Name: Ulepszanie map gęstości poprzez usuwanie większości cząstek z końcowych stosów kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Poznaj metodę CryoSieve do selekcji cząstek w kriogenicznej mikroskopii elektronowej, która poprawia rozdzielczość map gęstości poprzez eliminację zbędnych cząstek z końcowych stosów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Shenzhen Academy of Research and Translation (do M.H.), Advanced Innovation Center for Structural Biology (do M.H.), Beijing Frontier Research Center for Biological Structure (do M.H.), National Key R&D Program of China (No.2021YFA1001300) (do C.B.), National Natural Science Foundation of China (No.12271291) (do C.B.), oraz Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 12071244) (do Z.S.).

1. Instalacja
<ol>
	<li>Sprawdzanie i konfigurowanie środowiska akceleracji GPU
	<ol>
		<li>Otwórz terminal i wprowadź polecenie: nvidia-smi. Upewnij się, że polecenie pomyślnie wyświetla wszystkie informacje o kartach GPU, a wersja CUDA jest wyższa niż 10.2. Wykonaj polecenie: conda -V, aby sprawdzić, czy Conda jest zainstalowana (Rysunek uzupełniający 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfigurowanie środowiska wirtualnego
	<ol>
		<li>Wprowadź następujące polecenie, aby skonfigurować środowisko wirtualne, zastępując CRYOSIEVE_ENV żądaną nazwą środowiska: conda create -n CRYOSIEVE_ENV python=3.8 cudatoolkit=10.2 cupy=10.0 pytorch=1.10 -c pytorch -c conda-forge. Poczekaj kilka minut, aż środowisko zostanie pomyślnie skonfigurowane (Rysunek uzupełniający 2). 
		UWAGA: Użytkownicy mogą w razie potrzeby modyfikować nazwę środowiska. Podane polecenie jest specyficzne dla CUDA 10.2. Jeśli wymagana jest inna wersja CUDA, dostosuj numer wersji dla cudatoolkit.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj CryoSieve
	<ol>
		<li>Aktywuj środowisko, wykonując polecenie: conda activate CRYOSIEVE_ENV. Zainstaluj oprogramowanie, uruchamiając: install cryosieve lub conda install -c mxhulab cryosieve (Rysunek uzupełniający 3). Wprowadź cryosieve -h i upewnij się, że informacje pomocy są poprawnie wyświetlane (Rysunek uzupełniający 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przesiewanie cząstek
<ol>
	<li>Pobieranie danych
	<ol>
		<li>Pobierz zestaw danych końcowego stosu EMPIAR-10097 z EMPIAR (patrz tabela materiałów). Pobierz plik gwiazdy, plik maski (mask.mrc) i początkowy model (dla kroku ponownego oszacowania; initial.mrc) z Github (zobacz Tabelę materiałów). Umieść wszystkie te pliki w folderze razem (Rysunek uzupełniający 5). 
		UWAGA: Repozytorium w https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos korzysta z Git Large File Storage (Git LFS). Zainstalowanie usługi Git LFS jest niezbędne do klonowania całego repozytorium. Alternatywnie uzyskaj dostęp do pliku za pośrednictwem linku GitHub i kliknij przycisk Pobierz plik raw, aby pobrać pojedynczy plik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proces przesiewania cząstek
	<ol>
		<li>Otwórz terminal i użyj polecenia: cd FILEPATH, aby przejść do folderu, w którym znajduje się zestaw danych. Aktywuj środowisko Conda przez: conda activate CRYOSIEVE_ENV.</li>
		<li>Wprowadź następujące polecenie, aby rozpocząć nasz eksperyment z przesiewaniem cząstek: cryosieve --reconstruct_software relion_reconstruct --postprocess_software relion_postprocess --i T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star --o output/ --mask mask.mrc --angpix 1.3099979 --num_iters 10 --frequency_start 40 --frequency_end 3 --retention_ratio 0.8 --sym C3 --num_gpus 1 --balance (Rysunek uzupełniający 5). Podczas wykonywania terminal wyświetli dzienniki wyjściowe dla każdej iteracji. 
		UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące każdej opcji można znaleźć w pliku uzupełniającym 1. Czas przetwarzania i minimalne wymagania dotyczące wykonania są szczegółowo opisane w pliku uzupełniającym 2. T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star został udoskonalony przez CryoSPARC z T40_HA_130K-Equalized_run-data.star (pobranego z EMPIAR) w celu złagodzenia skutków spowodowanych postępem w technikach szacowania orientacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Znalezienie optymalnej iteracji
