Name: Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj metody konstrukcji syntetycznych komórek poprzez rekonstytucję białek błonowych i enkapsulację enzymów w pęcherzykach lipidowych. Techniki te umożliwiają budowę sieci metabolicznych zdolnych do autonomicznego wzrostu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Adityi Iyerowi za klonowanie genu pBAD-PercevalHR oraz Gei Schuurman-Wolters za pomoc w produkcji i oczyszczaniu białek. Badania zostały sfinansowane w ramach programu NWO Gravitation "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).

Lipid Vesicle Encapsulation Protocol for Complex Protein Networks

<ol><li>Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+bottom-up+assembly+of+molecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems.</a> Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).</li>
<li>Ivanov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+synthesis+of+artificial+cells%3A+recent+highlights+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges.</a> Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).</li>
<li>Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industrial+biomanufacturing%3A+The+future+of+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Industrial biomanufacturing: The future of chemical production.</a> Science. 355 (6320), (2017).</li>
<li>Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+synthetic+biology+platform+for+emerging+industrial+biomanufacturing%3A+Bottom-up+pathway+design%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Syst+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design.</a> Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).</li>
<li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-target+and+glucose-responsive+polymersomes+toward+mimicking+endogenous+insulin+secretion+with+improved+hepatic+glucose+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization.</a> Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168(2020).</li>
<li>Kanter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+production+of+scFv+fusion+proteins%3A+an+efficient+approach+for+personalized+lymphoma+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines.</a> Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).</li>
<li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology and personalized medicine.</a> Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).</li>
<li>Schwille, P., Frohn, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+protein+functions+and+what+they+may+teach+us%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hidden protein functions and what they may teach us.</a> Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).</li>
<li>Sachsenmeier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industry+5.0-The+relevance+and+implications+of+bionics+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology.</a> Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).</li>
<li>Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).</li>
<li>Godoy-Hernandez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+stable+membrane+reconstitution+by+LAiR+enables+the+study+of+physiological+integral+membrane+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions.</a> ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).</li>
<li>Sikkema, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+by+ionic+strength+and+safety+check+by+cyclic-di-AMP+in+the+ABC+transporter+OpuA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA.</a> Sci Adv. 6 (47), 7697(2020).</li>
<li>Foucaud, C., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactose+transport+system+of+Streptococcus+thermophilus.+Functional+reconstitution+of+the+protein+and+characterization+of+the+kinetic+mechanism+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport.</a> J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).</li>
<li>Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+on+solubilization+and+lipid+reconstitution+of+Na%2CK-ATPase%3A+enzyme+kinetic+and+biophysical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization.</a> Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).</li>
<li>Simidjiev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+large%2C+ordered+lamellae+from+non-bilayer+lipids+and+integral+membrane+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).</li>
<li>Harris, N. J., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+and+stability+of+membrane+transport+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Folding and stability of membrane transport proteins in vitro.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).</li>
<li>Jackson, M. L., Litman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-egg+phosphatidylcholine+reconstitution+by+an+octyl+glucoside+dilution+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).</li>
<li>Szoka, F., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+preparation+of+liposomes+with+large+internal+aqueous+space+and+high+capture+by+reverse-phase+evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation.</a> Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).</li>
<li>Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1">https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1</a> (2023).</li>
<li>Lee, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+artificial+organelles+sustain+and+control+ATP-dependent+reactions+in+a+protocellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system.</a> Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).</li>
<li>Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%A9l%C3%A9ard%2C+P+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. , Elsevier. 161-176 (2009).</li>
<li>Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+transmembrane+protein%2C+the+voltage-gated+ion+channel%2C+KvAP%2C+into+giant+unilamellar+vesicles+for+microscopy+and+patch+clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies.</a> J. Vis. Exp. (95), e52281(2015).</li>
<li>Doeven, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li>
<li>Pols, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+metabolic+network+for+physicochemical+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis.</a> Nat Commun. 10 (1), 4239(2019).</li>
<li>Bailoni, E., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+recycling+fuels+sustainable+glycerol+3-phosphate+formation+in+synthetic+cells+fed+by+dynamic+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis.</a> ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).</li>
<li>Van Der Heide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+osmotic+signal+and+osmosensing+mechanism+of+an+ABC+transport+system+for+glycine+betaine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine.</a> EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).</li>
<li>Van'T Klooster, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipid+requirements+of+the+lysine+transporter+Lyp1+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae.</a> J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).</li>
<li>Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microfluidic-based+approach+to+formulate+size-tuneable+large+unilamellar+cationic+liposomes%3A+Formulation%2C+cellular+uptake+and+biodistribution+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).</li>
