Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

W Holandii podstawowe konsorcjum ma na celu skonstruowanie syntetycznych komórek ze składników molekularnych. Podstawowe konsorcjum składa się z grup badawczych zajmujących się biologią molekularną po chemię, fizykę i nauki obliczeniowe. Celem tego konsorcjum jest stworzenie samoreplikującego się systemu zdolnego do autonomicznego wzrostu, przekazywania informacji i dzielenia.

Obecnie skupiamy się na budowie sieci molekularnych, które są zintegrowane w kierunku bardziej złożonych systemów molekularnych. Najnowsze osiągnięcia w biologii syntetycznej obejmują inżynierię modułów funkcji komórkowych, integrowanie ich w złożone sieci do zastosowań w diagnostyce, terapii, immunologii syntetycznej i materiałach adaptacyjnych. Postęp ten obejmuje grupy w Europie, Ameryce i Azji, które opracowują zarówno odgórne, jak i oddolne podejścia do budowy ogniw syntetycznych.

Obecne technologie w naszej dziedzinie obejmują metody inżynieryjne i ewolucyjne do budowy i optymalizacji sieci metabolicznych. Wykorzystujemy sztuczną inteligencję do selekcji molekularnej oraz zaawansowanych technik biochemicznych i biofizycznych do izolacji komponentów i tworzenia sieci. Stosujemy również rekonstytucję błony, fizyczną enkapsulację i wizualizację za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii.

Dzięki integracji modułów liczba białek błonowych i enzymów ogromnie wzrasta, co stanowi ograniczenia dla naszych technologii rekonstytucji i enkapsulacji. Enkapsulacja stochastyczna staje się problemem w przypadku pęcherzyków o rozmiarach submikronowych, a skuteczność tworzenia pęcherzyków o rozmiarach mikrometrów spada, gdy w błonie lipidowej odtwarza się wiele białek błonowych. W Corium rozwinęliśmy sieci metaboliczne do produkcji ATP i utrzymywania stanu nierównowagi poprzez podawanie substratu i eksport produktów.

Ponadto powiązaliśmy recykling ATP z syntezą i wydalaniem prekursorów lipidów, umożliwiając pęcherzykom wtórnym wytwarzanie lipidów, co jest znaczącym postępem w naszej dziedzinie. Na początek umieść porcję liposomów w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej, aby rozmrozić pęcherzyki. Wstępnie zrównoważyć wytłaczarkę wyposażoną w filtr z buforem A. Następnie przepuść rozmrożone liposomy do wytłaczarki 13 razy.

Zbierz wytłaczane liposomy w plastikowej tubie, minimalizując martwą objętość. Następnie odpipetować jeden mililitr rozcieńczonego roztworu liposomu do przezroczystej kołdry. Zmierz jego początkową gęstość optyczną przy 540 nanometrach za pomocą spektrofotometru.

Dodaj 50 mikrolitrów 10% Triton X-100 do liposomów. Gdy roztwór osiągnie maksymalną gęstość optyczną, miareczkować go względem Triton X-100 aż do uzyskania gęstości optycznej 60% nasycenia. Wlej zdestabilizowane pęcherzyki detergentu z powrotem do plastikowej tuby.

Następnie dodaj oczyszczone białko błonowe do zdestabilizowanych liposomów, aż do uzyskania pożądanego stosunku 400 do jednego. Mutuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dodaj 200 miligramów umytych i zwilżonych kulek polistyrenowych, aby usunąć detergent.

Teraz zabezpiecz pustą 10-mililitrową kolumnę przepływu grawitacyjnego nad pustą 6,5-mililitrową rurką do ultra centrowania umieszczoną na lodzie. Wlać próbkę do kolumny przepływu grawitacyjnego i zebrać proteoliposomy w probówce do ultrawirowania. Dodaj 0,5 mililitra buforu A do kulek.

Zebrać filtrat w probówce do ultrawirowania. Następnie umieść proteoliposomy w ultrawirówce, aby je zagęścić. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić granulowane proteoliposomy w łącznej objętości 200 mikrolitrów buforu A. Podziel końcową objętość proteoliposomów na trzy podwielokrotności.

Niewielkie ilości Triton X-100 początkowo skutkowały wzrostem absorbancji przy 540 nanometrach. Dalsze dodawanie powodowało częściowe rozpuszczenie pęcherzyków. Na naszej pile liposomy były całkowicie rozpuszczone.

