table><tbody><tr><td>Płytka 96-dołkowa, przezroczyste dno</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000631</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Roth</td><td>3738.4</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure, osioł, anty-mysie IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>715-545-150</td><td>Wtórne barwienie naczyń krwionośnych i barwienie nabłonka</td></tr><tr><td>przeciwciał Alexa Fluor 647 AffiniPure, osioł, anty-królik IgG (H+L)</td><td>Jackson Badania immunologiczne</td><td>711-605-152</td><td>Wtórne barwienie nabłonka przeciwciał</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647, osioł, anty-królicze IgG (H + L)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A31573</td><td>Wtórne barwienie naczyń krwionośnych</td></tr><tr><td>przeciwciał Aparat Axiocam ERc5s</td><td>Zeiss</td><td>426540-9901-000</td><td>Wyposażenie techniczne</td></tr><tr><td>Basal Medium MV, bez czerwieni fenolowej</td><td>Promocell</td><td>C-22225</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Biochip</td><td>Dynamic 42</td><td>BC002</td><td>Materiały eksploatacyjne mikroprzepływowe</td></tr><tr><td>Frakcja BSA V</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>C2BBe1 (klon Caco-2)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td>Źródło komórek nabłonkowych</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Heracell</td><td>150i</td><td>Wyposażenie techniczne</td></tr><tr><td>Kolagen IV z ludzkiego łożyska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (24 x 40 mm; #1.5)</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>15747592</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure, osioł, anty-kozi IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>705-165-147</td><td>Wtórne barwienie naczyniowe przeciwciał</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure, osioł, antyszczurzy IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>712-165-150</td><td>Wtórne barwienie nabłonka przeciwciał</td></tr><tr><td>Descosept PUR</td><td>Dr.Schuhmacher</td><td>00-323-100</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Gibco</td><td>41965-062</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>31053028</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>DPBS (-/-)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Roztwór EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka mieszanka suplementów</td><td>Promocell</td><td>C-39225</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Etanol 96%, niedenaturowany</td><td>Nordbrand-Nordhausen</td><td>410</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu invitrogen 10270106</td><td></td><td>Hodowla komórkowa materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)-dekstran (3-5 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne medium montażowe</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>Gentamycyna (10 mg / ml)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1272</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Hoechst (bisBenzimid) H33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Barwienie nabłonka</td></tr><tr><td>Holotransferyna (5 mg / ml) Transferyna, Holo, Milipore z ludzkiego osocza</td><td></td><td>616397</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-30</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Człowiek rekombinowany M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Urządzenie oświetleniowe</td> Konfiguracja <td>mikroskopu fluorescencyjnego</td><td>Zeiss</td><td>HXP 120 C</td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Konfiguracja mikroskopu fluorescencyjnego</td><td>Zeiss</td><td>CLSM980</td></tr><tr><td>Chlorowodorek lidokainy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Loftex Wipes</td><td>Loftex</td><td>1250115</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Rurki z niskim mocowaniem (PS, 5 mL)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Adapter Luer do górnej pokrywy (M)</td><td>Mo Bi Tec</td><td>M3003</td><td>Materiały eksploatacyjne mikroprzepływowe</td></tr><tr><td>Męskie mini wtyki luer, rząd czterech, PP, nieprzezroczyste</td><td>Chipshop mikroprzepływowy</td><td>09-0556-0336-09</td><td>Mikroprzepływowe materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Roth</td><td>8388.2</td><td>Mikroskop chemiczny</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer 5</td><td>Konfiguracja mikroskopu fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Menzel</td><td>MZ-0002</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Monoklonalne, mysie, anty-ludzkie przeciwciało CD68 ( KP1)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>14-0688-82</td><td>Pierwotne przeciwciało Barwienie naczyniowe</td></tr><tr><td>Monoklonalne, szczurze, anty-ludzkie przeciwciało E-kadheryny (DECMA-1)</td> <td>Sigma-Aldrich, Millipore</td><td>MABT26</td><td>Pierwotne barwienie nabłonka przeciwciał</td></tr><tr><td>Czytnik płytek Multiskan</td><td>Go Thermo Fisher</td><td>51119300</td><td>Wyposażenie techniczne</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Biozol</td><td>LIN-END9010-10</td><td>chemikalia</td></tr><tr><td>Przekrój optyczny</td> Konfiguracja <td>mikroskopu fluorescencyjnego</td><td>Zeiss</td><td>ApoTome</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / mL)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Zatyczki</td><td>Cole Parmer</td><td>GZ-45555-56</td><td>Materiały eksploatacyjne mikroprzepływowe</td></tr><tr><td>Poliklonalne, kozie, anty-ludzkie przeciwciało VE-Kadheryna</td><td>R& D Systems</td><td>AF938</td><td>Pierwotne przeciwciało Barwienie naczyniowe</td></tr><tr><td>Poliklonalne, królik, anty-ludzkie Przeciwciało czynnika von Willebranda</td><td>Dako</td><td>A0082</td><td>Pierwotne przeciwciało Barwienie naczyniowe</td></tr><tr><td>Poliklonalne, królik, przeciwciało anty-ludzkie ZO-1</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>Pierwotne przeciwciało Barwienie nabłonka</td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Mikroskop Zeiss</td><td>Eplax Vp232</td><td>Konfiguracja mikroskopu fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Mikroskop Primovert</td><td>Zeiss</td><td>415510-1101-000</td><td>Wyposażenie techniczne</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna Reglo ICC</td><td>Ismatec</td><td>ISM4412</td><td>Wyposażenie techniczne</td></tr><tr><td>SAHA (Vorinostat)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0061-25MG</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>47036</td><td>Chemicals</td></tr><tr><td>S-Monovette, 7,5 mL Z-Gel</td><td>Sarstedt</td><td>01.1602</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>S-Monovette, 9.0 mL K3E</td><td>Sarstedt</td><td>02.1066.001</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Zbiornik 4,5 ml</td><td>ChipShop</td><td>10000079</td><td>Materiały eksploatacyjne mikroprzepływowe</td></tr><tr><td>Trypane niebieskie barwienie 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>11538876</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Rurki</td><td>Dynamic 42</td><td>ST001</td><td>Materiały eksploatacyjne mikroprzepływowe</td></tr><tr><td>Pęseta (Pr&auml; zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)</td><td>Roth</td><td>K343.1</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Agglutynina z kiełków pszenicy (WGA)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>W32464</td><td>Barwienie nabłonka</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td>Materiały eksploatacyjne do hodowli komórkowych, Pożywka z komórek krwiotwórczych</td></tr><tr><td>Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterylne</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662 160</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterylne</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td>Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Zen Blue</td><td>Oprogramowanie Zeiss</td><td>Wersja 3.7</td><td>Oprogramowanie mikroskopowe</td></tr></tbody></table>

