Name: Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj metodę izolacji, ekspansji i nukleofekcji nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Technika zapewnia wysoką wydajność dostarczania genów i przeżywalność komórek powyżej 80%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty od Ministerio de Ciencia e Innovación i Agencia Estatal de Investigación (MCIN/AEI) (PID2019-110045GB-I00; PID2022-142734OB-I00 i EUR2023-143479) do SRF. EJV (FPU20/00795) i DSL (FPU22/03797) są finansowane przez hiszpański program stypendialny Formación de Profesorado Universitario (FPU). LLC (PRE2020-094137) i JDM (PREP2022-000680) są finansowane przez hiszpański program stypendialny Formación de Personal Investigador (FPI). CMM (CIACIF/2022/366) jest finansowany przez Generalitat Valenciana. MIL (CPI-22-481) jest finansowany ze stypendium Programa INVESTIGO (Next Generation EU). Finansowanie w ramach otwartego dostępu zapewnia Ministerio de Ciencia e Innovación.

Efficient Nucleofection of NSCs Isolated from the Murine Subventricular Zone

<ol><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).</li>
<li>Ming, G., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Ann Rev Neurosci. 28 (1), 223-250 (2005).</li>
<li>Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+astrocytes+are+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain.</a> Cell. 97 (6), 703-716 (1999).</li>
<li>Obernier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+is+sustained+by+symmetric+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).</li>
<li>Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+germinal+layer+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain.</a> Proc Natl Acad Sci. 96 (20), 11619-11624 (1999).</li>
<li>Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+and+three-dimensional+organization+of+the+subventricular+germinal+zone+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain.</a> J Neurosci. 17 (13), 5046-5061 (1997).</li>
<li>Mamber, C., Kozareva, D. A., Kamphuis, W., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shades+of+gray%3A+The+delineation+of+marker+expression+within+the+adult+rodent+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Shades of gray: The delineation of marker expression within the adult rodent subventricular zone.</a> Prog Neurobiol. 111, 1-16 (2013).</li>
<li>Cebrian-Silla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+ventricular-subventricular+zone+reveals+signatures+of+dorsal+and+ventral+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the ventricular-subventricular zone reveals signatures of dorsal and ventral adult neurogenesis.</a> eLife. 10, e67436(2021).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), New York, N.Y. 1707-1710 (1992).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (45), e2393(2010).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).</li>
<li>Ferrón, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+loss+of+Dlk1+imprinting+in+stem+cells+and+niche+astrocytes+regulates+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Postnatal loss of Dlk1 imprinting in stem cells and niche astrocytes regulates neurogenesis.</a> Nature. 475 (7356), 381-385 (2011).</li>
<li>Gil-Perotín, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+from+the+subventricular+zone%3A+A+review+of+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Record%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells from the subventricular zone: A review of the neurosphere assay.</a> Anat Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).</li>
<li>Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+origin%2C+heterogeneity+and+regulation+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain.</a> Development. 146 (4), 156059(2019).</li>
<li>Ferrón, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+ex%2Fin+vivo+assay+to+detect+effects+of+exogenously+added+factors+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells.</a> Nat Prot. 2 (4), 849-859 (2007).</li>
<li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131 (16), 4059-4070 (2004).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Meth. 3 (10), 801-806 (2006).</li>
<li>Santa-Olalla, J., Baizabal, J., Fregoso, M., Cárdenas, M. D. C., Covarrubias, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+positional+identity+gene+expression+code+is+not+preserved+in+neural+stem+cells+grown+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The in vivo positional identity gene expression code is not preserved in neural stem cells grown in culture.</a> Eur J Neurosci. 18 (5), 1073-1084 (2003).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3A+A+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open: A critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+and+limitations+of+neurosphere+assay%2C+CD133+immunophenotyping+and+side+population+assay+in+Glioma+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">The utility and limitations of neurosphere assay, CD133 immunophenotyping and side population assay in Glioma stem cell research.</a> Brain Pathol. 20 (5), 877-889 (2010).</li>
<li>Deleyrolle, L. P., Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurosphere+assay%2C+a+method+under+scrutiny%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropsych%22%5BJournal%5D)">The neurosphere assay, a method under scrutiny.</a> Acta Neuropsych. 20 (1), 2-8 (2008).</li>
<li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres%3A+Insights+into+neural+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres: Insights into neural stem cell biology.</a> Neurosci Res. 78 (6), 761-769 (2004).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres%E2%80%94re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres—re-evaluating the relationship.</a> Nat Meth. 2 (5), 333-336 (2005).</li>
<li>Parker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+of+an+operationally-defined+neural+stem+cell+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression profile of an operationally-defined neural stem cell clone.</a> Exp Neurol. 194 (2), 320-332 (2005).</li>
<li>Belenguer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+are+alerted+by+systemic+inflammation+through+TNF-%CE%B1+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells are alerted by systemic inflammation through TNF-α receptor signaling.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 285-299 (2021).</li>
<li>Cruz, M. T. G., Simões, S., Lima, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((de+Improving+lipoplex-mediated+gene+transfer+into+C6+glioma+cells+and+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">de Improving lipoplex-mediated gene transfer into C6 glioma cells and primary neurons.</a> Exp Neurol. 187 (1), 65-75 (2004).</li>
<li>Hagemann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transfection+of+glioma+cell+lines+and+primary+cells+for+overexpression+and+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">High efficiency transfection of glioma cell lines and primary cells for overexpression and RNAi experiments.</a> J Neurosci Meth. 156 (12), 194-202 (2006).</li>