Na początek odpipetuj 92,7 mikrolitra buforu A do pustej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj DTT, ADP sodu, chlorek magnezu, L-ornitynę i enzymy. Po delikatnym wymieszaniu roztworu dodaj go na wierzch 66,6 mikrolitrów wstępnie uformowanych proteoliposomów.

Błyskawicznie zamroź mieszaninę w ciekłym azocie, a następnie rozmroź ją w łaźni wodnej w temperaturze około 10 stopni Celsjusza. Przepuść mieszaninę kapsułkującą w wytłaczarce 13 razy przez filtr wstępnie zrównoważony buforem A, DTT, ADP sodu i L-ornityną, a następnie zbierz wytłaczany roztwór w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Aby określić syntezę ATP, pipetuj bufor K, proteoliposomy i jonofory do czarnej kwarcowej kuwety z małym okienkiem.

Podgrzej próbkę do 30 stopni Celsjusza we fluorometrze. Teraz uzyskaj widma wzbudzenia Percival HR. Gdy sygnał sondy jest stały, dodaj nadmiar L-argininy i glicerolu, aby uruchomić sieć metaboliczną i śledzić reakcję w czasie. Dodanie L-argininy do proteoliposomów spowodowało gwałtowny wzrost stosunku fluorescencji Percival HR przy wzbudzeniu 500 i 430 nanometrów.

Aby rozpocząć, włóż spód odciętej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów do wcześniej przygotowanego urządzenia do wychwytywania mikroprzepływowego. Pipetować za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr 0,2 mikrometra, aby wstrzyknąć 400 mikrolitrów roztworu beta kazeiny do zbiornika wlotowego chipa Wirować chip przy 900 G przez sześć minut. Poziom cieczy powinien być teraz równy zarówno na wlocie, jak i wylocie.

Narysuj kontur przekładki na dwóch szkiełkach obiektywu. Czyść szkiełka plazmą o wysokiej zawartości tlenu przez jedną minutę, aby były hydrofilowe. Dodaj agarozę o niskiej temperaturze żelowania na wierzch szkiełka, aż zostanie całkowicie pokryta agarozą.

Następnie przechyl szkiełko pod kątem 90 stopni i odsącz nadmiar agarozy na chusteczkę. Umieść szkiełka w temperaturze 50 stopni Celsjusza na 30 minut. Za pomocą ręcznego sonikotora wyposażonego w sondę o średnicy jednego milimetra, sonikuj przygotowane proteoliposomy.

Trzymaj proteo SUV na lodzie przez 30 sekund przed powtórzeniem sonikacji pięć razy. Za pomocą strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów nałóż 0,5 mikrolitra kropelek proteos SUV na przygotowany żel agarozowy. Użyj przepływu azotu przez około 10 minut, aby wysuszyć kropelki.

Za pomocą strzykawki i igły odpipetować roztwór pęczniejący do przygotowanej komory przez mały otwór z boku i pozostawić pęcherzyki do pęcznienia w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut. Postukaj komorą o twardą powierzchnię, aby zebrać GUV z żelu. Aby uwięzić GUV do mikroskopii, zamontuj pasywowany chip mikroprzepływowy na mikroskopie.

Po sprawdzeniu, czy nie ma wad, podłącz rurkę z wygiętą igłą do wylotu zbiornika. Po podłączeniu drugiego końca do strzykawki o pojemności jednego mililitra, zamontuj strzykawkę do pompy o maksymalnym natężeniu przepływu 10 mikrolitrów na minutę. Zastąp bufor płuczący zbiornika świeżym medium.

Przemyć co najmniej 80 mikrolitrami buforu P. Po usunięciu nadmiaru buforu dodać proteo GUV do zbiornika. Monitoruj chip w czasie, aż wystarczająca liczba GUV zostanie uwięziona w chipie. Odpipetować nadmiar roztworu GUV.

Następnie dodaj bufor płuczący P o natężeniu przepływu od 0,1 do jednego mikrolitra na minutę. Na koniec zlokalizuj pułapki z wystarczającą ilością pęcherzyków. Po zastosowaniu ustawień do mikroskopu dodaj bufor R do zbiornika o natężeniu przepływu 0,5 mikrolitra na minutę.

Ponowne uwodnienie wysuszonych proteo LUV na żelu agarozowym o niskiej temperaturze żelowania spowodowało powstanie pęcherzyków o wielkości mikrometrów. GUV zostały zebrane i uwięzione w urządzeniu mikroprzepływowym pasywowanym beta-kazeiną.