immunokompetentny model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit

Immunocompetent Intestine-on-Chip Model for Analyzing Gut Mucosal Immune Responses

Zaawansowany model jelita na chipie, odtwarzający nabłonkowe 3D organotypowe struktury podobne do kosmków i krypt. Model immunokompetentny obejmuje ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), komórki nabłonka jelitowego Caco-2, makrofagi rezydujące w tkankach i komórki dendrytyczne, które samoorganizują się w tkance, odzwierciedlając cechy błony śluzowej jelit człowieka. Unikalnym aspektem tej platformy jest jej zdolność do integracji krążących ludzkich pierwotnych komórek odpornościowych, co zwiększa znaczenie fizjologiczne. Model ma na celu zbadanie odpowiedzi jelitowego układu odpornościowego na kolonizację i infekcję bakteryjną i grzybiczą. Ze względu na powiększony rozmiar wnęki, model oferuje różnorodne odczyty funkcjonalne, takie jak testy przenikania, uwalnianie cytokin i infiltracja komórek odpornościowych, i jest kompatybilny z pomiarem immunofluorescencji struktur 3D utworzonych przez warstwę komórek nabłonka. Niniejszym dostarcza kompleksowych informacji na temat różnicowania i funkcji komórek. Platforma intestine-on-chip wykazała swój potencjał w wyjaśnianiu złożonych interakcji między substytutami żywej mikrobioty a ludzką tkanką gospodarza w ramach mikrofizjologicznej perfundowanej platformy biochipowej.

