Name: Szczurzy model niedrożności/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu bez uszkadzania struktury anatomicznej naczyń mózgowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Poznaj model niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczura z zachowaniem integralności naczyń. Ta mikrochirurgiczna metoda filamentowa umożliwia badanie udaru niedokrwiennego bez uszkadzania anatomii układu naczyniowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Projekt Wprowadzający Wywiad Zagraniczny Prowincji Hebei w 2023 roku. Dziękujemy dr Lisie Kreiner z Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), za zredagowanie angielskiego tekstu szkicu tego manuskryptu.

Procedura eksperymentalna została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Yantai (Numer Zgody: YTDX20230410) i przestrzegała wytycznych National Institutes of Health dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Do tego badania wykorzystano samce szczurów Sprague-Dawley o wadze od 300 do 350 g. Pełna lista używanych zwierząt, odczynników i sprzętu znajduje się w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Trzymaj zwierzęta w środowisku utrzymującym 12-godzinny cykl światła/ciemności, kontrolowaną temperaturę i wilgotność. Upewnij się, że mają nieograniczony dostęp do jedzenia i wody.</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
	<li>Znieczulić szczury poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe mieszaniną zawierającą ketaminę (80 mg/kg) i ksylazynę (20 mg/kg). 
	UWAGA: Przechyl głowę i ciało szczurów w dół. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się w prawym dolnym kwadrancie brzucha zwierzęcia. Przed wstrzyknięciem należy odciągnąć tłok. Średnia objętość wstrzyknięcia wynosi 0,4 ml.</li>
	<li>Potwierdź indukcję znieczulenia, oceniając odruch wycofania tylnej łapy i odruch mrugania. Jeśli nie zostanie osiągnięta odpowiednia głębokość znieczulenia, należy suplementować izofluranem podczas zabiegu chirurgicznego.</li>
</ol>
3. Procedura modelowania niedokrwiennego
<ol>
	<li>Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu. Zdezynfekuj stoły operacyjne i związany z nimi sprzęt za pomocą 70% etanolu.</li>
	<li>Przygotuj miejsce operacji, goląc sierść wokół przewidywanego miejsca nacięcia. Trzykrotnie zdezynfekuj skórę w miejscu operacji betadyną i 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej po stronie brzusznej o długości około 1,5 cm i otwórz powięź powierzchowną.</li>
	<li>Wykonaj ostre i rozwarstwienie, aby odsłonić tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA), tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) i tętnicę szyjną wspólną (CCA) zgodnie z wcześniej opisaną metodą7.</li>
	<li>Umieść trzy jedwabne szwy 4-0 wokół CCA i jeden jedwabny szew przez ECA w pobliżu rozwidlenia ICA. Zawiąż rozpinany węzeł poślizgowy na bliższym CCA. Zaciśnij szew na dystalnym CCA za pomocą hemostatu, aby zablokować przepływ krwi. Podczas szycia luźno zawiąż kolejny węzeł poślizgowy wokół CCA, aby upewnić się, że naczynie nie jest zasłonięte. 
	UWAGA: Upewnij się, że węzeł poślizgowy nie jest zbyt ciasny, tylko na tyle, aby zablokować przepływ krwi, ponieważ będzie musiał zostać zwolniony podczas szycia naczyniowego.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie 0,5 mm między bliższym szwem jedwabnym a środkowym szwem na CCA za pomocą nożyczek. 
	UWAGA: Upewnij się, że nacięcie umożliwia włókno (końcówka pokryta silikonem) wejście do CCA.</li>
	<li>Wprowadź filament 4-0 o długości 3 cm (końcówka pokryta silikonem) do CCA. Zaciśnij jedwabne szwy wokół CCA, aby zabezpieczyć włókno śródświetlne i zapobiec krwawieniu; następnie usuń szew z dystalnego CCA.</li>
