Name: Ujawnienie ferroptotycznego fenotypu rdzeniaka zarodkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: Odkryj metodę indukcji ferroptozy w komórkach rdzeniaka zarodkowego w celu oceny potencjału terapeutycznego. Technika ta umożliwia badanie nowych strategii leczenia nowotworów pediatrycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez rząd Księstwa Monako, jak również przez 'Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer' (GEMLUC) i Fundację Flavien, która dostarczyła środki na zakup BD FACS Melody.

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone przy użyciu linii komórkowych rdzeniaka zarodkowego typu dzikiego (WT) DAOY, które były hodowane w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w pożywce DMEM uzupełnionej 8% FBS. Linia komórkowa z delecją xCT była utrzymywana w tych samych warunkach, z eksperymentami przeprowadzonymi w pożywkach uzupełnionych 1 mM N-acetylocysteiną (NAC). Komórki były regularnie badane pod kątem mykoplazmy przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do wykrywania mykoplazmy (patrz tabela materiałów) i były hodowane do 10. pasażu.
1. Zbieranie i wysiewanie komórek
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane przy użyciu sterylnych technik aseptycznych w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych. Komórki rdzeniaka zarodkowego DAOY są przylegające, co oznacza, że wszystkie nieprzyłączone komórki można wyrzucić przez przemycie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez Ca2+ i Mg2+.
<ol>
	<li>Wziąć naczynie bulionowe (szalka Petriego, średnica 100 mm) z komórkami i usunąć pływające komórki i pożywkę z płytki za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Dodaj 5-10 ml PBS do naczynia, umyj dno okrężnymi ruchami naczynia, a następnie wyjmij PBS z talerza za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Dodaj 1 ml trypsyny (10x rozcieńczenie) do naczynia. Inkubować płytkę do momentu, gdy delikatne stukanie w płytkę spowoduje usunięcie komórek. Weź 10 ml pożywki hodowlanej DMEM uzupełnionej 8% FBS i mechanicznie zbierz komórki z naczynia.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Weź 500 μl zawiesiny komórek i umieść ją w kuwecie do liczenia. Policz liczbę komórek na ml zawiesiny komórek. W tym badaniu wykorzystano automatyczny licznik komórek (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Oblicz objętość niezbędną do pobrania z zawiesiny komórek, aby mieć 1 000 000 komórek.</li>
	<li>Weź 6-dołkową płytkę i dodaj obliczoną objętość zawiesiny komórek do każdej studzienki, a następnie dodaj pożywkę hodowlaną DMEM uzupełnioną 8% FBS do 2 ml w każdym dołku.</li>
</ol>
2. Leczenie komórek
UWAGA: Kontrola i zabiegi są przeprowadzane w trzech egzemplarzach. Grupy są następujące: Kontrola (DMSO), 1 μM erastyny, 0,3 μM RSL3, 250 μM FAC, 2 μM Ferrostatyny 1, 1 μM erastyny + 2 μM Ferrostatyny 1, 0,3 μM RSL3 + 2 μM Ferrostatyny 1, 250 μM FAC + 2 μM Ferrostatyny 1. Do eksperymentu potrzebne są cztery płytki 6-dołkowe, jak wskazano w tabeli 1). Szczegóły handlowe wszystkich niezbędnych odczynników są wymienione w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>24 godziny po wysiewie dodaj odpowiedni zabieg do dołka z komórkami.</li>
	<li>Pozostawić naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Barwienie wodoronadtlenków lipidów w leczonych komórkach za pomocą sondy BODIPY 581/591 C11
UWAGA: Roztwór podstawowy sondy lipidowej specyficznej dla wodoronadtlenku jest przygotowywany w DMSO w stężeniu 1 mM. Podwielokrotności roztworu podstawowego przechowuje się w temperaturze -20 °C w nieprzezroczystych probówkach. Do barwienia należy przygotować roztwór roboczy sondy o wielkości 2 μM w pożywce DMEM uzupełnionej 8% FBS.
<ol>
	<li>6 godzin po zabiegu obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym (powinno być widoczne zaokrąglenie komórek).</li>
	<li>Wyjąć szalki z inkubatora i umieścić je w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych. 
	Za pomocą aspiratora usuń pożywkę i pływające (martwe) komórki.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki, umyj dno okrężnymi ruchami 6-dołkowych płytek, a następnie wyjmij PBS z dołków za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Dodać 2 ml roztworu roboczego sondy (2 μM stężenie końcowe w DMEM uzupełnione FBS).</li>
	<li>Pozostaw naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut w ciemności (płytki można zawinąć w folię aluminiową).</li>
</ol>
4. Analiza zawartości wodoronadtlenku lipidów w leczonych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej
UWAGA: Wszystkie poniższe kroki są wykonywane w ciemności (brak świateł w okapie z przepływem laminarnym).
<ol>
	<li>Wyjąć szalki z inkubatora i umieścić je w okapie z przepływem laminarnym do hodowli tkankowych. 