Te reprezentatywne wyniki przedstawiają wyraźne warstwy tkanki w modelu jelita na chipie. Zostały one zabarwione immunofluorescencyjnie zgodnie z opisem w sekcji 11 protokołu. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego jako stosy z (z-stacks), a następnie przetworzono do projekcji ortogonalnej. Szczegóły dotyczące konfiguracji mikroskopowej i oprogramowania znajdują się w Tabeli Materiałów. Rysunek 5 przedstawia warstwę naczyniową, tworzącą barierę endotelialną monowarstwę składającą się z HUVECs i makrofagów. Zabarwiono reprezentatywne markery komórkowe, takie jak VE-Cadherin i czynnik von Willebranda dla komórek endotelialnych oraz CD68 dla makrofagów. Trójwymiarowa warstwa nabłonkowa składająca się z komórek C2BBe1 jest pokazana na Rysunku 6 i Rysunku 7. Integralność tkanki została potwierdzona poprzez zabarwienie E-Cadherin i ZO-1. Szczegółową analizę wszystkich oczekiwanych markerów tkankowych i polaryzacji tkanki można znaleźć w pracy Maurer et al.6. Rysunek 8 przedstawia przykładowy obraz wykazujący brak trójwymiarowego wzrostu struktur przypominających kosmki jelitowe. W porównaniu z typową trójwymiarową warstwą komórkową (Rysunek 6), liczba zabarwionych jąder jest znacznie mniejsza, a komórki występują jedynie w formie monowarstwy. Ten specyficzny fenotyp uzyskano poprzez dodanie do pożywki hodowlanej inhibitora deacetylazy histonowej, który hamuje proliferację komórek. Przepuszczalność bariery ocenia się za pomocą testu przenikania z użyciem FITC-dextran. Przepuszczalność wzrosła po zakażeniu oportunistycznym patogenem C. albicans, co pokazano na Rysunku 9A. Zakażenie prowadzi do zwiększonego uwalniania cytokin IL-1β, IL-6, IL-8 i IL-10 do nadsączu pożywki naczyniowej (Rysunek 9B)8.
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Utrwalona strona naczyniowa układu intestine-on-chip. Reprezentatywny obraz immunofluorescencji bariery naczyniowej po pięciu dniach perfuzji. Tkankę utrwalono metanolem. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wykonano stos z-stack z przekrojami o grubości 1 µm; przedstawiono ortogonalną projekcję maksymalną tego stosu. (A) DNA w jądrach komórkowych zabarwiono DAPI. (B) W pełni zróżnicowane makrofagi pochodzące z monocytów wykazują ekspresję CD68 i są rozproszone w całej tkance naczyniowej. (C) HUVECs tworzą konfluencyjną warstwę wykazującą integralność tkanki poprzez tworzenie połączeń przylegających, takich jak VE-Cadherin. Dodatkowo, (D) czynnik von Willebranda jest silnie eksponowany przez HUVECs. Na koniec, (E) wszystkie markery pokazano na obrazie nałożonym. Paski skali = 100 µm. Skróty: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; HUVECs = ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig06.jpg" /> 
Rycina 6: Utrwalona strona nabłonkowa układu jelita-na-chipie. Reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny spolaryzowanej warstwy komórek nabłonkowych po 5 dniach perfuzji, wykazujący ekspresję białek połączeń E-Cadherin i ZO-1. Tkankę utrwalono metanolem. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wykonano stos obrazów z (z-stack) o grubości sekcji 1 µm. Przedstawiono ortogonalną projekcję maksymalną tego stosu. (A) DNA w jądrach komórkowych zabarwiono DAPI. Szczelna bariera nabłonkowa powstaje w wyniku formowania się (B) połączeń przylegających, zabarwionych E-Cadherin, oraz (C) apikalnych połączeń ścisłych, zabarwionych ZO-1. Połączenia ścisłe i przylegające ko-lokalizują się w apikalnej błonie komórkowej, co widać na (D) obrazie nałożonym. Paski skali = 100 µm. Skrót: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig07.jpg" /> 
Rysunek 7: Utrwalona strona nabłonkowa jelita na chipie z wypustkami przypominającymi kosmki. Reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny trójwymiarowej warstwy komórek nabłonkowych po sześciu dniach perfuzji. Tkanka została utrwalona utrwalaczem Carnoya. Za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego wykonano stos obrazów z (z-stack) przekrojów o grubości 1 µm, a (A) przedstawiono ortogonalną projekcję maksymalną tego stosu obrazów. DNA w jądrach komórkowych zabarwiono Hoechstem. Dodatkowo tkankę zabarwiono aglutyniną z kiełków pszenicy, lektyną, która barwi ludzką mucynę. (B) Trójwymiarowy wzrost struktur nabłonka przypominających kosmki i krypty można zaobserwować w przekrojach x i y stosu obrazów. Paski skali = 50 µm. Skrót: WGA = aglutynina z kiełków pszenicy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig08.jpg" /> 