	<li>Kontynuuj wkładanie filamentu do światła MCA, kontrolując szwy wokół ECA, aby upewnić się, że włókno nie dostanie się do ECA. Długość wsunięcia wynosi zwykle od 18 mm do 20 mm.</li>
	<li>Uruchom minutnik i zarejestruj czas, w którym rozpoczyna się okluzja. Zszyj nacięcie szyi jedwabnymi szwami 3-0 i ostrożnie umieść zwierzę w klatce regeneracyjnej. Podawać dootrzewnowo 0,5 ml soli fizjologicznej.</li>
</ol>
4. Szycie mikrochirurgiczne CCA
<ol>
	<li>Ponownie znieczulić szczura 1,5 godziny po niedokrwieniu. Zdezynfekuj miejsce nacięcia trzykrotnie 70% etanolem i ponownie otwórz nacięcie.</li>
	<li>Delikatnie wycofaj filament zasłaniający, aż biała końcówka będzie wyraźnie widoczna w pobliżu nacięcia CCA. Umieść mikrozacisk poziomo blisko zabezpieczonego węzła szwu śródświetlnego w pobliżu rozwidlenia CCA. 
	UWAGA: Unikaj zaciskania białej końcówki filamentu, aby zapobiec oderwaniu silikonu i późniejszej zakrzepicy.</li>
	<li>Zwolnij zabezpieczony węzeł szwu śródświetlnego i całkowicie usuń włókno.</li>
	<li>Umieść kolejny mikro zacisk w pobliżu strony końca serca bliższego węzła CCA. Następnie usuń węzeł szwu wokół bliższego CCA. 
	UWAGA: Prawidłowe umieszczenie klamer ma kluczowe znaczenie dla podnoszenia stałych naczyń w późniejszych krokach, aby ułatwić szycie mikronaczyniowe. Umieść zaciski poziomo na otaczających mięśniach, aby zapobiec poślizgowi.</li>
	<li>Opłucz miejsce nacięcia zwykłą solą fizjologiczną i osusz obszar sterylnym wacikiem, aby usunąć krew i uzyskać czyste pole operacyjne.</li>
	<li>Pod mikroskopem (4-krotne powiększenie) zszyj nacięcie CCA za pomocą szwów mikrochirurgicznych 11-0 w przerywanym wzorze, zwykle wymagającym dwóch szwów w zależności od wielkości nacięcia.</li>
	<li>Po zszyciu usuń mikrozaciski z obu końców CCA, aby przywrócić przepływ krwi.</li>
	<li>Uciskaj sterylnym wacikiem w miejscu szwu CCA przez 30 s. Obserwuj CCA przez 2 minuty, aby upewnić się, że nie dojdzie do krwawienia. Zszyj nacięcie szyi szczura i umieść zwierzę w pojemniku do pielęgnacji w temperaturze 35 °C w celu odzyskania znieczulenia przed powrotem do klatki. 
	UWAGA: Podawać dootrzewnowo z meloksykamem w dawce 2 mg/kg mc. w celu znieczulenia pooperacyjnego.</li>
</ol>
5. Barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)
<ol>
	<li>Trzy dni po reperfuzji niedokrwiennej poddać zwierzęta eutanazji w głębokim znieczuleniu 4% izofluranem i zwichnięciu szyjki macicy.</li>
	<li>Usuń mózgi i pokrój je na odcinki koronalne o grubości 2 mm za pomocą ostrza skalpela8.</li>
	<li>Inkubować skrawki mózgu z 2% TTC przez 20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Opłucz sekcje mózgu dwukrotnie 10% formaliną, a następnie utrwal je 10% formaliną przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rób cyfrowe zdjęcia kolejnych wycinków i ilościowo mierz obszary zawału za pomocą oprogramowania Image J.</li>
</ol>
6. Test neurologiczny
UWAGA: Funkcja neurologiczna została oceniona za pomocą testu Garcii, zgodnie z poprzednim raportem9.
<ol>
	<li>Oceń spontaniczną aktywność, symetrię w ruchu wszystkich czterech kończyn, wyciąganie przedniej łapy, wspinanie się, propriocepcję ciała i reakcję na dotyk wibrysów. Przypisz wyniki na podstawie kryteriów testu Garcii, przy czym maksymalny wynik 18 punktów wskazuje na normalne funkcje neurologiczne.</li>
</ol>
7. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wykorzystaj GraphPad Prism do przeprowadzenia analizy statystycznej za pomocą testu t-Studenta. Wyrazić dane jako średnią ± odchylenie standardowe. Rozważ różnice między średnimi istotnymi statystycznie, jeśli P < 0,05.</li>
</ol>

Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats with Preserved Vascular Anatomy

<ol><li>Tu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((China+stroke+surveillance+report+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Mil+Med+Res%22%5BJournal%5D)">China stroke surveillance report 2021.</a> Mil Med Res. 10 (1), 33(2023).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oxidative+stress+and+inflammation+to+prevent+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion injury.</a> Front in Mol Neurosci. 13, 28(2020).</li>
<li>Ringelstein, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+and+extent+of+hemispheric+brain+infarctions+and+clinical+outcome+in+early+and+delayed+middle+cerebral+artery+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization.</a> Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).</li>
<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%3A+A+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jap+J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jap J Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Trueman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-examination+of+the+intraluminal+filament+MCAO+model%3A+Impact+of+external+carotid+artery+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection.</a> Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).</li>
<li>Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+%28MCAO%29+model+for+ischemic+stroke+with+laser+Doppler+flowmetry+guidance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in mice.</a> J Vis Exp. (51), e2879(2011).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icaritin+inhibits+neuroinflammation+in+a+rat+cerebral+ischemia+model+by+regulating+microglial+polarization+through+the+GPER-ERK-NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Icaritin inhibits neuroinflammation in a rat cerebral ischemia model by regulating microglial polarization through the GPER-ERK-NF-κB signaling pathway.</a> Mol Med. 28 (1), 142(2022).</li>
<li>Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+Deficit+and+extent+of+neuronal+necrosis+attributable+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Neurological Deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 26 (4), 627-634 (1995).</li>
<li>Bracko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Nitropropionic+acid-induced+ischemia+tolerance+in+the+rat+brain+is+mediated+by+reduced+metabolic+activity+and+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">3-Nitropropionic acid-induced ischemia tolerance in the rat brain is mediated by reduced metabolic activity and cerebral blood flow.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (9), 1522-1530 (2014).</li>
<li>Goldmacher, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+transplanted+bone+marrow+stem+cells+and+their+effects+in+the+rat+MCAO+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tracking transplanted bone marrow stem cells and their effects in the rat MCAO stroke model.</a> PLoS One. 8 (3), e60049(2013).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+human+umbilical+cord+blood-derived+mesenchymal+stem+cells+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease.</a> Neurosci Lett. 481 (1), 30-35 (2010).</li>
<li>Connolly, E. S., Winfree, C. J., Solomon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedural+and+strain-related+variables+significantly+affect+outcome+in+a+murine+model+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia.</a> Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).</li>
<li>Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+susceptibility+to+cerebral+ischemia+are+related+to+cerebral+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).</li>
<li>Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).</li>
<li>Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych potencjalnie sprzecznych interesów.

MCAo jest szeroko stosowaną metodą tworzenia zwierzęcych modeli udaru, skutecznie odwzorowującą proces udaru obserwowany u pacjentów poprzez przywrócenie przepływu krwi po niedokrwieniu 10,11,12. Nasze laboratorium opracowało model udaru niedokrwiennego, który umożliwia reperfuzję z CCA bez powodowania uszkodzenia ECA. Po indukcji niedokrwienia przeprowadza się mikrochirurgiczną naprawę CCA. Chociaż nie przeprowadzono bezpośredniego pomiaru przepływu krwi CCA, eksperymentatorzy zaobserwowali pulsację naczyniową w CCA przed przystąpieniem do reperfuzji. Technika ta zachowuje integralność anatomiczną naczyń szyi, a jednocześnie bardzo przypomina proces udaru u pacjentów. Co więcej, oceny funkcji neurologicznych i obszaru niedokrwienia mózgu potwierdziły zasadność udaru wywołanego tym podejściem chirurgicznym.
Na wcześniej opisane modele udaru niedokrwiennego mogą mieć wpływ różne czynniki. W metodzie Koizumi i wsp.4 reperfuzja krwi w dużym stopniu opiera się na okręgu Willisa ze względu na podwiązanie CCA. Jednak zmiany w unaczynieniu mózgu mogą wpływać na końcową objętość zawału mózgu, potencjalnie zwiększając śmiertelność modelu udaru z powodu niskiej perfuzji krwi13,14. Dodatkowo niedokrwienie ECA może upośledzać funkcję mięśni i nerwów twarzy, wpływając na ocenę różnych funkcji neurologicznych15,16.
Obecna metoda rozwiązuje te wyzwania poprzez trzy kluczowe kroki: (1) Utrzymanie nacięcia CCA tak małego, jak to możliwe, tylko wystarczająco dużego, aby można było wprowadzić włókno, skracając czas i zmniejszając uszkodzenia związane z szyciem naczyniowym. (2) Umieszczenie zacisków mikronaczyniowych jak najbliżej rozwidlenia CCA podczas zaciskania dystalnego CCA, aby zapobiec zaciskaniu białej końcówki włókna, co może prowadzić do oderwania silikonu i zakrzepicy. (3) Obserwacja CCA pod kątem wznowionej pulsacji i braku znacznego krwawienia przed zszyciem nacięcia szyi w linii środkowej po naprawie naczyń krwionośnych.
Obecna metoda ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, istnieje możliwość powstania zatoru w miejscu szwu, co może prowadzić do dalszego niedokrwienia mózgu w przypadku ich odklejenia. Ryzyko to powinno być dokładnie rozważone i kontrolowane w przyszłych eksperymentach. Po drugie, w badaniu nie monitorowano masy ciała szczurów, co utrudnia ustalenie, czy metoda wpłynęła na ich spożycie pokarmu. Spożycie pokarmu jest bezpośrednim wskaźnikiem zalet tej metody, a jej ocena może dostarczyć cennych informacji. Wreszcie, obecna metoda wymaga biegłości technicznej w operacjach mikrochirurgicznych, co może ograniczać jej powszechne stosowanie bez odpowiedniego przeszkolenia i wiedzy specjalistycznej.
Podsumowując, chociaż metoda modelowania MCAo oferuje wysokie znaczenie fizjologiczne i integralność strukturalną, wiąże się z ograniczeniami, którymi należy się zająć, aby uzyskać bardziej solidne eksperymenty. Zachowanie integralności anatomicznej naczyń szyjnych i ścisła symulacja procesów udarowych u pacjentów to istotne mocne strony tej metody. Takie podejście niewątpliwie znacząco przyczyni się do badań nad udarem niedokrwiennym, poprawiając wiarygodność i dokładność modeli eksperymentalnych. Ostatecznie może to prowadzić do mniejszej liczby grup eksperymentalnych potrzebnych do testowania efektów terapeutycznych, co skutkuje bardziej wiarygodnymi wynikami eksperymentalnymi.

