Name: Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Poznaj metodę modelowania inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym w fotopolimeryzowalnym hydrogelu kwasu hialuronowego i kolagenu. To podejście umożliwia badanie dynamiki inwazji komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować źródłom finansowania tej pracy: National Institutes of Health National Cancer Institute (R37 CA222563 do J.M.), Coulter Foundation (J.M.) oraz Virginia Tech ICTAS-CEH (J.M. & J.H.). Wzorce GSC użyte w tym teście zostały wyprowadzone przez dr Jakuba Godlewskiego (Harvard Medical School).

Replicating Glioblastoma Invasion with Hyaluronan-Collagen I Hydrogel System

<ol><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBTRUS+statistical+report%3A+Primary+brain+and+other+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2016-2020%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2016-2020.</a> Neuro Oncol. 25, 12 Suppl 2 1-99 (2023).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tumor-treating+fields+plus+maintenance+temozolomide+vs+maintenance+temozolomide+alone+on+survival+in+patients+with+glioblastoma%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: A randomized clinical trial.</a> JAMA. 318 (23), 2306-2316 (2017).</li>
<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li>
<li>Roos, A., Ding, Z., Loftus, J. C., Tran, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+microenvironmental+determinants+of+glioma+stem-like+cell+survival+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Molecular and microenvironmental determinants of glioma stem-like cell survival and invasion.</a> Front Oncol. 7, 120(2017).</li>
<li>Yabo, Y. A., Niclou, S. P., Golebiewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+heterogeneity+and+plasticity%3A+A+paradigm+shift+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer cell heterogeneity and plasticity: A paradigm shift in glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 24 (5), 669-682 (2022).</li>
<li>Geer, C. P., Grossman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+flow+along+white+matter+tracts%3A+A+potentially+important+mechanism+for+the+dissemination+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid flow along white matter tracts: A potentially important mechanism for the dissemination of primary brain tumors.</a> J Neurooncol. 32 (3), 193-201 (1997).</li>
<li>Munson, J. M., Bellamkonda, R. V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+flow+in+a+3D+microenvironment+increases+glioma+invasion+by+a+CXCR4-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Interstitial flow in a 3D microenvironment increases glioma invasion by a CXCR4-dependent mechanism.</a> Cancer Res. 73 (5), 1536-1546 (2013).</li>
<li>Kingsmore, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+flow+differentially+increases+patient-derived+glioblastoma+stem+cell+invasion+via+CXCR4%2C+CXCL12%2C+and+CD44-mediated+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Interstitial flow differentially increases patient-derived glioblastoma stem cell invasion via CXCR4, CXCL12, and CD44-mediated mechanisms.</a> Integr Biol. 8 (12), 1246-1260 (2016).</li>
<li>Qazi, H., Shi, Z. -D., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+regulates+the+invasive+potential+of+glioma+cells+via+modulation+of+migratory+activity+and+matrix+metalloproteinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress regulates the invasive potential of glioma cells via modulation of migratory activity and matrix metalloproteinase expression.</a> PLoS One. 6 (5), e20348(2011).</li>
<li>Parmigiani, E., Scalera, M., Mori, E., Tantillo, E., Vannini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+stars+and+new+players+in+the+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Old stars and new players in the brain tumor microenvironment.</a> Front Cell Neurosci. 15, 709917(2021).</li>
<li>Cornelison, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+patient-designed+tissue-engineered+model+of+the+infiltrative+glioblastoma+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precis+Oncol%22%5BJournal%5D)">A patient-designed tissue-engineered model of the infiltrative glioblastoma microenvironment.</a> NPJ Precis Oncol. 6 (1), 54(2022).</li>
<li>Tchafa, A. M., Shah, A. D., Wang, S., Duong, M. T., Shieh, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+model+for+measuring+the+effects+of+interstitial+fluid+flow+on+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture model for measuring the effects of interstitial fluid flow on tumor cell invasion.</a> J Vis Exp. (65), e4159(2012).</li>
<li>Shields, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chemotaxis+as+a+mechanism+of+tumor+cell+homing+to+lymphatics+via+interstitial+flow+and+autocrine+CCR7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling.</a> Cancer Cell. 11 (6), 526-538 (2007).</li>
<li>Shieh, A. C., Rozansky, H. A., Hinz, B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+is+promoted+by+interstitial+flow-induced+matrix+priming+by+stromal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts.</a> Cancer Res. 71 (3), 790-800 (2011).</li>
<li>Miteva, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmural+flow+modulates+cell+and+fluid+transport+functions+of+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium.</a> Circ Res. 106 (5), 920-931 (2010).</li>
<li>Kingsmore, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+analysis+to+map+interstitial+flow+in+the+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">MRI analysis to map interstitial flow in the brain tumor microenvironment.</a> APL Bioeng. 2 (3), 031905(2018).</li>
<li>Roberts, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+derived+suppressor+cells+migrate+in+response+to+flow+and+lymphatic+endothelial+cell+interaction+in+the+breast+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Myeloid derived suppressor cells migrate in response to flow and lymphatic endothelial cell interaction in the breast tumor microenvironment.</a> Cancers. 14 (12), 3008(2022).</li>
