Name: Kwantyfikacja aktywności systemu wydzielania Yersinia pseudotuberculosis typu III po głodzie żelaza i wzroście beztlenowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji aktywności systemu wydzielania typu III u Yersinia pseudotuberculosis po głodzie żelaza i wzroście beztlenowym. Badanie wyjaśnia regulację czynników wirulencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obrazy graficzne utworzone za pomocą BioRender.com. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health (www.NIH.gov) grant R01AI119082.

Szczegóły dotyczące odczynników, składu podłoża, sekwencji starterów i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów. Rysunek 1 ilustruje ogólny przebieg eksperymentu.
1. Przygotowanie szkła mytego kwasem i chelatowanych pożywek M9
UWAGA: Zanim zaczniesz, zapoznaj się z sekcją materiałów, aby zapoznać się z dokładnymi odczynnikami i recepturami, które zostaną użyte. Pożywka M9 została po raz pierwszy użyta do testów Yersinia T3SS w Cheng et al.11.
<ol>
	<li>Wlać 100 ml 6 N HCl do szklanej kolby o pojemności 250 ml. 
	UWAGA: HCl jest niezwykle niebezpieczny; Należy zapewnić podjęcie odpowiednich środków ostrożności podczas obchodzenia się z tą substancją.</li>
	<li>Uszczelnić wylot szklanego pojemnika szklanym korkiem i ostrożnie obracać kolbą przez 1 minutę, aby dokładnie rozprowadzić HCl, od czasu do czasu zmieniając kierunki.</li>
	<li>6 N HCl należy zutylizować w odpowiedni sposób.</li>
	<li>Wypłucz szklany pojemnik, dodając 100 ml dejonizowanegoH2O, zamykając usta, potrząsając przez 20 s, a następnie wylewając wodę.</li>
	<li>Powtórz etap płukania w sumie 3 razy.</li>
	<li>Pozostaw powietrze do wyschnięcia. Autoklaw do sterylizacji.</li>
	<li>Aby chelatować pożywkę, należy zmieszać składniki M9 z odczynnikiem chelatującym i mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze pokojowej przez ~18 godzin. Przefiltrować-wysterylizować i dodaćMgSO4 do końcowego stężenia 1 mM.</li>
</ol>
2. Hodowla pseudotuberculosy Y. przy różnych poziomach żelaza i napięciu tlenu
<ol>
	<li>Smuga Y. pseudotuberculosis (szczep IP2666pIB1 jest używany w tym badaniu) na płytkach agarowych Lysogeny Broth (LB) i inkubować w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Inkubacja Yersinia w temperaturze 37 °C, szczególnie w pożywce o niskiej zawartości wapnia, prowadzi do aktywności T3SS, zatrzymania wzrostu i ostatecznie selekcjonuje utratę plazmidu dla reguły Yersinia vi(pYV), która koduje klasę T3SS12. W związku z tym protokół ten wykorzystuje inkubację Yersinia w temperaturze 26 °C do czasu zmierzenia aktywności T3SS.</li>
	<li>Po 48 godzinach, gdy utworzą się widoczne kolonie, zaszczepić 4 ml pożywki M9 zawierającej 0,2% glukozy, 1 mg/L FeSO4,7H 2O i uzupełnić kazaaminokwasami (określanymi tutaj jako pożywki M9) z pojedynczej, izolowanej kolonii i hodować przez noc w temperaturze 26 °C z napowietrzaniem przy 250 obr./min przez około 18 godzin 
	UWAGA: Używaj naczyń szklanych mytych kwasem, zaczynając od następnego kroku i przechodząc dalej.</li>
	<li>Subkultura na chelatowane pożywki M9 zgodnie z poniższymi krokami. 
	UWAGA: Do wszystkich kolejnych etapów stosuje się pożywkę M9 z 0,9% glukozy zamiast standardowej 0,2% glukozy.
	<ol>
		<li>Za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną (OD600) nocnej hodowli.</li>
		<li>Rozcieńczyć kulturę przez noc do wartości OD600 wynoszącej 0,1 w sumie 14 ml sterylnych chelatowanych pożywek M9 zawierających 0,9% glukozy i bez FeSO 4,7H2 O w250 ml kolby przemytej kwasem bez suplementacji żelaza.</li>
		<li>Inkubować przez 8 godzin w temperaturze 26 °C z napowietrzaniem przy 250 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Subkultura na kultury tlenowe i beztlenowe równolegle.
	<ol>
		<li>Zmierz OD600 rosnących kultur.</li>