<li>Moritz, S., Lehmann, S., Faissner, A., Holst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+An+induction+gene+trap+screen+in+neural+stem+cells+reveals+an+instructive+function+of+the+niche+and+identifies+the+splicing+regulator+Sam68+as+a+Tenascin-C-regulated+target+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">von An induction gene trap screen in neural stem cells reveals an instructive function of the niche and identifies the splicing regulator Sam68 as a Tenascin-C-regulated target gene.</a> Stem Cells. 26 (9), 2321-2331 (2008).</li>
<li>Montalbán-Loro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET3+prevents+terminal+differentiation+of+adult+NSCs+by+a+non-catalytic+action+at+Snrpn%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">TET3 prevents terminal differentiation of adult NSCs by a non-catalytic action at Snrpn.</a> Nat Comm. 10 (1), 1726(2019).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+and+fibroblast+growth+factors+behave+as+mitogenic+regulators+for+a+single+multipotent+stem+cell-like+population+from+the+subventricular+region+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain.</a> J Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).</li>
<li>Nieto-Estévez, V., Pignatelli, J., Araúzo-Bravo, M. J., Hurtado-Chong, A., Vicario-Abejón, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+transcriptome+analysis+reveals+molecular+hallmarks+of+neural+stem+cell+death%2C+survival%2C+and+differentiation+in+response+to+partial+FGF-2+and+EGF+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A global transcriptome analysis reveals molecular hallmarks of neural stem cell death, survival, and differentiation in response to partial FGF-2 and EGF deprivation.</a> PLoS One. 8 (1), 53594(2013).</li>
<li>Vergaño-Vera, E., Méndez-Gómez, H. R., Hurtado-Chong, A., Cigudosa, J. C., Vicario-Abejón, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor-2+increases+the+expression+of+neurogenic+genes+and+promotes+the+migration+and+differentiation+of+neurons+derived+from+transplanted+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor-2 increases the expression of neurogenic genes and promotes the migration and differentiation of neurons derived from transplanted neural stem/progenitor cells.</a> Neuroscience. 162 (1), 39-54 (2009).</li>
<li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40 (3), 485-499 (2003).</li>
<li>Hack, M. A., Sugimori, M., Lundberg, C., Nakafuku, M., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionalization+and+fate+specification+in+neurospheres%3A+the+role+of+Olig2+and+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regionalization and fate specification in neurospheres: the role of Olig2 and Pax6.</a> Mol Cell Neurosci. 25 (4), 664-678 (2004).</li>
<li>Bithell, A., Finch, S. E., Hornby, M. F., Williams, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+2+maintains+the+neurogenic+capacity+of+embryonic+neural+progenitor+cells+in+vitro+but+changes+their+neuronal+subtype+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 2 maintains the neurogenic capacity of embryonic neural progenitor cells in vitro but changes their neuronal subtype specification.</a> Stem Cells. 26 (6), 1565-1574 (2008).</li>
<li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proc Natl Acad Sci. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li>
<li>Kobayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Def+Res+C%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to embryonic stem cells.</a> Birth Def Res C. 75 (1), 10-18 (2005).</li>
<li>Gresch, O., Altrogge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+difficult-to-transfect+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells.</a> Meth Mol Biol. 801, 65-74 (2011).</li>
<li>Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+human+natural+killer+cell+line%2C+NKL%2C+using+the+Amaxa+nucleofection+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system.</a> J Immunol Meth. 284 (1-2), 133-140 (2004).</li>
<li>von Holst, A., Egbers, U., Prochiantz, A., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem%2Fprogenitor+cells+express+20+tenascin+C+isoforms+that+are+differentially+regulated+by+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Neural stem/progenitor cells express 20 tenascin C isoforms that are differentially regulated by Pax6.</a> J Biol Chem. 282 (12), 9172-9181 (2007).</li>
<li>Woodard, L. E., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-ing+models+and+new+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-ing models and new therapeutic strategies.</a> Trend Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Ze względu na brak ostatecznych markerów do identyfikacji populacji NSC in vivo, analiza NSC opierała się przede wszystkim na obserwacji zachowania komórek wyizolowanych z nisz neurogennych w warunkach ex vivo . Pionierskie prace Reynoldsa i Weissa położyły podwaliny pod ustalenie precyzyjnych warunków hodowli, umożliwiających izolację i ekspansję pojedynczych komórek z tkanki SVZ myszy młodych dorosłych (2 miesiące) w warunkach nieadhezyjnych. Komórki te są zwykle rozmnażane w pożywce wolnej od surowicy zawierającej EGF i bFGF, warunki, które całkowicie uniemożliwiają różnicowanie się w neurony i glej, jednocześnie promując proliferację. Rzeczywiście, w tych warunkach hodowli9 większość komórek umiera w ciągu pierwszych dni hodowli, ale niewielka podgrupa zaczyna się dzielić i przede wszystkim tworzy unoszące się neurosfery9. Dysocjacja enzymatyczna i subkultura tych agregatów komórkowych ułatwiają rozmnażanie kultur, wykazując zdolność tych kultur do samoodnawiania się.
Warto zauważyć, że kultury neurosfery wykazują potencjał ekspansji tylko z dodatkiem EGF, podczas gdy NSC hodowane w pożywce zawierającej tylko bFGF nie wykazują długoterminowej proliferacji komórek30. Oba dowody wskazują na EGF jako główny mitogen samoodnawiający się NSC. Niemniej jednak obecność zarówno EGF, jak i bFGF w pożywce hodowlanej poprawia zdolność NSC31 do samoodnawiania, a także przyczynia się do zrównoważenia potencjału różnicowania w astrocyty, neurony i oligodendrocyty 32,33,34,35. Co więcej, zastosowanie określonej mieszaniny hormonów i czynników zamiast komercyjnych alternatyw w celu uzupełnienia pożywki zapewnia wysoką jakość i powtarzalność kultur NSC. W tych warunkach mysie hodowle NSC mogą przetrwać jako stabilne linie komórkowe bez ulegania unieśmiertelnieniu. Niemniej jednak problemem w hodowlach neurosfery jest potencjał proliferacyjnych populacji komórek do przechodzenia transformacji genetycznych, omijając mechanizmy regulacyjne cyklu komórkowego i prowadząc do unieśmiertelnionego fenotypu. Dlatego, chociaż kultury neurosfery są wysoce rozszerzalne, kultury powyżej 10 pasaży in vitro są zwykle odrzucane do badań, ponieważ mogą ulegać starzeniu replikacyjnemu i mogą pojawić się komórki o nieprawidłowej zawartości chromosomów lub nieregularnej dynamice wzrostu. Co więcej, stosowanie długoterminowych kultur neurosfery musi być stale monitorowane. Hodowle neurosfery oferują również możliwość zbadania ich cech i potencjału w kontrolowanym środowisku, zapewniając bardziej precyzyjne i regulowane ustawienia, które mogą być modulowane i monitorowane dokładniej niż in vivo. Dzięki analizom klonogennym lub populacyjnym in vitro możliwe jest ilościowe określenie zdolności tych komórek do samoodnawiania się i proliferacji, ułatwiając identyfikację mechanizmów leżących u podstaw tych właściwości.