<li>Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microregional+extracellular+matrix+heterogeneity+in+brain+modulates+glioma+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (6), 1046-1069 (2004).</li>
<li>Choi, J. R., Yong, K. W., Choi, J. Y., Cowie, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+photo-crosslinkable+hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Recent advances in photo-crosslinkable hydrogels for biomedical applications.</a> Biotechniques. 66 (1), 40-53 (2019).</li>
<li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 10, Unit 10.18 11-20 (2010).</li>
<li>Gelman, R. A., Williams, B. R., Piez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibril+formation.+Evidence+for+a+multistep+process%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Collagen fibril formation. Evidence for a multistep process.</a> J Biol Chem. 254 (1), 180-186 (1979).</li>
<li>Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibril+formation.+Optimal+in+vitro+conditions+and+preliminary+kinetic+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).</li>
<li>Mineo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+non-coding+RNA+HIF1A-AS2+facilitates+the+maintenance+of+mesenchymal+glioblastoma+stem-like+cells+in+hypoxic+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The long non-coding RNA HIF1A-AS2 facilitates the maintenance of mesenchymal glioblastoma stem-like cells in hypoxic niches.</a> Cell Rep. 15 (11), 2500-2509 (2016).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glioblastoma+stem+cells%3A+A+review+on+biomarkers%2C+signal+pathways+and+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Targeting glioblastoma stem cells: A review on biomarkers, signal pathways and targeted therapy.</a> Front Oncol. 11, 701291(2021).</li>
<li>Dirkse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-associated+heterogeneity+in+glioblastoma+results+from+intrinsic+tumor+plasticity+shaped+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stem cell-associated heterogeneity in glioblastoma results from intrinsic tumor plasticity shaped by the microenvironment.</a> Nat Commun. 10 (1), 1787(2019).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+reactivity%3A+Subtypes%2C+states%2C+and+functions+in+CNS+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Astrocyte reactivity: Subtypes, states, and functions in CNS innate immunity.</a> Trends Immunol. 41 (9), 758-770 (2020).</li>
<li>Tate, K. M., Munson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+drug+response+in+engineered+brain+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Assessing drug response in engineered brain microenvironments.</a> Brain Res Bull. 150, 21-34 (2019).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+microfluidic+devices+for+glioblastoma+study%3A+Current+status+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Application of microfluidic devices for glioblastoma study: Current status and future directions.</a> Biomed Microdevices. 22 (3), 60(2020).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Jadin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+expression+in+primary+and+secondary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors.</a> Ann Transl Med. 3 (6), 80(2015).</li>
<li>Cornelison, R. C., Munson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+translating+biomaterials+into+glioma+therapy%3A+Lessons+from+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mater%22%5BJournal%5D)">Perspective on translating biomaterials into glioma therapy: Lessons from in vitro models.</a> Front Mater. 5, 27(2018).</li>
<li>Kapałczyńska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+extracellular+matrix%2C+scaffolds%2C+and+signaling%3A+Tissue+architecture+regulates+development%2C+homeostasis%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: Tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).</li>
<li>Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitioning+pre-clinical+glioblastoma+models+to+clinical+settings+with+biomarkers+identified+in+3D+cell-based+models%3A+A+systematic+scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Transitioning pre-clinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review.</a> Biomed Pharmacother. 145, 112396(2022).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Ortiz-Cárdenas, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+spatially-organized+organs-on-chip%3A+Photopatterning+cell-laden+thiol-ene+and+methacryloyl+hydrogels+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Organs+Chip%22%5BJournal%5D)">Towards spatially-organized organs-on-chip: Photopatterning cell-laden thiol-ene and methacryloyl hydrogels in a microfluidic device.</a> Organs Chip. 4, 100018(2022).</li>
<li>Ozulumba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigating+reactive+oxygen+species+production+and+increasing+gel+porosity+improves+lymphocyte+motility+and+fibroblast+spreading+in+photocrosslinked+gelatin-thiol+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Mitigating reactive oxygen species production and increasing gel porosity improves lymphocyte motility and fibroblast spreading in photocrosslinked gelatin-thiol hydrogels.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+applications+of+photo-cross-linking+in+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and applications of photo-cross-linking in bioprinting.</a> Chem Rev. 120 (19), 10662-10694 (2020).</li>
<li>Ghosh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+synthesis%2C+properties+and+applications+of+gelatin+methacryloyl+hydrogel+for+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Adv%22%5BJournal%5D)">An insight into synthesis, properties and applications of gelatin methacryloyl hydrogel for 3D bioprinting.</a> Mater Adv. 4 (22), 5496-5529 (2023).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+hijacks+neuronal+mechanisms+for+brain+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma hijacks neuronal mechanisms for brain invasion.</a> Cell. 185 (16), 2899-2917 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych istotnych konfliktów interesów.