Udar mózgu, główna przyczyna zgonów i długotrwałych zaburzeń neurologicznych u dorosłych na całym świecie, obejmuje różne typy, przy czym udar niedokrwienny stanowi około 81,9% przypadków, podczas gdy krwotok mózgowy i krwotok podpajęczynówkowy stanowią odpowiednio 14,9% i 3,1%1. Udar niedokrwienny często wynika z miażdżycy lub niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCA), co prowadzi do lokalnego zmniejszenia przepływu krwi w mózgu, a następnie uszkodzenia mózgu. To zmniejszenie dopływu składników odżywczych do komórek niedokrwionych powoduje wyczerpanie energii, powodując utratę integralności błony, obrzęk komórek i ostateczną lizę. Ponadto czynniki takie jak zwiększony wewnątrzkomórkowy wapń, pobudzające uwalnianie aminokwasów, zwiększona produkcja wolnych rodników i aktywacja komórek zapalnych przyczyniają się do uszkodzenia tkanki mózgowej po udarze2.
Cele leczenia udaru niedokrwiennego są wieloaspektowe: zmniejszenie trwających uszkodzeń neurologicznych oraz zmniejszenie śmiertelności i długotrwałej niepełnosprawności; zapobieganie powikłaniom wynikającym z unieruchomienia i dysfunkcji neurologicznej; oraz zminimalizowanie ryzyka nawrotu udaru. Biorąc pod uwagę złożoność patofizjologii udaru niedokrwiennego, solidny model udaru mózgu ma zasadnicze znaczenie dla badań i rozwoju terapii ukierunkowanych na udar niedokrwienny.
Obecnie, niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAo) jest powszechnym zwierzęcym modelem udaru niedokrwiennego3. MCAo jest zwykle wykonywany przez wprowadzenie silikonowej końcówki lub stępionej płomieniowo żyłki przez naczynia szyjne, aż dotrze do początku tętnicy środkowej mózgu (MCA). W 1986 roku Koizumi i jego koledzy opracowali technikę polegającą na wprowadzeniu żyłki z silikonową końcówką przez nacięcie w tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), co pozwoliło jej dotrzeć do wejścia do MCA i zablokować przepływ krwi4. W 1989 roku grupa Longa opisała inną metodę MCAo, która polegała na wprowadzeniu monofilamentu przez nacięcie w tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA). Żyłka przechodzi następnie przez rozwidlenie tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) i ECA, zanim dotrze do punktu początkowego klasy MCA<sup='xref'>5.
Ograniczenia dwóch istniejących metod indukowania MCAo są oczywiste. Metoda Koizumiego wymaga trwałego zablokowania ipsilateralnego CCA, co prowadzi do zmniejszonej perfuzji MCA, ponieważ reperfuzja opiera się wyłącznie na okręgu klasy Willis4. Z drugiej strony, metoda Longa polega na przecięciu ECA, co skutkuje uszkodzeniem układu ECA, a następnie upośledzeniem funkcji mięśni twarzy5. Uszkodzenie to może wpływać na spożycie pokarmu i wody, a także powodować dysfunkcję czuciową twarzy, wpływając na rehabilitację i ocenę funkcji neurologicznych po udarze niedokrwiennym6.
Obecny protokół stara się rozwiązać te ograniczenia, opracowując nową metodę wywoływania modelu udaru niedokrwiennego bez uszkadzania anatomicznej struktury naczyń mózgowych. To nowatorskie podejście wykorzystuje techniki mikrochirurgiczne do naprawy CCA, unikając w ten sposób wad związanych z poprzednimi metodami.