Niemniej jednak, pomimo obszernej listy zalet pracy z NSC in vitro, charakter tego protokołu hodowli i delikatność NSC stanowią wyzwanie w tej dziedzinie. Na przykład liczba pierwotnych neurosfer generowanych podczas typowej sekcji może się znacznie różnić w zależności od umiejętności i precyzji eksperymentatora. Wyniki neurosfery pierwotnej ilustrują tę zmienność w liczbie neurosfer pierwotnych uzyskanych z SVZ 2-miesięcznych myszy, w zakresie od 500 do 3000 neurosfer. Do tej zmienności mogą przyczyniać się różne czynniki. Po pierwsze, precyzja precyzji preparacji minimalizuje niechcianą tkankę miąższową, która hamuje powstawanie pierwotnej sfery. Po drugie, generowanie małych fragmentów tkanki SVZ pozwala na wydajne trawienie enzymatyczne i rozcieranie, zmniejszając w ten sposób utratę komórek. Podkreśla to potrzebę wystarczającego wcześniejszego przećwiczenia protokołu preparacji i dopracowanego rozwoju przetwarzania tkanek podczas tworzenia kultur neurosfery.
Innym ograniczeniem tych kultur jest fakt, że neurosfery mogą składać się zarówno z NSC, jak i komórek progenitorowych, co utrudnia rozróżnienie tych dwóch populacji w kulturach pierwotnych. Chociaż doniesiono, że różne markery, takie jak GFAP, Nestin, Musashi i SOX2, są wyrażane przez NSC8, żaden z nich nie był związany wyłącznie z NSC. Pojawiające się techniki FACS oparte na ekspresji antygenu na powierzchni komórki umożliwiły izolację NSC i ich potomstwa. Badania te wykazały, że przodkowie wzmacniający tranzyt nie są w stanie tworzyć neurosfer po przejściu25,36. Tak więc, podczas gdy związek między komórkami SVZ a komórkami inicjującymi neurosferę wymaga dalszego udoskonalenia 18,19,20,21,22,23, zdolność neurosfer do szeregowego pasażowania przez dłuższy czas może odzwierciedlać obecność NSC w hodowlach.
Ten system hodowli neurosfery posłużył jako solidny model do badania wpływu szlaków sygnałowych i ekspresji genów na utrzymanie zdolności do samoodnawiania się NSC in vitro15,29. Jednym z podejść do badania tych aspektów jest transfekcja NSC w celu nadekspresji lub zniszczenia określonych genów. Można to osiągnąć za pomocą różnych technik, w tym metod wirusowych i niewirusowych. Chociaż wektory wirusowe często osiągają wysoką wydajność transferu genów, mają one istotne ograniczenia, takie jak wysokie wymogi bezpieczeństwa i czasochłonna produkcja wektorów26. I odwrotnie, klasyczne metody transfekcji, takie jak lipofekcja i elektroporacja, osiągają bardzo niskie wskaźniki transfekcji, co czyni je niewykonalnymi w przypadku komórek trudnych do transfekcji. Technologia nucleofekcji oferuje przyjazne dla użytkownika podejście poprzez połączenie specyficznych dla typu komórki rozwiązań nukleofekcji z unikalnymi parametrami elektrycznymi dla każdego typu komórki37,38. Zapewnia to transfer DNA bezpośrednio do jądra komórkowego39, umożliwiając włączenie DNA w sposób niezależny od cyklu komórkowego. W związku z tym nukleofekcja jawi się jako realna technika transfekcji trudnych do transfekcji komórek, takich jak mysie NSC28,40.
Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że dla każdego nukleofekcji zalecane i konieczne jest minimum 2 x 106 komórek, chociaż w optymalnych warunkach można użyć mniejszej liczby komórek na pojedynczy nukleofekcję (tj. 5 × 105 komórek). Kolejną wadą tej metody jest to, że jakość i stężenie DNA wykorzystywanego do nukleofekcji znacząco wpływają na efektywność transferu genów. Stosowanie przygotowanego DNA wolnego od endotoksyn jest wysoce zalecane, aby zapobiec zwiększonej śmiertelności komórek z powodu obecności endotoksyn. Ponadto użycie więcej niż 6 μg całkowitego DNA do nukleofekcji może znacznie zmniejszyć zarówno wydajność transferu genów, jak i żywotność komórek. Wreszcie, podawanie impulsów elektrycznych ma również kluczowe znaczenie dla przetrwania komórek nukleofektowanych.
W tej pracy zilustrowaliśmy manipulację ekspresją genu Snrpn poprzez zastosowanie strategii polegającej na regulacji w dół jego ekspresji za pomocą plazmidów episomalnych. Plazmidy te nie są zintegrowane z genomem komórek, a ponieważ NSC nadal namnażają się in vitro, wprowadzone DNA zostanie następnie rozcieńczone wzdłuż podziału komórkowego, a tym samym straci efekt manipulacji genetycznej. Dlatego strategia ta jest cenna dla badania skutków ostrej zmiany w krótkim czasie lub do datowania narodzin komórek in vitro. Dostępne są pewne alternatywy do oceny bardziej długotrwałego efektu perturbacji genów. Na przykład można zastosować system integracyjny, taki jak piggyBAC oparty na transpozonach. System ten polega na wprowadzeniu pożądanej sekwencji kodującej zawartej w plazmidzie otoczonej sekwencjami transpozycyjnymi i konukleofekcie komórek z plazmidem zawierającym sekwencję dla enzymu transpozazy41. Alternatywnie można zastosować transpozony lub systemy CRISPR/Cas. 
Dalszy rozwój technologii transfekcji będzie ważnym krokiem w kierunku wysokoprzepustowych testów oceniających rolę różnych genów w fizjologii dorosłych nerwowych komórek macierzystych. W połączeniu z coraz bardziej wyrafinowanymi metodami oczyszczania i namnażania, badania te umożliwią zrozumienie biologii in vitro dorosłych NSC oraz porównanie różnic biologicznych między pływającymi neurosferami a NSC in vivo.

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) to multipotencjalne komórki macierzyste rezydujące w mózgu. Komórki te posiadają zdolność do samoodnawiania się i różnicowania w trzy linie nerwowe: astrocyty, oligodendrocyty i neurony1. W związku z tym NSC odgrywają kluczową rolę w neurogenezie dorosłych ssaków, procesie, w którym nowe neurony są generowane w brain2. NSC znajdują się głównie w dwóch regionach mózgu dorosłego zwanych niszami neurogennymi: strefie podkomorowej (SVZ) wzdłuż ścian komór bocznych i strefie podziarnistej (SGZ) w zakręcie zębatym hipokampa3,4. NSC (znane również jako limfocyty B) w SVZ, najbardziej aktywnej niszy neurogennej u dorosłej myszy, samoodnawiają się i wytwarzają komórki progenitorowe wzmacniające tranzyt (TAP lub komórki C), które następnie różnicują się w neuroblasty (komórki A). Te neuroblasty migrują przez rostralny strumień migracyjny (RMS) do opuszki węchowej (OB), gdzie ulegają pełnemu różnicowaniu w interneurony, integrując się z wcześniej istniejącymi obwodami3,4,5,6.