	Za pomocą aspiratora usuń roztwór barwiący.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki, umyj dno okrężnymi ruchami 6-dołkowych płytek, a następnie wyjmij PBS z dołków za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Powtórz krok mycia jeszcze raz i odessaj pozostały PBS ze studni za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Dodać 150 μl dostępnego w handlu odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) na dno każdej studzienki i inkubować płytkę, aż delikatne stukanie w płytkę spowoduje przemieszczenie komórek. Weź 250 μl buforu FACS (PBS, 2 mM EDTA, 0,5% BSA) i mechanicznie zbierz komórki z dołków.</li>
	<li>Przenieś komórki do odpowiedniej (wcześniej oznaczonej) rurki FACS z nasadką filtra. Umieść probówkę z komórkami na lodzie w ciemności do czasu przeprowadzenia analizy (analizę należy przeprowadzić w ciągu godziny po barwieniu). 
	UWAGA: Konfiguracja i kalibracja maszyny FACS zależą od używanej maszyny (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Utwórz nowy eksperyment i nadaj mu nazwę (Ferroptoza w DAOY - wodoronadtlenki lipidów).</li>
	<li>W projekcie eksperymentu wybierz laser (488 nm) i filtr (FITC).</li>
	<li>W view dane wybierz odpowiedni rozmiar komórki (>12 μm), ustaw napięcia PMT (populacja komórek powinna pojawić się w pierwszej ćwiartce wykresu punktowego SSC-H/FSC-H) i bramka wykresu kropkowego.</li>
	<li>Dodaj nowy wykres - histogram, z FITC-A na osi y i skalą logarytmiczną.</li>
	<li>Wirować próbki w probówce FACS, umieścić je w maszynie FACS i załadować próbkę. Nagraj 10 000 zdarzeń wyróżniających FSC i nazwij plik (np. DAOY WT CTL 6h). Wyeksportuj plik jako .fcs.</li>
</ol>
5. Barwienie martwych komórek za pomocą jodku propidyny (PI) podczas leczenia
UWAGA: Projekt eksperymentu jest dokładnie taki sam jak w przypadku pomiaru wodoronadtlenku lipidów (patrz krok 1 i krok 2).
<ol>
	<li>24 godziny po wysiewie wyjmij naczynia z inkubatora i umieść je w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Zebrać pożywkę (z martwymi komórkami) w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodaj 1 ml PBS do każdej studzienki, umyj dno okrężnymi ruchami 6-dołkowych płytek, a następnie zbierz PBS do probówki z odpowiednią pożywką.</li>
	<li>Dodać 200 μl trypsyny (10x rozcieńczenie) na dno każdej studzienki i inkubować płytkę, aż delikatne stukanie w płytkę usunie komórki. Użyj odpowiednich pożywek + PBS, aby zebrać komórki ze studzienek.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 180 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 300 μl buforu FACS i umieścić go na lodzie do czasu analizy.</li>
	<li>Tuż przed analizą dodać roztwór PI (patrz tabela materiałów) do końcowego stężenia 2 μg/ml.</li>
</ol>
6. Analiza martwych komórek metodą cytometrii przepływowej 24 godziny po zabiegu
UWAGA: Ustawienia maszyny FACS i kalibracja są wykonywane jak wcześniej wskazano (patrz krok 4).
<ol>
	<li>Utwórz nowy eksperyment i nadaj mu nazwę (Ferroptosis in DAOY - śmierć komórki).</li>
	<li>W projekcie eksperymentu wybierz laser (488 nm) i filtr (PE).</li>
	<li>W view dane wybierz odpowiedni rozmiar komórki (>12 μm), ustaw napięcia PMT (populacja komórek powinna pojawić się w pierwszej ćwiartce wykresu punktowego SSC-H/FSC-H) i bramka wykresu kropkowego.</li>
	<li>Dodaj nowy wykres - histogram, z PE-A na osi y i skalą logarytmiczną.</li>
	<li>Wirować próbki w probówce FACS, umieścić je w maszynie FACS i załadować próbkę.</li>
	<li>Nagraj 10 000 zdarzeń wyróżniających FSC i nazwij plik (np. DAOY WT CTL 6h). Wyeksportuj plik jako .fcs.</li>
</ol>
7. Analiza zawartości wodoronadtlenku lipidów w komórkach DAOY xCT-/- za pomocą cytometrii przepływowej
UWAGA: komórki xCT-/- zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem24.
<ol>
	<li>W tym eksperymencie należy wysiać komórki, jak wskazano w kroku 2, ale zamiast zabiegu, uzupełnij pożywkę 1 mM NAC przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia utrzymuj NAC w jednej grupie i usuń go z drugiej.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę zawartości wodoronadtlenku lipidów metodą cytometrii przepływowej dokładnie w taki sam sposób, jak opisano w kroku 6.</li>
</ol>
8. Analiza wyników cytometru przepływowego
<ol>
	<li>Otwórz dokument .fcs w oprogramowaniu FlowJo (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie na pojedynczy plik, aby otworzyć wszystkie zdarzenia (nie tylko singlety FCS) zarejestrowane w pojedynczej próbce (wykres punktowy SSC-A/FSC-A). Ponieważ ustawienia są takie, że bramkowanie wykonane na maszynie nie jest zachowywane, konieczne jest ponowne utworzenie bramy i nazwanie populacji (np. DAOY WT).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie na bramkowaną populację, aby otworzyć kolejne okno z histogramem.</li>
	<li>Zmień oś Y na używany filtr fluorescencyjny (Comp-FITC/PE-A).</li>
	<li>Zmień oś X na modalną (znormalizuj każdy pik do jego trybu, tj. do % maksymalnej liczby komórek znajdujących się w określonym pojemniku).</li>
	<li>Skopiuj histogram do edytora układu. Powtórz tę czynność dla wszystkich próbek, a za każdym razem, gdy nowy histogram zostanie wklejony w edytorze układu, przeciągnij go na poprzedni, aby histogramy zostały nałożone (przesunięcie połowiczne).</li>
</ol>