<li>Weiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+bottom-up+assembly+of+mechanically+stabilized+synthetic+cells+by+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics.</a> Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).</li>
<li>Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymology+of+the+pathway+for+ATP+production+by+arginine+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown.</a> FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).</li>
<li>Yandrapalli, N., Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+capacity+microfluidic+trapping+of+giant+vesicles+for+high-throughput+membrane+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies.</a> Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).</li>
<li>Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459">http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459</a> (2019).</li>
<li>Elias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+characterization+of+biomimetic+membrane+mechanics+with+an+on-chip+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+Nano+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette.</a> Micro Nano Eng. 8, 100064(2020).</li>
<li>Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+trapping+of+giant+unilamellar+vesicles+to+study+transport+through+a+membrane+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore.</a> Biomicrofluidics. 7 (4), 044105(2013).</li>
<li>Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+Pressure+Enables+High-Yield+Assembly+of+Giant+Vesicles+in+Solutions+of+Physiological+Ionic+Strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths.</a> Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).</li>
<li>Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4 (1), 2550(2013).</li>
<li>Setyawati, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+dynamically+interacting+integral+membrane+subunits+of+energy-coupling+factor+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters.</a> eLife. 9, e64389(2020).</li>
<li>Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+coffee+ring+effect+for+a+defect-free+electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles.</a> Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).</li>
<li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+liposomes+from+spin-coated+films+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiamy protokół syntezy białka (błonowego) zawierającego pęcherzyki lipidowe o rozmiarach submikrometrowych (proteoLUVs) oraz konwersji proteoLUV w pęcherzyki gigantyczno-unimelarne (proteoGUVs). Protokół powinien mieć zastosowanie do rekonstytucji innych białek błonowych 13,19,30,40 i enkapsulacji sieci metabolicznych innych niż przedstawione tutaj szlaki rozkładu L-argininy i syntezy 3-fosforanu glicerolu.
Rekonstytucja białek błonowych w liposomach na ogół daje losową orientację białek w błonie lipidowej. W przypadku ArcD i Glpt orientacja nie ma znaczenia, ponieważ białka działają dwukierunkowo, a substancje rozpuszczone poruszają się w zależności od znaku całkowitego potencjału elektrochemicznego. W przypadku białek, które funkcjonują w jednym kierunku, połowa cząsteczek nie będzie dostępna do aktywności, gdy ich orientacja wynosi 50/50.
Wytłaczanie pęcherzyków przez filtr poliwęglanowy zawęża rozkład wielkości, a pęcherzyki stają się tym bardziej jednorodne, im mniejsza jest wielkość porów filtrów. Jednak mniejsze pęcherzyki mają cenę mniejszej objętości, a tym samym bardzo małej liczby białek (enzymów, białek błonowych) na pęcherzyk. Aby zminimalizować frakcję LUV, w których brakuje jednego lub więcej składników, stężenie białek można dostosować, jak pokazano na rysunku 3A, B, ale przy bardzo małych pęcherzykach efekty stochastyczne są nieuniknione.
Metoda pęcznienia wspomaganego żelem polega na osadzaniu się sonikowanych pęcherzyków (SUV) na wysuszonej powierzchni agarozy. Podczas procesu suszenia tworzy się gradient stężeń pęcherzyków, a stężenie lipidów jest najwyższe na obrzeżach plamki. Wynika to ze zjawiska znanego jako efekt plamy z kawy41,42. W rezultacie, tylko niewielki obszar w plamie zawiera stężenie lipidów odpowiednie do tworzenia GUV. Okrągłe nierównomiernie skoncentrowane plamki lipidowe powodują powstawanie dużych, nieużywanych obszarów, które nie są dostępne do fuzji pęcherzyków; w związku z tym efektywność tworzenia GUV staje się niska w tym podejściu. Aby zwiększyć wydajność GUV, należy dążyć do równomiernego osadzania lipidów, co można osiągnąć poprzez powlekanie wirowe42 lub wykorzystanie efektu plamy z kawy41.
Dalsze uwagi dotyczące protokołu:
Należy zadbać o to, aby w każdym pęcherzyku odtworzyć średnio kilka białek błonowych (>10), aby uniknąć efektów stochastycznych. Dlatego unikaj proporcji lipidów do białek wyższych niż 400:1 w/w. W przypadku większości białek przyjmuje się losową orientację.
Idealnie, objętość całkowitych białek błonowych jest jak najmniejsza i i tak nie przekracza 10-20% objętości liposomów. Dodanie większych objętości wprowadzi więcej detergentu, a większość wstępnie uformowanych liposomów może ulec lizie, co może mieć negatywny wpływ na skuteczność rekonstytucji.
Wstępna równowaga wytłaczarki z odpowiednim roztworem jest ważna, aby uniknąć rozcieńczenia składników podczas enkapsulacji. Idealnie byłoby, gdyby roztwór do wstępnej równowagi zawierał również rozpuszczalne enzymy, ale włączenie enzymów może być zbyt kosztowne ze względu na stosunkowo dużą objętość potrzebną do wstępnej równowagi wytłaczarki. Dlatego zazwyczaj pomijamy te składniki i akceptujemy 5% rozcieńczenie enzymów.
Jonowory należy dodawać do mieszanin zawierających proteoliposomy, ponieważ cząsteczki są wysoce hydrofobowe i mogą adsorbować się na powierzchniach, jeśli nie ma pęcherzyków. Należy zwrócić uwagę, aby objętość dodawanego rozpuszczalnika była mała (<1% całkowitej objętości reakcji). Kontrole przeprowadza się w celu sprawdzenia, czy rozpuszczalniki nie wpływają na sieci metaboliczne w pęcherzykach. Stężenia jonoforów wynoszące około 1 μM są ogólnie bezpieczne dla całkowitych stężeń lipidów ~3 mg/ml.
Należy zadbać o dokładne wysuszenie kropel. Jeśli kropelki nie są wystarczająco suche, tworzenie GUV jest mniej wydajne, ponieważ lipidy tworzą agregaty lipidowe, a MLV mogą tworzyć się po dodaniu roztworu pęczniejącego.
Glukoza służy do dopasowania osmolarności podłoża zewnętrznego do wewnętrznego; ten ostatni zawiera sacharozę zamiast glukozy, aby zwiększyć gęstość pęcherzyków, a tym samym ułatwić sedymentację GUV. Co więcej, glukoza w środowisku zewnętrznym wzmacnia kontrast fazowy, dzięki czemu pęcherzyk jest lepiej widoczny.
Efekty stochastyczne są znacznie mniejszym problemem w przypadku GUV; Ale w tym przypadku stosunek powierzchni do objętości może stać się niedopuszczalnie niski, tak że liczba białek błonowych (np. transporterów) staje się ograniczająca dla wewnętrznej sieci metabolicznej. Metoda opisana w tym protokole nie pozwala na precyzyjną kontrolę wielkości proteoGUV, ale większość z nich mieści się w zakresie wielkości 5-50 μm.
Podsumowując, prezentowana praca zapewnia kompleksowy przegląd rekonstytucji białek błonowych i enkapsulacji enzymów w pęcherzykach lipidowych o różnych rozmiarach. Pokazujemy budowę funkcjonalnych pęcherzyków do syntezy ATP oraz bloków budulcowych z prostych prekursorów, takich jak aminokwasy i glicerol. Rekonstytucja białek błonowych w GUV pozostaje wyzwaniem, ale przedstawione tutaj protokoły torują drogę do dalszych postępów w oddolnych badaniach biologii syntetycznej.

