Kwantyfikacja aktywności systemu wydzielania Yersinia pseudotuberculosis typu III po głodzie żelaza i wzroście beztlenowym

Patogeny bakteryjne wykorzystują czynniki wirulencji do kolonizacji różnych nisz w organizmie gospodarza. Pracujemy nad zrozumieniem, w jaki sposób patogeny bakteryjne wyczuwają określone sygnały środowiskowe w tkankach gospodarza, aby regulować ekspresję czynnika wirulencji. Ludzki patogen Yersinia pseudotuberculosis wykorzystuje czynnik wirulencji układu wydzielniczego typu trzeciego do wstrzykiwania białek efektorowych do komórek gospodarza.

System wydzielania typu trzeciego pozwala bakteriom obalić mechanizmy obronne gospodarza i skolonizować tkanki gospodarza. Jednak ekspresja systemu wydzielania Yersinia typu III jest metabolicznie uciążliwa, więc ekspresja genów układu wydzielania typu trzeciego jest ściśle regulowana w odpowiedzi na sygnały środowiskowe, takie jak temperatura. Nasze wcześniejsze publikacje wykazały, że ekspresja systemu wydzielania Yersinia typu III jest kontrolowana przez dostępność żelaza i napięcie tlenu poprzez czynnik transkrypcyjny zwany ISCR.

Odkrycia te są znaczące, ponieważ Yersinia kolonizuje tkanki gospodarza, które różnią się zawartością żelaza i ciśnieniem tlenu. Na przykład światło jelita zawiera wystarczającą ilość żelaza do wzrostu Yersinia, ale ma niskie ciśnienie tlenu. W przeciwieństwie do tego, tkanki takie jak krew mają bardzo niską dostępność żelaza, ale wyższe ciśnienie tlenu.

Nasza metoda pozwala nam hodować Yersinia w warunkach hodowli, które różnią się ilością dostępnego żelaza i tlenu, aby zbadać, jak te sygnały środowiskowe wpływają na ekspresję systemu wydzielania typu trzeciego. Metoda ta pomoże nam określić mechanizm molekularny, za pomocą którego dostępność żelaza i tlenu kontroluje ekspresję systemu wydzielania typu trzeciego i pomoże nam zrozumieć, w jaki sposób kontroluje to wynik infekcji Yersinia. Na początek nałóż smugi Yersinia Pseudo tuberculosis na płytkach agarowych z bulionu lizogennego.

Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Po utworzeniu widocznych kolonii zaszczepij pojedynczą izolowaną kolonię w czterech mililitrach pożywki M9. Hoduj go przez noc w temperaturze 26 stopni Celsjusza z napowietrzaniem przy 250 obr./min.

Umieścić kuwetę zawierającą kulturę w spektrometrze, a następnie rozcieńczyć kulturę w 14 mililitrach sterylnych chelatowanych pożywek M9 bez suplementacji żelazem, aby osiągnąć wartość OD600 0,1. Umieścić kolby w wytrząsarce o temperaturze 26 stopni Celsjusza i inkubować przez osiem godzin. Po zakończeniu inkubacji użyj kultury, aby rozpocząć trzy świeże kultury; dwa dla wzrostu beztlenowego i jeden dla wzrostu tlenowego.

W przypadku hodowli tlenowej należy rozcieńczyć kulturę do wartości OD600 wynoszącej 0,1 w 14 mililitrach sterylnych chelatowanych pożywek M9 bez suplementacji żelaza. Następnie hodowla z napowietrzaniem w temperaturze 26 stopni Celsjusza przez 12 godzin. W przypadku hodowli beztlenowej rozcieńczyć kulturę w 14 mililitrach sterylnego chelatowanego podłoża M9 do dwóch szklanych probówek przemytych kwasem.

W pierwszej probówce dodaj wysterylizowany przez filtr siarczan żelaza do końcowego stężenia jednego miligrama na litr. W drugiej probówce dodaj siarczan żelaza, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01 miligrama na litr. Inkubować obie probówki w komorze beztlenowej w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.