Zrozumienie skomplikowanej zależności między molekularnymi sygnałami i sygnałami, które regulują NSC w tych niszach, jest ważne, aby wykorzystać ich potencjał do zastosowań terapeutycznych. W tym celu opracowano różne metody badania tej populacji komórek, począwszy od selektywnej hodowli pierwotnej NSC, a skończywszy na selekcji komórek za pomocą markerów powierzchniowych7,8,9,10. Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje izolację i hodowlę NSC SVZ in vitro przy użyciu selektywnej pożywki bez surowicy zawierającej oba mitogeny: podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF). Pożywka ta ułatwia proliferację komórek i utrzymuje macierzystość NSC uzyskanych z SVZ mózgów dorosłych myszy, tworzących in vitro klonalne, trójwymiarowe, nieprzylegające agregaty znane jako neurosfery9. Kultury neurosfery służą jako kontrolowana platforma do manipulowania i badania mechanizmów molekularnych i czynników wpływających na proliferację, samoodnowę, różnicowanie i przeżycie NSC11. Warto zauważyć, że liczba pierwotnych neurosfer powstałych w kulturze pozwala na oszacowanie liczby NSC obecnych w SVZ in vivo, co czyni go potężnym narzędziem do badania wpływu różnych warunków na pulę dorosłych NSC12,13. Ponadto, po ustaleniu kultury pierwotnej, NSC mogą generować nowe agregaty (neurosfery wtórne) po przejściu przez symetryczne podziały w warunkach proliferacji14. W związku z tym wysiewanie wtórnych komórek neurosfery o niskiej gęstości (test klonalny) może być wykorzystane do oceny szybkości samoodnawiania się tych kultur4,15,16,17.
Pomimo potencjału neurosfer w odkrywaniu mechanizmów rządzących regulacją NSC, niektórzy badacze kwestionują wiarygodność wyników badań in vitro, twierdząc, że sztuczne warunki, w których rosną komórki, mogą nie odtwarzać wiernie skomplikowanego mikrośrodowiska in vivo nisz neurogennych18,19,20,21,22. Kolejny kontrowersyjny punkt dotyczy obserwowanej heterogeniczności w neurosferach. Niemniej jednak uważa się, że ta zmienność odzwierciedla symetryczne i asymetryczne podziały NSC, które naturalnie występują in vivo23,24. Co więcej, niedawna walidacja poparła wykorzystanie kultur NSC do przewidywania mechanizmów działających w niszy neurogennej SVZ in vivo, a kilka badań wykazało, że NSC hodowane in vitro dokładnie utrzymują profil transkryptomiczny obserwowany in vivo11,25.
Dlatego kultury neurosfery nie tylko służą jako metoda do badania zdolności do proliferacji i różnicowania NSC, ale także oferują system do badania wpływu genów rządzących biologią NSC. Kluczową techniką badania funkcji genów w NSC jest zaburzenie ekspresji genów. siRNA lub geny dostarczane przez plazmidy mogą być transfekowane do kultur komórkowych, co powoduje knockdown lub regulację w górę docelowego genu. To wszechstronne podejście znacznie skraca czas i koszty w porównaniu z zakładaniem kultur przy użyciu myszy z warunkowym nokautem, stanowiąc obiecującą drogę do rozwikłania genetycznych podstaw neurogenezy i zbadania perspektyw terapeutycznych. Zmiana ekspresji określonych genów w NSC umożliwia modulację ich zachowania, wpływając na kluczowe procesy biologiczne, takie jak proliferacja, różnicowanie i migracja. Jednak perspektywa transfekcji NSC, szczególnie w obrębie neurosfer myszy, stanowi poważne wyzwanie. Trójwymiarowa struktura neurosfer wpływa negatywnie na efektywność transfekcji, często skutkując niskimi wskaźnikami skutecznego dostarczania egzogennych kwasów nukleinowych, co ogranicza zakres manipulacji genetycznych26,27. Ponadto procedury transfekcji mogą niekorzystnie wpływać na żywotność i funkcjonalność komórek27. W tym kontekście przedstawiamy system nukleofekcji jako metodę łagodzenia uszkodzeń komórek, osiągania wysokiego wskaźnika przeżywalności i zapewnienia wyższej skuteczności w testach dostarczania genów stosowanych do zaburzania hodowli NSC.
Ten manuskrypt ma na celu zilustrowanie procedury izolacji, rozszerzania i nukleofektowania NSC z dorosłej niszy neurogennej SVZ w celu zakłócenia genów za pomocą systemu hodowli neurosfery. Metoda ta przewyższa skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji, zapewniając znacznie wyższe wskaźniki przeżycia i lepszą wydajność dostarczania genów wśród docelowych komórek.