FACS Analysis of Lipid Hydroperoxides in Ferroptotic Medulloblastoma Cells

<ol><li>Dixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+An+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Yang, W. S., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethal+screening+identifies+compounds+activating+iron-dependent%2C+nonapoptotic+cell+death+in+oncogenic-ras-harboring+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells.</a> Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Meister, A., Anderson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione.</a> Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).</li>
<li>Lewerenzm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystine%2Fglutamate+antiporter+system+xc-+in+health+and+disease%3A+From+molecular+mechanisms+to+novel+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Bersuker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQ+oxidoreductase+FSP1+acts+parallel+to+GPX4+to+inhibit+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis.</a> Nature. 575, 688-692 (2019).</li>
<li>Doll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSP1+is+a+glutathione-independent+ferroptosis+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor.</a> Nature. 575, 693-698 (2019).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+GCH1%2FBH4+axis+activates+ferritinophagy+to+mitigate+the+resistance+of+colorectal+cancer+to+erastin-induced+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis.</a> Front Cell Dev Biol. 10, (2022).</li>
<li>Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ferroptosis+as+a+vulnerability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).</li>
<li>Viswanathan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+a+therapy-resistant+state+of+cancer+cells+on+a+lipid+peroxidase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway.</a> Nature. 547, 453-457 (2017).</li>
<li>Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+of+epithelial-mesenchymal+transition+promotes+ferroptosis+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer.</a> Redox Biol. 37, 101697(2020).</li>
<li>Hangauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-tolerant+persister+cancer+cells+are+vulnerable+to+GPX4+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition.</a> Nature. 551, 247-250 (2017).</li>
<li>Zhang Tuo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+induces+ACSL4-dependent+ferroptosis+during+cerebral+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion.</a> Signal Transduct Target Ther. 7, 59(2022).</li>
<li>Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ferroptosis+and+emerging+links+to+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Front Aging Neurosci. 14, (2022).</li>
<li>Zhuo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+ferroptosis+in+glioblastoma%3A+Therapeutic+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges.</a> Front Mol Biosci. 9, (2022).</li>
<li>Bisaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+from+medullospheres+reveals+a+role+for+iron+in+the+cancer+progression+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma.</a> Mol Cell Ther. 3, 8(2015).</li>
<li>Schonberg, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+iron+trafficking+characterizes+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells.</a> Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).</li>
<li>Werbowetski-Ogilvie, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sorting+to+sequencing+in+the+molecular+era%3A+the+evolution+of+the+cancer+stem+cell+model+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma.</a> FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).</li>
<li>Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+cystine-glutamate+exchange+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis.</a> Elife. 3, e02523(2014).</li>
<li>Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+modulates+cell+survival+in+a+Ras-+and+MAPK-dependent+manner+in+ovarian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells.</a> Cell Death Dis. 4, e592(2013).</li>
<li>Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C11-BODIPY581%2F591%2C+an+oxidation-sensitive+fluorescent+lipid+peroxidation+probe%3A+%28Micro%29spectroscopic+characterization+and+validation+of+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology.</a> Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).</li>
<li>Miotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mechanism+of+ferroptosis+inhibition+by+ferrostatin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1.</a> Redox Biol. 28, 101328(2020).</li>
<li>Daher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+ablation+of+the+cystine+transporter+xCT+in+PDAC+cells+inhibits+mTORC1%2C+growth%2C+survival%2C+and+tumor+formation+via+nutrient+and+oxidative+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses.</a> Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).</li>
<li>Shimada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+cell+death+mechanisms+reveals+metabolic+regulation+of+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis.</a> Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).</li>
<li>Yang, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+lipoxygenases+drives+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).</li>
<li>Gaschler, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FINO2+initiates+ferroptosis+through+GPX4+inactivation+and+iron+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation.</a> Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).</li>
<li>Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryparedoxin+peroxidase-deficiency+commits+trypanosomes+to+ferroptosis-type+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death.</a> Elife. 7, e37503(2018).</li>
<li>Cheloni, G., Slaveykova, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+C11-BODIPY581%2F591+dye+for+the+determination+of+lipid+oxidation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry.</a> Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).</li>
<li>Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitation+of+BODIPY+as+a+probe+for+the+evaluation+of+lipid+peroxidation+and+its+inhibition+by+antioxidants+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma.</a> Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducer+erastin+irreversibly+inhibits+system+xc%E2%88%92+and+synergizes+with+cisplatin+to+increase+cisplatin%27s+cytotoxicity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin's cytotoxicity in cancer cells.</a> Sci Rep. 8, 968(2018).</li>
<li>Cheff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducing+compounds+RSL3+and+ML162+are+not+direct+inhibitors+of+GPX4+but+of+TXNRD1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1.</a> Redox Biol. 62, 102703(2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+degradation+mechanism+of+GPX4+degrader+in+induction+of+ferroptosis+exerting+anti-resistant+tumor+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect.</a> Eur J Med Chem. 247, 115072(2023).</li>
<li>Vucetic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Together+we+stand%2C+apart+we+fall%3A+how+cell-to-cell+contact%2Finterplay+provides+resistance+to+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis.</a> Cell Death Dis. 11, 789(2020).</li>
<li>Meira, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cystine-cysteine+intercellular+shuttle+prevents+ferroptosis+in+xctko+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers (Basel). 13 (6), 1434(2021).</li>
</ol>

Oświadczamy, że nie ma konfliktu interesów w związku z prezentowanym tu badaniem.