<ol>
	<li>Sprawdź rozdzielczości
	<ol>
		<li>Użyj polecenia: grep "+ FINAL RESOLUTION:" output/_postprocess*.txt, aby wydrukować wyniki rozdzielczości dla 10 iteracji przesiewania (Rysunek 1). Ponieważ stos cząstek przefiltrowany w 7. iteracji ma najwyższą rozdzielczość z najmniejszą liczbą cząstek, prawdopodobnie zapewni optymalny wynik. 
		UWAGA: Aby uniknąć niezamierzonego transferu informacji z cząstek odrzuconych do zatrzymanych15 i aby upewnić się, że stos cząstek po 7. iteracji jest rzeczywiście optymalny, użytkownicy są zobowiązani do wykonania kroku ponownej estymacji dla pobliskich iteracji. W tym protokole weryfikacji poddawane są iteracje 4, 5, 6, 7 i 8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Import przesianych cząstek
	<ol>
		<li>Otwórz interfejs sieciowy CryoSPARC i wykonaj następujące kroki: Wejdź do przestrzeni roboczej i kliknij przycisk Builder w prawym górnym rogu panelu. W panelu wybierz i kliknij opcję Importuj stos cząstek. W sekcji Parameters (Parametry) panelu Particle Stack Import (Import stosu cząstek) określ metaścieżkę Particle (Cząstka) jako plik _iter{n}.star znajdujący się w folderze wyjściowym ukończonych wyników oraz ścieżkę danych cząstek do folderu, w którym przechowywany jest plik mrcs. Kliknij przycisk Kolejka zadań, a następnie kliknij przycisk Kolejka, aby rozpocząć proces. W ten sam sposób należy zaimportować pozostałe iteracje, które wymagają ponownego oszacowania (rysunek uzupełniający 6A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Importowanie początkowego modelu
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk Kreator w prawym górnym rogu panelu. W panelu wybierz i kliknij opcję Importuj woluminy 3D.</li>
		<li>Określ ścieżkę danych woluminu jako plik initial.mrc. Kliknij przycisk Queue Job (Zadanie kolejki), a następnie kliknij przycisk Queue (kolejka), aby zainicjować proces (Rysunek uzupełniający 6B). 
		UWAGA: Model początkowy można również wygenerować poprzez rekonstrukcję ab initio (plik uzupełniający 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jednorodne zagęszczenie (zadanie kompilacji)
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk Kreator w prawym górnym rogu panelu. W panelu wybierz i kliknij opcję Jednorodne zagęszczenie. 
		UWAGA: Stosowane jest również niejednolite uściślenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jednorodne rozdrobnienie (cząstki importowane)
	<ol>
		<li>W panelu głównym po lewej stronie otwórz zadanie importowania stosu cząstek z 5. iteracji (lub żądanej iteracji). Przeciągnij moduł zaimportowanych cząstek z prawej strony panelu głównego i upuść go w sekcji Stosy cząstek w kreatorze po prawej stronie. Zamknij zadanie Importuj stos cząstek, klikając czerwony znak X w prawym górnym rogu panelu głównego.</li>
		<li>Otwórz zadanie importowania woluminów 3D. Przeciągnij moduł zaimportowanych woluminów z prawej strony panelu głównego i upuść go w sekcji Wolumin początkowy w Konstruktorze po prawej stronie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jednorodne zagęszczenie (modyfikacja parametrów)
	<ol>
		<li>W polu Parametry znajdź opcję Symetria i ustaw ją na C3. Znajdź opcję Wymuś ponowne wykonanie podziału GS i wyłącz ją. Kliknij przycisk Kolejka zadań, a następnie kliknij przycisk Kolejka, aby zainicjować jednorodne uściślenie. Wykonaj jednorodne zagęszczenie dla pozostałych iteracji przy użyciu tej samej metody (rysunek uzupełniający 6C-D). 
		UWAGA: Opcja podziału GS Force re-do ma kluczowe znaczenie. Wyłączenie tej opcji gwarantuje, że CryoSPARC zachowa złoty standard podziału określony przez plik gwiazdy, unikając nadmiernego dopasowania. Szczegółowe uzasadnienie wyłączenia Force Re-do GS Split można znaleźć w pliku uzupełniającym 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poczekaj, aż wszystkie zadania zakończą działanie, aby uzyskać wyniki. Na podstawie wyników potwierdza się, że stos cząstek przefiltrowany w 6. iteracji jest faktycznie optymalnym wynikiem. 
	UWAGA: To normalne, że uzyskane wyniki mają niewielkie losowe odchylenia od wyników podanych w tym protokole. Odchylenia te nie mają wpływu na ogólny wniosek.</li>
</ol>