<table><tbody><tr><td>10% formalina</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>BL913A</td><td></td></tr><tr><td>11-0 szwy mikrochirurgiczne</td><td>Ningbo Medical Seture Needle Co., Ltd.</td><td>3/8 1 razy; </td><td></td>5</tr><tr><td>chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC)</td> <td>SIGMA</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>3-0 szew jedwabny</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>3-0</td><td></td></tr><tr><td>4% izofluranu&nbsp; &nbsp;</td><td>Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Sp. z o.o.</td><td></td><td></td>20221102</tr><tr><td>6-0 jedwabny szew</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>6-0</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>20230408</tr><tr><td>Filament</td><td>Xinong Technologies Co Ltd.</td><td>2838-A5</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Sp. z o.o.</td><td>230613BL</td><td></td></tr><tr><td>Samiec szczurów Sprague Dawley</td><td>Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.</td><td>SCXK (Lu) 20190003</td><td></td></tr><tr><td>Microclips</td><td>Szanghaj Jinzhong Fabryka urządzeń medycznych</td><td>W40150</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>S100 OPMI pico</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka pielęgniarska</td><td>Pekin Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd.</td><td>FYL-YS-100L</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>SIGMA</td><td>PHR3263</td><td></td></tr></tbody></table>

szczurzy model niedrożności/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu bez uszkadzania struktury anatomicznej naczyń mózgowych

A Rat Model of Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion Without Damaging the Anatomical Structure of Cerebral Vessels

Udar niedokrwienny jest główną przyczyną długotrwałej niepełnosprawności i śmiertelności wśród dorosłych na całym świecie. Zwierzęce modele udaru niedokrwiennego znacząco przyczyniły się do zrozumienia jego patologicznych mechanizmów i opracowania potencjalnych metod leczenia. Obecnie istnieją dwie powszechne metody wykorzystujące techniki włókien (szwów wewnątrznaczyniowych) w celu wywołania zwierzęcych modeli niedokrwienia mózgu. Jednak metody te mają nieodłączne ograniczenia, takie jak zmniejszona perfuzja krwi do mózgu, uszkodzenie zewnętrznego układu tętnicy szyjnej, upośledzone spożycie pokarmu i/lub wody oraz dysfunkcja czuciowa twarzy. W artykule przedstawiono nową metodę indukowania modelu udaru niedokrwiennego u szczura bez uszczerbku dla anatomii naczyń mózgowych. W tym badaniu odsłonięto wspólną tętnicę szyjną (CCA) szczurów Sprague-Dawley i wykonano nacięcie. Następnie włókno zostało wprowadzone przez nacięcie do tętnicy szyjnej wewnętrznej, aby zamknąć tętnicę środkową mózgu. Po 1,5 h od wywołanego niedokrwienia włókno okluzyjne zostało całkowicie usunięte zarówno z tętnicy szyjnej wewnętrznej, jak i z CCA. Nacięcie w CCA zostało następnie zszyte za pomocą nici mikrochirurgicznych 11-0 pod mikroskopem (powiększenie 4x). Dzięki wykorzystaniu technik mikrochirurgicznych do naprawy CCA, w badaniu tym z powodzeniem opracowano unikalną metodę wywoływania modelu udaru niedokrwiennego u szczurów przy jednoczesnym zachowaniu integralności anatomicznej naczyń krwionośnych mózgu.