Montaż modelu TME obejmuje sześć podstawowych kroków: 1) pasażowanie komórek i rozdzielanie komórek w podobnych warunkach, 2) składanie stężonego roztworu kolagenu dla wszystkich warunków, 3) łączenie składników żelu (komórki, kolagen, metakrylowany kwas hialuronowy i fotoinicjator) dla każdego warunku, 4) galwaniczne żele, 5) sieciowanie przez ekspozycję na promieniowanie UV i ciepło oraz 6) dodanie głowicy ciśnieniowej płynu. Po 18 godzinach lub więcej żele można pobrać do cytometrii przepływowej, ekstrakcji RNA, ekstrakcji białek, obrazowania lub innych dalszych zastosowań, podczas gdy błony wstawiające hodowlę tkankową można utrwalić w celu ilościowego określenia inwazji. Tak więc, poza przygotowaniem komórek przed dniem eksperymentu, cały proces, w tym wysiewanie modelu i dalsze aplikacje, zwykle trwa nie dłużej niż 2-4 dni.
Model TME może być dostosowany do reprezentowania różnych mikrośrodowisk i nowotworów. Mianowicie, typy ogniw i ich proporcje mogą być modyfikowane lub w celu uzyskania różnych natężeń przepływu lub sztywności, można zmienić skład matrycy. Wydłużenie czasu fotosieciowania żeli w świetle UV lub usieciowania kolagenu w temperaturze 37 °C zwiększy sztywność. Używane nośniki powinny być dostosowane do wszelkich nowych komórek dodawanych do modelu. Co więcej, komórki mogą być dodawane do żelu w pożywkach przepływowych, aby dokładniej modelować infiltrację komórkową dla modeli komórek odpornościowych. Jednak żywotność komórek i istotne czynniki, takie jak utrzymanie łodygi lub zakres glejozy reaktywnej, powinny być oceniane przed ustaleniem jakichkolwiek nowych parametrów. Glejozę reaktywną można ocenić za pomocą ekspresji GFAP i CD68, jak opisano12, podczas gdy łodygę można zmierzyć za pomocą różnych markerów GSC25, chociaż należy zauważyć, że istnieje coraz więcej dowodów na to, że zarówno glejoza reaktywna, jak i łodyga są stanami przejściowymi reprezentowanymi przez przewagę markerów; W związku z tym należy wybrać markery istotne doświadczalnie26,27. W opisanym przez nas modelu TME ekspresja CD68 i GFAP jest stosunkowo niska w izolowanym gleju, ale często jest albo zwiększona, albo zmniejszona w obecności różnych linii GSC, a ekspresja CD68 i GFAP w gleju ujemnie koreluje z macierzystą CD71+ wGSCs 12.
Istnieje wiele modeli, które podsumowują aspekty mikrośrodowisk mózgu i generalnie należą do jednej lub więcej z trzech kategorii: modele mikrotkanek, które autologicznie wydzielają matrycę (tj. sferoidy i organoidy w płynnych lub stałych matrycach), gotowe matryce (rusztowania) i urządzenia mikroprzepływowe; zostały one niedawno zrecenzowane przez Tate i Munson (2019)28. Główne zalety modelu opisanego w tym artykule w porównaniu z innymi kategoriami to to, że model ten 1) rekapituluje macierz guza mózgu, która w przeciwnym razie jest nieobecna w hodowlach 2D lub zawiesinach komórek płynnych, 2) działa niezależnie od rurek, pomp i innych urządzeń elektronicznych zwykle kojarzonych z modelami mikroprzepływowymi, 3) może być zbudowany z materiałów, które nie wymagają własnej produkcji, W przeciwieństwie do niektórych rusztowań i urządzeń mikroprzepływowych29 i 4) wykorzystuje opartą na mózgu, niezastrzeżoną matrycę kwasu hialuronowego, która jest definiowalna, a nie ekstrakty matrycowe, takie jak Matrigel30, minimalizując czynniki zakłócające. Kwas hialuronowy występuje w dużych ilościach w GBM31 i reguluje inwazję glejaka o zwiększonym przepływie przez CD449. Mówiąc bardziej ogólnie, wpływ składu ECM, sił biofizycznych i charakteru środowiska 3D (np. niedotlenienie i zmniejszona penetracja środków terapeutycznych) na proliferację, metabolizm, łodygę i różnicowanie, odpowiedź na terapie i inwazyjność jest znaczący i został szeroko przeanalizowany 32,33,34,35,36.
Do ograniczeń tego modelu należy fakt, że nie jest on jeszcze w stanie odtworzyć złożonej architektury tkankowej, takiej jak unaczynienie lub wzorce neuronalne. Ponadto obrazowanie często wymaga drogiego sprzętu do obrazowania (tj. mikroskopów konfokalnych) ze względu na rozpraszanie światła przez hydrożel. Ponadto natężenie światła UV i czas ekspozycji na promieniowanie UV w celu sieciowania różnią się znacznie w opublikowanej literaturze 37,38,39,40 i w razie potrzeby można je dostosować w celu optymalizacji żywotności i funkcji komórek. W szczególności wykazano, że światło UV o wysokiej intensywności zmniejsza żywotność komórek wrażliwych typów komórek ze względu na produkcję reaktywnych form tlenu (ROS)38. Jeśli początkowe eksperymenty z żywotnością komórkową są nieoptymalne, można zastosować protokoły w celu zmniejszenia wpływu ROS na żywotność38. Jednak wszelkie korekty zmienią właściwości fizyczne żelu i potencjalnie natężenie przepływu.
Model TME jest najbardziej bezpośrednio przydatny do modelowania przepływu płynu w inwazyjnym mikrośrodowisku guza w glejaku. Model można jednak dostosować do reprezentowania różnych mikrośrodowisk, niezależnie od tego, czy uwzględniono przepływ, czy typ nowotworu, o ile komórki są zdolne do życia i nadal reprezentują fizjologię danej choroby. W szczególności ostatnie badania wykazały, że neurony są siłą napędową inwazji glejaka41,42; w związku z tym włączenie neuronów do modelu TME może być interesujące dla badania ich wpływu na inwazję GSC, ale wymagałoby dalszej optymalizacji modelu poza zakresem tego protokołu. Alternatywnie, wersje modelu bez GSC, ale zawierające komórki glejowe i inne istotne typy komórek, takie jak neurony, są przydatne do modelowania wyników w chorobach nienowotworowych w mózgu28. Co ważne, rozpuszczalne potencjalne terapie można łatwo przetestować za pomocą modelu przed przystąpieniem do prac in vivo.

