Ulepszanie map gęstości poprzez usuwanie większości cząstek z końcowych stosów kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek
10 maja 2024
Zaawansowana metoda selekcji cząstek dla cryo-EM, a mianowicie CryoSieve, poprawia rozdzielczość mapy gęstości, usuwając większość cząstek z końcowych stosów, co zostało zademonstrowane poprzez jej zastosowanie na rzeczywistym zestawie danych.
Kriogeniczna mikroskopia elektronowa jest niezbędna do określania bliskich struktur atomowych lub mikrocząsteczek biologicznych. Pomimo tego, że opiera się na uśrednianiu wielu obrazów o niskim poziomie sygnału do szumu, optymalna liczba cząstek potrzebnych do uzyskania określonej rozdzielczości pozostaje nieznana. To ograniczenie hamuje postęp w metodach analizy i przygotowania próbek.
Aby temu zaradzić, wprowadzamy metodę sortowania iteracyjnego. Standardowy wybór postępu obejmuje klasyfikację dwuwymiarową i trójwymiarową. Obecnie stosowane są inne kryteria sortowania postępu, takie jak metoda znormalizowanej korelacji krzyżowej, podejście oparte na spójności wykresu kątowego i klasyfikacja niewyrównania.
Szeroko zakrojone eksperymenty pokazują, że CryoSieve przewyższa inne algorytmy solenia cząstek cryo EM, ujawniając, że większość cząstek jest niepotrzebna w końcowych stosach. Mniejszość cząstek pozostających w końcowych stosach daje amplitudę o bardzo wysokiej rozdzielczości na zrekonstruowanych mapach gęstości. W przypadku niektórych zestawów danych rozmiar końcowego podzbioru zbliża się do teoretycznego limitu.
W przygotowywaniu próbek cryo EM, w tym procesie pracy, ze względu na brak standardowych wskaźników do porównywania protokołów, stosunek wybranych do pobranych cząstek może służyć jako wskaźnik jakości, badanie ich rozkładu przestrzennego i czasowego może również podkreślić kluczowe, fizyczne czynniki wpływające na skuteczność przygotowania. Aby skonfigurować środowisko akceleracji GPU, otwórz terminal i wprowadź polecenie nvidia.smi. Sprawdź, czy polecenie pomyślnie wyświetla wszystkie informacje o karcie procesora graficznego i czy wersja CUDA jest wyższa niż 10.2.
Następnie wykonaj polecenie conda V, aby potwierdzić instalację Conda. Wprowadź następujące polecenie, aby skonfigurować środowisko wirtualne i poczekaj kilka minut, aż środowisko zostanie pomyślnie skonfigurowane. Wykonaj polecenie conda activate CRYOSIEVE_ENV, aby aktywować nowo utworzone środowisko wirtualne.
Aby zainstalować CryoSieve, uruchom polecenie install cryosieve. Po instalacji wprowadź polecenie cryosieve h, aby upewnić się, że informacje pomocy są wyświetlane poprawnie. Z NPR pobierz końcowy zestaw danych stosu NPR 10097.
Otwórz usługę GitHub, a następnie pobierz plik gwiazdki i maskę. mrc oraz początkowy plik mrc. Umieść wszystkie te pliki w folderze razem.
Otwórz terminal i użyj ścieżki pliku CD polecenia, aby przejść do folderu zawierającego zestaw danych. Następnie wprowadź polecenie conda activate CRYOSIEVE_ENV , aby aktywować środowisko Conda. Użyj następującego polecenia, aby rozpocząć przesiewanie cząstek.
Monitoruj wyświetlacz terminala pod kątem dzienników wyjściowych dla każdej iteracji. Wprowadź wskazane polecenie, aby wydrukować wyniki rozdzielczości dla 10 iteracji przesiewania. Stos cząstek przefiltrowany w siódmej iteracji ma najwyższą rozdzielczość, przy czym najmniejsza liczba cząstek pokazuje optymalny wynik.
Aby zaimportować przesiane cząstki, otwórz interfejs sieciowy CryoSPARC. Wejdź do obszaru roboczego i kliknij przycisk kreatora w prawym górnym rogu panelu. Następnie wybierz i kliknij opcję importuj stos cząstek.
W sekcji parametrów panelu importu stosu cząstek określ metaścieżkę cząstki jako plik _. nstar z folderu wyjściowego oraz ścieżkę danych cząstek do folderu zawierającego plik MRCS. Kliknij przycisk zadania Q, a następnie przycisk Q, aby rozpocząć proces.
W prawym górnym panelu CryoSPARC kliknij przycisk konstruktora, a następnie wybierz i kliknij opcję importu woluminów 3D. Określ ścieżkę danych woluminu jako początkowy plik MRC. Kliknij przycisk zadania Q, a następnie przycisk Q, aby rozpocząć proces.
Ponownie kliknij przycisk konstruktora i wybierz opcję jednorodnego udoskonalenia. W panelu głównym po lewej stronie otwórz zadanie importowania stosu cząstek czwartej iteracji. Przeciągnij moduł zaimportowanych cząstek z prawej strony panelu głównego i upuść go w sekcji stosów cząstek w kreatorze.
Kliknij czerwony znak X, aby zamknąć zadanie importu stosu cząstek. Otwórz zadanie importowania woluminów 3D. Przeciągnij moduł zaimportowanych woluminów z prawej strony panelu głównego i upuść go w początkowej sekcji woluminu kreatora.