Enhancing Cryo-EM Map Quality with CryoSieve Particle Selection

<ol><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., Mcmullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-em+particles%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-em particles.</a> elife. 2, 00461(2013).</li>
<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-em.</a> Nat Meth. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+tem%2C+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cis tem, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, e35383(2018).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relion%3A+Implementation+of+a+bayesian+approach+to+cryo-em+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Relion: Implementation of a bayesian approach to cryo-em structure determination.</a> J Str Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosparc%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-em+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Cryosparc: Algorithms for rapid unsupervised cryo-em structure determination.</a> Nat Meth. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resolution+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quart+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quart Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Wagner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphire-cryolo+is+a+fast+and+accurate+fully+automated+particle+picker+for+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphire-cryolo is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM.</a> Comm Biol. 2 (1), 218(2019).</li>
<li>Bepler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive-unlabeled+convolutional+neural+networks+for+particle+picking+in+cryo-electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Positive-unlabeled convolutional neural networks for particle picking in cryo-electron micrographs.</a> Nat Meth. 16 (11), 1153-1160 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deeppicker%3A+A+deep+learning+approach+for+fully+automated+particle+picking+in+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Deeppicker: A deep learning approach for fully automated particle picking in cryo-em.</a> J Str Biol. 195 (3), 325-336 (2016).</li>
<li>Heimowitz, A., Andén, J., Singer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apple+picker%3A+Automatic+particle+picking%2C+a+low-effort+cryo-em+framework%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Apple picker: Automatic particle picking, a low-effort cryo-em framework.</a> J Str Biol. 204 (2), 215-227 (2018).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+can+single-particle+cryo-em+become%3F+What+remains+before+it+approaches+its+physical+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">How good can single-particle cryo-em become? What remains before it approaches its physical limits.</a> Ann Rev Biophys. 48, 45-61 (2019).</li>
<li>Diiorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+%28cryo-em%29+processing+workflow+with+cryosparc%2C+relion%2C+and+scipion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion.</a> J Vis Exp. (179), e63387(2022).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minority+of+final+stacks+yields+superior+amplitude+in+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A minority of final stacks yields superior amplitude in single-particle cryo-em.</a> Nat Comm. 14 (1), 7822(2023).</li>
<li>Zhou, Y., Moscovich, A., Bendory, T., Bartesaghi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+particle+sorting+for+high-resolution+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Inv+Probl%22%5BJournal%5D)">Unsupervised particle sorting for high-resolution single-particle cryo-em.</a> Inv Probl. 36 (4), 044002(2020).</li>
<li>Méndez, J., Garduno, E., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+incorrectly+oriented+particles+in+cryo-em+single+particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of incorrectly oriented particles in cryo-em single particle analysis.</a> J Str Biol. 213 (3), 107771(2021).</li>
<li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-em+through+tilting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting.</a> Nat Meth. 14 (8), 793-796 (2017).</li>
<li>Rosenthal, P. B., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+determination+of+particle+orientation%2C+absolute+hand%2C+and+contrast+loss+in+single-particle+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimal determination of particle orientation, absolute hand, and contrast loss in single-particle electron cryomicroscopy.</a> J Mol Biol. 333 (4), 721-745 (2003).</li>
<li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+computational+methods+to+improve+the+interpretability+and+analysis+of+cryo-em+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Local computational methods to improve the interpretability and analysis of cryo-em maps.</a> Nat Comm. 12 (1), 1240(2021).</li>
<li>Stagg, S. M., Noble, A. J., Spilman, M., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reslog+plots+as+an+empirical+metric+of+the+quality+of+cryo-em+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Reslog plots as an empirical metric of the quality of cryo-em reconstructions.</a> J Str Biol. 185 (3), 418-426 (2014).</li>
<li>Vargas, J., Otón, J., Marabini, R., Carazo, J. M., Sorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+alignment+reliability+in+single+particle+electron+cryomicroscopy%3A+A+general+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Particle alignment reliability in single particle electron cryomicroscopy: A general approach.</a> Sci Rep. 6 (1), 21626(2016).</li>
<li>Vargas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+quality+assessment+and+sorting+for+automatic+and+semiautomatic+particle-picking+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Particle quality assessment and sorting for automatic and semiautomatic particle-picking techniques.</a> J Str Biol. 183 (3), 342-353 (2013).</li>
<li>Vargas, J., Melero, R., Gomez-Blanco, J., Carazo, J. -M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+3d+alignment+quality%3A+Its+impact+on+soft-validation%2C+particle+pruning+and+homogeneity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of 3d alignment quality: Its impact on soft-validation, particle pruning and homogeneity analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 6307(2017).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27sample+preparation+for+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard'sample preparation for single-particle cryo-em.</a> J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Sec+D%3A+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Sec D: Str Biol. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+can+cryo-em+become%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">How good can cryo-em become.</a> Nat Meth. 13 (1), 28-32 (2016).</li>
<li>Kim, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+cryo-em+single+particle+analysis+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow.</a> Front Mol Biosci. 5, 50(2018).</li>
<li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em.</a> Nat Meth. 18 (5), 463-471 (2021).</li>
</ol>

Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Cryo-EM jest kluczową techniką wyjaśniania struktur cząsteczek biologicznych. W tym procesie, po zebraniu danych za pomocą mikroskopii, niezbędna jest ekstrakcja cząstek z mikrofotografii, a następnie ich wieloetapowa klasyfikacja w celu skompilowania końcowego stosu. Częstym wyzwaniem jest przewaga uszkodzonych lub niepożądanie uformowanych cząstek, co podkreśla potrzebę wielokrotnej selekcji cząstek w celu uzyskania map gęstości o wysokiej rozdzielczości. To sprawia, że selekcja cząstek jest kluczowym krokiem w cryo-EM SPA w celu uzyskania wysokiej jakości map gęstości. Istniejące techniki selekcji cząstek obejmują statystyczny algorytm walidacji bez pochylenia22, podejście oparte na wskaźniku z23 oraz metodę szacowania dokładności kątowej24.
CryoSieve jawi się jako cenne narzędzie w tym kontekście, biegłe w eliminowaniu znacznej liczby obcych cząstek z końcowego stosu. Redukcja ta nie tylko zwiększa wydajność obliczeniową rekonstrukcji, ale także usprawnia proces. Oferuje kompleksowy pakiet do selekcji cząstek, w którym zakres odrzucania cząstek i wynikająca z tego poprawa rozdzielczości w dużej mierze zależą od początkowej jakości danych i metodologii zastosowanych w przetwarzaniu danych.
W tym manuskrypcie przedstawiliśmy kompletny przebieg przesiewania cząstek przy użyciu rzeczywistego zestawu danych trymerów hemaglutyniny grypy (wpis EMPIAR: 10097). Omówione i omówione tutaj kroki można podsumować jako przesiewanie cząstek i ponowną ocenę pozy. Ostateczna zrekonstruowana w 3D objętość osiągnęła rozdzielczość 3,62 A, a łańcuchy boczne w alfa-helisach były wyraźniejsze w objętości poddanej obróbce końcowej w porównaniu z opublikowaną mapą gęstości.
CryoSieve to metoda typu open source, która jest dostępna na GitHub (https://github.com/mxhulab/cryosieve). Szczegółowy samouczek można również znaleźć na jego stronie głównej. Użytkownicy mogą go zainstalować i używać, postępując zgodnie z samouczkiem. Dodatkowo dostępne są dwa moduły: cryosieve-csrefine i cryosieve-csrhbfactor. Moduł cryosieve-csrefine został specjalnie zaprojektowany, aby zautomatyzować sekwencyjne wykonywanie różnych operacji w CryoSPARC (plik uzupełniający 5). Operacje te obejmują importowanie stosów cząstek i przeprowadzanie zadań ab initio, jednorodnego lub niejednorodnego uszlachetniania. Z drugiej strony, moduł cryosieve-csrhbfactor został zaprojektowany w celu zautomatyzowania oznaczania czynnika B Rosenthala-Hendersona poprzez wykorzystanie możliwości cryosieve-csrefine (plik uzupełniający 6).
Obecnie zastosowanie tej metody ogranicza się do pojedynczych scenariuszy konformacji. W związku z tym, w przypadkach, gdy cząstki reprezentują wiele konformacji, ich możliwości są ograniczone. Zaleca się, aby użytkownicy początkowo zaangażowali się w klasyfikację 3D w celu posegregowania cząstek o różnych konformacjach przed zastosowaniem jej do wyrafinowanej selekcji cząstek. Co więcej, chociaż metoda ta wykazuje biegłość w odfiltrowywaniu ponad 50% cząstek z końcowego stosu, pochodzenie tych wyrzuconych cząstek i przyczyny ich znikomego wkładu w jakość rekonstrukcji pozostają niejasne. Ta luka w zrozumieniu wymaga dodatkowych badań, aby kompleksowo zająć się tym ograniczeniem i potencjalnie je naprawić.
Istnieją trzy możliwe metody sortowania cząstek lub przesiewania cząstek. Po pierwsze, cisTEM4 może raportować wynik dla każdego obrazu pojedynczej cząstki po udoskonaleniu 3D. Użytkownicy mogą sortować cząstki za pomocą wyniku cisTEM, aby odrzucić cząstki. Podejście oparte na spójności wykresu kątowego (AGC)17 jest również metodą odrzucania nieprawidłowo ustawionych cząstek. Co więcej, klasyfikacja niewspółosiowości5 jest tradycyjnym sposobem odrzucania cząstek przy użyciu klasyfikacji 3D. Porównaliśmy jakość cząstek zatrzymanych tymi metodami z CryoSieve i stwierdziliśmy, że zatrzymane cząstki CryoSieve są wyższej jakości15. Przedstawiona tutaj metoda znacznie przewyższa metody alternatywne i pozwala osiągnąć najmniejszą liczbę cząstek przy tej samej rozdzielczości.
Jak wykazano w wyniku, większość cząstek w końcowym stosie cryo-EM nie przyczynia się do rekonstrukcji mapy gęstości. Innymi słowy, spośród wszystkich cząstek zebranych podczas akwizycji obrazu, tylko kilka wybranych, a mianowicie najdrobniejszy podzbiór, faktycznie przyczynia się do ostatecznej rekonstrukcji. W związku z tym stosunek tego końcowego podzbioru do całkowitej liczby zebranych cząstek może służyć jako ilościowy miernik do oceny jakości próbki. Im wyższy ten stosunek, tym lepsza jakość próbki. Pomimo postępu technicznego, który sprawił, że cryo-EM stał się bardziej dostępny dla biologów strukturalnych, przygotowanie próbek pozostaje głównym wąskim gardłem w przepływie pracy. Naukowcy i inżynierowie koncentrują swoje wysiłki na tym wyzwaniu25. W analizie pojedynczych cząstek (SPA) przygotowanie próbki składa się z dwóch kluczowych etapów: optymalizacji próbki i przygotowania siatki. Pierwsza z nich polega na oczyszczeniu próbki przy zachowaniu jej optymalnego stanu biochemicznego. To ostatnie wiąże się z przygotowaniem próbki do analizy pod mikroskopem, w tym obróbką chemiczną lub plazmową siatki, osadzaniem próbki i witryfikacją. Zaproponowano wiele technik w celu rozwiązania problemu niestabilności makromolekularnej, ale skuteczność jednego podejścia w stosunku do drugiego zależy od charakterystyki próbki25,26. Obecnie na wyniki przygotowania siatki duży wpływ ma wiedza i doświadczenie użytkownika, co może sprawić, że proces ten będzie czasochłonny i wymagający 27,28. Liczne zmienne napotkane podczas przygotowywania próbki i siatki stanowią wyzwanie w ustaleniu związków przyczynowo-skutkowych, ponieważ naukowcy mogą ocenić próbkę tylko na poziomie molekularnym za pomocą mikroskopu. W rezultacie, nadal brakuje statystyk ilościowych pochodzących z porównań różnych protokołów przygotowania próbek i siatek, a systematyczne podejście jest niezbędne do zbadania trendów i zrozumienia podstawowych mechanizmów zachowania próbki29.

