Hodowla desmoplastycznych trójwymiarowych sferoid raka trzustki z kokultury
27 września 2024
Rak trzustki pozostaje jednym z najtrudniejszych nowotworów do leczenia. Dlatego tak ważne jest, aby modele przedkliniczne oceniające skuteczność leczenia były powtarzalne i istotne klinicznie. Protokół ten opisuje prostą procedurę kohodowli w celu wygenerowania powtarzalnych, klinicznie istotnych sferoid desmoplastycznych.
Hodowle sferoidalne 3D są coraz częściej wykorzystywane do udzielania odpowiedzi na mechanistyczne pytania dotyczące wzrostu guza i służą do badań przesiewowych nowych terapii. Dlatego tak ważne jest, aby modele te były klinicznie reprezentatywne. Skupiamy się na odtworzeniu desmoplazji obserwowanej w wielu nowotworach, w tym raku trzustki, przy użyciu tej techniki.
Kultury sferoidalne ewoluowały, aby włączyć komórki pochodzące od pacjentów, złożone współkultury z komórkami odpornościowymi i struktury fizjologiczne, takie jak naczynia krwionośne. Ponadto technologia mikroprzepływowa jest wykorzystywana do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i tworzenia systemów narządów na chipie. Profilowanie multiomiczne w sferoidach jest teraz wykorzystywane do uzyskiwania wglądu w mechanizmy mechaniczne.
Opisana metoda może być wykorzystana do stworzenia powtarzalnych sferoid 3D z kokulturą za pomocą wytrzymałego ECM, wolnego od syntetycznych materiałów matrycowych. Zaletą jest to, że ECM ściśle replikuje guzy kliniczne bez ingerencji odpowiedniej matrycy syntetycznej w zastosowania terapeutycznych badań przesiewowych. Model ten umożliwi ocenę odpowiedzi ECM na terapie i odpowie na ważne pytania mechanistyczne dotyczące dynamicznej bariery, jaką ECM stanowi w wielu nowotworach.
Planujemy rozszerzyć ten model o komponenty komórek odpornościowych i makrofagów, a także rozszerzyć model używany do zrozumienia ECM jako bariery dla terapii i chorób innych niż rak, takich jak ziarniniaki gruźlicy. Na początek uzyskaj hodowlę komórkową PANC-1 i umyj komórki dziewięcioma mililitrami zbalansowanego roztworu soli Hanksa w odstępach co trzy mililitry. Inkubuj komórki z dwoma mililitrami trypsyny przez około 10 minut.
Aby zneutralizować zawiesinę, dodaj trzy mililitry DMEM uzupełnione 10% FBS. Po siedmiokrotnym umyciu komórek pożywką z przyrostami jednego mililitra, zbierz każdą zneutralizowaną podwielokrotność w 15-mililitrowej probówce. Podobnie, uzyskaj trypsynizowane ludzkie komórki gwiaździste trzustki lub HPaSteC, używając roztworu neutralizującego trypsynę i pożywki z komórek gwiaździstych.
Wymieszaj wymaganą ilość obu zawiesin komórkowych w 11 mililitrach DMEM z 10% FBS, unikając tworzenia się piany. Delikatnie dozuj 100 mikrolitrów mieszanki zawiesiny komórkowej do płytki hodowlanej i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Trzeciego dnia dodaj 50 mikrolitrów DMEM z 10% FBS do każdego dołka wzdłuż boku studni.
W dniu 10 lub 11 odessać zużyte podłoże bez naruszania roztworu w pobliżu halo i dodać 100 mikrolitrów świeżej pożywki wzdłuż boku każdej studzienki. W dniu 14 lub 17, używając pipety o pojemności jednego mililitra, usuń pożywkę z każdej studzienki, aż do osiągnięcia halo. Dopasuj płytkę do tła okapu, aby zlokalizować sferoidy na dole.
Delikatnie odpipetować około 50 mikrolitrów pożywki w pobliżu sferoidy, aby przeszkodzić jej w gromadzeniu się. Stwierdzono, że sferoidy uzyskane w 14 dniu dorastają do średniej objętości 0,048 milimetra sześciennego.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje procedurę kokultury w celu stworzenia sferoidów desmoplastycznych, które są istotne klinicznie i powtarzalne w badaniach nad rakiem trzustki. Wykorzystanie 3D kultur sferoidalnych umożliwia badania mechanizmów wzrostu guza oraz przesiewy terapeutyczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Onkologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Rak trzustki jest trudny do leczenia ze względu na swój agresywny charakter.