<table><tbody><tr><td>0,22 &m; m butelki z filtrem porów (250 ml)</td><td>VWR</td><td>514-0330P</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m butelki z filtrem porów (500 ml)</td><td>VWR</td><td>514-0332P</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa</td><td>płytka LabClinics</td><td>PLC30012</td><td></td></tr><tr><td>probówka 15 ml</td><td>Fisher</td><td>10738771</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa</td><td>płytka LabClinics</td><td>PLC30024</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>BioWest</td><td>L0180-100</td><td></td></tr><tr><td>4&,6- diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka</td><td>ThermoFisher</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa</td><td>LabClinics</td><td>PLC30006</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Labclinics</td><td>PLC30096</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td>Określany jako roztwór enzymatyczny</td></tr><tr><td>Amaxa Mouse Neural Stem Stem Cell Nucleofector Zestaw</td><td>Lonza</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector Iib</td><td>Lonza</td><td>10700807</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk/Antybiotyk (A/A)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Apo-t-Transferryna</td><td>Sigma</td><td>T2252-1G</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Sigma</td><td>203350</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>B4287-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Sitko komórkowe 40 &mu; m</td><td>LabClinics</td><td>PLC93040</td><td></td></tr><tr><td>Trifosforan deoksynukleotydu (dNTPs)</td><td>NZYTech</td><td>MB08701</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Bufor soli fosforanowej (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM) F12 1:1</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha; Competent Cells</td><td>ThermoFisher</td><td>EC0112</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Earlesa (EBSS)</td><td>Gibco</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu - rekombinowany przez człowieka (EGF)</td><td>Gibco</td><td>53003-018</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E-6511</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki Ostre</td><td>narzędzia do nauki</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polimeraza</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td>Zestaw zawiera odczynniki do PCR</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>LB agar (Lennox)</td><td>LabKem</td><td>AGLB-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>Rosół LB (Lennox)</td><td>LabKem</td><td>LBBR-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteina</td><td>Sigma</td><td>C-8277</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Komora Neubauera</td><td>Blaubrand</td><td>BR718620</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Labbox</td><td>WATR-00A-10K</td><td></td></tr><tr><td>NZYMaxiprep Zestaw bez endotoksyn</td><td>NZYTech</td><td>MB39901</td><td></td></tr><tr><td>Papaina Liofilizowana</td><td>Worthington</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P-6149</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma</td><td>P-7505</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10316-14</td><td></td></tr><tr><td>Misja shSCRAMBLE</td><td>(Sigma)</td> <td>SHC003</td><td></td></tr><tr><td>Misja shSNRPN</td><td>(Sigma)</td><td>TRCN0000109285</td><td></td></tr> Szpatułka z <tr><td>seleninitem sodu</td><td>Sigma</td><td>S-9133</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-17</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne filtry strzykawkowe PES (0,22 i mu; m filtr porów)</td><td>Epica</td><td>SFPE-22E-050</td><td></td></tr><tr><td>T12.5 cm2 Kolba</td><td>Biofil</td><td>TCF012025</td><td></td></tr><tr><td>T25 cm2 Kolba</td><td>LabClinics</td><td>PLC70025</td><td></td></tr><tr><td>T75 cm2 Kolba</td><td>LabClinics</td><td>PLC70075</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Izolacja i ekspansja nerwowych komórek macierzystych (NSC) ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy może być osiągnięta w pożywce uzupełnionej o podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) jako mitogeny, wytwarzające agregaty klonalne znane jako neurosfery. Ten system in vitro jest cennym narzędziem do badania potencjału NSC. Transfekcja siRNA lub genów przenoszonych w plazmidach może być wykorzystana do wywołania zaburzeń ekspresji genów i badania biologii NSC. Jednak dostarczanie egzogennych kwasów nukleinowych do kultur NSC jest trudne ze względu na niską skuteczność transfekcji komórek ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W tym miejscu prezentujemy ulepszony system nukleofekcji, który osiąga wysoką skuteczność dostarczania genów w ekspandowanych NSC z dorosłego mysiego SVZ. Wykazaliśmy, że ta stosunkowo prosta metoda zwiększa perturbację genów w dorosłych NSC, przewyższając tradycyjne protokoły transfekcji ze wskaźnikami przeżycia przekraczającymi 80%. Co więcej, metoda ta może być również stosowana w pierwotnych izolowanych NSC, zapewniając kluczowy postęp w badaniach funkcji genów poprzez manipulację ekspresją genów poprzez knockdown lub nadekspresję w kulturach neurosfery.

Optymalne warunki hodowli umożliwiają izolację i ekspansję dorosłych NSC pochodzących z SVZ in vitro 
Hodowle NSC pochodzących z dorosłego SVZ stanowią cenną metodę in vitro badania mechanizmów molekularnych i sygnałów niszy regulujących NSC w obrębie ich specyficznych mikrośrodowisk. Analiza neurosfer opisana w niniejszym manuskrypcie została zastosowana do oceny liczby NSC w dorosłym SVZ. Tkanka SVZ została wyizolowana z mózgów 3-miesięcznych myszy, dysocjowana i hodowana w pełnym medium dla NSC uzupełnionym zarówno o EGF i bFGF, jak i o każdy z nich osobno. Po 10 dniach in vitro (DIV), całkowita liczba pierwotnych sfer utworzonych w tych trzech różnych warunkach hodowli została określona za pomocą mikroskopii kontrastowej (Rycina 2A,B). Co istotne, nasze wyniki wykazują, że obecność EGF prowadziła do maksymalnego tworzenia się pierwotnych sfer, co wynika z mniejszej liczby pierwotnych sfer zaobserwowanej w hodowlach z samym bFGF (Rycina 2A,B). Aby ocenić zdolność do samoodnawiania NSC w różnych warunkach pożywkowych, komórki poddano subkulturowaniu i wysiano przy niskiej gęstości (5 cells/µL) w mediach uzupełnionych wspomnianymi kombinacjami mitogenów. Ilościowe oznaczenie sfer wtórnych wykazało, że NSC z SVZ wymagają co najmniej EGF do efektywnego samoodnawiania oraz że kombinacja EGF i bFGF poprawia zdolność komórek do samoodnawiania (Rycina 2B). Ponadto, dla szczegółowej analizy dynamiki wzrostu w różnych warunkach pożywkowych, zarejestrowano liczbę wysianych i uzyskanych komórek w ciągu 7 pasaży. Krzywe wzrostu otrzymane dla różnych warunków pożywkowych potwierdziły, że hodowle uzupełnione samym EGF lub kombinacją EGF z bFGF wykazywały lepszą dynamikę wzrostu w porównaniu z hodowlami uzupełnionymi wyłącznie bFGF (Rycina 2C). Zbiorczo wyniki te potwierdzają, że jednoczesne zastosowanie EGF i bFGF zwiększa wydajność hodowli NSC in vitro.
Aby zbadać liczbę NSC w obszarze SVZ w różnych okresach wieku postnatalnego oraz ocenić wpływ starzenia się myszy na wydajność hodowli neurosfer, wypreparowano tkankę SVZ z myszy w wieku od 1 do 12 miesięcy. Warto zauważyć, że nasze wyniki wykazały znaczny spadek liczby sfer pierwotnych wraz z wiekiem, przy czym maksymalna wydajność w zakresie liczby sfer wystąpiła w wieku około 2 do 4 miesięcy (Rysunek 2D). Dodatkowo, aby ocenić zdolność do samoodnawiania NSC podczas subkultywacji, NSCs z myszy w wieku od 2 do 4 miesięcy poddano subkultywacji i wysiano w gęstości klonalnej (5 komórek/µL) w medium kompletnym. Ilościowe oznaczenie liczby sfer wtórnych w kolejnych pasażach wskazało na znaczny spadek wydajności hodowli wraz z liczbą pasaży (Rysunek 2E). Na podstawie wszystkich tych obserwacji, w celu dalszej optymalizacji warunków hodowli NSC, zaleca się przeprowadzanie testów samoodnawiania podczas wczesnych pasaży.