Dziedzina syntetycznej biologii oddolnej (bottom-up) koncentruje się na konstruowaniu (minimalnych) komórek1,2 oraz metabolicznych bioreaktorów do celów biotechnologicznych3,4 lub biomedycznych5,6,7,8. Konstrukcja syntetycznych komórek dostarcza unikalnej platformy, która pozwala badaczom na studiowanie białek (błonowych) w ściśle określonych warunkach naśladujących środowiska natywne, co umożliwia odkrywanie właściwości emergentnych oraz ukrytych funkcji biochemicznych białek i sieci reakcji9. Jako krok pośredni w kierunku autonomicznie funkcjonującej komórki syntetycznej, opracowywane są moduły odwzorowujące kluczowe cechy żywych komórek, takie jak metaboliczna konserwacja energii, synteza białek i lipidów oraz homeostaza. Takie moduły nie tylko poszerzają naszą wiedzę o życiu, ale mają również potencjalne zastosowania w medycynie8 i biotechnologii10.
Białka transbłonowe stanowią centrum niemal każdej sieci metabolicznej, ponieważ transportują cząsteczki do wnętrza komórki lub na zewnątrz, przekazują sygnały, reagują na jakość środowiska oraz pełnią liczne role biosyntetyczne. W związku z tym inżynieria modułów metabolicznych w komórkach syntetycznych wymaga w większości przypadków rekonstytucji integralnych i/lub peryferyjnych białek błonowych w dwuwarstwie lipidowej składającej się ze specyficznych lipidów i charakteryzującej się wysoką integralnością (niską przepuszczalnością). Praca z tymi białkami błonowymi jest trudna i wymaga specjalistycznej wiedzy oraz umiejętności eksperymentalnych.
Opracowano wiele metod rekonstytucji białek błonowych w pęcherzykach fosfolipidowych, najczęściej w celu zbadania funkcji11,12, regulacji13, właściwości kinetycznych14,15, zależności od lipidów15,16 i/lub stabilności17 konkretnego białka. Metody te obejmują szybkie rozcieńczanie białka solubilizowanego detergentem w środowisku wodnym w obecności lipidów18, usuwanie detergentów poprzez inkubację białka solubilizowanego detergentem z pęcherzykami lipidowymi destabilizowanymi detergentem i absorpcję detergentów na kuleczkach polistyrenowych19 lub usuwanie detergentów za pomocą dializy lub chromatografii wykluczania cząsteczkowego20. Do tworzenia pęcherzyków lipidowych stosowano rozpuszczalniki organiczne, na przykład poprzez tworzenie międzyfaz olej-woda21, jednak większość integralnych białek błonowych ulega inaktywacji po wystawieniu na działanie takich rozpuszczalników.
W naszym laboratorium białka błonowe rekonstruujemy głównie metodą absorpcji detergentu w celu utworzenia dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUVs)19. Metoda ta pozwala na jednoczesną rekonstrukcję wielu białek błonowych oraz enkapsulację enzymów, metabolitów i sond w świetle pęcherzyka22,23. LUVs zawierające białka błonowe mogą zostać przekształcone w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs), z enkapsulacją lub bez enkapsulacji komponentów rozpuszczalnych w wodzie, wykorzystując elektroformowanie24 lub pęcznienie wspomagane żelem25 przy zastosowaniu specyficznych warunków w celu zachowania integralności białek błonowych26.
Niniejsza praca przedstawia protokół rekonstrukcji w LUV pozarównowagowej sieci metabolicznej, która regeneruje ATP poprzez rozkład L-argininy do L-ornityny27. Tworzenie ATP jest sprzężone z produkcją glicerolo-3-fosforanu (G3P), który stanowi istotny budulec dla syntezy fosfolipidów22,28. Ścieżka metaboliczna składa się z dwóch białek integralnych błony: antyportera argininy/ornityny (ArcD) oraz antyportera G3P/Pi (GlpT). Ponadto do recyklingu ATP wymagane są trzy enzymy rozpuszczalne (ArcA, ArcB, ArcC), a GlpK jest wykorzystywany do przekształcania glicerolu w glicerolo-3-fosforan przy użyciu ATP pochodzącego z rozkładu L-argininy; schematyczny przegląd tej ścieżki przedstawiono na Ryc. 1. Protokół ten stanowi dobry punkt wyjścia do przyszłej konstrukcji jeszcze bardziej złożonych sieci reakcji – służących do syntezy lipidów lub białek bądź do podziału komórek. Skład lipidowy pęcherzyków wspiera aktywność szerokiej gamy białek integralnych błony i został zoptymalizowany pod kątem transportu różnorodnych cząsteczek do wnętrza lub na zewnątrz pęcherzyków27,29,30.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg" /> 
Rycina 1: Przegląd ścieżki produkcji ATP oraz syntezy i wydzielania glicerolu 3-fosforanu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Krótko mówiąc, oczyszczone białka błonowe (solubilizowane w dodecyl-β-D-maltosydzie, DDM) dodaje się do wcześniej przygotowanych pęcherzyków lipidowych, które zostały zdestabilizowane Tritonem X-100, co umożliwia wbudowanie białek w błonę. Następnie cząsteczki detergentu są (powoli) usuwane poprzez dodanie aktywowanych kulek polistyrenowych, co prowadzi do powstania szczelnych proteoliposomów. Do pęcherzyków można następnie dodać komponenty rozpuszczalne i enkapsulować je za pomocą cykli zamrażania i rozmrażania, co więzi cząsteczki w procesie fuzji błon. Uzyskane pęcherzyki są wysoce heterogeniczne i wiele z nich jest wielowarstwowych. Są one następnie przeciskane przez filtr poliwęglanowy o rozmiarze porów 400, 200 lub 100 nm, co pozwala uzyskać pęcherzyki o bardziej jednolitym rozmiarze; im mniejszy rozmiar porów, tym pęcherzyki są bardziej jednorodne i jednowarstwowe, jednak odbywa się to kosztem mniejszej objętości wewnętrznej. Białka nie wbudowane oraz małe cząsteczki są usuwane z roztworu zewnętrznego za pomocą chromatografii wykluczania rozmiaru. ProteoLUV można przekształcić w pęcherzyki o rozmiarach mikrometrycznych poprzez pęcznienie wspomagane żelem, a tak otrzymane proteoGUV są następnie zbierane i uwięzione w chipie mikrofluidycznym w celu charakterystyki mikroskopowej i manipulacji. Rysunek 2 przedstawia schematyczny przegląd pełnego protokołu.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg" /> 