Następnie indukuj aktywność układu sekrecji typu trzeciego, przesuwając kultury beztlenowe do 37 stopni Celsjusza i kontynuując inkubację przez cztery godziny. Następnie rozcieńczyć kultury rosnące tlenowo do wartości OD600 wynoszącej 0,2, dodając 14 mililitrów chelatowanej pożywki M9 do dwóch kolb przemytych kwasem. Dodać siarczan żelaza o wymaganych stężeniach końcowych do kolb.

Inkubować obie kolby z napowietrzeniem w temperaturze 26 stopni Celsjusza przy 250 obr./min przez dwie godziny. Po dwóch godzinach przenieś kultury do 37 stopni Celsjusza z napowietrzaniem przy 250 obr./min przez cztery godziny, aby wywołać aktywność systemu wydzielania typu trzeciego. Po indukowaniu systemu wydzielania typu trzeciego w Yersinia pseudotuberculosis, przenieś znormalizowane objętości tej kultury inkubowanej do 15-mililitrowych probówek.

Dodać cztery mikrolitry albuminy surowicy bydlęcej do każdej probówki jako kontrolę wytrącania białka. Odwirować kultury w temperaturze 3 200 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przefiltrować supernatant do świeżej 15-mililitrowej probówki za pomocą filtra PVDF o grubości 0,22 mikrona podłączonego do strzykawki.

Następnie dodać kwas trichlorooctowy w ilości odpowiadającej 10% objętości supernatantu. Energicznie obracaj rurki przez jedną minutę. Inkubuj probówki na lodzie w chłodnym pomieszczeniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnie dodaj dwa mililitry każdej próbki do dwumililitrowej probówki, a następnie odwiruj w 21 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać supernatant za pomocą nasadki próżniowej. Powtórzyć pipetowanie dwóch mililitrów próbki do tej samej probówki, odwirować i odessać supernatant.

Skonsoliduj reakcje wytrącania w jednej dwumililitrowej probówce. Umyj granulki jednym mililitrem lodowatego 100% acetonu, a następnie odwiruj i zaaspiruj supernatant. Po ostatnim usunięciu supernatantu, suszyć osad na stole przez godzinę.

Wytrącone białko powinno wyglądać jak mgiełka wzdłuż boku rurki. Następnie ponownie zamieszaj każdą granulkę w 50 mikrolitrach roztworu F-S-B-DTT. Dokładnie wiruj przez jedną minutę.

Następnie gotuj próbki na bloku grzewczym w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie krótko odwirować z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej. Załaduj 15 mikrolitrów każdej próbki beztlenowej i 10 mikrolitrów każdej próbki tlenowej do 12,5% żelu SDS-PAGE w celu analizy.

Po zakończeniu przebiegu żelu użyj barwienia srebrem, aby uwidocznić białka na żelu. Na początek umieść żel SDS-PAGE zawierający oddzielone próbki tlenowe Yersinia pseudotuberculosis w systemie obrazowania. W oprogramowaniu wybierz pasma reprezentujące białko efektorowe układu wydzielania typu trzeciego, YopE, we wszystkich studzienkach.

Ustaw referencyjne pasmo YopE na odpowiednią próbkę. Eksportuj obliczone programowo względne wartości kwantyfikacji dla wszystkich pasm YopE. Następnie wybierz wszystkie pasma BSA we wszystkich studzienkach.

Upewnij się, że referencyjne pasmo BSA jest zgodne z próbką referencyjnego pasma YopE. Eksportuj względne wartości kwantyfikacji dla wszystkich pasm BSA. Podziel wartość YopE przez wartość BSA dla każdego warunku, aby uzyskać znormalizowane wyniki.

Barwiony srebrem żel SDS-PAGE ujawnił, że w próbkach beztlenowych 38-krotnie więcej YopE było obecne w próbkach o niskiej zawartości żelaza w porównaniu z próbkami o wysokiej zawartości żelaza. W próbkach tlenowych białka te były wydzielane w prawie podobnych ilościach.