Rysunek 8: Utrwalona strona nabłonkowa jelita-na-chipie bez wypustek przypominających kosmki. Reprezentatywny obraz immunofluorescencyjny warstwy komórek nabłonkowych traktowanych kwasem suberoylanilidohydroksamowym (SAHA), inhibitorem deacetylazy histonowej, zapobiegającym proliferacji komórek. Tkankę utrwalono metanolem. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wykonano stos z-stack z przekrojami o grubości 1 µm. Przedstawiono ortogonalną projekcję maksymalną tego stosu z-stack. (A) DNA w jądrach komórkowych zabarwiono DAPI. Na obrazie (B) połączenia przylegające zabarwiono E-kadheryną, a na obrazie (C) połączenia ścisłe zabarwiono ZO-1. Połączenia ścisłe i przylegające ko-lokalizują, co widać na obrazie nałożonym (D). Paski skali = 100 µm. Skrót: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig09.jpg" /> 
Rycina 9: Patogenozależna odpowiedź immunologiczna zintegrowanych wrodzonych komórek odpornościowych: Rycina zmodyfikowana na podstawie pracy Kaden et al.8. Model jelita na chipie niezinfekowany (-) lub zinfekowany (+) C. albicans SC5314 analizowano pod kątem (A) przepuszczalności z użyciem FITC-Dekstranu (3-5 kDa) oraz (B) sekrecji cytokin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Roztwór/pożywka</td>
			<td colspan="2">Skład</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór zapasowy kolagenu&#160;</td>
			<td colspan="2">0.5 mg/mL kolagenu IV w 0.5 mM kwasie octowym</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor izotoniczny&#160;</td>
			<td colspan="2">PBS&#160;-/-, 1&#160;mg/mL albuminy surowicy bydlęcej frakcji V, 2&#160;mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka do różnicowania monocytów</td>
			<td colspan="2">Pożywka dla komórek krwiotwórczych &#160;+ 10% ludzkiej surowicy autologicznej + 10&#160;ng/mL rekombinowanego czynnika stymulującego kolonie makrofagów (M-CSF) + 10&#160;ng/mL rekombinowanego czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik do dysocjacji trypsyną&#160;</td>
			<td colspan="2">0.25% trypsyny + 1&#160;mM EDTA w PBS&#160;-/-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik do odrywania monocytów</td>
			<td colspan="2">4&#160;mg/mL lidokainy + 5&#160;mM EDTA &#160;w PBS -/-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka warunkowana przez komórki śródbłonka (EC)</td>
			<td colspan="2">Pożywka EC + 10% ludzkiej surowicy autologicznej + 10&#160;ng/mL M-CSF + 10&#160;ng/mL GM-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka C2&#160;</td>
			<td colspan="2">DMEM z wysoką zawartością glukozy (4.5&#160;g/L) + 10% FBS + 1% GlutaMax + 1% roztwór nieessentialnych aminokwasów MEM + 1&#160;mM pirogronianu sodu + 10&#160;µg/mL ludzkiej holo-transferyny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór zapasowy dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)&#160;</td>
			<td colspan="2">1&#160;mg/mL w podgrzanej pożywce C2 bez czerwieni fenolowej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór blokujący i permeabilizujący</td>
			<td colspan="2">3% normalnej surowicy osła (NDS) + 0.1% saponiny w PBS&#160;+/+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór barwiący</td>
			<td colspan="2">0.3% normalnej surowicy osła (NDS) + 0.1% saponiny w PBS +/+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór do płukania</td>
			<td colspan="2">0.1% saponiny w PBS&#160;+/+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiksatyw Carnoya</td>
			<td colspan="2">60% etanolu, 30% chloroformu, 10% lodowatego kwasu octowego</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wykaz i skład roztworów użytych w tym protokole. Skrót: PBS -/- = sól fizjologiczna z buforem fosforanowym Dulbecco bez magnezu i wapnia.