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) analiza pojedynczych cząstek (SPA) stała się dominującą metodą wyznaczania trójwymiarowych map gęstości makrocząsteczek biologicznych o wysokiej rozdzielczości. Dzięki serii innowacji technologicznych1,2,3,4,5,6, o nazwie resolution revolution7, cryo-EM ma zdolność określania struktur makrocząsteczek biologicznych z rozdzielczością do atomową w niespotykanym dotąd tempie. To przełomowe odkrycie wyznacza początek nowej ery w badaniach molekularnych, wyprzedzając krystalografię rentgenowską jako dominującą technikę i odpowiadając na odwieczne pytania biologiczne.
Cryo-EM SPA różni się od krystalografii rentgenowskiej, ponieważ nie wymaga krystalizacji makrocząsteczek biologicznych. Zamiast tego roztwór zawierający docelowe makrocząsteczki biologiczne jest szybko zamrażany w szklistym lodzie. Następnie jest obrazowany za pomocą wiązki elektronów w celu wytworzenia serii mikrofotografii, z pominięciem potrzeby krystalizacji8. Następnie algorytmy wybierania cząstek są wykorzystywane do wyodrębniania pojedynczych surowych cząstek z tych mikrofotografii4,9,10,11,12. Ponieważ cryo-EM nie zależy od krystalizacji, naturalne jest, że wyekstrahowane cząstki są w przeważającej mierze uszkodzone lub znajdują się w niepożądanych stanach konformacyjnych, co wymaga wielu rund selekcji cząstek w celu uzyskania mapy gęstości o wysokiej rozdzielczości. W przetwarzaniu obrazów cryo-EM SPA selekcja cząstek ma zatem kluczowe znaczenie dla uzyskania map gęstości o wysokiej rozdzielczości13.
W cryo-EM SPA, standardowe metody selekcji cząstek obejmują dwuwymiarową (2D) i trójwymiarową (3D) klasyfikację14. Klasyfikacja 2D kategoryzuje cząstki do predefiniowanej liczby grup, uzyskując średni obraz i szacunkową rozdzielczość 2D dla każdej klasy. Badacze mogą następnie wizualnie sprawdzić te klasy, usuwając cząstki z grup o niższej rozdzielczości, aby wykorzystać pozostałe w rekonstrukcjach mających na celu osiągnięcie wyższej rozdzielczości. rezolucja. Po ustaleniu pozycji cząstek za pomocą algorytmów udoskonalania, naukowcy przystąpią do klasyfikacji 3D, grupując cząstki w wiele klas. Umożliwia to wizualną kontrolę zrekonstruowanej mapy gęstości dla każdej klasy, co pozwala na wykluczenie niepożądanych cząstek, takich jak te pochodzące z niepożądanych konformacji. Po wielu rundach klasyfikacji uzyskuje się końcowy stos składający się ze stosunkowo wysokiej jakości cząstek. Te końcowe stosy odgrywają zasadniczą rolę w tworzeniu map gęstości o rozdzielczości atomowej lub prawie atomowej.
Zhu i jej koledzy wykazali, że na tych końcowych stosach można przeprowadzić dalszą selekcję cząstek15. CryoSieve15, innowacyjna iteracyjna metoda selekcji cząstek, może być zastosowana w celu poprawy jakości końcowej mapy gęstości poprzez znaczne zmniejszenie liczby cząstek. Podczas gdy inne kryteria sortowania cząstek i oprogramowanie, takie jak metoda znormalizowanej korelacji krzyżowej (NCC)16, podejście do spójności wykresu kątowego (AGC)17 i klasyfikacja bez wyrównania5, są obecnie używane w tej dziedzinie, wykazano, że ta metoda przewyższa te algorytmy pod względem skuteczności.
W tym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy przewodnik po całym procesie. Jako studium przypadku zastosowaliśmy tę nową metodę do zestawu danych trimera hemaglutyniny grypy (wpis EMPIAR: 10097)18, który zawiera 130 000 cząstek w końcowym stosie. Nasza procedura z powodzeniem odrzuciła około 73,8% cząstek z końcowego stosu tego zestawu danych, poprawiając rozdzielczość zrekonstruowanej mapy gęstości z 4,11 A do 3,62 A. Oprócz trimera hemaglutyniny grypy, wyniki z wielu zestawów danych przedstawiono we wcześniejszej publikacji15, prezentując różne rozdzielczości i masy cząsteczkowe biomolekuł.

<table><tbody><tr><td>CryoSPARC</td><td>Structura Biotechnology Inc. Toronto, Kanada</td><td></td><td>CryoSPARC (Cryo-EM Single Particle Ab-Initio Reconstruction and Classification) to najnowocześniejsze oprogramowanie HPC do kompleksowego przetwarzania danych z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) z pojedynczych cząstek. CryoSPARC jest przydatny do rozwiązywania struktur krio-EM białek błonowych, wirusów, kompleksów, elastycznych cząsteczek, małych cząstek, danych dotyczących płytek fazowych i danych dotyczących barwienia ujemnego.</td></tr><tr><td>EMPIAR-10097 Zestaw danych</td><td></td><td>https://ftp.ebi.ac.uk/empiar/world_availability/10097/data/Particle-Stack/T40_HA_130K-Equalized-Particle-Stack.mrcs</td><td>Ten zestaw danych zawiera dane krio-EM z pojedynczych cząstek trymera hemaglutyniny grypy, charakteryzujące się wysoce preferowaną orientacją, zebrane przy użyciu strategii zbierania pod kątem 40 stopni.</td></tr><tr><td>initial.mrc</td><td></td><td>https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097</td><td></td></tr><tr><td>mask.mrc</td><td></td><td>https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097</td><td></td></tr><tr><td>RELION</td><td></td><td>4.0-beta-2</td><td>RELION (REgularyzowany LIKkelihood OptimisatioN) to oprogramowanie typu open source do przetwarzania danych z mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), w szczególności do udoskonalania makromolekularnych Struktur. Wykorzystując podejście bayesowskie, doskonale radzi sobie z oddzielaniem sygnału od szumu, umożliwiając określenie struktury w wysokiej rozdzielczości. RELION obsługuje analizę pojedynczych cząstek, tomografię i uśrednianie subtomogramowe i stał się szeroko stosowany w biologii strukturalnej ze względu na swoją skuteczność i przyjazny dla użytkownika interfejs.</td></tr><tr><td>T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star</td><td></td><td>https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097</td><td>Plik metadanych dla końcowego stosu cząstek z EMPIAR-10097</td></tr></tbody></table>

ulepszanie map gęstości poprzez usuwanie większości cząstek z końcowych stosów kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Enhancing Density Maps by Removing the Majority of Particles in Single Particle Cryogenic Electron Microscopy Final Stacks

W ciągu ostatniej dekady, postęp w technologii i metodologii w dziedzinie kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM) analizy pojedynczych cząstek (SPA) znacznie poprawił naszą zdolność do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek biologicznych. Postęp ten zapoczątkował nową erę wglądu molekularnego, zastępując krystalografię rentgenowską jako dominującą metodę i dostarczając odpowiedzi na odwieczne pytania w biologii. Ponieważ cryo-EM nie zależy od krystalizacji, która jest istotnym ograniczeniem krystalografii rentgenowskiej, wychwytuje cząstki o różnej jakości. W związku z tym selekcja cząstek ma kluczowe znaczenie, ponieważ jakość wybranych cząstek ma bezpośredni wpływ na rozdzielczość zrekonstruowanej mapy gęstości. Innowacyjne, iteracyjne podejście do selekcji cząstek, nazwane CryoSieve, znacznie poprawia jakość zrekonstruowanych map gęstości poprzez skuteczne zmniejszenie liczby cząstek w końcowym stosie. Dowody eksperymentalne pokazują, że metoda ta może wyeliminować większość cząstek w końcowych stosach, co skutkuje znaczną poprawą jakości map gęstości. W tym artykule przedstawiono szczegółowy przepływ pracy tego podejścia i przedstawiono jego zastosowanie w rzeczywistym zestawie danych.