Nukleofekcja jest wysoce wydajną techniką manipulacji ekspresją genów w dorosłych NSCs 
Z uwagi na to, że NSCs są trudne do transfekcji, w celu manipulacji ekspresją genów przedstawiamy tutaj protokół nukleofekcji zapewniający wyższy odsetek skutecznego dostarczenia genów bez konieczności stosowania transdukcji wirusowej. Po wyizolowaniu i hodowli poszczególnych SVZ od myszy w wieku od 2 do 4 miesięcy, NSCs poddano nukleofekcji plazmidem niosącym GFP, zgodnie z opisem (Rycina 3A). Detekcja komórek GFP-dodatnich 2 dni po nukleofekcji wykazała wydajność w zakresie od 30% do 50%, co jest zgodne z poprzednią literaturą28. Aby specyficznie wyizolować pomyślnie nukleofektowane NSCs, komórki posortowano za pomocą FACS na podstawie intensywności fluorescencji GFP od 3 do 5 dni po nukleofekcji (Rycina 3A-C). Około 40% analizowanych przed FACS komórek wykazywało wysokie poziomy fluorescencji GFP i zostało następnie wybranych poprzez sortowanie (Rycina 3C). Ponowne wysiewanie posortowanych GFP+ NSCs wykazało, że wszystkie komórki były GFP-dodatnie, co potwierdziło poprawność metody izolacji komórek opartej na nukleofekcji (Rycina 3D). Co istotne, nukleofektowane NSCs zachowały żywotność podczas kolejnych pasaży, co potwierdza wykonalność nukleofekcji dla dorosłych NSCs. Wyniki te podkreślają skuteczność łączenia nukleofekcji i FACS w celu uzyskania czystej hodowli zmodyfikowanych NSCs.
Jako przykład modulacji genów w dorosłych NSC zastosowano osłabienie ekspresji genu za pomocą nukleofekcji krótkich interferujących RNA (shRNA). W szczególności, shRNA celujące w gen Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N (Snrpn), zawierające reporter CAG-GFP (shSNRPN), poddano nukleofekcji w kulturach NSC pochodzących od 2-miesięcznych myszy. Obniżenie poziomu Snrpn zostało potwierdzone za pomocą qPCR oraz immunocytochemii w komórkach poddanych nukleofekcji plazmidem shSNRPN, natomiast nie zaobserwowano go w przypadku kontrolnego plazmidu shSCRAMBLE (Rysunek 3E,F)29. Aby wyjaśnić wpływ obniżenia ekspresji Snrpn na zdolność NSC do samoodnowy, w nuklefekowanych komórkach przeprowadzono test niskiej gęstości (Rysunek 3F,G). Ilościowe oznaczenie wtórnych neurosfer w nuklefekowanych kulturach wykazało zwiększoną zdolność do tworzenia neurosfer po obniżeniu ekspresji Snrpn (Rysunek 3G). Test ten podkreśla skuteczność nukleofekcji w manipulowaniu ekspresją genów w dorosłych NSC i, co bardziej szczegółowe, identyfikuje rolę Snrpn w utrzymywaniu właściwości macierzystości w dorosłych NSC.
<img alt="Procedura sekcji neurologicznej, przekroje mózgu A-L, analiza anatomiczna krok po kroku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66651/66651fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Szczegółowy opis sekcji SVZ. (A) Po wyjęciu mózgu myszy, cały organ jest przenoszony w DPBS na silikonową podkładkę do sekcji. (B) Za pomocą skalpela usuwa się z mózgu OB i móżdżek. (C) Mózg jest dzielony na dwie półkule, aby móc przeprowadzić sekcję każdej z nich osobno. (D) Mózg jest otwierany wzdłuż linii ciała modzelowatego, oddzielając korę i prążkowie od hipokampa, przegrody i wzgórza, co odsłania komory boczne. (E-F) Hipokamp, przegroda i wzgórze są usuwane wzdłuż brzusznej granicy komór. (G-I) Tkanka poza rostralnym i kaudalnym końcem SVZ oraz kora są usuwane wzdłuż ciała modzelowatego. (J-K) Tkankę przechyla się tak, aby SVZ znajdowało się z boku, co umożliwia usunięcie tkanki prążkowia znajdującej się pod SVZ. (L) Otrzymywany jest cienki fragment tkanki zawierający SVZ. Czarne przerywane linie wskazują miejsce cięcia. Czarne kropkowane linie wskazują lokalizację SVZ na każdym etapie. Skróty: OB = opuszka węchowa; CB = móżdżek. Pasek skali w A-H: 5 mm; w I-L: 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66651/66651fig1v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza tworzenia neurosfer; wykresy pokazujące efekty EGF, bFGF; dane dotyczące wzrostu komórek, pasażowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66651/66651fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Oba mitogeny EGF i bFGF są niezbędne do optymalnej hodowli i ekspansji NSC in vitro. (A) Obrazy z mikroskopii kontrastowej pierwotnych i wtórnych kultur neurosfer w medium NSC uzupełnionym o oba mitogeny EGF i bFGF lub o każdy z mitogenów osobno. (B) Liczba pierwotnych sfer uzyskanych na mysz i na studzienkę w zależności od składu mitogenów w medium hodowlanym: brak mitogenów (szary, n=9), EGF+bFGF (niebieski, n=33), tylko EGF (zielony, n=20) lub tylko bFGF (różowy, n=19; panel lewy). Liczba wtórnych neurosfer utworzonych przy niskiej gęstości (5 cells/μL) na studzienkę w zależności od składu mitogenów w medium hodowlanym: brak mitogenów (szary, n=11), bFGF (różowy, n=18), EGF (zielony, n=18) lub EGF+bFGF (niebieski, n=37; panel prawy). Zastosowano test Kruskala-Wallisa z analizą post hoc Dunna. (C) Krzywe wzrostu przedstawiające całkowitą liczbę komórek po 8 pasażach w różnych kulturach neurosfer, zależnie od obecności mitogenów w medium hodowlanym: bFGF (różowy, n=5), EGF (zielony, n=5) lub EGF+bFGF (niebieski, n=10). Zastosowano analizę regresji liniowej. (D) Liczba pierwotnych neurosfer pochodzących od poszczególnych myszy, wyizolowanych i zagregowanych z zwierząt na różnych etapach rozwoju postnatalnego. Zastosowano analizę regresji liniowej. Wartość n podano w nawiasach. (E) Liczba wtórnych neurosfer utworzonych przy niskiej gęstości (5 cells/µL) w kolejnych pasażach in vitro w celu oceny ich zdolności do samoodnawiania. Zastosowano test Kruskala-Wallisa; podano wartości p: *: p&lt;0.05; **: p&lt;0.01; ***: p&lt;0.001; ****: p&lt;0.0001. n.s: brak istotności statystycznej. Słupki błędów reprezentują SEM. Pasek skali w A wynosi 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66651/66651fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat nukleofekcji i analiza FACS ekspresji GFP; ekspresja mRNA Snrpn; obrazy mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66651/66651fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat procesu nukleofekcji oraz selekcji komórek nukleofektowanych za pomocą FACS. (A) Przegląd procesu nukleofekcji i selekcji komórek nukleofektowanych za pomocą FACS. 1) Roztwór plazmidowego DNA łączy się z roztworem do nukleofekcji i dodaje do komórek. Mieszaninę tę przenosi się następnie do kuwety w celu przeprowadzenia nukleofekcji. 