		<li>W celu kontynuacji inkubacji tlenowej, należy przeprowadzić subkulturę rosnących kultur do wartości OD600 wynoszącej 0,1 w 14 ml sterylnego chelatowanego podłoża M9 zawierającego 0,9% glukozy i bez FeSO 4,7H2 O w kolbie przemytej kwasem o pojemności 250 ml i hodowli z napowietrzaniem w temperaturze 26 °C przez 12 godzin bez suplementacji żelaza.</li>
		<li>W przypadku hodowli beztlenowej subkultura do wartości OD600 wynoszącej 0,1 na 14 ml sterylnego chelatowanego podłoża M9 do dwóch szklanych probówek przemytych kwasem. Do pierwszej probówki dodać wysterylizowany filtrem (przy użyciu membrany polieterosulfonowej 0,22 μm) FeSO4,7H 2O dla końcowego stężenia 1 mg/L (określanego jako "wysoka zawartość żelaza"). W drugiej probówce dodać FeSO 4,7H2 O, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01 mg/l (określane jako "niska zawartość żelaza"). Można to zrobić za pomocą 10 mg/ml FeSO4,7H 2O roztworu podstawowego. Inkubować obie probówki beztlenowo w komorze beztlenowej w temperaturze pokojowej przez 12 h. 
		UWAGA: 1 mg/L FeSO 4,7H2 O zapewnia warunkibogate w żelazo dla silnego wzrostu Yersinia. I odwrotnie, dodanie tylko 0,01 mg/L FeSO4,7H 2O do kultur beztlenowych zapewnia wystarczający wzrost w warunkach beztlenowych, ale nadal umożliwia reakcje głodu żelaza, podczas gdy kultury tlenowe są hodowane przez 12 godzin przy braku dodatku żelaza w celu stymulowania reakcji głodu żelaza przed stymulacją aktywności T3SS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukuj aktywność układu sekrecji typu III.
	<ol>
		<li>Przesunąć kultury beztlenowe do temperatury 37 °C i kontynuować inkubację beztlenową przez 4 godziny w celu wywołania T3SS.</li>
		<li>Zmierz OD600 kultury rosnącej tlenowo.</li>
		<li>Do dwóch kolb przemytych kwasem przeprowadzić subkulturę kultur rosnących tlenowo do wartości OD600 wynoszącej 0,2 w 14 ml sterylnych chelatowanych pożywek M9. Do pierwszej kolby dodać wysterylizowany przez filtr FeSO 4,7H2 O dla końcowegostężenia 1 mg/L. Do drugiej kolby dodać FeSO 4,7H2 O dla końcowego stężenia 0,01 mg/L. Inkubować obie kolby z napowietrzaniem w temperaturze 26 °C przy 250 obr./min przez 2 godziny.</li>
		<li>Po 2 godzinach przesunąć kultury tlenowe do temperatury 37 °C z napowietrzeniem przy 250 obr./min i inkubować przez 4 godziny w celu indukcji T3SS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wytrącanie białek efektorowych T3SS kwasem trichlorooctowym (TCA)
<ol>
	<li>Po zakończeniu inkubacji beztlenowej zmierzyć OD600 kultur.</li>
	<li>Znormalizować wszystkie próbki beztlenowe, aby uzyskać równą masę komórek (patrz przykład podany w tabeli 1). W przypadku hodowli beztlenowej generalnie należy spodziewać się wartości OD600 wynoszącej ~0,5 w kulturach pozbawionych żelaza i ~1 w kulturach bogatych w żelazo. W takim przypadku należy użyć 6 ml kultur pozbawionych żelaza i 3 ml kultur bogatych w żelazo. 
	UWAGA: Pozostała kultura może być wykorzystana do innych celów, takich jak zbieranie całkowitego RNA i stosowanie ilościowego PCR do pomiaru poziomów docelowego mRNA w stanie ustalonym (nieopisane tutaj).</li>
	<li>Przenieś znormalizowane objętości każdej kultury do probówek o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Aby kontrolować skuteczność wytrącania wydzielanych białek, dodaj 4 μl 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do każdej probówki.</li>
	<li>Kultury osadów w temperaturze 3200 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podłącz filtr PVDF 0,22 μm do strzykawki o pojemności 10 ml i przefiltruj supernatant z każdej granulowanej kultury do świeżej probówki o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Ten etap filtracji minimalizuje ryzyko przeniesienia całych komórek bakteryjnych, co skutkowałoby niepożądanymi białkami cytoplazmatycznymi w próbce.</li>
	<li>Dodać 10% objętości supernatantu wynoszącej 6,1 N TCA do każdej próbki.</li>