Glioblastoma jest wyniszczającą chorobą, charakteryzującą się krótkim czasem przeżycia1, który jest jedynie umiarkowanie wydłużany przez dostępne klinicznie metody leczenia2,3. Ta przeszkoda w skutecznej terapii wynika w dużej mierze z silnie naciekaącej natury chemoopornych komórek macierzystych glejaka (GSCs), które są niedostępne dla resekcji i stają się źródłem nawrotów nowotworu4. Jednocześnie komórki GSC wykazują wysoką plastyczność, reagując na różnorodne bodźce w mikrośrodowisku guza (TME), aby przetrwać i naciekać5,6. W szczególności gęsto zasiedlony guz i nieszczelne naczynia krwionośne generują znaczny różnicowy gradient ciśnienia na granicy guza, co zwiększa przepływ płynu śródmiąższowego (IFF) w obszarach korelujących z inwazją GSC7. Zwiększony IFF wpływa na8,9,10, a często nasila8,9 inwazję GSC poprzez szlaki molekularne, które można hamować farmakologicznie. Proces ten jest jednak utrudniony przez wpływ gleju w TME na inwazję glejaka; w rzeczywistości opisano, że glej moduluje inwazję glejaka w wielu kontekstach11, a wstępne dowody w naszym laboratorium wskazują na podobny wpływ gleju na inwazję glejaka nasiloną przez IFF12. W związku z tym nasze laboratorium opracowało regulowany model 3D TME, który odtwarza te inwazyjne obszary graniczne guza poprzez włączenie zarówno IFF, jak i interakcji między glejem a GSC, aby ilościowo ocenić inwazję GSC oraz inne parametry (np. ekspresję białek powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych, ekspresję RNA itp.) pod wpływem IFF, gleju i/lub potencjalnych środków terapeutycznych12(Rycina 1).
Model TME jest podobny do innych testów przepływu płynu śródmiąższowego opartych na wkładkach do hodowli tkankowych (tj. testów statycznych/przepływowych), które zostały szeroko opisane w literaturze8,9,10,13,14,15,16,17,18. Głównymi wyróżnikami tego modelu są: zastosowanie niedopatentowanej i regulowanej macierzy kolagenowo-kwasu hialuronowego, włączenie do macierzy astrocytów i mikrogleju w proporcjach reprezentatywnych dla TME pacjentów12 oraz całkowite zamknięcie systemu w płytce wielodołkowej, bez konieczności stosowania zewnętrznych przewodów, zbiorników czy pomp. Kwas hialuronowy jest jednym z głównych składników macierzy zewnątrzkomórkowej mózgu19, jednak nie jest on wystarczający, aby umożliwić przepływ płynów; dlatego do mieszaniny dodano kolagen I. Sieciowanie zachodzi w dwóch etapach: poprzez polimeryzację wzrostową łańcucha inicjowaną rodnikowo, w której pod wpływem światła ultrafioletowego (UV) z fotoinicjatora powstają wolne rodniki i tworzą się wiązania chemiczne między cząsteczkami metakrylowanego kwasu hialuronowego20, oraz poprzez neutralizację kolagenu konserwowanego kwasem i poddanie go działaniu ciepła w celu utworzenia włókien kolagenowych21,22,23.
Różne parametry zoptymalizowane dla tego testu zostały opisane w wcześniej opublikowanych pracach dotyczących hydrożeli hialuronianowo-kolagenowych modyfikowanych grupami tiolowymi8,12. W szczególności komórki (pierwotne ludzkie GSC24, pierwotne ludzkie astrocyty korowe oraz unieśmiertelniona ludzka mikroglia) wykorzystane w tym teście wykazują co najmniej 60% żywotności przez 3 dni w żelach składających się z pożywki astrobasalnej uzupełnionej o czynniki wzrostu GSC, 0,5% v/v N-2 oraz 1% v/v B-27 bez witaminy A12. W przypadkach, gdy żele muszą zostać zdegradowane (np. w celu ekstrakcji białek lub cytometrii przepływowej), stosuje się kolagenazę i dispazę, które pozwalają zachować wystarczającą żywotność (Ryc. 2).
Aby ilościowo określić stopień inwazji, GSCs muszą zostać oznakowane fluorescencyjnie przed połączeniem ich z glejem w matrycy. Można to osiągnąć poprzez oznakowanie Hoechst 33342 (opisane poniżej), zastosowanie markerów typu cell trackers12, modyfikację genetyczną lub transdukcję. Niezależnie od wybranej metody, przed wprowadzeniem komórek do modelu TME należy zmierzyć żywotność komórek oznakowanych nowymi markerami. Alternatywnie, jeśli inwazja nie będzie mierzona ilościowo, a żele zostaną pobrane do ekstrakcji białek, ekstrakcji RNA lub innych analiz, komórki często nie wymagają oznakowania fluorescencyjnego podczas procesu przygotowywania żelu. W takim przypadku żele mogą zostać utrwalone w formalinie do obrazowania, zdegradowane, a komórki zlizowane w celu ekstrakcji RNA, lub zdegradowane za pomocą proteaz do cytometrii przepływowej, a następnie zlizowane buforami do lizy białek na potrzeby Western blotów lub innych analiz białek.
W niniejszym materiale przedstawiamy protokół włączania ludzkich astrocytów, mikrogleju oraz pochodnych od pacjenta GSC w określonym dla pacjenta stosunku 4:1:112 do macierzy składającej się z 1,2 mg/mL kolagenu I oraz 4 mg/mL kwasu hialuronowego w warunkach statycznych lub przepływowych. Konkretne parametry zastosowane w analizie (np. proporcje komórek, sztywność, typy komórek itp.) mogą zostać zmienione w celu odwzorowania różnych kontekstów, o ile przeżywalność komórek jest odpowiednia.
<img alt="Układ hodowli komórek mózgu; schemat warunków statycznych i przepływowych; astrocyty, mikroglej, GSCs." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat modelu TME składającego się z GSCs, astrocytów i mikrogleju w hydrożelu pod wpływem ciśnienia cieczy. Komórki są zatopione w hydrożelu z kolagenu i kwasu hialuronowego wewnątrz insertu do hodowli tkankowej. Siła grawitacji napędza wypadkowy przepływ w dół. Pory w membranie insertu do hodowli tkankowej umożliwiają przywieranie komórek migrujących w dół do dolnej powierzchni insertu; komórki te mogą być utrwalone, obrazowane i poddane kwantyfikacji. Utworzono za pomocą BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przeżywalności komórek; % żywych komórek w czasie (30, 45, 60 min); wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przeżywalność komórkowa po degradacji hydrożelu. G34s (GSCs), astrocyty i mikroglej zasiano w modelu TME w stosunku 4:1:1 i inkubowano przez 21 h w 37 °C. Żele usunięto i poddano degradacji przy użyciu 0,3 mg/mL kolagenazy + 0,02 mg/mL dispazy przez łącznie 30, 45 lub 60 min, mieszając za pomocą pipety co 15 min (warunek 30 min) lub w 30 min, a następnie co 15 min (warunki 45 min i 60 min). Po degradacji żeli komórki zabarwiono pomarańczą akrydynową (wszystkie komórki) i jodkiem propidium (martwe komórki), a następnie policzono za pomocą automatycznego licznika komórek. Przeżywalność określono dla wszystkich komórek w modelu TME. Komórki utrzymały przeżywalność na poziomie co najmniej 70% w czasie od 30 do 60 min. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM; n = 3 powtórzenia biologiczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli tkankowej, sterylne</td><td>produkty naukowe Celltreat&nbsp;</td><td></td><td></td>229112</tr><tr><td>Filtr 250 ml&nbsp; System, Materiał filtracyjny PES, 0,22 i mikro; m, 50 mm, Sterylny</td><td>DOT Scientific 667706</td><td></td><td></td></tr><tr><td>385 nm, 1650 mW (min) Zamontowana dioda LED, 1700 mA&nbsp;</td><td>Szpitale&nbsp;</td><td>M385LP1-C1</td><td></td></tr><tr><td>75cm2 Kolba do hodowli tkankowych - Nasadka odpowietrzająca, sterylna</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229341</td><td></td></tr><tr><td>8.0 &mu; m Wkładka do hodowli komórkowej o średnicy 12 mm</td><td>Millicell</td><td>PI8P01250</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol, 200 proof, Biologia molekularna</td><td>klasy Thermo Fisher Scientific</td><td>T038181000CS</td><td>Etanol do kontroli martwych komórek cytometrii przepływowej.</td></tr><tr><td>Pożywka dla astrocytów (Astrofull)</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>1801</td><td>Zawiera astrobazalną, FBS i penicylinę/streptomycynę.&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x), bez witaminy A (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BSA (MACS)</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD71 (eBioscience, Invitrogen)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>25-0719-41</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka z komorą do liczenia komórek</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-PD100-002</td><td></td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek</td><td>Biologix USA&nbsp;</td><td>70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Celometr K2 Licznik fluorescencyjny komórek (Nexelcom Bioscience)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>Wirówka NEXCCMK2-SK150-FCS</td><td></td></tr><tr><td>- wolnoobrotowa</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5702 R</td><td>Wirówka do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Przezroczyste 96-dołkowe mikropłytki z polistyrenu, Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-108</td><td>Płytki z dnem w kształcie litery V do barwienia metodą cytometrii przepływowej.</td></tr><tr><td>CO2&nbsp; Inkubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, wysokie stężenie, Rat Tail</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, Rat Tail</td><td>Corning</td><td>354236</td> <td>Niskie stężenie do powlekania kolb przylegających.</td></tr><tr><td>Kolagenaza (CAS # 9001-12-1)</td><td>Stany Zjednoczone Biologiczny</td> adapter kolimacyjny <td>C7511-30</td><td></td></tr><tr><td>do Olympus BX i IX, AR Powłoka: 350 - 700 nm</td> Waciki <td>bawełniane Thorlabs</td><td>COP1-A</td><td></td></tr><tr><td>, końcówki Q-tip Precyzyjne końcówki&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>B01KCJB3R2</td><td></td></tr><tr><td>Dystrybucja (CAS# 9001-92-7)&nbsp;</td><td>Stany Zjednoczone Biologiczny</td><td>D3760</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoki poziom glukozy (Gibco)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL</td><td>Invitrogen</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (Gibco)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>Do hodowli mikrogleju.</td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, buforowany obojętnie, 10% (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 / Zestaw barwiących czynnik transkrypcyjny (eBioscience, Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Komórki macierzyste glejaka</td><td>nie dotyczy</td> nie <td>dotyczy</td><td>Mogą być liniami komórek macierzystych glejaka pochodzącymi od pacjenta lub komercyjnymi.&nbsp;</td></tr><tr><td>Guava easyCyte HT System</td><td>Millipore Sigma</td><td>0500-4008</td><td>Cytometr przepływowy.</td></tr><tr><td>HBSS (Sigma-Aldrich)&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M) (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1-kanałowy sterownik LED o dużej mocy z modulacją impulsów, 10,0 A Max, 50,0 V Max&nbsp;</td>Interfejs <td>Thorlabs</td><td>DC2200</td><td>do lampy UV.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Roztwór (20 mM) (Thermo Scientific)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie astrocyty</td><td>ScienCell Research Laboratories</td><td>1800</td><td>Astrocyty pierwotne pochodzące z kory mózgowej.</td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane EGF (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>Unieśmiertelniony ludzki mikroglej - hTERT</td><td>Applied Biological Materials&nbsp;</td><td>T0251</td><td></td></tr><tr><td>Incu-mixer MP Podgrzewany wirownik do mikropłytek, 2-pozycyjny</td><td>Benchmark Naukowy&nbsp;</td><td>H6002</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 REAfinity, przeciwciało PerCP-Vio 700</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-420</td><td></td></tr><tr><td>LED Miernik utwardzania UV</td><td>Optometr Gigahertz-Optik</td><td>X1-RCH-116</td><td>do pomiaru natężenia światła UV.</td></tr><tr><td>Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)&nbsp;</td><td>Zaawansowana Biomatrix</td><td>5269-100MG&nbsp;</td><td>Fotoinicjator.</td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Naprawialna bliska podczerwień (Invitrogen)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L24975</td><td></td></tr><tr><td>Metakrylowany kwas hialuronowy (photoHA)</td><td>Mikrowirówka Advanced Biomatrix</td><td>5212-100MG</td><td></td></tr><tr><td>, Sorvall ST8R (Thermo Scientific)</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-997-203</td><td>Wirówka do barwienia cytometrią przepływową.</td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100X) (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7,4 bez Ca & Mg</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>119-069-101</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, granulki ACS (CAS# 1310-73-2)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>97064-476</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain Roztwór do barwienia AOPI</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CS2-0106</td><td></td></tr></tbody></table>

fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

A Photopolymerizable Hyaluronic Acid-Collagen Model of the Invasive Glioma Microenvironment with Interstitial Flow

Nawrót glejaka jest główną przeszkodą w sukcesie leczenia i jest spowodowany inwazją komórek macierzystych glejaka (GSC) do zdrowych tkanek, które są niedostępne do chirurgicznej resekcji i są odporne na istniejące chemioterapie. Ruch płynu na poziomie tkanki lub przepływ płynu śródmiąższowego (IFF) reguluje inwazję GSC w sposób zależny od mikrośrodowiska guza (TME), podkreślając potrzebę systemów modelowych, które obejmują zarówno IFF, jak i TME. Przedstawiamy przystępną metodę replikacji inwazyjnego TME w glejaku: hydrożel hialuronowo-kolagenowy I złożony z ludzkich GSC, astrocytów i mikrogleju wysianych we wstawce do hodowli tkankowej. Podwyższony IFF można przedstawić poprzez przyłożenie głowicy ciśnieniowej płynu do hydrożelu. Ponadto model ten można dostroić w celu odtworzenia różnic między pacjentami lub wewnątrz pacjentów w proporcjach komórkowych, natężeniach przepływu lub sztywności matrycy. Inwazję można określić ilościowo, podczas gdy żele można zbierać w celu uzyskania różnych wyników, w tym inwazji GSC, cytometrii przepływowej, ekstrakcji białek lub RNA lub obrazowania.