Proces mikroszycia 
Nicią wycofano filament w pobliżu nacięcia CCA, aż do momentu, gdy widoczny stał się biały koniec filamentu (Rysunek 1A). Następnie na CCA założono mikrozaciski (Rysunek 1B). Pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu nacięcie CCA zaszyto szwami mikrosurgicalnymi w sposób przerywany (Rysunek 1C). Następnie usunięto mikrozaciski z CCA, przywracając strukturę anatomiczną oraz przepływ krwi (Rysunek 1D).
Barwienie TTC i współczynnik śmiertelności 
Łącznie 12 dorosłych samców szczurów podzielono losowo na dwie grupy: grupę pozorowaną (sham) oraz grupę modelową (n = 6 w każdej grupie). Niestety, jedno zwierzę w grupie pozorowanej padło z powodu przedawkowania środka znieczulającego, a jedno zwierzę w grupie modelowej zdechło w ciągu 24 h. Obszary zawału wynikające z niedokrwienia mózgu zaobserwowano zarówno w prążkowiu, jak i w korze (Ryc. 2A). W 3. dobie po udarze niedokrwiennym całkowity procent zawału wyniósł 29,3% ± 1,6% półkuli (Ryc. 2B), a współczynnik śmiertelności po operacji wyniósł 16,7%.
Ocena funkcji neurologicznych 
W 1. i 3. dobie po udarze niedokrwiennym wyniki w grupach modelowych uległy znacznemu obniżeniu w porównaniu z grupami pozorowanymi (odpowiednio 17,8 ± 0,4 vs. 8,2 ± 1,5, Rycina 3A; 17,6 ± 0,9 vs. 9,6 ± 1,3, Rycina 3B).
<img alt="Schemat techniki szwu chirurgicznego; pęseta trzymająca tkankę; etapy: wprowadzenie igły, wiązanie węzła." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Proces mikroszycia. (A) Filament zostaje wycofany z CCA. Niebieskie strzałki wskazują klamry mikronaczyniowe. (B) Czarna strzałka wskazuje nacięcie po całkowitym usunięciu filamentu. Niebieskie strzałki wskazują klamry mikronaczyniowe. (C) Pod mikroskopem (powiększenie 4x) nacięcie CCA zostało zszyte przy użyciu nici mikrosurgicalnych 11-0 szwem przerywanym. Niebieskie strzałki wskazują klamry mikronaczyniowe. Czarna strzałka wskazuje zszyte nacięcie. (D) Klamry mikrochirurgiczne zostają usunięte, a przepływ krwi w CCA zostaje przywrócony. Czarna strzałka wskazuje miejsce zszycia CCA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przekroje niedokrwiennej tkanki mózgu, wykres słupkowy, porównanie procentowej powierzchni niedokrwienia, wyniki eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wyniki barwienia TTC w modelu niedokrwienia. (A) Reprezentatywne obrazy skrawków mózgu barwionych chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazoliu (TTC) po niedokrwieniu mózgu. W żywej tkance TTC jest enzymatycznie redukowany przez dehydrogenazy do 1,3,5-trifenyloformazanu, który ma czerwony kolor. Tkanki w obszarach martwiczych pozostają białe ze względu na brak takiej aktywności enzymatycznej. (B) Procent powierzchni niedokrwienia u szczurów 3 dni po niedokrwieniu mózgu. W porównaniu z grupą Sham, **P &lt; 0.01. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. W każdej grupie znajdowało się pięć szczurów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący wyniki w skali Garcia w grupie Sham i Model, wykazujący istotną różnicę (**)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ocena funkcji neurologicznych. (A) Wyniki w skali Garcia 1 dzień po niedokrwieniu mózgu. (B) Wyniki w skali Garcia 3 dni po niedokrwieniu mózgu. W porównaniu z grupą Sham, **P &lt; 0.01. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. W każdej grupie znajdowało się pięć szczurów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Obecny protokół opisuje szczurzy model okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu, który zachowuje anatomiczną strukturę naczyń mózgowych bez powodowania uszkodzeń.

Szczurzy model niedrożności/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu bez uszkadzania struktury anatomicznej naczyń mózgowych

Ischemic stroke stands as the primary cause of long-term disability and mortality among adults worldwide. Animal models of ischemic stroke have ...