Podstawową cechą charakterystyczną ferroptotycznej śmierci komórki jest niekontrolowane nagromadzenie wodoronadtlenków lipidów w błonie komórkowej. To uszkodzenie oksydacyjne może wystąpić w sposób enzymatyczny lub nieenzymatyczny, ale w obu przypadkach reakcja jest zależna od żelaza / katalizowana, co wyjaśnia nazwę tego typu śmierci komórki. Hydroperoksydacja lipidów jest często pośrednio szacowana poprzez pomiar produktów degradacji hydroperoksydacji lipidów, takich jak 4-hydroksy-2,3-trans-nonenal (4-HNE) lub aldehyd malonowy (MDA). Produkty te, powstające w wyniku peroksydacyjnego rozkładu wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, mogą reagować z różnymi makrocząsteczkami, prowadząc do wielu różnych patologii, takich jak między innymi zaburzenia neurodegeneracyjne, cukrzyca i przewlekła niewydolność serca. Niemniej jednak są to konsekwencje zdarzenia peroksydacji i włożono znaczny wysiłek w opracowanie dobrych sond specyficznych dla wodoronadtlenku lipidów.
Jedną z często używanych sond jest BODIPY 581/591 C11, która ma również swoje wady, które należy wziąć pod uwagę. W szczególności kolor fluorescencji BODIPY 591/581 wykazuje dwa piki emisji, jeden w stanie zredukowanym (590 nm) i jeden w stanie utlenionym (510 nm). Stosunek między fluorescencją przy tych dwóch długościach fal ma szczególne znaczenie, jeśli celem jest precyzyjna kwantyfikacja. Jednak intensywność fluorescencji pojedynczej emisji BODIPY 591/581 nm była szeroko stosowana w literaturze 1,25,26,27,28, zwłaszcza że zmniejszona intensywność emisji czerwieni przy 510 nm jest często maskowana przez rozlanie się fluorescencji utlenionej cząsteczki 22,29. Jest to jeden z głównych powodów, dla których fluorescencja BODIPY 591/581 jest zwykle przedstawiana w sposób jakościowy jako funkcja intensywności pojedynczej (zielonej) fluorescencji.
Innym ważnym ograniczeniem tej sondy jest jej tłumienie emisji fluorescencji przez przeciwutleniacze w sposób zależny od stężenia30. Dlatego barwienie powinno odbywać się w pożywkach bez suplementacji przeciwutleniaczami. W niniejszym protokole zastosowano ferrostatynę 1, silny wymiatacz wodoronadtlenków lipidów; niemniej jednak przed dodaniem sondy ferrostatyna 1 została usunięta, a komórki przemyto PBS, aby sonda nie była narażona na jej aktywność przeciwutleniającą.
Jeśli chodzi o indukcję ferroptozy, można zastosować wiele dostępnych na rynku leków. W tym przypadku zastosowano erastynę, nieodwracalny inhibitor transportera xCT31. Biorąc pod uwagę, że wiąże się kowalencyjnie z transporterem, można stosować jeszcze wyższe stężenia (do 100 μM) przez krótszy czas (5 minut), a następnie etap płukania31. Aby ocenić dokładną kinetykę ferroptozy po całkowitym zahamowaniu xCT, wykorzystano komórki xCT -/- przy braku NAC. Masywne nagromadzenie wodoronadtlenków lipidów było wykrywalne po 6 godzinach, a praktycznie żadne żywe komórki nie były wykrywalne 24 godziny po wysiewie. Jeśli chodzi o RSL3, bardzo silny induktor ferroptozy w zakresie nanomolowym, wykazywał on kinetykę podobną do tej obserwowanej w komórkach xCT. Jego sposób działania jest nadal dość kontrowersyjny, ale wydaje się, że nie wpływa na aktywność, ale zamiast tego indukuje degradację enzymu GPx432,33.
Ważnym aspektem indukcji ferroptozy in vitro jest zbieg komórek. Od dawna obserwuje się, że zlewająca się warstwa komórkowa jest znacznie bardziej odporna na głód cysteiny, hamowanie xCT lub GPx4, zubożenie GSH itp.34. Głównym podawanym powodem jest to, że kontakt fizyczny, tj. zbieg, prowadzi do aktywacji szlaku hipopotama, który z kolei obniża metabolizm i wewnętrzną produkcję reaktywnych form tlenu (ROS). Co więcej, transport zredukowanej cysteiny może również przyczyniać się do oporności na niepełne hamowanie xCT35. W niniejszym badaniu zastosowano stężenie 1 000 000 komórek na studzienkę (płytka 6-dołkowa) w celu utrzymania niskiej konfluencji z komórkami, które są dość duże i płaskie. Jednak w przypadku mniejszych i okrągłych komórek, takich jak HD-MB03, liczba ta może zostać zwiększona do 1,50 000-2,00,000 komórek na dołek (płytka 6-dołkowa).
Ostatnim ograniczeniem niniejszego badania jest wykrycie śmierci komórki metodą jodku propidyny (PI). Metoda ta jest przyjazna dla użytkownika do wykrywania dowolnego rodzaju śmierci komórki, a ferroptozę można odróżnić od innych typów śmierci komórek za pomocą inhibitorów specyficznych dla ferroptozy, takich jak ferrostatyna-1. Barwienie PI opiera się na fakcie, że umierające komórki tracą integralność błony, co pozwala PI przenikać do komórek, interkalować między zasadami DNA i emitować sygnał fluorescencyjny. Warto jednak zauważyć, że hydroperoksydacja lipidów indukuje "wyciek" błony, co umożliwia przenikanie PI jeszcze przed śmiercią komórki. W związku z tym oszacowanie kinetyki ferroptozy na podstawie samej tej metody jest trudne.

