Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Nasza praca bada, w jaki sposób mikrośrodowisko guza napędza inwazję komórek nowotworowych w glejaku, najbardziej śmiertelnej postaci raka mózgu. W szczególności interesuje nas, w jaki sposób przepływ płynu śródmiąższowego napędzany zwiększonym ciśnieniem wewnątrznowotworowym powoduje inwazję komórek nowotworowych na otaczający miąższ mózgu. Obecnie używamy modeli masy układu kolagenowego 3D kwasu hialuronowego, w połączeniu z obrazowaniem MRI i analizą obliczeniową w celu zbadania inwazji glejaka napędzanej przepływem płynu śródmiąższowego.

W przypadku podejść in vitro przepływ płynu jest generowany przez wywieranie nacisku na górną część modelu TME, naśladując przepływ płynu śródmiąższowego w mózgu. Zapewnienie odpowiednich sygnałów fizycznych do replikacji mikrośrodowiska tkanek jest ciągłym wyzwaniem. Nasz trójwymiarowy model wykorzystuje kwas hialuronowy i kolagen, które znajdują się w macierzy mózgu, oraz stały przepływ płynu śródmiąższowego.

Razem czynniki te dostarczają kluczowych sygnałów fizycznych do komórek zdrowych i nowotworowych. Nasze ostatnie prace wskazują, że rezydentne komórki mózgowe wpływają na to, jak komórki glejaka reagują na przepływ śródmiąższowy. Odpowiedź ta zależy jednak od czynników specyficznych dla pacjenta.

Aby zbadać wpływ tych czynników na inwazję glejaka, opracowaliśmy model frontu inwazyjnego glejaka, który naśladuje natywną tkankę mózgową. Model guza pacjenta pozwala na wysoce kontrolowany eksperyment in vitro, który nadal reprezentuje czynniki na poziomie tkanki wpływające na inwazję glejaka. Co więcej, model ten jest dostępny w porównaniu z podobnymi modelami inwazji glejaka i przepływu śródmiąższowego, ponieważ nie wymaga przewodów ani pomp.

I wykorzystuje materiały dostępne na rynku. Na początek umieść kolagen, wodorotlenek sodu, sterylną ultraczystą wodę, 10 razy PBS, jedną mikroprobówkę wirówkową, metakrylowany kwas hialuronowy i fotoinicjator na lodzie. Następnie umieść wkładki do kultur tkankowych na płytce i oznacz ją.

Aby przygotować trzy miligramy na mililitr roztworu kolagenu, połącz kolagen o wysokim stężeniu, jeden normalny wodorotlenek sodu, ultraczystą wodę i 10 razy PBS. Dodaj składniki do probówki mikrowirówki i trzymaj końcówkę pipety zanurzoną podczas mieszania, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Następnie odwirować komórki w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie delikatnie usuń nadmiar pożywki z górnej części każdego roztworu stanu komórki, pozostawiając objętość pożywki wymaganą dla danego stanu. Umieść te roztwory na lodzie. Dodaj obliczoną objętość roztworu kolagenu do każdego roztworu stanu komórki.

Następnie dodaj obliczoną objętość 1% metakrylowanego kwasu hialuronowego, a następnie 17 miligramów na mililitr LAP w każdym roztworze stanu komórki. Mieszaj każdą probówkę kondycyjną pojedynczo, trzymając końcówkę pipety zanurzoną, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. I dodaj od 100 do 150 mikrolitrów do każdej wkładki do hodowli tkankowej.

Teraz włącz lampę ultrafioletową o długości 385 nanometrów przy stałym prądzie. Aby sfotografować sieciowanie każdego żelu, wystawiaj każdą studzienkę na działanie światła ultrafioletowego przez 45 sekund, pojedynczo. Następnie umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 do 45 minut, aby usieciować kolagen.

Używając pożywki astro base z 0,5% i dwiema objętościami i 1% objętościowo B27 bez witaminy A, nałóż głowicę ciśnieniową płynu na żele. Dodaj pożywkę do płytki studzienkowej i wkładek do hodowli tkankowych, aby uzyskać zerowy przepływ netto. Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, na co najmniej 18 godzin lub do pięciu dni.