W tym badaniu opracowano szczurzy model niedrożności lub reperfuzji tętnicy środkowej mózgu, który utrzymuje integrację naczyń mózgowych. Koncentruje się na wprowadzeniu nowej metody wywoływania modelu udaru niedokrwiennego u szczurów bez naruszania anatomii naczyń mózgowych. W projekcie wykorzystano techniki mikrochirurgiczne oraz niedokrwienie wywołane filamentem.Wprowadza metodę wywoływania niedokrwienia bez uszkadzania tętnicy szyjnej wspólnej lub układu szyjnego zewnętrznego. W przeciwieństwie do technik, które mogą trwale zaburzyć przepływ krwi lub uszkodzić anatomię naczyń mózgowych, protokół ten utrzymuje integralność anatomiczną kilku naczyń. Zapewnia dokładniejsze, mniej szkodliwe podejście do badania udaru niedokrwiennego.Aby rozpocząć, umieść znieczulonego szczura na platformie operacyjnej. Po ogoleniu sierści wokół gardła i lewej szyi należy trzykrotnie zdezynfekować miejsce operowane Betadine i 70% etanolem. Wykonaj nacięcie linii środkowej o długości 1,5 centymetra po brzusznej stronie szyi i otwórz powięź powierzchowną.Wykonaj rozwarstwienie, aby odsłonić tętnicę szyjną zewnętrzną, tętnicę szyjną wewnętrzną i tętnicę szyjną wspólną. Umieść trzy jedwabne szwy 4-0 wokół wspólnej tętnicy szyjnej i kolejny jedwabny szew przez tętnicę szyjną zewnętrzną w pobliżu rozwidlenia tętnicy szyjnej wewnętrznej. Zawiąż rozwiązywalny węzeł poślizgowy na bliższej tętnicy szyjnej wspólnej.Zaciśnij szew na dystalnej tętnicy szyjnej wspólnej za pomocą hemostatu, aby zablokować przepływ krwi. Podczas szycia luźno zawiąż kolejny węzeł ślizgowy wokół wspólnej tętnicy szyjnej, aby upewnić się, że naczynie nie jest niedrożne. Teraz za pomocą nożyczek wykonaj 0,5-milimetrowe nacięcie między proksymalnym szwem jedwabnym a środkowym szwem na tętnicy szyjnej wspólnej.Wprowadź trzycentymetrowe włókno 4-0 do wspólnej tętnicy szyjnej. Zaciśnij jedwabne szwy wokół tętnicy szyjnej wspólnej, aby zabezpieczyć włókno śródświetlne i zapobiec krwawieniu. Następnie usuń szew z dystalnej tętnicy szyjnej wspólnej.Kontynuuj wprowadzanie włókna do światła środkowej tętnicy mózgowej, kontrolując szwy wokół tętnicy szyjnej zewnętrznej. Uruchom minutnik i zarejestruj czas, w którym rozpoczyna się okluzja. Zszyj nacięcie szyi jedwabnymi szwami 3-0.Ostrożnie umieść zwierzę w klatce regeneracyjnej. Po modelowaniu niedokrwiennym ponownie otwórz nacięcie szyi od znieczulonego szczura. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie wycofaj włókno okluzyjne, umieszczając mikrozacisk poziomo w pobliżu węzła szwu śródświetlnego.Kontynuuj wycofywanie, aż biała końcówka będzie wyraźnie widoczna w pobliżu nacięcia tętnicy szyjnej wspólnej. Następnie całkowicie usuń włókno i zwolnij zabezpieczony węzeł szwu śródświetlnego. Umieść kolejny mikrozacisk w pobliżu strony serca bliższego węzła tętnicy szyjnej wspólnej.Następnie usuń węzeł szwu wokół bliższej tętnicy szyjnej wspólnej. Przepłukać miejsce nacięcia solą fizjologiczną. Osusz obszar sterylnym wacikiem, aby usunąć krew i uzyskać czyste pole operacyjne.Teraz przy 4-krotnym powiększeniu zszyj nacięcie tętnicy szyjnej wspólnej za pomocą szwów mikrochirurgicznych 11-0 w przerwanym wzorze. Po zszyciu usuń mikrozaciski z obu końców wspólnej tętnicy szyjnej, aby przywrócić przepływ krwi. Uciskaj sterylnym wacikiem w miejscu szwu tętnicy szyjnej wspólnej przez 30 sekund.Obserwuj tętnicę szyjną wspólną przez dwie minuty, aby upewnić się, że nie wystąpi krwawienie. Zszyj nacięcie szyi i umieść szczura w pudełku do pielęgnacji o temperaturze 35 stopni Celsjusza w celu odzyskania znieczulenia. Trzy dni po reperfuzji niedokrwiennej usuń mózg z uśpionego szczura.Zamroź mózg w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 20 minut. Po zamrożeniu za pomocą skalpela pokrój mózg na odcinki koronalne o grubości dwóch milimetrów. Inkubuj sekcje mózgu z 2% TTC przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji przenieś skrawki mózgu na małą szalkę Petriego i odrzuć 2% TTC. Następnie utrwal sekcje mózgu 10% formaliną przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć formalinę i przepłucz skrawki mózgu PBS.Rób cyfrowe zdjęcia kolejnych wycinków. Za pomocą oprogramowania ImageJ zmierz ilościowo obszary zawału. Po barwieniu TTC zaobserwowano zawały wynikające z niedokrwienia mózgu zarówno w prążkowiu, jak i w korze.Po trzech dniach od udaru niedokrwiennego całkowitego odsetka zawału mierzono na poziomie około 30% półkuli, a śmiertelność po operacji wynosiła 16,7%.

a-rat-model-middle-cerebral-artery-occlusionreperfusion-without

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Chirurgiczne wywołanie niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u szczura jest powszechnie stosowanym modelem w badaniach nad udarem. W niniejszej pracy demonstrujemy indukcję ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez zamknięcie tętnicy środkowej mózgu. Przedstawiono również wizualizację powstałego zawału za pomocą barwienia histologicznego oraz obrazowania rezonansem magnetycznym.