	<li>Wirować energicznie przez 1 minutę. Inkubować probówki na lodzie w chłodni o temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Czas trwania inkubacji można zoptymalizować w zależności od potrzeb. Zaledwie 1-godzinna inkubacja może działać w przypadku warunków lub szczepów, w których wydzielanie jest silne.</li>
	<li>Powtórzyć etapy zbierania osadów i wytrącania TCA z kulturami tlenowymi po zakończeniu 4-godzinnej inkubacji. 
	UWAGA: Normalizować kultury tlenowe, granulując objętości o równoważnej masie komórkowej.</li>
	<li>Dodać 2 ml każdej próbki do świeżej probówki o pojemności 2 ml i odwirować przy 21 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant za pomocą nasadki próżniowej i uważać, aby nie dotknąć dna ani boków probówki. 
	UWAGA: Granulka może być trudna do uwidocznienia i może wyglądać jak mgła na całej długości tuby.</li>
	<li>Powtarzać kroki 3.10 i 3.11 aż do momentu, gdy cała zawartość z każdej reakcji wytrącania zostanie wytrącona do pojedynczej probówki o pojemności 2 ml. Może to wymagać trzech lub czterech sekwencyjnych etapów wirowania, ale pozwala na zagęszczenie wszystkich wydzielanych białek z każdej próbki w probówce o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Aby umyć granulki, delikatnie dodaj 1 ml lodowatego 100% acetonu do każdej probówki. Aby uniknąć utraty próbki, nie zawieszaj ponownie i nie dotykaj boków probówki.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 21 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zassać supernatant i uważać, aby nie dotknąć dna ani boków probówki.</li>
	<li>Powtórzyć kroki mycia acetonem w lodowatym getonie 3.13 i 3.14.</li>
	<li>Po ostatnim zassaniu supernatantu należy otworzyć probówki i pozostawić osad do całkowitego wyschnięcia na stole przez około 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu FSB: DTT do każdej wysuszonej próbki. Aby uniknąć utraty białka, nie należy go ponownie zawieszać.</li>
	<li>Dokładnie wirować każdą próbkę przez 1 minutę, upewniając się, że roztwór FSB: DTT pokrywa ścianki całej probówki. Można to zoptymalizować za pomocą nasadki wirowej, która może pomieścić wiele rurek jednocześnie.</li>
	<li>Gotować próbki w temperaturze 95 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki krótko przez 30 s z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłego użycia.</li>
</ol>
4. SDS-PAGE i barwienie srebrem do wizualizacji białek efektorowych T3SS
<ol>
	<li>Załadować 15 μl każdej próbki beztlenowej i 10 μl każdej próbki tlenowej do 12,5% żelu SDS-PAGE, wraz z 3 μl dostępnego w handlu niebarwionego wzorca jako drabiny.</li>
	<li>Uruchom żel na około 90 minut przy napięciu 100 V. Ustawienia te mogą się różnić w zależności od używanego urządzenia.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem barwienia srebrem, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, w wyniku czego otrzymasz żel, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja względnej aktywności T3SS
<ol>
	<li>Umieść żel w systemie obrazowania, upewniając się, że wszystkie prążki przeznaczone do oznaczania ilościowego znajdują się w ramce obrazu. 
	UWAGA: Masa cząsteczkowa BSA wynosi ~66 kDa, podczas gdy masa cząsteczkowa białka efektorowego T3SS YopE wynosi ~23 kDa.</li>
	<li>W oprogramowaniu wybierz wszystkie pasma YopE we wszystkich studzienkach.</li>
	<li>Ustaw referencyjne pasmo YopE na odpowiednią próbkę.</li>
	<li>Eksportuj względne wartości kwantyfikacji obliczone przez oprogramowanie dla wszystkich pasm YopE.</li>
	<li>Wracając do oprogramowania, wybierz wszystkie pasma BSA we wszystkich odwiertach.</li>
	<li>Ustaw referencyjne pasmo BSA, aby upewnić się, że pochodzi ono z tej samej próbki, co referencyjne pasmo YopE.</li>
	<li>Eksport względnych wartości kwantyfikacji obliczonych przez oprogramowanie dla wszystkich pasm BSA.</li>
	<li>Aby obliczyć względne poziomy wyrażenia YopE, należy podzielić wartość YopE względnej ilości przez względną wartość ilości BSA dla każdej próbki.</li>
</ol>