Ferroptosis to nowo kontekstualizowany, zależny od reaktywnych form tlenu (ROS) typ śmierci komórkowej1. Oprócz ROS, żelazo odgrywa kluczową rolę w tym typie śmierci komórki, stąd nazwa2. Ostatnim i wykonawczym etapem ferroptozy jest katalizowana żelazem akumulacja uszkodzeń oksydacyjnych lipidów w błonie plazmatycznej, która ostatecznie prowadzi do naruszenia integralności błony i selektywnej przepuszczalności, a ostatecznie do śmierci komórki przez bulgotanie. Zdarzenie hydroperoksydacji lipidów jest zjawiskiem występującym naturalnie; Jednak jego rozprzestrzenianiu się przez błonę komórkową zapobiega obrona antyoksydacyjna komórki. Głównym graczem w tym kontekście jest peroksydaza glutationowa 4 (GPx4) w białku Se, która może zbliżyć się do błony i przekształcić wodoronadtlenki lipidów w ich mniej toksyczne pochodne alkoholowe3. Moc redukcyjna GPx4 jest głównie, ale nie wyłącznie, dostarczana przez glutation (GSH), tripeptyd złożony z aminokwasów endogennych: glicyny, glutaminianu i cysteiny. Aminokwasem ograniczającym szybkość biosyntezy GSH jest cysteina4. Chociaż cysteina jest klasyfikowana jako aminokwas endogenny, jej zapotrzebowanie może łatwo przekroczyć jej wewnętrzną produkcję w komórkach o wysokiej proliferacji (takich jak komórki rakowe). W związku z tym został przeklasyfikowany do grupy aminokwasów półegzogennych. Niezbędny import cysteiny odbywa się głównie poprzez system Xc-, który pozwala na import utlenionej (dominującej) formy cysteiny (inaczej cystyny) kosztem eksportu glutaminianu5. System Xc- składa się z podjednostki transportowej niezależnej od Na+, zależnej od Cl, znanej jako xCT, oraz podjednostki opiekuńczej, znanej jako CD98. Do niedawna właściwości antyferroptotyczne osi xCT-GSH-GPx4 były postrzegane jako unikalne i niepowtarzalne6. Jednak w 2019 roku opisano alternatywny szlak antyferroptozowy, składający się z ubichinolu (koenzymu Q10) i jego enzymu regeneracyjnego - białka supresorowego ferroptozy 1 (FSP1), 7,8. Wkrótce potem doniesiono o kolejnym systemie detoksykacji wodoronadtlenku lipidów z udziałem cyklohydrolazy GTP-1/tetrahydrobiopteryny (GCH1/BH4)9. Niemniej jednak centralna rola osi xCT-GSH-GPx4 w zapobieganiu ferroptozie wydaje się nie być kwestionowana.
W ciągu ostatniej dekady, ferroptoza była intensywnie badana w różnych typach nowotworów, wykazując duży potencjał jako strategia przeciwnowotworowa (recenzowane przez Lei et al.10). Ponadto doniesiono, że komórki rakowe wykazujące wysoką oporność na konwencjonalne chemioterapeutyki i/lub skłonność do przerzutów są zaskakująco wrażliwe na induktory ferroptozy, takie jak inhibitory GPx411,12,13. Jednak w kontekście nowotworów mózgu potencjał induktorów ferroptotycznych pozostaje w dużej mierze niedostatecznie zbadany. Podczas gdy ten rodzaj śmierci komórki jest ściśle związany z uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym mózgu14i chorobami neurodegeneracyjnymi15, jego potencjał w kontekście guzów mózgu jest głównie ograniczony do glejaka, najczęstszego złośliwego nowotworu czaszkowo-mózgowego (sprawdzone przez Zhuo et al.16). Z drugiej strony, wrażliwość rdzeniaka zarodkowego, najczęstszego złośliwego nowotworu mózgu u dzieci i głównej przyczyny śmiertelności w dzieciństwie, na induktory ferroptozy pozostaje w dużej mierze niezbadana. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, istnieje niewiele recenzowanej literatury łączącej ferroptozę z rdzeniakiem zarodkowym. Niemniej jednak niektóre badania wykazały, że żelazo odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu, proliferacji i potencjale rakotwórczym komórek macierzystych raka (CSC) zarówno rdzeniaka, jak i glejaka17,18, potencjalnie czyniąc je bardziej podatnymi na indukcję ferroptozy. Jest to szczególnie istotne, ponieważ rdzeniak zarodkowy jest znany z subpopulacji CSC, czyli komórek inicjujących/rozmnażających nowotwór, które wydają się być w dużej mierze odpowiedzialne za chemooporność guza, rozprzestrzenianie się i nawroty19.
Wrażliwość na indukcję ferroptozy jest zazwyczaj badana poprzez pomiar zawartości/akumulacji wodoronadtlenku lipidów, co może, ale nie musi prowadzić do śmierci komórki. Najczęściej stosowanymi induktorami ferroptozy są: (1) erastyna, inhibitor transportera xCT 20, (2) RSL3, inhibitor enzymu GPx4 2, i/lub (3) donory żelaza, takie jak cytrynian żelazoamoniowy (FAC)21. Zawartość wodoronadtlenku lipidów ocenia się za pomocą sondy selektywnej BODIPY 581/591 C1122, która ma maksima wzbudzenia i emisji przy 581/591 nm w stanie zredukowanym. Po interakcji i utlenieniu przez wodoronadtlenki lipidów, sonda przesuwa swoje maksima wzbudzenia i emisji do 488/510 nm. Zazwyczaj znaczny wzrost zawartości wodoronadtlenku lipidów poprzedza ferroptotyczną śmierć komórki. Ponieważ ferroptoza nie jest zaprogramowaną śmiercią komórki, nie ma molekularnej kaskady sygnalizacyjnej prowadzącej do jej wykonania. Dlatego jedynym sposobem, aby to potwierdzić, jest monitorowanie zawartości wodoronadtlenku lipidów i stosowanie specyficznych inhibitorów tego typu śmierci komórek, takich jak ferrostatyna 123. Ferrostatyna 1 jest lipofilowym przeciwutleniaczem, który może przenikać do przedziału lipidowego komórki i detoksykować wodoronadtlenki lipidów, zapobiegając w ten sposób zdarzeniom ferroptotycznym.

<table><tbody><tr><td>BODIPY 581/591 C11</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3861</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Beckman</td><td>Coulter Z1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM średni&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Erastin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7781-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian żelazoamminium</td><td>Acros Organics</td><td>211842500</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatin-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0583-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodowa (FBS)</td><td>Dominique Dutcher</td><td>500105N1N</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Melody</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek Gibco StemPro Accutase</td><td>Thermo Fisher</td><td>11599686</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania mykoplazmy</td><td>InvivoGen</td><td>rep-pt1</td><td></td></tr><tr><td>jodek propidyny</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2234-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna - EDTA 10X - 100 ml</td><td>Dominique Dutcher</td><td>X0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