2) Kuwetę zawierającą DNA i komórki umieszcza się w nukleofektorze, gdzie przyłożony jest impuls elektryczny. Dla kultur neurosfer izolowanych z dorosłej SVZ zaleca się stosowanie programu A-031 NSC. 3) Po nukleofekcji komórki przenosi się do kolby zawierającej pełną pożywkę uzupełnioną o EGF i bFGF. 4) Komórki są sortowane metodą FACS na podstawie ekspresji reportera zawartego w plazmidowym DNA. 5) Posortowane komórki poddawane są dalszej hodowli do następnych eksperymentów.(B) Strategia selekcji oparta na FACS i bramkowanie dla nukleofektowanych NSCs. Najpierw wybierane są żywe komórki na podstawie wysokiego FSC-A i wysokiego SSC-A (wykres po lewej), a następnie eliminowane są dublety i triplety komórkowe poprzez analizę parametrów FSC-A względem FSC-H (wykres po prawej). (C) Bramkowanie FACS dla komórek nukleofektowanych na podstawie ich ekspresji GFP (fluorescencja SSC-A względem FITC-A). (D) Obrazy z mikroskopii kontrastowej i obrazy fluorescencji GFP nukleofektowanych NSCs przed (n=3) i po (n=4) selekcji FACS (panel lewy). Procent nukleofektowanych komórek GFP+ przedstawiono przed i po selekcji FACS (panel prawy). Zastosowano test t. (E) Analiza ilościowej PCR (qPCR) ekspresji Snrpn w proliferujących NSCs nukleofektowanych specyficznym dla Snrpn shRNA (n=4). Jako kontrolę zastosowano nukleofekcję za pomocą shRNA SCRAMBLE (n=4). Zastosowano test t. (F) Obrazy immunocytochemiczne przedstawiające SNRPN (na czerwono) w NSCs 7 dni po nukleofekcji shRNA (panele zewnętrzne). Do barwienia kontrastowego DNA wykorzystano DAPI. Reprezentatywne obrazy przedstawiające neurosfery pochodzące z NSCs w warunkach shSNRPN i shSCRAMBLE (panele środkowe). (G) Koni quantyfikacja liczby neurosfer utworzonych w kulturach NSC po nukleofekcji shSNRPN (n=8) lub shSCRAMBLE (n=8). Zastosowano test t. Podano wartości p: *: p&lt;0.05; **: p&lt;0.01; ***: p&lt;0.001; ****: p&lt;0.0001. n.s: nieistotne. Słupki błędu reprezentują SEM. Pasek skali w D, 10 µm; w F, 100 µm (obrazy o dużym powiększeniu w F, 7 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66651/66651fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

Nasze badania koncentrują się na zbadaniu, w jaki sposób populacja nerwowych komórek macierzystych jest regulowana w mózgu dorosłego ssaka. Zrozumienie wewnętrznych i zewnętrznych mechanizmów molekularnych, które regulują neuronalne komórki macierzyste w niszach neurogennych, jest ważne dla zrozumienia biologii i opracowania przyszłych potencjalnych zastosowań terapeutycznych. Do badania zachowań neurosensorycznych szeroko stosuje się zarówno podejścia in vivo, jak i in vitro, hodowle nerwowych komórek macierzystych in vitro w ich kontrolowanym środowisku oraz możliwość łatwego manipulowania i monitorowania tej populacji komórek.Techniki perturbacji ekspresji genów in vitro są wszechstronnym podejściem do badania mechanizmów molekularnych podczas nauki biologii komórki. Jednak skuteczna i powtarzalna metoda nadekspresji i niszczenia genów kandydujących w nerwowych komórkach macierzystych nadal stanowi wyzwanie w tej dziedzinie. Tradycyjne metody transfekcji w celu dostarczania genów okazały się skuteczne w komórkach ośrodkowego układu nerwowego.Co więcej, metody te wpływają na żywotność i funkcjonalność komórek. W związku z tym udoskonalenie alternatywnych podejść ma kluczowe znaczenie dla manipulowania ekspresją genów w nerwowych komórkach macierzystych. Dzięki temu protokołowi przedstawiamy ulepszony system nukleofekcji, który osiąga wysoką skuteczność dostarczania genów w hodowlach nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej, wraz ze wskaźnikami przeżycia wyższymi niż 80%Aby rozpocząć ekstrakcję mózgu z prawidłowo uśpionej myszy, po oddzieleniu głowy od reszty ciała, Odsłoń mózg, początkowo przecinając czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego.Za pomocą cienkiej pęsety usuń kości. Uważaj, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej pod czaszką podczas tego kroku. Za pomocą szpatułki ostrożnie wyjmij mózg z czaszki.Umieść go w 12-dołkowej płytce zawierającej zimną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco lub DPBS. Następnie przenieś cały mózg na podkładkę silikonową, gdzie odbędzie się sekcja. Użyj skalpela, aby usunąć opuszkę węchową znajdującą się na rostralnym końcu mózgu i móżdżek znajdujący się w części ogonowej, zachowując centralną część mózgu zawierającą obie boczne komory.Następnie podziel mózg wzdłuż podłużnej szczeliny na dwie półkule, zanim przystąpisz do sekcji obu półkul osobno. Pracując z jedną półkulą, zmień jej orientację tak, aby obszar przyśrodkowy był skierowany do góry. Otwórz mózg wzdłuż linii ciała modzelowatego, oddzielając korę i prążkowie od hipokampa, przegrody i międzymózgowia, odsłaniając w ten sposób komory boczne.Usuń hipokamp, przegrodę i międzymózgowie zgodnie z brzuszną granicą komór. Następnie usuń tkankę poza rostralne i ogoniaste końce strefy podkomorowej lub SVZ i kory podążającej za ciałem modzelowatym. Przechyl tkankę tak, aby SVZ był skierowany na boki.Usuń tkankę prążkowia pod SVZ, aby uzyskać cienki kawałek tkanki zawierający nerwowe komórki macierzyste. Przechowuj oba wypreparowane SVZ od myszy na 12-dołkowej płytce zawierającej zimny DPBS do czasu przetworzenia tkanek. Aby wyizolować nerwowe komórki macierzyste lub NSC z wypreparowanych mysich stref podkomorowych lub SVZ, należy pociąć każdy SVZ na cztery do pięciu