T3SS Activity in Yersinia pseudotuberculosis Under Iron Depletion & Anaerobic Stress

<ol><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+structure%2C+function+regulation+of+type+III+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems.</a> Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).</li>
<li>Springer International Publishing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bacterial+Type+III+Protein+Secretion+Systems%22">Bacterial Type III Protein Secretion Systems</a>. 427, Springer International Publishing. Cham. (2020).</li>
<li>Schubert, K. A., Xu, Y., Shao, F., Auerbuch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yersinia+type+III+secretion+system+as+a+tool+for+studying+cytosolic+innate+immune+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Yersinia type III secretion system as a tool for studying cytosolic innate immune surveillance.</a> Annu Rev Microbiol. 74, 221-245 (2020).</li>
<li>Cassat, J. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Iron in infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).</li>
<li>Singhal, R., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+battle+in+the+gut%3A+Hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+metabolic+and+inflammatory+responses+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine.</a> J Biol Chem. 295 (30), 10493-10505 (2020).</li>
<li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).</li>
<li>Rakin, A., Schneider, L., Podladchikova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunger+for+iron%3A+the+alternative+siderophore+iron+scavenging+systems+in+highly+virulent+Yersinia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hunger for iron: the alternative siderophore iron scavenging systems in highly virulent Yersinia.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, (2012).</li>
<li>Lesic, B., Carniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Transfer+of+the+high-pathogenicity+island+of+Yersinia+pseudotuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Horizontal Transfer of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis.</a> J Bacteriol. 187 (10), 3352-3358 (2005).</li>
<li>Green, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fis+is+essential+for+Yersinia+pseudotuberculosis+virulence+and+protects+against+reactive+oxygen+species+produced+by+phagocytic+cells+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fis is essential for Yersinia pseudotuberculosis virulence and protects against reactive oxygen species produced by phagocytic cells during infection.</a> PLOS Pathog. 12 (9), e1005898(2016).</li>
<li>Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yersinia+Ysc-Yop+%26%2334%3BType+III%26%2334%3B+weaponry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Yersinia Ysc-Yop &#34;Type III&#34; weaponry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 742-753 (2002).</li>
<li>Cheng, L. W., Anderson, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+type+III+secretion+mechanisms+for+YopE+in+Yersinia+enterocolitica%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica.</a> Mol Microbiol. 24 (4), 757-765 (1997).</li>
<li>Straley, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+low-Ca2%2B+response+virulence+regulon+of+human-pathogenic+yersiniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathog%22%5BJournal%5D)">The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae.</a> Microbial Pathog. 10 (2), 87-91 (1991).</li>
<li>Balada-Llasat, J. -M., Mecsas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+has+a+tropism+for+B+and+T+cell+zones+of+lymph+nodes+that+is+independent+of+the+type+III+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system.</a> PLoS Pathog. 2 (9), e86(2006).</li>
<li>Adams, W., Morgan, J., Kwuan, L., Auerbuch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+pseudotuberculosis+YopD+mutants+that+genetically+separate+effector+protein+translocation+from+host+membrane+disruption%3A+YopD+central+region+promotes+Yop+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yersinia pseudotuberculosis YopD mutants that genetically separate effector protein translocation from host membrane disruption: YopD central region promotes Yop translocation.</a> Mol Microbiol. 96 (4), 764-778 (2015).</li>
<li>Hooker-Romero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+availability+and+oxygen+tension+regulate+the+Yersinia+Ysc+type+III+secretion+system+to+enable+disseminated+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Iron availability and oxygen tension regulate the Yersinia Ysc type III secretion system to enable disseminated infection.</a> PLOS Pathog. 15 (12), e1008001(2019).</li>
<li>Balderas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+scale+analysis+reveals+IscR+directly+and+indirectly+regulates+virulence+factor+genes+in+pathogenic+Yersinia%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome scale analysis reveals IscR directly and indirectly regulates virulence factor genes in pathogenic Yersinia.</a> mBio. 12 (3), e00633-00721 (2021).</li>
<li>Bearden, S. W., Perry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yfe+system+of+Yersinia+pestis+transports+iron+and+manganese+and+is+required+for+full+virulence+of+plague%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague.</a> Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+iron+assimilation+and+fur+regulation+in+Yersinia+pestis%3A+Global+analysis+of+iron+assimilation+and+fur+regulation+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis.</a> FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).</li>
<li>Wijerathne, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+new+class+of+%5B2Fe-2S%5D+protein+that+functions+in+bacterial+iron+homeostasis%2C+requires+a+structural+anion+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">a new class of [2Fe-2S] protein that functions in bacterial iron homeostasis, requires a structural anion binding site.</a> Biochemistry. 57 (38), 5533-5543 (2018).</li>
<li>Bearden, S. W., Staggs, T. M., Perry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ABC+transporter+system+of+Yersinia+pestis+allows+utilization+of+chelated+iron+by+Escherichia+coli+SAB11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11.</a> J Bacteriol. 180 (5), 1135-1147 (1998).</li>
<li>Miller, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IscR+is+essential+for+Yersinia+pseudotuberculosis+type+III+secretion+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence.</a> PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

T3SS jest ważnym czynnikiem wirulencji wielu bakterii chorobotwórczych; Dlatego opracowanie technik laboratoryjnych do badania jego regulacji jest ważne dla zrozumienia patogenezy i opracowania potencjalnych terapii1. Wiadomo, że żelazo i tlen są ważnymi sygnałami gospodarza wyczuwanymi przez patogeny bakteryjne w celu regulacji ekspresji T3SS5; w związku z tym metoda ta przedstawia strategię hodowli Y. pseudotuberculosis w warunkach beztlenowych lub tlenowych, z n...