ujawnienie ferroptotycznego fenotypu rdzeniaka zarodkowego

Revealing the Ferroptotic Phenotype of Medulloblastoma

Interakcja żelaza i tlenu jest integralną częścią rozwoju życia na Ziemi. Niemniej jednak ta wyjątkowa chemia nadal fascynuje i intryguje, prowadząc do nowych przedsięwzięć biologicznych. W 2012 roku grupa z Columbia University uznała tę interakcję za centralne zdarzenie prowadzące do nowego rodzaju regulowanej śmierci komórki zwanej "ferroptozą". Główną cechą ferroptozy jest akumulacja wodoronadtlenków lipidów z powodu (1) dysfunkcyjnej obrony antyoksydacyjnej i/lub (2) przytłaczającego stresu oksydacyjnego, który najczęściej zbiega się ze zwiększoną zawartością wolnego labilnego żelaza w komórce. Zwykle zapobiega temu kanoniczna oś antyferroptotyczna składająca się z transportera cystyny xCT, glutationu (GSH) i peroksydazy GSH 4 (GPx4). Ponieważ ferroptoza nie jest zaprogramowanym typem śmierci komórki, nie obejmuje szlaków sygnałowych charakterystycznych dla apoptozy. Najczęstszym sposobem udowodnienia tego typu śmierci komórki jest użycie lipofilowych przeciwutleniaczy (witaminy E, ferrostatyny-1 itp.), Aby jej zapobiec. Cząsteczki te mogą zbliżać się do uszkodzeń oksydacyjnych w błonie plazmatycznej i detoksykować je. Innym ważnym aspektem w odkrywaniu fenotypu ferroptotycznego jest wykrycie poprzedzającej akumulacji wodoronadtlenków lipidów, do których stosuje się specyficzny barwnik BODIPY C11. Niniejszy manuskrypt pokaże, w jaki sposób ferroptoza może być indukowana w komórkach rdzeniaka zarodkowego typu dzikiego przy użyciu różnych induktorów: erastyny, RSL3 i donora żelaza. Podobnie zostaną wykorzystane komórki xCT-KO, które rosną w obecności NAC i które ulegają ferroptozie po usunięciu NAC. Charakterystyczny fenotyp "bulgotania" jest widoczny pod mikroskopem świetlnym w ciągu 12-16 godzin od momentu wyzwolenia ferroptozy. Ponadto zostanie zastosowane barwienie BODIPY C11, a następnie analiza FACS w celu wykazania akumulacji wodoronadtlenków lipidów i wynikającej z tego śmierci komórki przy użyciu metody barwienia PI. Aby udowodnić ferroptotyczny charakter śmierci komórki, ferrostatyna-1 zostanie użyta jako specyficzny środek zapobiegający ferroptozie.