Rysunek 2: Przegląd protokołu rekonstytucji białek błonowych oraz enkapsulacji enzymów i komponentów rozpuszczalnych w wodzie w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach submikrometrycznych (LUVs) i mikrometrycznych (GUVs). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Protokoły rekonstytucji i enkapsulacji działają sprawnie, a funkcjonalność białek zostaje zachowana, jednak proteoLUV i proteoGUV są niejednorodne pod względem rozmiaru. Podejścia mikrofluidyczne31,32 umożliwiają tworzenie pęcherzyków o rozmiarach mikrometrycznych, które są bardziej jednorodne, lecz funkcjonalna rekonstytucja białek błonowych jest zazwyczaj niemożliwa, ponieważ pozostałości rozpuszczalnika w dwuwarstwie inaktywują białka. Rozmiar proteoLUV mieści się w zakresie od 100 do 400 nm, a przy niskich stężeniach enzymów enkapsulacja może prowadzić do powstania pęcherzyków z niekompletnymi szlakami metabolicznymi (efekty stochastyczne; patrz Rycina 3). LUV są idealne do konstruowania specyficznych modułów metabolicznych, co pokazano tutaj na przykładzie produkcji ATP oraz bloków budulcowych, takich jak G3P. Takie proteoLUV mogą potencjalnie zostać zamknięte w GUV i służyć jako przedziały przypominające organelle dla pęcherzyków gospodarzy.
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg" /> 
Rysunek 3: Liczba cząsteczek na pęcherzyk o średnicy 100, 200 lub 400 nm. (A) Gdy inkapsulowane białka (enzymy, sondy) znajdują się w zakresie 1-10 µM. (B) Rekonstytucję przeprowadzono przy stosunku białek błonowych do lipidów wynoszącym 1:1 000, 1:10 000 i 1:100 000 (mol/mol). Przyjmujemy założenie, że cząsteczki są inkapsulowane w indicated stężeniach i włączane do błony w tych stosunkach białko-lipid. W przypadku niektórych enzymów zaobserwowaliśmy, że wiążą się one z błonami, co może zwiększyć ich pozorne stężenie w pęcherzykach. Skrót: LPR = Lipid-Protein-Ratio (stosunek lipidów do białek) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odcinający Amicon</td><td>Filtry</td><td>odśrodkowe Sigma Aldrich Milipore Amicon Ultra&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BioKoraliki</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Macron Chemikalia wysokowartościowe</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glukoza</td><td></td> <td>Formedium-D</td><td></td></tr><tr><td>(+)-sacharoza</td><td>Formedium-DDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Glikon</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Formedium&nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Wytłaczarka</td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>Fluorymetr</td><td>Jasco</td><td>Spektrofluorometr FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>Wysięgnik</td><td>glicerolu</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna przepływu grawitacyjnego</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 100 &micro; L</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 1000 &mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny dozownik LCP</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny sonograf</td><td>Hielscher Ultrasound Technology</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BOOM</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Duża wirówka rurkowa Falcon</td><td>Eppendorf</td><td>Wirówka 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-ornityna</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Układ mikroprzepływowy</td><td>domowej roboty&nbsp;</td><td>Na podstawie PDMS</td><td>DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr Nanodrop Spektrofotometr</td><td>Isogen Life Science</td><td>ND-1000 NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>Igły do GUV</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 G x 3/4'' 0,4 x 20 mm</td></tr><tr><td>Igły do mikrofluidyki</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G x 1 1/2'' 1,2 x 40 mm</td></tr><tr><td>Ni2+ Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>Miernik</td> <td>osmolalnościGonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 podstawowy osmometr</td><td></td>do pomiaru temperatury zamarzania</tr><tr><td>Plasmacleaner Plasma</td><td>Etch</td><td>PE-Avenger</td><td></td></tr><tr><td>Filtr poliwęglanowy</td><td>Cytiva Whatman</td><td>Nuclepor Track-Etch Membrane Produkt: 10417104</td><td>0,4 i mikro; </td></tr><tr><td>m Rurka ultrawirówkowa z poliwęglanu</td><td>Beckman Coulter</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>Pyranine</td><td>Acros Organics</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa ()</td><td>Żywica Hellma Analytics</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics Sonics & Materiały: INC</td><td>Sonics, vibra cell</td><td></td></tr><tr><td>, filtr strzykawkowy</td><td>Sarstedt,</td><td>Filtropur S, plus 0,2</td>, <td>0,2 i mikro; m</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvard</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Wirówka Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>Przekładka teflonowa</td><td>Domowej roboty&nbsp;</td><td>Na bazie teflonu</td><td>45 x 26 x 1,5 lub 45 x 26 x 3 lub 20 x 20 x 3 mm</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Lampa UV Beckman Coulter</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Spektroline</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS Spektrofotometr</td><td>Jasco</td><td>V730</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Szerokokątny mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Casein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