Wiele klinicznie istotnych patogenów Gram-ujemnych, takich jak Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas i Shigella, koduje system sekrecji typu III (T3SS) do wstrzykiwania białek efektorowych do komórek gospodarza1. U wielu gatunków bakterii T3SS znajduje się pod ścisłą kontrolą regulacyjną2. Na przykład translokacja białek efektorowych Yersinia T3SS do docelowych komórek gospodarza ma kluczowe znaczenie dla obalenia mechanizmów obronnych gospodarza i umożliwienia kolonizacji bakteryjnej tkanek gospodarza. Jednak aktywność Yersinia T3SS jest metabolicznie uciążliwa i może wywołać rozpoznanie przez receptory immunologiczne gospodarza3. W związku z tym regulatory, które wyczuwają określone sygnały środowiskowe, kontrolują ekspresję genów T3SS u wielu gatunków bakterii. Ponieważ patogeny, takie jak Yersinia, doświadczają zmian środowiskowych podczas cyklu infekcji, które wpływają na ekspresję krytycznych czynników wirulencji, ważne jest, aby opracować warunki laboratoryjne, które naśladują istotne cechy nisz żywicielskich zajmowanych przez patogeny bakteryjne. W szczególności napięcie tlenu i dostępność żelaza różnią się w różnych miejscach tkanki w sposób czasoprzestrzenny i wpływają na ekspresję genów wirulencji, takich jak T3SS4,5,6. Dlatego celem tej metody jest ocena, w jaki sposób tlen i żelazo wpływają na ekspresję Yersinia T3SS. Zapewni to wgląd w dynamikę interakcji gospodarz-patogen.
Opisana tutaj metoda szczegółowo opisuje, jak hodować Yersinia pseudotuberculosis tlenowo i beztlenowo, a także jak wyczerpywać zapasy żelaza Yersinia podczas wzrostu tlenowego lub beztlenowego. Podkreślono tutaj kilka ważnych kwestii dotyczących udanej hodowli bakterii w tych zmiennych warunkach. Po pierwsze, hodowla beztlenowa wymaga dodatkowej suplementacji glukozy, modyfikacji, która jest odnotowana w recepturze pożywki. Po drugie, ponieważ Y. pseudotuberculosis wykorzystuje siderofory i inne systemy pochłaniania żelaza, które mogą skutecznie usuwać żelazo ze środowiska, szczególną uwagę zwraca się na zapewnienie, że podłoża hodowlane i szkło laboratoryjne są jak najbardziej wolne od żelaza7. W poprzednich badaniach stosowano chelatory żelaza, takie jak dipirydyl, do zubożania żelaza z kultur bakteryjnych bogatych w pożywki, aby naśladować głód żelaza8,9. Jednak wyczerpywanie się zapasów żelaza Yersinia w celu wywołania głodu żelaza wymaga usunięcia resztek żelaza ze szkła i mediów, a także długotrwałego wzrostu przy braku żelaza. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak myć kwasem naczynia szklane i chelatować podłoża w celu usunięcia resztek żelaza, a także hodować bakterie przez kilka pokoleń, aby zapewnić dokładny głód żelaza. Głód żelaza można zapewnić, mierząc względne poziomy transkryptów dobrze scharakteryzowanych genów reagujących na żelazo w różnych warunkach, jak wykazano w przypadku yfeA i bfd.
Punkt kulminacyjny tego protokołu pokazuje, jak wytrącić wydzielane białka efektorowe T3SS z każdego z tych warunków, traktując supernatant hodowli kwasem trichlorooctowym (TCA) i wizualizując wydzielane białka za pomocą SDS-PAGE. Wreszcie, względną aktywność T3SS ocenia się poprzez wizualizację wydzielanych białek za pomocą barwienia srebrem i ilościowe określenie względnych poziomów białek efektorowych T3SS, określanych jako białka zewnętrzne Yersinia (Yops)10.
Testy aktywności T3SS zazwyczaj wykorzystują specyficzne przeciwciała do wykrywania poziomów białek efektorowych T3SS w supernatancie hodowli. Jednak przeciwciała western blot dla białek efektorowych T3SS często nie są dostępne na rynku. W związku z tym zwrócono szczególną uwagę na to, aby ostateczna wizualizacja aktywności T3SS w tej metodzie nie wymagała specyficznych przeciwciał, a zamiast tego mogła wykorzystywać barwienie srebrem, co pozwala na wizualizację wszystkich wydzielanych białek. Chociaż metoda ta jest specjalnie dostosowana i zoptymalizowana pod kątem Y. pseudotuberculosis, można ją dostosować do innych gatunków bakterii, chociaż dokładne warunki pożywki i czas inkubacji będą się różnić.