W niniejszym protokole wykorzystaliśmy zbiór danych trimeru hemaglutyniny grypy (wpis EMPIAR: 10097) jako demonstrację skuteczności tego procesu. Ze względu na preferowaną orientację próbki, pozyskiwanie danych wymagało nachylenia pod kątem 40°. Białko wykazuje symetrię C3 i posiada masę cząsteczkową 150 kDa.
Zastosowaliśmy opisany wcześniej protokół w celu przetworzenia końcowego stosu cząsteczek. W każdej iteracji sukcesywnie usuwano 20% cząsteczek, co skutkowało współczynnikiem retencji wynoszącym odpowiednio 80,0%, 64,0%, 51,2% i tak dalej. Jak przedstawiono w Rycina 1 i Rysunek 2rozdzielczość zatrzymanych cząsteczek początkowo uległa poprawie, lecz ostatecznie spadła. spośród iteracji, 6th stwierdzono, że ta iteracja stanowi najbardziej optymalny podzbiór, zawierający najmniejszą liczbę cząsteczek przy jednoczesnym osiągnięciu najwyższej rozdzielczości. Nasz algorytm pomyślnie wyłonił podzbiór cząsteczek obejmujący zaledwie 26,2% pierwotnego stosu, co pozwoliło na poprawę rozdzielczości z 4,19 Å do 3,62 Å (przypowiedziana przez CryoSPARC), przedstawione w Rycina 2Ponadto porównano mapy gęstości przed i po zastosowaniu CryoSieve w Rysunek 3Przedstawiono również krzywą korelacji powłok Fouriera (FSC) dla modelu i mapy oraz krzywą FSC dla połowicznych map zrekonstruowanych map gęstości przed i po zastosowaniu metody. (Rysunek 3A-B)Porównano również uzyskane surowe mapy gęstości oraz wyostrzone mapy gęstości, stosując równoważny poziom konturu. (Rycina 3C)Porównano łańcuchy boczne ostrych map gęstości, co wykazało poprawę zrekonstruowanych map gęstości. Do kryteriów oceny jakości cząsteczek przyjęto również szacowany czynnik B według metody Rosenthala-Hendersona.19Po usunięciu większości cząsteczek z końcowego stosu, czynnik B w równaniu Rosenthala-Hendersona wzrósł z 226,9 Å2 do 146,2 Å2 (Rysunek 3D)Lokalna rozdzielczość, lokalny czynnik B20, oraz ResLog21 wykorzystano również do porównania, co wskazuje, że CryoSieve rzeczywiście poprawia zarówno jakość map gęstości, jak i cząstek (Rycina 4).
<img alt="Wyniki komend terminala pokazujące końcowe wartości rozdzielczości, zrzut ekranu z analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66617/66617fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Rozdzielczości każdej iteracji. Zgłoszone rozdzielczości zostały zaznaczone czerwonymi ramkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/66617fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przebieg przetwarzania danych Cryo-EM; tabela stanu zadań; udoskonalanie cząsteczek; analiza strukturalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66617/66617fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Rozdzielczości każdej iteracji. Rozdzielczości wyznaczone w ramach zadań udoskonalania homogenicznego (homogeneous refinement) zostały zaznaczone czerwonymi ramkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/66617fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywe FSC, wykresy rozdzielczości GSFSC, porównanie map 3D, analiza czynnika B wg Rosenthala-Hendersona." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66617/66617fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Mapy gęstości. (A) Porównanie krzywej FSC modelu do mapy dla zrekonstruowanych map gęstości przed i po zastosowaniu CryoSieve. Oś y reprezentuje FSC, a oś x reprezentuje rozdzielczość. Czerwona przerywana linia oznacza próg 0,5 dla FSC. Pionowa przerywana linia ilustruje rozdzielczość map gęstości uzyskanych przy progu 0,5. (B) Krzywe FSC dla połowic map (half-maps) uzyskano z zrekonstruowanych map gęstości przed i po zastosowaniu CryoSieve za pomocą CryoSPARC. Oś y reprezentuje FSC, a oś x reprezentuje rozdzielczość. (C) Przedstawiono surowe mapy gęstości oraz wyostrzone mapy gęstości zarówno dla cząsteczek zachowanych przez CryoSieve, jak i dla pełnego zestawu cząsteczek w końcowych stosach. Dla surowych map gęstości zastosowano równoważny poziom konturu 0,65. Dla wyostrzonych map gęstości zastosowano równoważny poziom konturu 0,84. Wyostrzone mapy gęstości uzyskano bezpośrednio za pomocą CryoSPARC. Mapy te zostały poddane automatycznemu postprocesowaniu, najpierw przez ważenie FSC (na podstawie wartości FSC podanych przez CryoSPARC). Następnie czynnik B został wyostrzony przy użyciu automatycznie wyznaczonych czynników B (232,0 Å2 dla wszystkich cząsteczek w końcowym stosie i 160,8 Å2 dla CryoSieve). Porównano łańcuchy boczne na wyostrzonych mapach gęstości, wykorzystując modele atomowe jako odniesienie. Czerwone