Prezentujemy metodę włączania do pęcherzyków złożonych sieci białkowych, obejmujących integralne białka błonowe, enzymy i czujniki oparte na fluorescencji, przy użyciu oczyszczonych składników. Metoda ta jest istotna dla projektowania i budowy bioreaktorów oraz badania złożonych sieci reakcji metabolicznych w nierównowadze. Zaczynamy od odtworzenia (wielu) białek błonowych w duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV) zgodnie z wcześniej opracowanym protokołem. Następnie kapsułkujemy mieszaninę oczyszczonych enzymów, metabolitów i czujników opartych na fluorescencji (białek fluorescencyjnych lub barwników) poprzez wytłaczanie przez zamrażanie, rozmrażanie i usuwanie niewłączonych składników za pomocą wirowania i / lub chromatografii wykluczającej rozmiar. Wydajność sieci metabolicznych jest mierzona w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie stosunku ATP/ADP, stężenia metabolitów, wewnętrznego pH lub innych parametrów za pomocą odczytu fluorescencji. Nasze pęcherzyki błonowe zawierające białka o średnicy 100-400 nm można przekształcić w pęcherzyki gigantyczno-jednowarstwowe (GUV), przy użyciu istniejących, ale zoptymalizowanych procedur. Podejście to umożliwia włączenie rozpuszczalnych składników (enzymów, metabolitów, czujników) do pęcherzyków o rozmiarach mikrometrów, zwiększając w ten sposób objętość bioreaktorów o rzędy wielkości. Sieć metaboliczna zawierająca GUV jest uwięziona w urządzeniach mikroprzepływowych w celu analizy za pomocą mikroskopii optycznej.