Reprezentatywne dane dotyczące inwazji (Rysunek 3), żywotności oraz ekspresji Ki67 i CD71 w cytometrii przepływowej (Rysunek 4) dla linii GSC zostały przedstawione zgodnie z wcześniejszą publikacją dotyczącą hydrożelu hialuronianowo-kolagenowego modyfikowanego tiolowo12. Obecność astrocytów i mikrogleju w modelu TME wykazuje zróżnicowany wpływ na inwazję GSC w zależności od linii komórkowej (Rysunek 4). W szczególności, komórki GSC G44 i G6224 zasiano w modelu TME z astrocytami i mikroglejem oraz bez nich, a następnie poddano działaniu ciśnienia hydraulicznego (przepływ) lub zerowego przepływu netto (warunki statyczne).
Obecność względem braku astrocytów i mikrogleju w modelu TME wiązała się z redukcją inwazji G44 w warunkach statycznych (Rycina 3; p &lt; 0,05). W przeciwieństwie do tego, ani przepływ, ani obecność astrocytów i mikrogleju nie wpłynęły znacząco na inwazję G62. Te odmienne efekty mikrośrodowiska guza oraz przepływu na inwazję zostały opisane dla innych linii komórkowych12 i powinny zostać zbadane dla nowych linii komórkowych wprowadzanych do systemu modelowego.
Aby przeanalizować żywotność, proliferację Ki67+ oraz cechy macierzystości CD71+ komórek GSC w modelu TME, linię GSC G3424 wysiano wraz z astrocytami i mikroglejem znakowanymi barwnikami fluorescencyjnymi, a następnie zastosowano warunki statyczne lub przepływowe. Następnie żele zdegradowano, aby wyizolować komórki do cytometrii przepływowej. Komórki barwiono barwnikiem live/dead (fixable), a następnie utrwalono i znakowano przeciwciałami przeciwko Ki67 lub CD7112. Rycina 4A przedstawia ogólny protokół bramkowania dla żywych komórek G34 CD71+ i Ki67+ w celu ich odróżnienia od astrocytów i mikrogleju. Proliferacja G34 (Ki67) była istotnie wyższa w warunkach przepływu w porównaniu do warunków statycznych, gdy komórki znajdowały się w żelach samodzielnie (p &lt; 0,001), a także w obecności względem braku gleju w warunkach statycznych (p &lt; 0,05) (Rycina 4B). Mimo braku istotności statystycznej, w przypadku komórek G34 występowała tendencja do zwiększonej ekspresji CD71 podczas przepływu, gdy znajdowały się one w żelach samodzielnie; tendencja ta nie została zaobserwowana w obecności gleju (Rycina 4C). Metoda ta może być wykorzystana do ilościowego oznaczenia innych markerów zainteresowania dla każdego typu komórek w modelu TME.
Warto zauważyć, że ze względu na zmienność wprowadzaną przez liczne czynniki, które mogą potencjalnie wpływać na inwazję glejaka (sztywność żelu, gliosis reaktywna, zmiany fenotypowe wynikające z selekcji i pasażowania itp.), często pomocne jest raportowanie wielkości efektu, a przed analizą nowych linii komórkowych konieczne jest przygotowanie powtórzeń technicznych oraz przeprowadzenie analizy mocy dla powtórzeń biologicznych. Zazwyczaj dopuszczalna liczba powtórzeń biologicznych wynosi n = 3-6. Aby zminimalizować zmienność i zmaksymalizować moc statystyczną, wszystkie warunki, w tym porównania między różnymi liniami GSC, powinny być realizowane w ramach jednego eksperymentu, o ile jest to możliwe.
<img alt="Wykres słupkowy porównujący warunki statyczne i przepływowe pod kątem % inwazji, wskazujący istotne różnice." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Różnicowy wpływ mikrośrodowiska guza na stymulowaną przepływem inwazję w dwóch liniach GSC. Fluorescencyjnie znakowane komórki GSC (G44 i G62) zasiano w hydrożelach samodzielnie (-A/M) lub wraz z astrocytami i mikroglejem (+A/M). W warunkach „przepływowych” (flow) zastosowano ciśnienie hydrauliczne; w warunkach „statycznych” (static) zastosowano zerowy wypadkowy przepływ cieczy. Inwazyjne komórki GSC utrwalono na membranie wkładki do hodowli tkankowej, przeliczono i wyciągnięto średnią z powtórzeń technicznych. Średnią inwazję naniesiono na wykres dla każdego powtórzenia biologicznego. Inwazja G44 była istotnie zredukowana przez obecność A/M w warunkach statycznych (p &lt; 0,05). Z kolei ani przepływ, ani obecność A/M nie wpłynęły na inwazję w przypadku G62. Udział zasianych komórek GSC, które dokonały inwazji, przedstawiono jako średnia ± SEM; n = 3 powtórzenia biologiczne; *p &lt; 0,05 dla dopasowanej dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z następującym testem wielokrotnych porównań Tukeya. Dane zostały przeredagowane i przedrukowane za zgodą autorów Cornelison et al. 202212. Analiza statystyczna została zaktualizowana, aby obejmowała tylko interesujące badaczy linie komórkowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej, rozkład glejaka, markery Ki67/CD71, wykres słupkowy procentu żywych komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66604/66604fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Pomiar żywotności, proliferacji (Ki67) i cech macierzystości (CD71) w komórkach GSC w modelu TME. GSCs zasiano z lub bez astrocytów (zielone) i mikrogleju (ciemnoczerwone) znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi w modelu TME, a następnie poddano działaniu zerowego przepływu płynu (statyczny) lub przepływu netto (przepływ). Żele zdegradowano i zabarwiono bliskopodczerwonym barwnikiem live/dead oraz przeciwciałami przeciwko Ki67 lub CD71 do analizy cytometrii przepływowej. Kontrole izotypowe przedstawiono w kolorze szarym. (A) Wyselekcjonowano bramki dla typów komórek, a żywotne komórki ilościowo określono za pomocą bliskopodczerwonego barwnika live/dead. (B) Proliferacja Ki67 w komórkach G34 jest istotnie zwiększona w warunkach przepływu w porównaniu do warunków statycznych, zarówno gdy komórki znajdują się samodzielnie w hydrożelu (p < 0,001), jak i w obecności astrocytów oraz mikrogleju (A/M) w warunkach statycznych (p < 0,05). (C) W przeciwieństwie do tego, choć nie jest to istotne statystycznie, macierzystość G34, reprezentowana przez ekspresję CD71, jest utrzymywana w warunkach statycznych dzięki włączeniu astrocytów i mikrogleju do modelu TME. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM; n = 3 powtórzenia biologiczne. *p < 0,05 oraz ***p < 0,0001 dla dwuczynnikowej analizy wariancji ANOVA z następującym testem wielokrotnych porównań Tukey'a. Rycina została przekształcona i przedrukowana za zgodą Cornelison et al. 202212; dołączono dodatkowe dane obrazujące warunki statyczne w panelach B i C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66604/66604fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Glioblastoma recurrence is a major hindrance to treatment success and is driven by the invasion of glioma stem cells (GSCs) into healthy tissue that are ...

