Wykrywanie interakcji białko-baldaszek CD40 za pomocą różnicowej fluorescencji skaningowej
1 marca 2024
Ten protokół opisuje unikalną metodę wykrywania wiązania między związkami a cząsteczkami białka, oferując korzyści w postaci minimalnej utraty próbki białka i wysokiej dokładności danych.
Nasz protokół zapewnia znaczną przewagę, umożliwiając użytkowanie bez specjalistycznego sprzętu. W przeciwieństwie do tradycyjnych ilościowych metod PCR fluorozy, po prostu stawia czoła procesowi eksperymentalnemu, który wymaga etapów danych dla widzów i zmniejsza ogólną złożoność, dzięki czemu jest prosty i łatwiejszy do przeprowadzenia. Eksperyment ten wymaga od operatora dokładnego zaznajomienia się z procedurą eksperymentalną i czytnikiem mikropłytek fluorescencyjnych, a także nie marnowania zbyt wiele czasu podczas podgrzewania roztworu i wykrywania fluorescencji.
Skupimy się na mechanizmie molekularnym, dzięki któremu umbelliferon do białka CD40 wywołuje efekty immunologiczne. Na początek dodaj 500x pomarańczowy barwnik do roztworu PBS, aby uzyskać różne proporcje barwnika. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych na pulpicie.
Kliknij na instrument, a następnie wybierz odpowiedni model mikropłytki i wybierz OK. Kliknij ustawienia akwizycji i wybierz fluorescencję. Pod interfejsem długości fali ustaw lambda jeden na 470 nanometrów i 570 nanometrów. Następnie naciśnij przycisk OK. Odpipetować 100 mikrolitrów każdego stężenia pomarańczowego barwnika do dołków 96-dołkowej płytki.
Umieść płytkę w stopniu wykrywania w czytniku mikropłytek fluorescencyjnych. Kliknij ikonę odczytu w oprogramowaniu i zmierz fluorescencję każdego stężenia barwnika 13 razy w temperaturze pokojowej w odstępie dwóch minut. Po każdym ustaleniu kliknij ikonę eksportu, a następnie wybierz Eksportuj do XML, XLS, TXT.
Wybierz wszystkie płyty, a następnie wybierz płytę w formacie wyjściowym i kliknij OK, aby zapisać dane w formacie XLS do dalszej analizy. Teraz włącz cyfrowe ogrzewanie, wytrząsanie suchej kąpieli. Ustaw temperaturę grzania na 35 stopni Celsjusza, a czas nagrzewania na dwie minuty.
Przygotuj optymalny stosunek rozcieńczenia barwnika w 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki. Następnie umieść go w suchej kąpieli z cyfrowym ogrzewaniem i wytrząsaniem na dwie minuty. Teraz dodaj 100 mikrolitrów zarówno PBS, jak i roztworów barwiących do dołków płytki.
Umieść płytkę w stopniu wykrywającym przyrządu. Kliknij ikonę odczytu w oprogramowaniu do akwizycji danych. Ustaw temperaturę grzania na 40 stopni Celsjusza, a czas nagrzewania na dwie minuty.
Teraz odpipetuj roztwór barwnika z płytki z powrotem do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Podgrzej go w suchej kąpieli z wytrząsaniem w cyfrowym ogrzewaniu przez dwie minuty. Powtórz dodawanie roztworów barwników, eksportując wynikowe dane w celu przetestowania absorbancji roztworu barwnika w krokach co pięć stopni temperatury od 35 do 95 stopni Celsjusza.
Połącz roztwór białka CD40 z PBS, aby uzyskać końcowe stężenia 5, 10, 15 i 20 mikrogramów na mikrolitry. Następnie połącz pomarańczowy barwnik z PBS, aby uzyskać końcowe stężenie od jednego do 500. Ocenić absorbancję roztworu białka CD40 w krokach co pięć stopni temperatury od 35 do 95 stopni Celsjusza.
Zapisz dane jako pliki XLS, a następnie oblicz temperaturę topnienia lub wartość TM za pomocą oprogramowania do analizy danych. Następnie wymieszaj CD40 i baldaszkowit z roztworem PBS. Następnie odpipetuj pomarańczowy barwnik do PBS, aby uzyskać roztwór o stężeniu od jednego do 500.
Zmierzyć absorbancję roztworu kompleksów umbelliferonu CD40 w krokach co pięć stopni temperatury od 35 do 95 stopni Celsjusza. Pomarańczowy barwnik konsekwentnie wykazywał stabilne wzbudzenie fluorescencyjne zarówno w temperaturze pokojowej, jak i podwyższonej. Określono optymalny stosunek rozcieńczenia jeden do 500.
Stabilna wartość TM wynosząca 51,82 stopni Celsjusza była wykrywalna przy stężeniu 15 mikrogramów na mililitr, które spadło do 45,79 stopni Celsjusza wraz ze wzrostem stężenia białka CD40.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje unikalną metodę wykrywania wiązania między związkami a cząsteczkami białek, oferując zalety w postaci minimalnej utraty próbki białka oraz wysokiej dokładności danych. Metoda ta upraszcza proces eksperymentalny, czyniąc go dostępnym bez konieczności posiadania specjalistycznego sprzętu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Interakcje białkowe
- Immunologia
Wstęp
- Tradycyjne metody wykrywania wiązania białek często wymagają specjalistycznego sprzętu.