<table><tbody><tr><td>10 ml strzykawka Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>10x SDS Bufor do biegania&nbsp;</td><td></td><td>Domowa</td><td>baza 0,25 M Tris, 1,92 M glicyna, 1% SDS w 1 litrowej objętości</td></tr><tr><td>12,5% SDS-Page Gel</td><td>Domowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki hodowlane 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>Na początek na noc&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml probówki Falcon</td><td>Falcom</td><td>352196</td><td>Do zbierania supernatantu</td></tr><tr><td>Kolba hodowlana 250 ml</td><td>Belco</td><td>251000250</td><td></td></tr><tr><td>500 mL System filtrów</td><td>Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>6 N Roztwór kwasu solnego</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732185</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Chemical</td><td>A949-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Bio Rad ChemiDoc MP Obrazowanie System</td><td>Bio Rad</td><td>Numer modelu: Uniwersalny kaptur III</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane ze szkła borokrzemianowego</td><td>Fisherbrand</td><td>14-961-34</td><td>Do hodowli beztlenowej</td></tr><tr><td>Chelex 100 Resin</td><td>Bio Rad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>Chelex M9 +0,9% Pożywki glukozowe</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1% casaminokwasów, <mocny>0,9% dekstrozy</mocny>, 0,0005% tiaminy, 5 g/L żywicy Chelex 100. Mieszaj pożywkę przez 18 godzin w temperaturze pokojowej, przefiltruj za pomocą 500 ml jednostki filtracyjnej Corning, a następnie dodaj MgSO4 dla 1 mM MgSO4 końcowy</td></tr><tr><td>roztwór Bufor próbki końcowej (FSB)</td><td>Domowy</td><td></td><td>0,1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% glicerol, 0,2% błękitu bromofenolowego</td></tr><tr><td>FSB: Rozwiązanie DTT</td><td>Domowe</td><td></td><td>oprogramowanie FSB+0,2 M DTT</td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Oprogramowanie</td><td>Bio Rad</td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z</td></tr><tr><td>Isotemp Heat Block</td><td>Fisher Scientific</td><td>88860021</td><td></td></tr><tr><td>LB Płytki agarowe</td><td>Domowa robota</td><td></td><td>10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl, 15 g Agar w 1 l całkowitej objętości. Autoklawizowane</td></tr><tr><td>podłoże glukozowe M9 + 0,2%</td><td>Domowe</td><td></td> 6 <td>g / L Na2HPO4, 3 g / L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 1 mg/L FeSO47H2O, 1% casaminokwasy, <silny>0,2% dekstroza, 0,0005% tiamina&nbsp;</td></tr><tr><td>Nasadka filtrująca Millex-GP PES 0,22um do strzykawki</td><td>Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td>Do filtracji FeSO47H2O</td></tr><tr><td>Nasadka filtrująca Millex-GV PVDF 0,22um do strzykawki</td><td>Millipore</td><td>SLGVR33RS</td><td>Do filtracji supernatantu</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Unstained Standard</td><td>Bio Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Aparat żelowy</td><td>Bio Rad</td><td>Numer modelu: Mini PROTEAN Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>SilverXpress Zestaw do barwienia srebra&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr><tr><td>Shaker BellyDancer</td><td>IBI Scientific</td><td>BDRAA1155</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu trichlorooctowego 6.1N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Komora winylowa beztlenowa</td><td>Coy Lab Products</td><td></td><td>https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details</td></tr><tr><td>qPCR Sekwencje starterów&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yfeA forward - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yfeA reverse - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A BFD FORWARD</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- CCAGCATCAGCCCCATACAG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BFD REVERSE - TGGCTTGTCGGATGCACTTC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>YOPE forward - CCATAAACCGGTGGTGAC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yopE rewers - CTTGGCATTGAGTGATACTG</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja aktywności systemu wydzielania yersinia pseudotuberculosis typu iii po głodzie żelaza i wzroście beztlenowym

Quantifying Yersinia pseudotuberculosis Type III Secretion System Activity Following Iron Starvation and Anaerobic Growth