Linię komórkową medulloblastoma DAOY hodowano w standardowej pożywce DMEM uzupełnionej o 8% FBS, aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 60%. W dniu eksperymentu komórki zebrano i wysiano w płytkach 6-dołkowych w zagęszczeniu 100 000 komórek na dołek, zgodnie z Tabela 1Następnego dnia komórki (w trzech powtórzeniach) poddano działaniu albo 1 µM erastyny, 0.3 µM RSL3 lub 250 µM metodą FAC. Następnie płytki umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22Po 6 h komórki obserwowano pod mikroskopem w celu wykrycia pęcherzykowania komórek, na co wskazują strzałki w Rysunek 1Służyło to jako wskaźnik, że lek skutecznie indukuje ferroptozę przed przygotowaniem komórek do barwienia na hydroperoksydy lipidów i późniejszej analizy FACS.
Do detekcji zawartości hydroperoksydów lipidów wykorzystano specyficzny barwnik BODIPY 581/591 C11 w końcowym stężeniu 2 µM przez 30 min. Ponieważ barwnik ten jest wrażliwy na utlenianie i redukcję, konieczne było usunięcie z komórek wszelkich czynników traktujących oraz przemycie ich uprzednio ogrzanym PBS. Po półgodzinnym barwieniu komórki przemyto dwukrotnie PBS, odłączono za pomocą roztworu do odłączania komórek i przygotowano do analizy FACS. Dane uzyskane na tym etapie wykazały zwiększoną zieloną fluorescencję barwnika w próbkach traktowanych wszystkimi trzema lekami (Rysunek 2). Jednak najsilniejszy efekt zaobserwowano przy zastosowaniu 0,3 µM RSL3 (Rysunek 2B), podczas gdy 1 µM erastyny (Rysunek 2A) oraz 250 µM FAC (Rysunek 2C) wykazały nieco słabszy efekt po 6 h traktowania.
Aby wykazać, że wykryta akumulacja hydroperoksydów lipidów prowadzi do śmierci komórkowej, a konkretnie do ferroptozy, zastosowano te same zabiegi opisane w Tabeli 1 przez 24 h. Do analizy martwych komórek metodą cytometrii przepływowej zebrano zarówno komórki, jak i supernatant. Żywe oraz martwe komórki odwirowano w wirówce, a następnie resuspenderowano w buforze FACS do późniejszej analizy cytometrycznej. Dane przedstawione na Rysunku 3 wykazały, że wszystkie trzy zabiegi wywołały masową śmierć komórek, której całkowicie zapobiegło zastosowanie specyficznego inhibitora ferroptozy, ferrostatin-1. Jasno potwierdza to występowanie ferroptotycznej śmierci komórek po inhibicji xCT, inhibicji GPx4 lub przeciążeniu żelazem w komórkach medulloblastoma.
Z uwagi na to, że trzy leki wykazały nieco odmienne efekty w zakresie akumulacji nadtlenków lipidów, co prawdopodobnie wynikało z różnic w ich mocy, zastosowano podejście genetyczne w celu zbadania pełnej potencji induktorów ferroptozy. Wcześniej uzyskane komórki DAOY xCT-/- (Supplementary Figure 1A) hodowano w tym samym medium co ich odpowiedniki WT, ale z dodatkiem NAC. Ta selekcja pozytywna umożliwiła wzrost komórek xCT-/- w kulturze. Jednak 6 h po usunięciu NAC z pożywki hodowlanej, komórki zaczęły akumulować nadtlenki lipidów na poziomie zbliżonym do komórek WT traktowanych RSL3 (Figure 4). Podobnie jak w przypadku inhibicji farmakologicznej, usunięcie NAC z pożywki wywołało charakterystyczne pęcherzykowanie komórek xCT-/- po 6 h (Supplementary Figure 1B).
<img alt="Test żywotności komórek, obrazy mikroskopowe; porównanie wpływu inhibitora ferroptozy; pasek skali 50 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Fenotyp ferroptotyczny komórek medulloblastoma. Reprezentatywne mikrografie komórek DAOY WT traktowanych (lub nie) przez 6 h 1 µM erastyny (ERA), 0,3 µM RSL3 lub 250 µM cytrynianu ferroamonu (FAC) w obecności lub braku 2 μM inhibitora ferroptozy Ferrostatin-1 (Ferro-1). Białe strzałki wskazują okrągłe, „pęcherzykowate” komórki, co wskazuje na fenotyp ferroptotyczny widoczny pod mikroskopem świetlnym. Powiększenie: 20x, wstawki: 40x. Paski skali: 50 µm, wstawki: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej wykazująca efekty ERA, RSL3 i FAC; obejmuje wykresy kropkowe i histogramy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Nadtlenek lipidowy jako kluczowy marker ferroptozy w komórkach medulloblastoma. Reprezentatywne dane z barwienia nadtlenków lipidowych metodą cytometrii przepływowej w komórkach traktowanych przez 6 h (A,B) 1 µM erastyny (ERA), (C,D) 0,3 µM RSL3 lub (E,F) 250 µM cytrynianu żelaza(III) (FAC), w obecności lub bez 2 µM inhibitora ferroptozy Ferrostatin-1 (Ferro-1). (A,C,E) Wykresy kropkowe zarejestrowanych zdarzeń; (B,D,F) reprezentacja histogramowa zawartości nadtlenków lipidowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej; analiza żywotności komórek, porównanie efektów traktowania; badanie wpływu związków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Indukcja śmierci komórkowej drogą ferroptozy za pomocą podejścia farmakologicznego. Reprezentatywne wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej komórek barwionych jodkiem propidynyum po 6 h traktowania 1 µM erastyny (ERA), 0,3 µM RSL3 lub 250 µM cytrynianu żelaza(III)-amonu (FAC), w obecności lub bez 2 µM inhibitora ferroptozy Ferrostatin-1 (Ferro-1). Bramkowanie oddziela populacje komórek żywych (Q4) i martwych (Q3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej, komórki DAOY z inhibitorem xCT, histogramy i wykresy kropkowe, różnicowanie komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Indukcja ferroptozy metodą genetyczną. Reprezentatywne dane z barwienia nadtlenków lipidów metodą cytometrii przepływowej w komórkach DAOY WT oraz xCT-/- po 6 h w obecności lub w przypadku braku 2 µM inhibitora ferroptozy Ferrostatin-1 (Ferro-1). Po lewej stronie przedstawiono histogramy zawartości nadtlenków lipidów. Po prawej stronie znajdują się wykresy kropkowe zarejestrowanych zdarzeń. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tablica I </td>
			<td>CTL I</td>
			<td>CTL II </td>
			<td>CTL III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 µM erastyna I</td>
			<td>1 µM erastyna II</td>
			<td>1 µM erastyna III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tablica II </td>
			<td>0.3 µM RSL3 I</td>
			<td>0.3 µM RSL3 II</td>
			<td>0.3 µM RSL3 III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>250 µM FAC I</td>
			<td>250 µM FAC II</td>
			<td>250 µM FAC III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tablica III </td>
			<td>2 µM Ferro-1 I</td>
			<td>2 µM Ferro-1 II</td>
			<td>2 µM Ferro-1 III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 M erastyny + 2 M Ferro-1</td>
			<td>1 M erastyny + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>1 M erastyny + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tablica IV </td>
			<td>0,3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 I</td>
			<td>0,3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>0,3 M RSL3 + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>250 µM FAC + 2 µM Ferro-1 I</td>
			<td>250 $\mu$M FAC + 2 $\mu$M Ferro-1 II</td>
			<td>250 $\mu$M FAC + 2 $\mu$M Ferro-1 III</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Szczegóły traktowania komórek kontrolnych i doświadczalnych.
Rycina uzupełniająca 1: Śmierć ferroptotyczna komórek DAOY xCT-/-. (A) Analiza Western blot poziomu xCT w komórkach DAOY WT oraz xCT-/- w pożywce DMEM z dodatkiem lub bez dodatku 2 µM Ferrostatiny-1. (B) Reprezentatywne mikrofotografie komórek DAOY xCT-/- w obecności (lewo) i przy braku (prawo) 1mM N-acetylcysteiny przez 6 h. Białe strzałki wskazują okrągłe, „pęcherzykowate” komórki, co wskazuje na fenotyp ferroptotyczny widoczny pod mikroskopem świetlnym. Powiększenie: 40x. Paski skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Zawartość wodoronadtlenku lipidów stanowi najczęściej używany wskaźnik śmierci komórek ferroptotycznych. W artykule przedstawiono krok po kroku analizę zawartości wodoronadtlenku lipidów w komórkach po indukcji ferroptozy za pomocą cytometrii przepływowej.

Ujawnienie ferroptotycznego fenotypu rdzeniaka zarodkowego

The interaction of iron and oxygen is an integral part of the development of life on Earth. Nonetheless, this unique chemistry continues to fascinate and ...