- Desmoplazja jest częstą cechą wielu nowotworów, w tym raka trzustki.
- Kultury sferoidów 3D mogą obejmować komórki pochodzące od pacjentów oraz komórki odpornościowe.
- Technologia mikroprzepływowa zwiększa możliwości wysokoprzepustowego przesiewu.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnego modelu do badania raka trzustki.
- Ocena skuteczności leczenia w kontekście klinicznie istotnym.
- Odtworzenie desmoplastycznego środowiska guzów.
Zastosowane metody
- Procedury kokultury w celu generowania sferoidów.
- Integracja komórek pochodzących od pacjentów oraz komórek odpornościowych.
- Wykorzystanie technologii mikroprzepływowej do skriningu.
- Profilowanie multiomiczne w celu uzyskania wglądu w mechanizmy działania.
Główne wyniki
- Skuteczne wytworzenie sferoidów desmoplastycznych.
- Wykazanie istotności w kontekście klinicznego środowiska raka trzustki.
- Umożliwienie wysokoprzepustowego przesiewu terapeutyków.
- Uzyskanie wiedzy na temat mechanizmów wzrostu guza.
Wnioski
- Procedura kokultury stanowi cenne narzędzie w badaniach nad rakiem trzustki.
- Trójwymiarowe modele sferoidalne mogą pogłębić zrozumienie biologii nowotworów.
- Podejście to może prowadzić do opracowania lepszych strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Desmoplastyczne sferoidy raka trzustki 3D generowane z kokultury stanowią klinicznie istotny i powtarzalny model, który ściśle naśladuje mikrośrodowisko guza, w tym barierę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). System ten umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka i zwiększenie wiarygodności prognostycznej w badaniach przesiewowych terapeutyków, rozwiązując krytyczny problem braku przełożenia modeli przedklinicznych na wyniki kliniczne. Zgodność modelu z klinicznymi cechami nowotworu wspiera decyzje dotyczące portfela projektów z uwzględnieniem ryzyka we wczesnej fazie odkrywania leków oraz w badaniach przedklinicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w kontekście ECM istotnym dla danej choroby.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez odtworzenie klinicznej desmoplazji.
- Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego w przypadku terapii kandydackich celujących w mikrośrodowisko guza.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie wprowadzania związków na kolejne etapy rozwoju.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zestandaryzowany, bezrusztowianowy system 3D do ilościowej oceny odpowiedzi na leki.
- Gwarantuje powtarzalność i skalowalność w zastosowaniach do wysokoprzepustowych analiz przesiewowych.
- Generuje stabilne komponenty ECM, umożliwiając wiarygodną ocenę czynników celujących w ECM.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań nad mechanizmami działania i skutecznością.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Usprawnia dopasowanie modeli przedklinicznych do cech ECM guza w warunkach klinicznych w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera odkrywanie i walidację biomarkerów w środowisku istotnym fizjologicznie.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o dane o wartości prognostycznej klinicznie, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Ułatwia badania mechanistyczne nad ECM jako barierą w terapii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model sferoidów z kokultury łączy wczesną fazę odkryć, identyfikację związków wiodących oraz walidację przedkliniczną, zapewniając istotną klinicznie platformę do testowania hipotez i przesiewania leków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w desmoplastycznym mikrośrodowisku.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki oceny związków w odniesieniu do sferoidów bogatych w ECM.
- Analityka: Umożliwia pomiar objętości sferoidów i składu ECM w celu porównania odpowiedzi terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Zachowuje spójność z klinyczną charakterystyką guza na potrzeby badań nad biomarkerami i skutecznością.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje reużywalną, zestandaryzowaną platformę, którą można dostosować do dodatkowych typów komórek i modeli chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w opracowywaniu terapii celowanych w ECM.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność dla międzyfunkcyjnych zespołów badawczo-rozwojowych (R&D).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostosowanie modeli przedklinicznych do wyników klinicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów o wyższym potencjale translacyjnym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach 3D hodowli komórkowych oraz kokulturach.
- Wymaga dostępu do infrastruktury obrazowania i analiz ilościowych w celu oceny sferoidów.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności w ramach kampanii przesiewowych.
- Możliwość adaptacji do dodatkowych typów komórek lub modeli chorobowych po optymalizacji protokołu.
- Ograniczone do kontekstów nowotworowych bogatych w ECM, zgodnie z aktualnymi danymi walidacyjnymi.