Kluczowym mechanizmem wirulencji dla wielu patogenów Gram-ujemnych jest system wydzielania typu III (T3SS), przypominający igłę wyrostek, który przemieszcza cytotoksyczne lub immunomodulujące białka efektorowe do komórek gospodarza. T3SS jest celem kampanii odkrywania środków przeciwdrobnoustrojowych, ponieważ jest dostępny pozakomórkowo i w dużej mierze nieobecny u bakterii niepatogennych. Ostatnie badania wykazały, że T3SS Yersinia i Salmonella są regulowane przez czynniki reagujące na żelazo i tlen, które są ważnymi sygnałami specyficznymi dla niszy występującymi podczas infekcji ssaków. Opisano tutaj metodę głodzenia żelaza w postaci Yersinia pseudotuberculosis, z późniejszą opcjonalną suplementacją żelaza nieorganicznego. Aby ocenić wpływ dostępności tlenu, ten proces głodu żelaza wykazano zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Wreszcie, inkubacja kultur w temperaturze gospodarza ssaków wynoszącej 37 °C indukuje ekspresję T3SS i umożliwia ilościowe określenie aktywności Yersinia T3SS poprzez wizualizację białek efektorowych uwolnionych do supernatantu. Opisane tutaj kroki dają przewagę nad stosowaniem chelatorów żelaza przy braku głodu żelaza, który jest niewystarczający do wywołania silnego głodu żelaza, prawdopodobnie ze względu na wydajne systemy pobierania i oczyszczania żelaza Yersinia. Podobnie, szkło laboratoryjne do mycia kwasem jest szczegółowo oczyszczone z desztek żelaza, które jest niezbędne do wywołania silnego głodu żelaza. Dodatkowo opisano stosowanie środka chelatującego w celu usunięcia pozostałości żelaza z pożywki i hodowli bakterii przez kilka pokoleń w przypadku braku żelaza w celu wyczerpania bakteryjnych zapasów żelaza. Dzięki zastosowaniu standardowych protokołów wytrącania białek indukowanego kwasem trichlorooctowym, SDS-PAGE i barwienia srebrem, procedura ta demonstruje dostępne sposoby pomiaru aktywności T3SS. Chociaż procedura ta jest zoptymalizowana pod kątem Y. pseudotuberculosis, stanowi ona ramy do badań nad patogenami o podobnych silnych systemach wychwytu żelaza. W dobie oporności na antybiotyki metody te można rozszerzyć w celu oceny skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych ukierunkowanych na T3SS w warunkach istotnych dla gospodarza.

Metoda ta umożliwia względne porównanie sekrecyjnych białek Yop w różnych warunkach w stosunku do referencyjnego warunku zainteresowania. Ogólny schemat eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1. Tabela 1 przedstawia sposób, w jaki zazwyczaj odbywa się normalizacja hodowli komórkowych w przypadku każdego warunku hodowli oraz objętość TCA, która zostałaby dodana do każdego supernatantu. Tutaj zaprezentowano reprezentatywne wyniki z użyciem szczepu dzikiego (WT) Y. pseudo...

Bakterie kolonizują tkanki gospodarza, które różnią się biodostępnością tlenu i żelaza, jednak większość podejść do badania bakterii wykorzystuje napowietrzone, bogate media. Protokół ten opisuje hodowlę ludzkiego patogenu Yersinia pseudotuberculosis przy różnych stężeniach żelaza i ciśnieniu tlenu oraz ilościowe określenie aktywności układu wydzielania Yersinia typu III, który jest ważnym czynnikiem wirulencji.

Kwantyfikacja aktywności systemu wydzielania Yersinia pseudotuberculosis typu III po głodzie żelaza i wzroście beztlenowym

A key virulence mechanism for many Gram-negative pathogens is the type III secretion system (T3SS), a needle-like appendage that translocates cytotoxic or ...

Patogeny bakteryjne wykorzystują czynniki wirulencji do kolonizacji różnych nisz w organizmie gospodarza. Pracujemy nad zrozumieniem, w jaki sposób patogeny bakteryjne wyczuwają określone sygnały środowiskowe w tkankach gospodarza, aby regulować ekspresję czynnika wirulencji. Ludzki patogen Yersinia pseudotuberculosis wykorzystuje czynnik wirulencji układu wydzielniczego typu trzeciego do wstrzykiwania białek efektorowych do komórek gospodarza.System wydzielania typu trzeciego pozwala bakteriom obalić mechanizmy obronne gospodarza i skolonizować tkanki gospodarza. Jednak ekspresja systemu wydzielania Yersinia typu III jest metabolicznie uciążliwa, więc ekspresja genów układu wydzielania typu trzeciego jest ściśle regulowana w odpowiedzi na sygnały środowiskowe, takie jak temperatura. Nasze wcześniejsze publikacje wykazały, że ekspresja systemu wydzielania Yersinia typu III jest kontrolowana przez dostępność żelaza i napięcie tlenu poprzez czynnik transkrypcyjny zwany ISCR.Odkrycia te są znaczące, ponieważ Yersinia kolonizuje tkanki gospodarza, które różnią się zawartością żelaza i ciśnieniem tlenu. Na przykład światło jelita zawiera wystarczającą ilość żelaza do wzrostu Yersinia, a

quantifying-yersinia-pseudotuberculosis-type-iii-secretion-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie opisujemy procedurę ekspresji bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach oraz identyfikację fenotypów zahamowania wzrostu indukowanego przez efektory. Takie fenotypy mogą być następnie wykorzystane do wyjaśnienia funkcji i celów działania efektorów.