Nasz szczegółowy protokół opisuje tworzenie i używanie zaawansowanego modelu jelita na chipie, który symuluje ludzką błonę śluzową jelit ze strukturami 3D i różnymi typami komórek, umożliwiając dogłębną analizę odpowiedzi immunologicznych i funkcji komórkowych w odpowiedzi na kolonizację mikrobiologiczną.

Immunokompetentny model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit

An advanced intestine-on-chip model recreating epithelial 3D organotypic villus-like and crypt-like structures has been developed. The immunocompetent ...

Nasze badania koncentrują się na rozwoju i wykorzystaniu immunokompetentnych platform narządów na chipie. Tworząc te fizjologicznie istotne, humanizowane modele in vitro, jesteśmy w stanie badać złożoną interakcję gospodarz-patogen. Tworzona przez nas wiedza może być wykorzystana do manipulacji i identyfikacji celów molekularnych w terapii chorób zakaźnych.Jednym z kluczowych wyzwań jest utrzymanie żywej mikrobioty w warunkach homeostazy wraz z tkanką gospodarza in vitro. Obejmuje to odtworzenie organotypowej topografii 3D struktur krypt i kosmków oraz ich kolonizacji mikrobiologicznej. Platformy Intestine-on-chip rozwiązują ten problem, wykorzystując przepływ do kształtowania struktur organotypowych i zapobiegania nadmiernemu rozrostowi bakterii.Zapewnia to stabilne warunki hodowli. W porównaniu z innymi dostępnymi platformami typu intestine-on-chip, nasz model umożliwia szczegółowe badanie ludzkiej odpowiedzi immunologicznej na patogeny dzięki włączeniu pierwotnych komórek odpornościowych rezydujących w tkance. Ponadto rozmiar modelu umożliwia wiele odczytów w jednym eksperymencie, co zmniejsza ogólny koszt i liczbę eksperymentów.Nasze laboratorium koncentruje się na wykorzystaniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do opracowania systemów autologicznych, które umożliwiają medycynę spersonalizowaną. Na początek przygotuj rozcieńczenie 1:100 roztworu podstawowego kolagenu w DPBS z magnezem i wapniem. Dodać 350 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu podstawowego do odpowiedniej komory i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Przepłucz wszystkie komory dwa razy za pomocą 350 mikrolitrów DPBS z magnezem i wapniem, aby wypłukać pozostały kolagen i kwas octowy. Wyjmij wtyczki z jednego miejsca i przełącz je na drugą stronę. Po ponownym przepłukaniu komory dodaj do niej 350 mikrolitrów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka.Wyjmij wtyczki z jednego miejsca i przełącz je na drugą stronę. Następnie dodaj 350 mikrolitrów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka do każdej komory. Weźmy HUVEC hodowane w pasażach 1-3 z 80 do 90% zbieżnością komórek w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka.Następnie wyjmij pożywkę do hodowli komórkowych z kolby do hodowli komórkowych T25 i delikatnie umyj komórki trzema do pięciu mililitrami DPBS bez magnezu i wapnia. Po usunięciu roztworu dodać jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego trypsyny i inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki oderwą się od kolby. Przenieś odłączone komórki do probówki za pomocą dziewięciu mililitrów 5% FBS w PBS bez magnezu i wapnia Wirować w 350 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po przemieszczeniu supernatantu ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze pożywki do wzrostu komórek śródbłonka. Dodaj odpowiednią objętość komórek do komory i inkubuj biochipy w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 24 godzinach należy przeprowadzić wymianę pożywki w komorze zawierającej HUVEC na 350 mikrolitrów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka.Jeśli w biochipach mikroprzepływowych pojawią się pęcherzyki powietrza, zamknij wszystkie porty biochipa poza portami dotkniętej komory. Przechyl wiór, aby przesunąć pęcherzyk powietrza blisko jednego końca wnęki. Z portu drugiego końca przepchnij 700 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych przez komorę, trzymając przeciwległe