Nasza praca bada, w jaki sposób mikrośrodowisko guza napędza inwazję komórek nowotworowych w glejaku, najbardziej śmiertelnej postaci raka mózgu. W szczególności interesuje nas, w jaki sposób przepływ płynu śródmiąższowego napędzany zwiększonym ciśnieniem wewnątrznowotworowym powoduje inwazję komórek nowotworowych na otaczający miąższ mózgu. Obecnie używamy modeli masy układu kolagenowego 3D kwasu hialuronowego, w połączeniu z obrazowaniem MRI i analizą obliczeniową w celu zbadania inwazji glejaka napędzanej przepływem płynu śródmiąższowego.W przypadku podejść in vitro przepływ płynu jest generowany przez wywieranie nacisku na górną część modelu TME, naśladując przepływ płynu śródmiąższowego w mózgu. Zapewnienie odpowiednich sygnałów fizycznych do replikacji mikrośrodowiska tkanek jest ciągłym wyzwaniem. Nasz trójwymiarowy model wykorzystuje kwas hialuronowy i kolagen, które znajdują się w macierzy mózgu, oraz stały przepływ płynu śródmiąższowego.Razem czynniki te dostarczają kluczowych sygnałów fizycznych do komórek zdrowych i nowotworowych. Nasze ostatnie prace wskazują, że rezydentne komórki mózgowe wpływają na to, jak komórki glejaka reagują na przepływ śródmiąższowy. Odpowiedź ta zależy jednak od czynników specyficznych dla pacjenta.Aby zbadać wpływ tych czynników na inwazję glejaka, opracowaliśmy model frontu inwazyjnego glejaka, który naśladuje natywną tkankę mózgową. Model guza pacjenta pozwala na wysoce kontrolowany eksperyment in vitro, który nadal reprezentuje czynniki na poziomie tkanki wpływające na inwazję glejaka. Co więcej, model ten jest dostępny w porównaniu z podobnymi modelami inwazji glejaka i przepływu śródmiąższowego, ponieważ nie wymaga przewodów ani pomp.I wykorzystuje materiały dostępne na rynku. Na początek umieść kolagen, wodorotlenek sodu, sterylną ultraczystą wodę, 10 razy PBS, jedną mikroprobówkę wirówkową, metakrylowany kwas hialuronowy i fotoinicjator na lodzie. Następnie umieść wkładki do kultur tkankowych na płytce i oznacz ją.Aby przygotować trzy miligramy na mililitr roztworu kolagenu, połącz kolagen o wysokim stężeniu, jeden normalny wodorotlenek sodu, ultraczystą wodę i 10 razy PBS. Dodaj składniki do probówki mikrowirówki i trzymaj końcówkę pipety zanurzoną podczas mieszania, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Następnie odwirować komórki w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie delikatnie usuń nadmiar pożywki z górnej części każdego roztworu stanu komórki, pozostawiając objętość pożywki wymaganą dla danego stanu. Umieść te roztwory na lodzie. Dodaj obliczoną objętość roztworu kolagenu do każdego roztworu stanu komórki.Następnie dodaj obliczoną objętość 1% metakrylowanego kwasu hialuronowego, a następnie 17 miligramów na mililitr LAP w każdym roztworze stanu komórki. Mieszaj każdą probówkę kondycyjną pojedynczo, trzymając końcówkę pipety zanurzoną, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. I dodaj od 100 do 150 mikrolitrów do każdej wkładki do hodowli tkankowej.Teraz włącz lampę ultrafioletową o długości 385 nanometrów przy stałym prądzie. Aby sfotografować sieciowanie każdego żelu, wystawiaj każdą studzienkę na działanie światła ultrafioletowego przez 45 sekund, pojedynczo. Następnie umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 do 45 minut, aby usieciować kolagen.Używając pożywki astro base z 0,5% i dwiema objętościami i 1% objętościowo B27 bez witaminy A, nałóż głowicę ciśnieniową płynu na żele. Dodaj pożywkę do płytki studzienkowej i wkładek do hodowli tkankowych, aby uzyskać zerowy przepływ netto. Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, na co najmniej 18 godzin lub do pięciu dni.

a-photopolymerizable-hyaluronic-acid-collagen-model-invasive-glioma

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film pokazuje, jak glejaki, pochodzące z guzów mózgu, są rozdzielane na pojedyncze komórki i zamykane w hydrożelu na bazie kwasu hialuronowego. Proces ten sprzyja interakcjom komórka-komórka, tworząc ustrukturyzowany, trójwymiarowy model glejaka.

Hydrożel na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka

Na tym filmie komórki glejaka i mikrogleju są mieszane z roztworem matrycy polimerowej i przenoszone do porowatej wkładki komory, w której tworzy się żel, osadzając komórki. Mikroglej stymuluje migrację komórek glejaka przez porowatą wkładkę, naśladując inwazję komórek nowotworowych na otaczającą tkankę, Komórki są następnie utrwalane i przygotowywane do dalszej analizy.

Model inwazji guza oparty na macierzy z wykorzystaniem kohodowli glejaka wielopostaciowego mikrogleju

Tutaj prezentujemy protokół hodowli 3D komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Pokazujemy pierwotną hodowlę komórkową, syntezę hydrożelu metakrylowanego kwasu hialuronowego (HAMA), fotopolimeryzację HAMAfotopolimeryzację i enkapsulację komórek oraz przetwarzanie próbek do konfokalnego i skaningowego obrazowania mikroskopem elektronowym.

Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego

Tutaj prezentujemy protokół trójwymiarowej hodowli komórek glejaka pochodzących od pacjenta w ortogonalnie przestrajalnych biomateriałach zaprojektowanych tak, aby naśladować matrycę mózgu. Podejście to zapewnia platformę eksperymentalną in vitro, która zachowuje wiele cech komórek glejaka in vivo, zwykle traconych w hodowli.

Hydrożele na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka wielopostaciowego pochodzących od pacjentów

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Obecny protokół ustanawia model nawrotu glejaka (GBM) po resekcji za pomocą mikroskopii w celu zbadania efektu terapeutycznego wstrzykiwanego, bioresponsywnego hydrożelu in vivo.

Model nawrotu glejaka po resekcji do badań terapeutycznych hydrożelu

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

Przedstawiamy trójwymiarowy model migracji glejaka glejaka wykorzystującego magnetyczne gliomasfery pochodzące od pacjentów, generowane z nowo zdiagnozowanych i nawracających guzów. Platforma ta umożliwia wizualizację specyficznych dla pacjenta dynamiki migracji oraz ocenę skuteczności terapeutycznej. Test może być multipleksowany po migracji, aby ocenić lokalizację i wzorce ekspresji białek.

Powtarzalny 3D test migracji glejaka z magnetyczną lokalizacją sferoidów za pośrednictwem nanocząstek magnetycznych w warunkach hipoksycznych

Opisano nowatorskie podejście umożliwiające analizę wysokiej rozdzielczości interakcji komórek nowotworowych z egzogennym kwasem hialuronowym (HA). Powierzchnie wzorowane są wytwarzane poprzez połączenie chemii karbodiimidowej i mikrodruku kontaktowego.

Powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

Poznaj metodę modelowania inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym w fotopolimeryzowalnym hydrogelu kwasu hialuronowego i kolagenu. To podejście umożliwia badanie dynamiki inwazji komórek nowotworowych.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Przeglądaj więcej filmów