W folderze parameters znajdź opcję symetrii i ustaw ją na C3. Znajdź i wyłącz opcję wymuszonego ponownego wykonania podziału GS. Kliknij przycisk zadania Q, a następnie przycisk kolejki, aby zainicjować jednorodne zagęszczenie. Po zakończeniu wszystkich zadań przejrzyj wyniki i potwierdź, że stos cząstek przefiltrowany w szóstej iteracji zapewnił optymalny wynik.
Pokazany jest model do mapowania i półmapy krzywych korelacji powłoki zrekonstruowanych map gęstości dla zestawu danych hemaglutyniny i trimera grypy przed i po metodzie. Surowe i ostre mapy gęstości porównano również z zastosowanym równoważnym poziomem konturu. Ulepszenie zrekonstruowanych map gęstości jest widoczne w porównaniu łańcuchów bocznych na ostrych mapach.
Po usunięciu większości cząstek w końcowym stosie, współczynnik B Rosenthala-Hendersona wzrósł z 226,9 angstrema kwadratowego do 146,2 angstrema kwadratowego Parametry takie jak lokalna rozdzielczość, lokalny współczynnik B i res log wskazują, że CryoSieve poprawia zarówno jakość map gęstości, jak i cząstek.
Przegląd
To badanie przedstawia CryoSieve, zaawansowaną metodę selekcji cząstek do mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), która poprawia rozdzielczość map gęstości. Poprzez usuwanie niepotrzebnych cząstek z ostatecznych stoków, CryoSieve znacznie poprawia jakość zrekonstruowanych map gęstości.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Mikroskopia krioelektronowa
- Biologia strukturalna
- Metody selekcji cząstek
Tło
- Mikroskopia krioelektronowa jest kluczowa dla oznaczania struktur zbliżonych do atomowych biologicznych makrocząsteczek.
- Obecne metody selekcji cząstek często zachowują niepotrzebne cząstki, ograniczając rozdzielczość.
- Standardowe techniki selekcji obejmują różne metody klasyfikacji i metryki.
- Brakuje standardowych metryk do porównywania protokołów przygotowania próbek.
Cel badania
- Opracowanie iteracyjnej metody sortowania, która optymalizuje selekcję cząstek w krio-EM.
- Wykazanie skuteczności CryoSieve w poprawie rozdzielczości map gęstości.
- Ustalenie metryki jakości opartej na stosunku wybranych do zebranych cząstek.
Zastosowane metody
- Iteracyjna metoda sortowania do selekcji cząstek.
- Przyspieszenie GPU dla wydajności przetwarzania.
- Wykorzystanie specyficznych poleceń do skonfigurowania środowiska i uruchomienia CryoSieve.
- Porównanie map gęstości przed i po zastosowaniu CryoSieve.
Główne wyniki
- CryoSieve przewyższył istniejące algorytmy selekcji cząstek.
- Ostateczny podzbiór cząstek zbliżył się do granic teoretycznych, dając mapy o wysokiej rozdzielczości.
- Zaobserwowano znaczne poprawy w czynniku Rosenthal Henderson B.
- Ulepszone mapy gęstości pokazały wyraźniejsze łańcuchy boczne i szczegóły strukturalne.
Wnioski
- CryoSieve efektywnie poprawia jakość map gęstości w krio-EM.
- Metoda zmniejsza liczbę cząstek, poprawiając rozdzielczość.
- Przyszłe prace mogą skupić się na standaryzacji metryk dla przygotowania próbek w krio-EM.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution structural elucidation of biological macromolecules is critical for target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The CryoSieve iterative particle selection workflow enhances density map quality in single particle cryo-EM by removing the majority of non-contributory particles, directly impacting the predictive confidence of structural models. This capability supports more reliable early discovery decisions and portfolio triage by improving the fidelity of molecular insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of therapeutic hypotheses through improved structural clarity.
- Reduces mechanistic ambiguity by refining density maps to near-atomic resolution.
- Supports functional target validation by providing higher-confidence structural data.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing high-quality targets based on structural evidence.
Screening & Assay Development
- Prepares validated structural models for downstream screening and compound evaluation workflows.
- Improves assay reproducibility by standardizing particle selection and map quality.
- Enables quantitative assessment of structural features relevant to ligand binding or modulation.
- Supports scalable and reusable platform development for structure-based screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural outputs with disease-relevant models for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by ensuring structural accuracy.
- De-risks advancement decisions by supplying robust, high-resolution molecular data.
- Enhances predictive value for downstream functional and pharmacological studies.
Pipeline & Workflow Integration
The CryoSieve workflow integrates into the discovery continuum from early structural biology through lead identification and preclinical research, supporting iterative hypothesis testing and model refinement.
- Discovery Biology: Refines structural hypotheses and clarifies molecular pathways by maximizing density map resolution.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality structural data for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as B factor and local resolution for objective comparison of conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning structural data with disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable approach for particle selection across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in structural models.
- Operational Value: Standardizes and streamlines particle selection, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and enhances capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM data processing and structural biology.
- Demands GPU-accelerated computational infrastructure for efficient iterative sorting.
- Necessitates cross-team standardization of particle selection and quality metrics.
- Adaptable to diverse macromolecular systems but dependent on dataset quality.
- Practical limitations include the need for robust sample preparation and data management workflows.