zatyczki.Na początek dokładnie wyczyść wszystkie obszary inkubatora i pompy perystaltycznej środkiem dezynfekującym, aby zapewnić quasi-sterylne środowisko. Następnie przepłucz każdą rurkę 700 mikrolitrami PBS z magnezem i wapniem, a następnie 500 mikrolitrami pożywki kondycjonowanej C2 lub EC. Użyć rurki o krótkiej odległości od zamka luer do korka pompy perystaltycznej dla lewej wnęki, a rurki z drugą symetrią dla prawej wnęki.Po pobraniu z inkubatora biochipa z komórkami HUVEC i C2BBe1 należy przeprowadzić wymianę pożywki z 350 mikrolitrami na każdą komorę. Następnie przenieś wtyczki z dolnego do górnego miejsca. Dodaj 350 mikrolitrów świeżej pożywki do dolnej komory biochipa.Następnie usuń wszystkie wtyczki i napełnij wszystkie porty do samej góry. Zaczynając od lewej wnęki, włóż adapter luer lock do portu biochipa, aby podłączyć pierwszą rurkę do prawego portu górnej komory. Następnie podłącz drugi przewód do lewego portu dolnej komory.Następnie weź zbiornik i dodaj niewielką kroplę pożywki do hodowli komórkowych na dno zbiornika. Następnie włóż zbiornik po przeciwnej stronie pierwszej rurki i powtórz dla drugiej komory. Gdy wszystkie porty zostaną podłączone do rurki lub zbiornika, napełnij zbiorniki 3.5 mililitrami pożywki do hodowli komórkowych.Następnie umieść luźną stronę rurki, do której przymocowana jest pokrywka, na górze zbiornika, aby zamknąć układ mikroprzepływowy każdej komory. Przetransportować biochip do pompy perystaltycznej. Za pomocą korków pompy perystaltycznej podłącz każdą rurkę do pompy perystaltycznej tak, aby medium przepływało ze zbiornika do wnęki i z powrotem przez pompę.Następnie perfaktoruj każdą komorę z natężeniem przepływu 50 mikrolitrów na minutę. Po zakończeniu wstępnej perfuzji zatrzymaj pompę perystaltyczną. Zdejmij pokrywkę podłączoną do rurki każdego zbiornika i umieść ją na sterylnej chusteczce obok pompy.Po usunięciu całego podłoża napełnij zbiorniki dwoma mililitrami świeżo przygotowanego podłoża. Ponownie podłącz rurkę w pokrywie i kontynuuj perfuzję kołową z natężeniem przepływu 50 mikrolitrów na minutę przez dodatkowe 24 godziny. Po zatrzymaniu pompy perystaltycznej otwórz zbiorniki wszystkich jam, opróżnij zbiorniki i odłącz rurki i zbiorniki od biochipa.Umyj wnęki mikroprzepływowe 500 mikrolitrami zimnego PBS z magnezem i wapniem dwa razy w komorze. Dodaj 500 mikrolitrów lodowatego metanolu do wszystkich ubytków. Po otwarciu chipa należy przeciąć lub usunąć folię klejącą biochipa.Przeciąć tkankę zawierającą błonę PET na pół, aby wybarwić ją równolegle za pomocą różnych immunopaneli. Za pomocą precyzyjnej pęsety przenieś każdy kawałek membrany do osobnego dołka w 24-dołkowej płytce z roztworem blokującym i przepuszczalnym. Następnie przenieś kawałki membrany na czyste szkiełko podstawowe w wilgotnej komorze.Dodać 50 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego przygotowanego w roztworze barwiącym do każdego kawałka membrany. Po przeniesieniu próbek do płytki 24-dołkowej należy przemyć membrany dwukrotnie przez pięć minut roztworem do mycia, a następnie PBS zawierającym magnez i wapń. Używając fluorescencyjnego podłoża montażowego i szkła nakrywkowego, zamontuj elementy membrany na czystym szkiełku podstawowym i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu uzyskania mikroskopowego obrazowania.Po pięciu dniach perfuzji jądrowe DNA wybarwione DAPI wykazało w pełni zróżnicowane makrofagi pochodzące z monocytów eksprymujące CD68 rozprzestrzeniające się po całej tkance naczyniowej. HUVEC utworzył zlewającą się warstwę wykazującą integralność tkanek poprzez tworzenie połączeń adherenowych, takich jak VE-Cadherin. Dodatkowo, czynnik von Willebranda jest silnie wyrażany przez HUVEC.Po pięciu dniach perfuzji komórki C2BBe1 utworzyły spolaryzowane warstwy komórek nabłonkowych eksprymujących białka połączeniowe E-kadherynę i ZO-1. Trójwymiarowy wzrost struktur nabłonka przypominających kosmki i krypty można wykryć w sekcjach x i y stosu z po sześciu dniach perfuzji.