strzałki wskazują obszary o poprawionej jakości. (D) Przedstawiono szacowany czynnik B wg Rosenthala-Hendersona zarówno dla cząsteczek zachowanych przez CryoSieve, jak i dla pełnego zestawu cząsteczek w końcowych stosach. Oś y reprezentuje liczbę użytych cząsteczek, a oś x reprezentuje odwrotność kwadratu rozdzielczości. Przesuwając się z góry na dół, każdy punkt reprezentuje połowę liczby cząsteczek z punktu poprzedniego. Rozdzielczości wyznaczono poprzez rafinację. Czynniki B wyznaczono przy użyciu aproksymacji metodą najmniejszych kwadratów dla zmierzonych punktów, co pokazują krzywe dopasowania. Szacowane czynniki B wg Rosenthala i Hendersona wskazano w legendach: kolor pomarańczowy reprezentuje cząsteczki zachowane przez CryoSieve, natomiast kolor niebieski oznacza wszystkie cząsteczki w końcowym stosie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/66617fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Ocena struktury białek CryoSieve; wykresy porównawcze i modele z analizą danych rozdzielczości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66617/66617fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Porównanie różnych wskaźników map gęstości. (A) Porównanie map rozdzielczości lokalnej przed i po zastosowaniu CryoSieve uzyskanych za pomocą CryoSPARC. Rozdzielczość lokalna mieści się w zakresie od 7 Å (czerwony) do 3,5 Å (niebieski). (B) Porównanie map gęstości przed i po zastosowaniu CryoSieve, pokolorowanych za pomocą mapy lokalnego czynnika B uzyskanej programem LocBFactor przy zastosowaniu zakresu rozdzielczości [20-3,5] Å. (C) Porównanie wykresów ResLog przed i po zastosowaniu CryoSieve uzyskanych za pomocą CryoSPARC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/66617fig04large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Wykorzystanie poleceń nvidia-smi oraz conda -V do weryfikacji wymagań wstępnych. Jeśli wymagania wstępne są spełnione, wpisanie polecenia nvidia-smi wyświetli wersję sterownika GPU, wersję CUDA oraz status kart GPU. Podobnie, wprowadzenie polecenia conda -V powinno poprawnie wyświetlić zainstalowaną wersję Conda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Proces tworzenia nowych środowisk z akceleracją GPU.Ekran wyświetla wynik wygenerowany przez polecenie służące do utworzenia środowiska Conda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_2.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 3: Instalacja CryoSieve w środowisku z akceleracją GPU. Po aktywacji nowo utworzonego środowiska Conda na ekranie wyświetla się wynik wykonania polecenia instalacji CryoSieve za pomocą Pip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_3.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 4: Informacje pomocnicze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_4.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 5: Proces uruchamiania. Po uruchomieniu programu CryoSieve z poziomu wiersza poleceń, na ekranie wyświetlane są informacje dotyczące procesu wykonywania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_5.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek dodatkowy 6: Konfiguracja zadań w programie CryoSPARC. (A) Import stosu cząstek. (B) Import objętości 3D. (C-D) Rafinacja homogeniczna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_6.zip" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Opcje systemu CryoSieve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Czas przetwarzania i minimalne wymagania do uruchomienia programu Cryosieve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_2.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Generowanie modelu wstępnego za pomocą CryoSPARC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_3.pdf" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Uzasadnienie wyłączenia wymuszania ponownego wykonania podziału GS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_4.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 5: Opcje programu cryosieve-csrefine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_5.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 6: Opcje cryosieve-csrhbfactor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_6.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Zaawansowana metoda selekcji cząstek dla cryo-EM, a mianowicie CryoSieve, poprawia rozdzielczość mapy gęstości, usuwając większość cząstek z końcowych stosów, co zostało zademonstrowane poprzez jej zastosowanie na rzeczywistym zestawie danych.