- Metody ilościowego PCR w badaniach fluorozy mogą być złożone i czasochłonne.
- Zrozumienie molekularnych mechanizmów oddziakiwań białkowych jest kluczowe dla badań immunologicznych.
- Interakcja umbelyferonu z białkiem CD40 jest szczególnie interesująca ze względu na jego efekty immunologiczne.
Cel badania
- Aby przedstawić uproszczony protokół wykrywania wiązania białka z związkiem chemicznym.
- Aby zbadać wpływ umbelliferoonu na białko CD40 w kontekście odpowiedzi immunologicznej.
- Aby zwiększyć dokładność danych przy jednoczesnym zminimalizowaniu strat próbki.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu PBS o różnych stężeniach pomarańczowego barwnika.
- Wykorzystanie fluorescencyjnego czytnika mikropłytek do akwizycji danych.
- Koncentracja na procedurze eksperymentalnej w celu zapewnienia wydajności.
- Uruchomienie oprogramowania do akwizycji danych w celu ułatwienia analizy.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia dokładne wykrywanie wiązania białek.
- W trakcie procesu osiągnięto minimalną utratę próbki białka.
- Proces pozyskiwania danych został usprawniony, co zmniejszyło ogólną złożoność metody.
- Uzyskano wiedzę na temat immunologicznych efektów działania umbelliferony na CD40.
Wnioski
- Ta metoda stanowi praktyczną alternatywę dla tradycyjnych technik detekcji.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie oddziaływań białek w immunologii.
- Protokół ten można łatwo wdrożyć w różnych warunkach badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Różnicowa skanująca fluorescencja (DSF) umożliwia szybką, ilościową ocenę oddziaływań białko-ligand, wspierając wczesny etap walidacji celu i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w portfelach odkryć skoncentrowanych na immunologii. Zdolność do wykrywania wiązania białka CD40 z ombrelliferoną z wysoką czułością i minimalną utratą próbki usprawnia ocenę związków immunomodulujących. Niniejszy schemat pracy pozycjonuje DSF jako skalowalne i dostępne narzędzie do rozwijania badań nad stabilnością białek i ich oddziaływaniami w badaniach i rozwoju (R&D) w sektorze biofarmaceutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę wiązania białko-ligand w odniesieniu do celów szlaków odpornościowych.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez kwantyfikację przesunięć stabilności termicznej po związaniu związku.
- Ułatwia szybką selekcję kandydatów z małych cząsteczek do dalszej oceny immunomodulacyjnej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowany, powtarzalny test oparty na fluorescencji do screeningu oddziaływań białkowych.
- Dostarcza ilościowe wyniki Tm (temperatury topnienia) do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Zmniejsza złożoność testu i zużycie próbek, wspierając przygotowanie do wysokoprzepustowego screeningu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z istotnymi w kontekście chorób celami immunologicznymi, takimi jak CD40, w celu eksploracji translacyjnych biomarkerów.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od badań wiązania na etapie odkrywania do przedklinicznej walidacji modulatorów odporności.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp prac nad kandydatami z potwierdzonym oddziaływaniem z białkiem.
Integracja potoku i przepływu pracy
Wykrywanie oddziaływań między białkami a małymi cząsteczkami w oparciu o metodę DSF wpisuje się w kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, stanowiąc pomost między wczesną walidacją celu a identyfikacją wiodących związków dla modulatorów szlaków immunologicznych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowo określa zmiany stabilności białek w celu wsparcia badań nad związaniem z celem opartych na hipotezach.
- Przesiewy: Oferuje powtarzalne, ilościowe pomiary Tm do priorytetyzacji związków.
- Analityka: Generuje eksportowalne dane fluorescencji i absorbancji dla rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Łączy dane o wiązaniu molekularnym z istotnością ścieżek immunologicznych podczas rozwoju kandydatów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy szeroko stosowalną, niskozłożonościową platformę do analizy oddziaływań białko-ligand.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu oraz zrozumienia mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Upraszcza przepływy pracy, ogranicza zapotrzebowanie na specjalistyczny sprzęt i minimalizuje utratę próbek.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji go/no-go dla związków immunomodulujących i zwiększa efektywność kapitałową.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów z walidowanymi interakcjami białkowymi w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość operatora w obsłudze czytników mikropłytek fluorescencyjnych oraz oprogramowania do akwizycji danych.
- Konieczny jest dostęp do standardowej aparatury laboratoryjnej oraz cyfrowego sprzętu grzewczego.
- Wymagane jest rygorystyczne przestrzeganie czasu podczas ogrzewania i detekcji fluorescencji w celu zapewnienia jakości danych.
- Kluczowe dla powtarzalności wyników jest ustandaryzowanie rozcieńczenia barwnika oraz przyrostów temperatury.
- Adaptacja metody do innych układów białko-ligand może wymagać optymalizacji barwnika oraz warunków analizy.