immunocompetent-intestine-on-chip-model-for-analyzing-gut-mucosal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy protokół in vitro do wspólnej hodowli mikrobiomu jelitowego i kosmków jelitowych przez dłuższy okres przy użyciu ludzkiego systemu mikrofizjologicznego typu gut-on-a-chip.

Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

neuroHuMiX to zaawansowany model jelita na chipie do badania interakcji komórek bakteryjnych, nabłonkowych i neuronalnych w proksymalnych i reprezentatywnych warunkach wspólnej hodowli. Model ten pozwala na rozwikłanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw komunikacji między mikrobiomem jelitowym a układem nerwowym.

Model Gut-on-A-Chip do badania osi mikrobiom jelitowy i układu nerwowego

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

Modele płuc na chipie przewyższają tradycyjne hodowle 2D, naśladując granicę powietrze-ciecz i perfuzję komórek śródbłonka, symulując przepływ krwi i wymianę składników odżywczych, co jest kluczowe dla badań nad fizjologią płuc. Zwiększa to znaczenie badań nad płucami, oferując dynamiczne, fizjologicznie dokładne środowisko, które pomaga w lepszym zrozumieniu i leczeniu infekcji dróg oddechowych.

Immunokompetentny model pęcherzyka płucnego na chipie do badania odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej pęcherzyków płucnych

Aby zbadać wzrost guza oraz mikrośrodowisko nowotworowe in vivo, zastosowaliśmy syngeniczny i ortotopowy model raka jajnika u immunokompetentnych myszy. Przetransdukowaliśmy linię komórkową nowotworu mysiego (MOV1) białkiem fluorescencyjnym Katushka (MOV1KAT), a w niniejszej pracy przedstawiamy sposób jej ortotopowej implantacji do jajnika oraz obrazowanie in vivo.

Ortotopowy model surowiczego raka jajnika u immunokompetentnych myszy do obrazowania guzów in vivo i monitorowania odpowiedzi immunologicznych guza

Listeria monocytogenes jest organizmem modelowym do badania odpowiedzi immunologicznych i genetycznej podatności myszy na bakterie wewnątrzkomórkowe. Metoda ta umożliwia pomiar ładunku bakteryjnego oraz przygotowanie jednokomórkowych zawiesin wątroby i śledziony myszy do analizy FACS w celu określenia zmian w komórkach odpornościowych wywołanych zakażeniem Listeria.

Pomiar ładunku bakteryjnego i odpowiedzi immunologicznych u myszy zainfekowanych Listeria monocytogenes

Ludzki syncytialny wirus oddechowy (HRSV) może powodować ciężkie zapalenie oskrzelików u małych niemowląt. Część patogenezy ciężkiej choroby HRSV jest spowodowana odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Stymulacja pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych za pomocą HRSV zapewnia szybki i powtarzalny system modelowy do badania aktywacji szlaków zapalnych i infekcji.

Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

Współinfekcja człowieka jest trudna do odtworzenia in vitro. Jednak ludzkie pasożyty malarii mogą być łatwo hodowane in vitro, podobnie jak świeżo wyizolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naturalnie zakażone wirusem HIV. Stanowi to doskonały model do badania wczesnych odpowiedzi immunologicznych na pasożyty malarii w kontekście współzakażenia wirusem HIV.

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

Poznaj zaawansowany model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej. Ta metoda umożliwia badanie interakcji gospodarz-patogen w kontrolowanych warunkach in vitro.

Immunokompetentny model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit

Przeglądaj więcej filmów