Ulepszanie map gęstości poprzez usuwanie większości cząstek z końcowych stosów kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Over the past decade, advancements in technology and methodology within the field of cryogenic electron microscopy (cryo-EM) single-particle analysis ...

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa jest niezbędna do określania bliskich struktur atomowych lub mikrocząsteczek biologicznych. Pomimo tego, że opiera się na uśrednianiu wielu obrazów o niskim poziomie sygnału do szumu, optymalna liczba cząstek potrzebnych do uzyskania określonej rozdzielczości pozostaje nieznana. To ograniczenie hamuje postęp w metodach analizy i przygotowania próbek.Aby temu zaradzić, wprowadzamy metodę sortowania iteracyjnego. Standardowy wybór postępu obejmuje klasyfikację dwuwymiarową i trójwymiarową. Obecnie stosowane są inne kryteria sortowania postępu, takie jak metoda znormalizowanej korelacji krzyżowej, podejście oparte na spójności wykresu kątowego i klasyfikacja niewyrównania.Szeroko zakrojone eksperymenty pokazują, że CryoSieve przewyższa inne algorytmy solenia cząstek cryo EM, ujawniając, że większość cząstek jest niepotrzebna w końcowych stosach. Mniejszość cząstek pozostających w końcowych stosach daje amplitudę o bardzo wysokiej rozdzielczości na zrekonstruowanych mapach gęstości. W przypadku niektórych zestawów danych rozmiar końcowego podzbioru zbliża się do teoretycznego limitu.W przygotowywaniu próbek cryo EM, w tym procesie pracy, ze względu na brak standardowych wskaźników do porównywania protokołów, stosunek wybranych do pobranych cząstek może służyć jako wskaźnik jakości, badanie ich rozkładu przestrzennego i czasowego może również podkreślić kluczowe, fizyczne czynniki wpływające na skuteczność przygotowania. Aby skonfigurować środowisko akceleracji GPU, otwórz terminal i wprowadź polecenie nvidia.smi. Sprawdź, czy polecenie pomyślnie wyświetla wszystkie informacje o karcie procesora graficznego i czy wersja CUDA jest wyższa niż 10.2.Następnie wykonaj polecenie conda V, aby potwierdzić instalację Conda. Wprowadź następujące polecenie, aby skonfigurować środowisko wirtualne i poczekaj kilka minut, aż środowisko zostanie pomyślnie skonfigurowane. Wykonaj polecenie conda activate CRYOSIEVE_ENV, aby aktywować nowo utworzone środowisko wirtualne.Aby zainstalować CryoSieve, uruchom polecenie install cryosieve. Po instalacji wprowadź polecenie cryosieve h, aby upewnić się, że informacje pomocy są wyświetlane poprawnie. Z NPR pobierz końcowy zestaw danych stosu NPR 10097.Otwórz usługę GitHub, a następnie pobierz plik gwiazdki i maskę. mrc oraz początkowy plik mrc. Umieść wszystkie te pliki w folderze razem.Otwórz terminal i użyj ścieżki pliku CD polecenia, aby przejść do folderu zawierającego zestaw danych. Następnie wprowadź polecenie conda activate CRYOSIEVE_ENV , aby aktywować środowisko Conda. Użyj następującego polecenia, aby rozpocząć przesiewanie cząstek.Monitoruj wyświetlacz terminala pod kątem dzienników wyjściowych dla każdej iteracji. Wprowadź wskazane polecenie, aby wydrukować wyniki rozdzielczości dla 10 iteracji przesiewania. Stos cząstek przefiltrowany w siódmej iteracji ma najwyższą rozdzielczość, przy czym najmniejsza liczba cząstek pokazuje optymalny wynik.Aby zaimportować przesiane cząstki, otwórz interfejs sieciowy CryoSPARC. Wejdź do obszaru roboczego i kliknij przycisk kreatora w prawym górnym rogu panelu. Następnie wybierz i kliknij opcję importuj stos cząstek.W sekcji parametrów panelu importu stosu cząstek określ metaścieżkę cząstki jako plik _. nstar z folderu wyjściowego oraz ścieżkę danych cząstek do folderu zawierającego plik MRCS. Kliknij przycisk zadania Q, a następnie przycisk Q, aby rozpocząć proces.W prawym górnym panelu CryoSPARC kliknij przycisk konstruktora, a następnie wybierz i kliknij opcję importu woluminów 3D. Określ ścieżkę danych woluminu jako początkowy plik MRC. Kliknij przycisk zadania Q, a następnie przycisk Q, aby rozpocząć proces.Ponownie kliknij przycisk konstruktora i wybierz opcję jednorodnego udoskonalenia. W panelu głównym po lewej stronie otwórz zadanie importowania stosu cząstek czwartej iteracji. Przeciągnij moduł zaimportowanych cząstek z prawej strony panelu głównego i upuść go w sekcji stosów cząstek w kreatorze.Kliknij czerwony znak X, aby zamknąć zadanie importu stosu cząstek. Otwórz zadanie importowania woluminów 3D. Przeciągnij moduł zaimportowanych woluminów z prawej strony panelu głównego i upuść go w początkowej sekcji woluminu kreatora.W folderze parameters znajdź opcję symetrii i ustaw ją na C3. Znajdź i wyłącz opcję wymuszonego ponownego wykonania podziału GS. Kliknij przycisk zadania Q, a następnie przycisk kolejki, aby zainicjować jednorodne zagęszczenie. Po zakończeniu wszystkich zadań przejrzyj wyniki i potwierdź, że stos cząstek przefiltrowany w szóstej iteracji zapewnił optymalny wynik.Pokazany jest model do mapowania i półmapy krzywych korelacji powłoki zrekonstruowanych map gęstości dla zestawu danych hemaglutyniny i trimera grypy przed i po metodzie. Surowe i ostre mapy gęstości porównano również z zastosowanym równoważnym poziomem konturu. Ulepszenie zrekonstruowanych map gęstości jest widoczne w porównaniu łańcuchów bocznych na ostrych mapach.Po usunięciu większości cząstek w końcowym stosie, współczynnik B Rosenthala-Hendersona wzrósł z 226,9 angstrema kwadratowego do 146,2 angstrema kwadratowego Parametry takie jak lokalna rozdzielczość, lokalny współczynnik B i res log wskazują, że CryoSieve poprawia zarówno jakość map gęstości, jak i cząstek.

enhancing-density-maps-removing-majority-particles-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Analiza pojedynczych cząstek w mikroskopii krioelektronowej jest jedną z głównych technik używanych do określania struktury zespołów biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Scipion dostarcza narzędzia do stworzenia całego procesu przetwarzania informacji uzyskanych przez mikroskop i uzyskania rekonstrukcji 3D próbki biologicznej.

Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

Obecny protokół opisuje uogólniony i łatwy do wdrożenia schemat zbierania danych o pojedynczych cząstkach w eksperymentach kriogenicznych. Taka procedura jest szczególnie przydatna do uzyskania wysokiej jakości mapy EM dla próbek cierpiących na odchylenie preferencyjnej orientacji ze względu na przyleganie do granicy faz powietrze-woda.

Zbieranie danych Cryo-EM z pojedynczymi cząstkami z pochyleniem stolika przy użyciu Leginon

Zastosowanie warstw nośnych do siatek kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) może zwiększyć gęstość cząstek, ograniczyć interakcje z interfejsem powietrze-woda, zredukować ruch wywołany wiązką i poprawić rozkład orientacji cząstek. W artykule opisano solidny protokół powlekania siatek krioEM monowarstwą grafenu w celu lepszego przygotowania próbek kriogenicznych.

Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Przedstawiamy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, służący do wizualizacji fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Poprzez znakowanie cząsteczek wirusowych fluoroforami, które różnicowo barwią błonę wirusa oraz jego wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia się porów.

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Poznaj metodę CryoSieve do selekcji cząstek w kriogenicznej mikroskopii elektronowej, która poprawia rozdzielczość map gęstości poprzez eliminację zbędnych cząstek z końcowych stosów.

Ulepszanie map gęstości poprzez usuwanie większości cząstek z końcowych stosów kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszanie map gęstości poprzez usuwanie większości cząstek z końcowych stosów kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Przeglądaj więcej filmów