Model ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez endowaskularną okluzję tętnicy środkowej mózgu u szczura za pomocą szwu

W materiale wideo demonstrujemy metodę wywołania zatoru w środkowej tętnicy mózgowej u dorosłych myszy z wykorzystaniem wewnątrzluminalnego monofilamentu. Pokazujemy również, jak oceniać zakres zawału mózgu za pomocą barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC).

Myszy model udaru niedokrwiennego wywołanego zamknięciem tętnicy środkowej mózgu

Ten film przedstawia procedurę wykonywania trwałej dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu lub MCAO z tętnicą szyjną wspólną lub podwiązaniem CCA u starszych szczurów w celu modelowania udaru niedokrwiennego. Blokuje to przepływ krwi do mózgu, prowadząc do śmierci neuronów i generowania modelu do badania mechanizmów udaru i potencjalnych metod leczenia.

Wywoływanie niedokrwienia poprzez niedrożność środkowej części mózgu i tętnicy szyjnej wspólnej w modelu szczurzym

Źródło: Larpthaveesarp, A., et. al. Przemijający model niedrożności tętnicy środkowej mózgu udaru noworodka u szczurów P10. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje ustanowienie modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczeniaka szczura. Tętnica szyjna wewnętrzna (ICA) jest odsłonięta, a ligatura jest zabezpieczona, aby ograniczyć napływ krwi. Okluda jest wprowadzana przez ICA, aby dotrzeć do tętnicy środkowej mózgu. Szczenię może następnie dojść do siebie przed dalszą analizą.

Generowanie niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczeniaka szczura w celu wywołania lokalnego niedokrwienia mózgu

Opisujemy wysoce powtarzalną metodę trwałego zamknięcia głównego naczynia krwionośnego mózgu gryzoni.  Technikę tę można osiągnąć przy bardzo niewielkim uszkodzeniu obwodowym, minimalnej utracie krwi, wysokim wskaźniku długoterminowego przeżycia i stałej objętości zawału współmiernej do populacji klinicznej ludzi.

Stała niedrożność naczynia mózgowego poprzez podwójne podwiązanie i przecięcie

Udar noworodkowy jest istotną przyczyną wczesnego uszkodzenia mózgu, wymagającym modelu translacyjnego ze spójnymi wzorcami urazów ogniskowych i wysoką odtwarzalnością, aby umożliwić badanie. W pracy opisano szczegółową procedurę chirurgiczną mającą na celu stworzenie niekrwotocznego, jednostronnego ogniskowego uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego u gryzoni o długości równoważnej.

Przemijający model niedrożności tętnicy środkowej mózgu udaru noworodka u szczurów P10

Wewnątrzświateł okluzja włókien środkowej tętnicy mózgowej jest najczęściej używanym modelem in vivo eksperymentalnego udaru mózgu u gryzoni. Wykonuje się tutaj alternatywne podejście chirurgiczne umożliwiające naprawę tętnicy szyjnej wspólnej, które umożliwia reperfuzję tętnicy szyjnej wspólnej i pełną reperfuzję do obszaru tętnicy środkowej mózgu.

Niedrożność tętnicy środkowej mózgu umożliwiająca reperfuzję poprzez wspólną naprawę tętnicy szyjnej u myszy

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Ten protokół opisuje proces przygotowania do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu przez tętnicę szyjną wspólną.

Zmodyfikowany model preparatu do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Celem niniejszej pracy było ustalenie reprodukowalnej metody wykonywania kraniektomii z późniejszym trwałym, selektywnym zamknięciem tętnicy mózgowej środkowej u szczurów dla zastosowania w badaniach eksperymentalnych nad deficytami ruchowymi i przestrzenną pamięcią.

Selektywne i trwałe zatorowanie środkowej tętnicy mózgowej u szczurów: eksperymentalne podejście do badania niedoborów motorycznych i przestrzennej pamięci

Poznaj model niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczura z zachowaniem integralności naczyń. Ta mikrochirurgiczna metoda filamentowa umożliwia badanie udaru niedokrwiennego bez uszkadzania anatomii układu naczyniowego.

Szczurzy model niedrożności/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu bez uszkadzania struktury anatomicznej naczyń mózgowych

Przeglądaj więcej filmów