Rekonstytucja solubilizowanych białek błonowych w liposomach wymaga destabilizacji wcześniej utworzonych pęcherzyków. Dodanie niewielkich ilości Triton X-100 powoduje początkowo wzrost absorbancji przy 540 nm (A540) ze względu na zwiększenie rozpraszania światła wywołane pęcznieniem pęcherzyków (Rycina 4). Maksymalna wartość A540 oznacza punkt, w którym liposomy są nasycone detergentem (Rsat); każde dalsze dodanie Triton X-100 prowadzi do częściowej solubilizacji pęcherzyków. W punkcie Rsol liposomy są całkowicie solubilizowane (Rycina 4). Do rekonstytucji białek błonowych zazwyczaj wykorzystujemy pęcherzyki destabilizowane do poziomu 60% powyżej Rsat (wskazanego strzałką).
Zrekonstytuowane białko błonowe ArcD służy do transportu L-argininy do wnętrza pęcherzyków i L-ornityny na zewnątrz, a wraz z zamkniętymi wewnątrz enzymami ArcA, ArcB i ArcC umożliwia regenerację ATP z ADP i fosforanu nieorganicznego. GlpT jest antyporterem glicerolu 3-fosforanu/fosforanu, który wraz z GlpK jest niezbędny do syntezy (i wydalania) glicerolu 3-fosforanu z glicerolu oraz ATP wytwarzanego w procesie rozkładu L-argininy. Dodanie 5 mM L-argininy w czasie t = 0 do proteoliposomów powoduje gwałtowny wzrost stosunku fluorescencji PercevalHR przy wzbudzeniu 500 i 430 nm39, co odzwierciedla stosunek ATP/ADP wewnątrz pęcherzyków (Rycina 5). Po dodaniu glicerolu ATP jest wykorzystywane do syntezy glicerolu 3-fosforanu, co prowadzi do obniżenia stosunku ATP/ADP28. Rozkład L-argininy prowadzi również do zmian pH, które można ilościowo określić przy użyciu pyraniny lub pHluoriny27.
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg" /> 
Rycina 5: Recykling ATP w szlaku rozkładu L-argininy. LUVs o stężeniu 2,7 mg lipidów/mL umieszczono w kuwecie i zarejestrowano stosunek fluorescencji przy 500 nm i 430 nm. W czasie t = 0 dodano 5 mM L-argininy. Stosunek F500/F430 jest miarą stosunku ATP/ADP wewnątrz pęcherzyków. Skrót: LUVs = duże pęcherzyki jednowarstwowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
LUV wytwarzające ATP mogą być również wykorzystane do tworzenia GUV. Rehydratacja wysuszonych proteo-LUV na żelu agarozowym LGT prowadzi do powstania pęcherzyków o rozmiarach mikrometrycznych (Rysunek 6). Tworzenie proteo-GUV w obrębie wysuszonych plamek LUV zależy w znacznym stopniu od lokalnego stężenia lipidów oraz stopnia odwodnienia. W niektórych obszarach występują duże skupiska GUV, podczas gdy w innych miejscach w tej samej kropli formuje się niewiele lub wcale nie formują się GUV. Tworzenie GUV poprzez pęcznienie wspomagane agarozą LGT skutkuje uzyskaniem GUV o zróżnicowanych rozmiarach, zazwyczaj od kilku mikrometrów&#160;do ponad 50 μm.
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg" /> 
Rysunek 6: Obrazy DIC proteoGUV-ów utworzonych poprzez pęcznienie wspomagane żelem. Pasek skali = 25 µm. Skróty: DIC = kontrast interferencyjny różnicowy; GUVs = gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
GUV zostają zebrane i uwięzione w mikrofluidycznym urządzeniu opartym na PDMS, pasywowanym β-kazeiną (Rysunek 7). Urządzenie jest zaprojektowane w taki sposób, aby wiele pęcherzyków mogło zostać uwięzionych i przeanalizowanych w ramach jednego eksperymentu, a samo urządzenie służy do kontrolowania środowiska zewnętrznego (szybkość przepływu, skład buforu itp.)34. Nawet przy niskiej wydajności proteo-GUV, stały przepływ GUV przez chip mikrofluidyczny umożliwia zebranie wielu pęcherzyków. Po uwięzieniu odpowiedniej liczby GUV, system jest płukany buforem o zrównoważonej osmolalności w celu usunięcia komponentów zewnętrznych, takich jak białka rozpuszczalne, małe cząsteczki i sondy fluorescencyjne. Bufor płuczący zostaje następnie zastąpiony roztworem substratu o tej samej osmolalności, zawierającym 50 mM KPi (pH 7.0), zmienne ilości glukozy (w celu dostosowania osmolalności) oraz substraty, takie jak 10 mM L-argininy. Eksperyment z szeregiem czasowym jest przeprowadzany w kilku pułapkach chipa mikrofluidycznego, a obrazy są rejestrowane co 90 s (wzbudzanie 405 nm i 488 nm przy użyciu PercevalHR). Ponadto w każdym punkcie czasowym wykonuje się obraz w świetle przechodzącym. Stosunek intensywności emisji po wzbudzeniu przy 488 i 405 nm stanowi miarę stosunku ADP/ATP w pęcherzykach.
<img alt="Rycina 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg" /> 
Rycina 7: Pułapkowanie pęcherzyków za pomocą układu mikrofluidycznego. (A)&#160;Pułapkowanie pęcherzyków wraz z możliwością kontrolowania środowiska zewnętrznego i szybkości przepływu. (B) ProteoGUVs pułapkowane w urządzeniu mikrofluidycznym i wzbudzane laserem 405 nm (zielony) oraz laserem 488 nm (czerwony). Emisję dla obu kanałów mierzy się przy &#62;500 nm. Obraz w jasnym polu pozwala na wizualizację pęcherzyków bez fluorescencji. Pasek skali = 25 µm. Skrót: GUVs = gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiamy protokół do odtwarzania białek błonowych i enkapsulacji enzymów oraz innych rozpuszczalnych w wodzie składników w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach sub-mikrometrowych i mikrometrowych.

Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

W Holandii podstawowe konsorcjum ma na celu skonstruowanie syntetycznych komórek ze składników molekularnych. Podstawowe konsorcjum składa się z grup badawczych zajmujących się biologią molekularną po chemię, fizykę i nauki obliczeniowe. Celem tego konsorcjum jest stworzenie samoreplikującego się systemu zdolnego do autonomicznego wzrostu, przekazywania informacji i dzielenia.Obecnie skupiamy się na budowie sieci molekularnych, które są zintegrowane w kierunku bardziej złożonych systemów molekularnych. Najnowsze osiągnięcia w biologii syntetycznej obejmują inżynierię modułów funkcji komórkowych, integrowanie ich w złożone sieci do zastosowań w diagnostyce, terapii, immunologii syntetycznej i materiałach adaptacyjnych. Postęp ten obejmuje grupy w Europie, Ameryce i Azji, które opracowują zarówno odgórne, jak i oddolne podejścia do budowy ogniw syntetycznych.Obecne technologie w naszej dziedzinie obejmują metody inżynieryjne i ewolucyjne do budowy i optymalizacji sieci metabolicznych. Wykorzystujemy sztuczną inteligencję do selekcji molekularnej oraz zaawansowanych technik biochemicznych i biofizycznych do izolacji komponentów i tworzenia sieci. Stosujemy również rekonstytucję błony, fizyczną enkapsulację i wizualizację za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii.Dzięki integracji modułów liczba białek błonowych i enzymów ogromnie wzrasta, co stanowi ograniczenia dla naszych technologii rekonstytucji i enkapsulacji. Enkapsulacja stochastyczna staje się problemem w przypadku pęcherzyków o rozmiarach submikronowych, a skuteczność tworzenia pęcherzyków o rozmiarach mikrometrów spada, gdy w błonie lipidowej odtwarza się wiele białek błonowych. W Corium rozwinęliśmy sieci metaboliczne do produkcji ATP i utrzymywania stanu nierównowagi poprzez podawanie substratu i eksport produktów.Ponadto powiązaliśmy recykling ATP z syntezą i wydalaniem prekursorów lipidów, umożliwiając pęcherzykom wtórnym wytwarzanie lipidów, co jest znaczącym postępem w naszej dziedzinie. Na początek umieść porcję liposomów w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej, aby rozmrozić pęcherzyki. Wstępnie zrównoważyć wytłaczarkę wyposażoną w filtr z buforem A. Następnie przepuść rozmrożone liposomy do wytłaczarki 13 razy.Zbierz wytłaczane liposomy w plastikowej tubie, minimalizując martwą objętość. Następnie odpipetować jeden mililitr rozcieńczonego roztworu liposomu do przezroczystej kołdry. Zmierz jego początkową gęstość optyczną przy 540 nanometrach za pomocą spektrofotometru.Dodaj 50 mikrolitrów 10% Triton X-100 do liposomów. Gdy roztwór osiągnie maksymalną gęstość optyczną, miareczkować go względem Triton X-100 aż do uzyskania gęstości optycznej 60% nasycenia. Wlej zdestabilizowane pęcherzyki detergentu z powrotem do plastikowej tuby.Następnie dodaj oczyszczone białko błonowe do zdestabilizowanych liposomów, aż do uzyskania pożądanego stosunku 400 do jednego. Mutuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dodaj 200 miligramów umytych i zwilżonych kulek polistyrenowych, aby usunąć detergent.Teraz zabezpiecz pustą 10-mililitrową kolumnę przepływu grawitacyjnego nad pustą 6,5-mililitrową rurką do ultra centrowania umieszczoną na lodzie. Wlać próbkę do kolumny przepływu grawitacyjnego i zebrać proteoliposomy w probówce do ultrawirowania. Dodaj 0,5 mililitra buforu A do kulek.Zebrać filtrat w probówce do ultrawirowania. Następnie umieść proteoliposomy w ultrawirówce, aby je zagęścić. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić granulowane proteoliposomy w łącznej objętości 200 mikrolitrów buforu A. Podziel końcową objętość proteoliposomów na trzy podwielokrotności.Niewielkie ilości Triton X-100 początkowo skutkowały wzrostem absorbancji przy 540 nanometrach. Dalsze dodawanie powodowało częściowe rozpuszczenie pęcherzyków. Na naszej pile liposomy były całkowicie rozpuszczone.Na początek odpipetuj 92,7 mikrolitra buforu A do pustej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj DTT, ADP sodu, chlorek magnezu, L-ornitynę i enzymy. Po delikatnym wymieszaniu roztworu dodaj go na wierzch 66,6 mikrolitrów wstępnie uformowanych proteoliposomów.Błyskawicznie zamroź mieszaninę w ciekłym azocie, a następnie rozmroź ją w łaźni wodnej w temperaturze około 10 stopni Celsjusza. Przepuść mieszaninę kapsułkującą w wytłaczarce 13 razy przez filtr wstępnie zrównoważony buforem A, DTT, ADP sodu i L-ornityną, a następnie zbierz wytłaczany roztwór w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Aby określić syntezę ATP, pipetuj bufor K, proteoliposomy i jonofory do czarnej kwarcowej kuwety z małym okienkiem.Podgrzej próbkę do 30 stopni Celsjusza we fluorometrze. Teraz uzyskaj widma wzbudzenia Percival HR. Gdy sygnał sondy jest stały, dodaj nadmiar L-argininy i glicerolu, aby uruchomić sieć metaboliczną i śledzić reakcję w czasie. Dodanie L-argininy do proteoliposomów spowodowało gwałtowny wzrost stosunku fluorescencji Percival HR przy wzbudzeniu 500 i 430 nanometrów.Aby rozpocząć, włóż spód odciętej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów do wcześniej przygotowanego urządzenia do wychwytywania mikroprzepływowego. Pipetować za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr 0,2 mikrometra, aby wstrzyknąć 400 mikrolitrów roztworu beta kazeiny do zbiornika wlotowego chipa Wirować chip przy 900 G przez sześć minut. Poziom cieczy powinien być teraz równy zarówno na wlocie, jak i wylocie.Narysuj kontur przekładki na dwóch szkiełkach obiektywu. Czyść szkiełka plazmą o wysokiej zawartości tlenu przez jedną minutę, aby były hydrofilowe. Dodaj agarozę o niskiej temperaturze żelowania na wierzch szkiełka, aż zostanie całkowicie pokryta agarozą.Następnie przechyl szkiełko pod kątem 90 stopni i odsącz nadmiar agarozy na chusteczkę. Umieść szkiełka w temperaturze 50 stopni Celsjusza na 30 minut. Za pomocą ręcznego sonikotora wyposażonego w sondę o średnicy jednego milimetra, sonikuj przygotowane proteoliposomy.Trzymaj proteo SUV na lodzie przez 30 sekund przed powtórzeniem sonikacji pięć razy. Za pomocą strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów nałóż 0,5 mikrolitra kropelek proteos SUV na przygotowany żel agarozowy. Użyj przepływu azotu przez około 10 minut, aby wysuszyć kropelki.Za pomocą strzykawki i igły odpipetować roztwór pęczniejący do przygotowanej komory przez mały otwór z boku i pozostawić pęcherzyki do pęcznienia w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut. Postukaj komorą o twardą powierzchnię, aby zebrać GUV z żelu. Aby uwięzić GUV do mikroskopii, zamontuj pasywowany chip mikroprzepływowy na mikroskopie.Po sprawdzeniu, czy nie ma wad, podłącz rurkę z wygiętą igłą do wylotu zbiornika. Po podłączeniu drugiego końca do strzykawki o pojemności jednego mililitra, zamontuj strzykawkę do pompy o maksymalnym natężeniu przepływu 10 mikrolitrów na minutę. Zastąp bufor płuczący zbiornika świeżym medium.Przemyć co najmniej 80 mikrolitrami buforu P. Po usunięciu nadmiaru buforu dodać proteo GUV do zbiornika. Monitoruj chip w czasie, aż wystarczająca liczba GUV zostanie uwięziona w chipie. Odpipetować nadmiar roztworu GUV.Następnie dodaj bufor płuczący P o natężeniu przepływu od 0,1 do jednego mikrolitra na minutę. Na koniec zlokalizuj pułapki z wystarczającą ilością pęcherzyków. Po zastosowaniu ustawień do mikroskopu dodaj bufor R do zbiornika o natężeniu przepływu 0,5 mikrolitra na minutę.Ponowne uwodnienie wysuszonych proteo LUV na żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania spowodowało powstanie pęcherzyków o wielkości mikrometrów. GUV zostały zebrane i uwięzione w urządzeniu mikroprzepływowym pasywowanym beta-kazeiną.