Identyfikacja fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach

Źródło: Gupta, S., et al. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje procedurę hodowli Mycobacterium tuberculosis w warunkach ograniczonych żelazem w celu wywołania stresu żelazowego i promowania wydzielania sideroforów, które wspierają przeżycie bakterii.

Hodowla prątków gruźlicy w warunkach ograniczonych żelazem

Zacznij od kultur Gram-ujemnych gatunków Yersinia i innych niż Yersinia Enterobacteriaceae.Używając sterylnych inokulatorów igłowych, umieść kultury zarówno na tradycyjnym agarze Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin lub CIN, jak i na zmodyfikowanym agarze CIN.Inkubuj płytki, aby pobudzić wzrost bakterii.Zarówno tradycyjne, jak i modyfikowane agary CIN wspomagają wzrost Yersinia i innych niż Yersinia Enterobacteriaceae, które fermentują mannitol w celu wytworzenia kwaśnych produktów ubocznych.Produkcja...

Ulepszona izolacja różnicowa gatunków Yersinia przy użyciu zmodyfikowanego agaru cefsulodin-irgasan-nowobiocyna

Ten film demonstruje test wydzielania embrionalnej fosfatazy alkalicznej przy użyciu komórek reporterowych interferonu HEK-Blue α/β do ilościowego określenia interferonów typu I (IFN) uwolnionych po stymulacji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych przez limfocyty T CD4+ zakażone HIV-1.

Oznaczanie ilościowe bioaktywnych interferonów typu I przy użyciu testu reporterowego wydzielanej embrionalnej fosfatazy alkalicznej

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji onkogennych organelli bakteryjnych znanych jako System Wydzielania Cag Typu IV (Cag-T4SS).  Odkryliśmy, że Cag-T4SS jest wytwarzany w różny sposób na powierzchni H. pylori w odpowiedzi na różne warunki dostępności żelaza.

Mikroskopia elektronowa wysokiej rozdzielczości systemu wydzielania Helicobacter pylori Cag typu IV pili wytwarzanego w różnych warunkach dostępności żelaza

Translokacja efektorowa do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu III jest powszechną strategią wirulencji wśród bakterii Gram-ujemnych. Zastosowano test oparty na fuzji efektorowej beta-laktamazy do ilościowej analizy translokacji. W komórkach zakażonych Yersinia konwersja reportera FRET przez beta-laktamazę jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Wzrost kultur bakterii znakowanych radioaktywnie w mikromiareczkowych szalkach ułatwia pobieranie próbek o wysokiej przepustowości, co pozwala na wiele technicznych i biologicznych testów replikacji obfitości puli nukleotydów, w tym (p)ppGpp. Można monitorować skutki przemian wzrostowych wywołanych przez źródła stresu fizjologicznego, a także powrót do zdrowia po stresie.

Stosowanie znakowania radioaktywnego mikromiareczkowego do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p)ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej

Opisujemy tutaj metodę hodowli Neisseria gonorrhoeae w płynnym pożywce z ograniczoną zawartością metali, aby ułatwić ekspresję genów do pobierania metali. Przedstawiamy również dalsze eksperymenty mające na celu scharakteryzowanie fenotypu gonokoków hodowanych w tych warunkach. Metody te mogą być dostosowane tak, aby nadawały się do charakterystyki genów reagujących na metale u innych bakterii.

Ograniczony metalem wzrost Neisseria gonorrhoeae w celu scharakteryzowania genów reagujących na metale i pozyskiwania metali z ligandów gospodarza

Ten protokół dostarcza zarówno jakościowych, jak i ilościowych analiz całkowitej liczby sideroforów, pioverdyny i pyocheliny z Pseudomonas aeruginosa.

Analiza jakościowa i ilościowa produkcji sideroforów z Pseudomonas aeruginosa

Obecny protokół opisuje testy infekcji do badania przestrzegania Shigella, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej przy użyciu linii komórkowych nabłonka in vitro.

Analizy zakażeń komórek nabłonkowych preparatem Shigella

Poznaj metodę kwantyfikacji aktywności systemu wydzielania typu III u Yersinia pseudotuberculosis po głodzie żelaza i wzroście beztlenowym. Badanie wyjaśnia regulację czynników wirulencji.

Kwantyfikacja aktywności systemu wydzielania Yersinia pseudotuberculosis typu III po głodzie żelaza i wzroście beztlenowym

Przeglądaj więcej filmów