Ostatecznym celem naszych badań jest opracowanie nowych metod leczenia nowotworów dziecięcych, takich jak rdzeniak zarodkowy. W tym celu nasz zespół opracowuje nowe systemy modelowe podkreślające genetyczne podłoże choroby, a także wykorzystujące nowe ścieżki terapeutyczne. W ostatnich latach genomika pojedynczych komórek ujawniła, w jaki sposób upośledzone zaangażowanie w linię wpływa na wyniki kliniczne nowotworów dziecięcych, a także odpowiedź na leczenie i ostatecznie rozwój opornych na leczenie populacji komórek w obrębie guza.Spektrum stanu zróżnicowanego neuronalnego progenitora wydaje się leżeć u podstaw wyników klinicznych raka u dzieci. Głównym wyzwaniem jest zrozumienie tych wysoce plastycznych, nieposiadających lub niewystarczająco progenitorów w obrębie nowotworów, a także opracowanie nowych metod leczenia, które są bardziej skuteczne i mniej szkodliwe dla tych chorób. Z tego punktu widzenia nasze badania nad ferroptozą wydają się niezwykle obiecujące.Uzależnienie od żelaza jest jedną z głównych podatności komórek rakowych, znanych również jako rakowe komórki macierzyste. Żelazo, wszystkie niezbędne pierwiastki, jest mieczem obosiecznym, ponieważ jego reakcja z reaktywnymi formami tlenu może prowadzić do określonego rodzaju śmierci komórki, która nazywa się ferroptozą. Nasze dane wyraźnie pokazały, że ferroptoza ma ogromny potencjał przeciwko tego typu komórkom nowotworowym.Aby rozpocząć wysiew w hodowli, linie komórkowe rdzeniaka zarodkowego typu dzikiego w płytce sześciodołkowej. Po 24 godzinach dodaj do komórek odpowiedni środek indukujący ferroptozę i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po sześciu godzinach leczenia obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym pod kątem zaokrąglenia komórek.Za pomocą aspiratora usuń pożywkę i pływające komórki z płytki pod laminarnym przepływem powietrza. Aby umyć komórki, dodaj dwa mililitry PBS, delikatnie zamieszaj i odessaj PBS. Następnie dodaj dwa mililitry roztworu roboczego sondy i inkubuj płytkę w ciemności.Obrazy mikroskopowe światła komórek typu dzikiego DAOY potraktowanych jednym mikromolem erastyny wykazały okrągłe bulgoczące komórki, co wskazuje na fenotyp ferroptozy. Aby rozpocząć inkubację komórek rdzeniaka zarodkowego wywołanych ferroptozą, należy je wykonać za pomocą ciała PC 11 i usunąć roztwór barwiący pod laminarnym kapturem. Po umyciu komórek dwoma mililitrami PBS inkubować komórki ze 150 mikrolitrami odczynnika do dysocjacji komórek.Aby mechanicznie zebrać komórki, dodaj 250 mikrolitrów buforu cytometrii przepływowej i delikatnie postukaj w płytkę. Następnie przenieś komórki do znakowanej rurki do cytometrii przepływowej z nasadką filtrującą. Następnie włącz maszynę FACS.Utwórz nowy eksperyment i wybierz filtr FITC oraz laser 488 nanometrów. W polu Wyświetl dane wybierz rozmiar komórki większy niż 12 mikrometrów i bramkuj wykres punktowy. Następnie dodaj nowy histogram wykresu z FITCA na osi i skalą logarytmiczną.Następnie zwirować próbkę pobraną w probówce i załadować ją do maszyny FACS. Na koniec nagraj 10 000 zdarzeń wyróżniających rozproszenie do przodu. Aby zabarwić martwe komórki, dodaj roztwór jodku propidyny tuż przed analizą FACS.Analiza hydroperoksydacji lipidów za pomocą cytometrii przepływowej potwierdziła indukcję ferroptozy w komórkach rdzeniaka zarodkowego leczonych erastyną.

revealing-the-ferroptotic-phenotype-of-medulloblastoma

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy protokół opisuje izolację, wzbogacanie i utrzymanie komórek macierzystych nowotworu medulloblastoma pochodzących od mutantowych myszy z ektopową aktywnością szlaku Sonic hedgehog.

Izolacja, namnażanie i utrzymanie komórek macierzystych medulloblastomy

Niniejszy protokół opisuje izolację i dysocjację tkanki medulloblastoma myszy oraz późniejsze alloprzeszczepienie komórek nowotworowych do myszy biorców z niedoborem odporności w celu zainicjowania wtórnego medulloblastoma.

Wewnątrzczaszkowe ortotopowe przeszczepianie allogeniczne komórek medulloblastoma u myszy z niedoborem odporności

Tutaj opisujemy skuteczny i wszechstronny protokół do indukcji, monitorowania i analizy nowych glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o histopatologicznej charakterystyce ludzkiego GBM.

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia manipulacji genetycznej w mózgu fretki embrionalnej za pomocą elektroporacji in utero. Metoda ta pozwala na celowanie w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej in vivo.

Celowanie in vivo w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej fretki za pomocą elektroporacji in utero

Korzystając z elektroporacji in ovo, opracowaliśmy metodę selektywnego transfekowania wewnętrznego ucha słuchowego i jądra ślimakowego w zarodkach kurczaków, aby osiągnąć specyficzne dla danej grupy komórek eliminację delikatnego białka X w upośledzeniu umysłowym podczas dyskretnych okresów składania obwodów.

Analiza autonomicznej funkcji białka upośledzenia umysłowego Fragile X w obwodzie słuchowym za pomocą elektroporacji in ovo

Metody pozwalające na charakterystykę i izolację populacji komórek macierzystych z próbek biologicznych są kluczowe dla rozwoju terapii komórek macierzystych w leczeniu raka i nie tylko. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji nowotworowych komórek macierzystych przy użyciu fenotypu populacji bocznej wywołanego barwnikiem.

Wykorzystanie fenotypu populacji bocznej wyzwalanego barwnikiem DNA do wykrywania i oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych z próbek biologicznych

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek apoptotycznego raka piersi poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i dalsze wykrywanie przejścia komórek raka piersi niebędących komórkami macierzystymi do komórek podobnych do komórek macierzystych raka piersi po odwróceniu apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie cytometryczne przepływowe nowo powstałych komórek przypominających komórki macierzyste raka piersi po odwróceniu apoptozy

Ten protokół przedstawia szybką metodę jednoczesnego generowania kultur melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy w wieku 0-4 dni. Te pierwotne kultury mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania różnych fizjologicznie istotnych procesów, w tym biologii komórek skóry, pigmentacji, gojenia się ran i czerniaka.

Szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów

W tym artykule przedstawiliśmy zestaw praktycznych i wykonalnych metod charakteryzowania mutantów kinaz rodziny RAF związanych z chorobą, które obejmują test kinazy in vitro, test koaktywacji RAF i komplementarny test rozszczepionej lucyferazy.

Scharakteryzować związane z chorobą mutanty kinaz z rodziny RAF przy użyciu zestawu praktycznych i wykonalnych metod

Odkryj metodę indukcji ferroptozy w komórkach rdzeniaka zarodkowego w celu oceny potencjału terapeutycznego. Technika ta umożliwia badanie nowych strategii leczenia nowotworów pediatrycznych.

Ujawnienie ferroptotycznego fenotypu rdzeniaka zarodkowego

Przeglądaj więcej filmów