construction-out-equilibrium-metabolic-networks-nano-micrometer-sized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj opisujemy proste metody przygotowania pęcherzyków, enkapsulacji maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej oraz monitorowania produkcji białek. Powstałe w ten sposób systemy bezkomórkowe mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia do budowania coraz bardziej złożonych mimik komórkowych.

Enkapsulacja bezkomórkowej maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej w pęcherzykach do budowy mimiki komórkowej

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

Ten protokół opisuje proces wytwarzania sieci nanorurek lipidowych za pomocą ślizgającej się ruchliwości kinezyny w połączeniu z gigantycznymi jednopłytkowymi pęcherzykami lipidowymi.

Wytwarzanie wieloskładnikowych sieci nanorurek lipidowych przy użyciu testu ruchliwości kinezyny ślizgowej

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Ten artykuł przedstawia prostą jednoetapową rekonstrukcję sieci cytoszkieletu wewnątrz oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzyków. Metodę tę można uogólnić i zastosować do enkapsulacji lub uwięzienia szerokiego zakresu biomolekuł.

Metody in vitro Rekonstrukcja sieci cytoszkieletu w oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV)

Poznaj metody konstrukcji syntetycznych komórek poprzez rekonstytucję białek błonowych i enkapsulację enzymów w pęcherzykach lipidowych. Techniki te umożliwiają budowę sieci metabolicznych zdolnych do autonomicznego wzrostu.

Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

Przeglądaj więcej filmów