małych kawałków, aby ułatwić dezagregację tkanki.Za pomocą sterylnej plastikowej pipety Pasteura przenieś posiekane SVZ do 15-mililitrowej probówki wirówkowej, upewniając się, że na płytce nie pozostały żadne fragmenty. Pozwól, aby tkanka osiadła na dnie probówki przed usunięciem pozostałego DPBS. Dodaj 500 mikrolitrów przefiltrowanej mieszanki enzymatycznej zawierającej papainę dla dwóch SVZ na mózg i inkubuj probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Po inkubacji do każdej próbki dodać pięć mililitrów pożywki kontrolnej podgrzanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odwirować próbkę o masie 300 g przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety lub pompy próżniowej.Za pomocą wypolerowanej ogniowo szklanej pipety Pasteura dodaj jeden mililitr pożywki kontrolnej do granulki. Ostrożnie rozdrobnić mechanicznie granulki, pipetując w górę i w dół 10 do 20 razy, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki kontrolnej i wymieszaj przez odwrócenie, aby umyć komórki.Po odwirowaniu w stężeniu 300 g przez pięć minut, jednorodnie ponownie zawiesić powstały osad w jednym mililitrze kompletnego podłoża, pipetując w górę iw dół 10 razy. Po rozcieńczeniu jednej części podwielokrotności zawiesiny komórek jedną częścią błękitu trypanowego, należy policzyć komórki za pomocą komory Neubauera pod mikroskopem. Zapewnić dezagregację komórkową na poziomie pojedynczej komórki przed równomiernym wysiewem komórek w ośmiu dołkach 48-dołkowej płytki w końcowej objętości 500 mikrolitrów kompletnej pożywki.Inkubuj komórki przez pięć do siedmiu dni, aby mogły się uformować pierwotne neurosfery. Aby przeprowadzić przejście neurosfer uzyskanych z nerwowych komórek macierzystych wyizolowanych z mysiej strefy podkomorowej, należy pobrać pożywkę zawierającą neurosfery z płytek wielodołkowych i przenieść je do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Wirować neurosfery przez pięć minut w temperaturze 300g.Po usunięciu supernatantu dodaj 200 mikrolitrów roztworu enzymatycznego do osadu i delikatnie postukaj w dno probówki, aby ją usunąć. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby ułatwić dysocjację neurosfery. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki kontrolnej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.Mechanicznie dysocjuj neurosfery za pomocą mikropipety P-1000, pipetując w górę i w dół od 10 do 20 razy. Dodać dodatkową objętość czterech mililitrów pożywki kontrolnej i wymieszać przez odwrócenie, aby umyć komórki. Odwirowywać komórki przez pięć minut w temperaturze 300 g przed usunięciem supernatantu.Dodać jeden mililitr kompletnej pożywki i ponownie zawiesić osad w celu homogenizacji zawiesiny komórkowej, pipetując w górę iw dół 10 razy. Po rozcieńczeniu jednej części podwielokrotności zawiesiny komórek jedną częścią błękitu trypanowego, należy policzyć zawiesinę komórek przy użyciu komory Neubauera. Aby rozszerzyć hodowlę, należy zasiać komórki o gęstości 10 000 komórek na centymetr kwadratowy przy użyciu kompletnego podłoża w odpowiedniej płytce hodowlanej lub kolbie.Korzystając z zalecanego zestawu, przystąp do przygotowania 95 mikrolitrów roztworu nukleofekcji w 1,5-mililitrowej probówce dla każdego pożądanego stanu nukleofekcji. Przygotuj również kolbę T25 wypełnioną czterema mililitrami wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki na każdy warunek i trzymaj ją w inkubatorze do czasu użycia. Aby przeprowadzić nukleofekcję, odwiruj żądaną liczbę komórek przez pięć minut przy 300 g przed usunięciem supernatantu.Dodać jeden mililitr DPBS i równomiernie zawiesić granulkę, pipetując w górę i w dół 10 razy. Po powtórzeniu wirowania ponownie zawiesić osad w 95 mikrolitrach roztworu nukleofekcji. Połącz 95 mikrolitrów komórek z wstępnie zmieszanym roztworem zawierającym pięć mikrolitrów każdego plazmidu wybranego do nukleofekcji.Po przeniesieniu tego roztworu do kuwety, umieść go w urządzeniu Nucleofector w celu nukleekcji komórek z plazmidami za pomocą zoptymalizowanego programu nerwowych komórek macierzystych systemu Nucleofector. Po zakończeniu elektroporacji, za pomocą pipety Pasteura dołączonej do zestawu, ostrożnie wprowadź ciepłe, kompletne podłoże do kuwety. Przenieść zawartość kuwety do uprzednio przygotowanej kolby T25 zawierającej wstępnie podgrzane kompletne podłoże.Inkubuj komórki nukleofektyczne w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy do pięciu dni i wizualizuj neurosfery nukleofekcji.

isolation-expansion-nucleofection-neural-stem-cells-from-adult-murine

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę testu neurosfer w celu generowania i namnażania neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego dorosłej myszy oraz dostarcza wskazówek technicznych pozwalających na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer.

Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Film pokazuje proces izolacji i hodowli nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej mózgu myszy. Polega na rozwarstwieniu tkanek, dysocjacji enzymatycznej i wyhodowaniu ich za pomocą czynników różnicujących, aby rozwinęły się w dojrzałe komórki nerwowe.

Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Ustanowienie systemów hodowli do ekspansji dorosłych nerwowych komórek macierzystych (aNSC) pozwala na badanie i zastosowanie aNSC w terapii. Strefa podmodzelowa (SCZ) została niedawno uznana za nowy region tworzący neuroblasty u dorosłych myszy. W tym miejscu opisano metody izolacji, ekspansji i różnicowania SCZ-aNSC.

W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół generowania kultur neurosfery z pourodzeniowych mysich nerwowych komórek macierzystych pochodzących z głównych nisz neurogennych myszy. Neurosfery służą do identyfikacji nerwowych komórek macierzystych z tkanki mózgowej, co pozwala na oszacowanie liczby komórek prekursorowych. Co więcej, te struktury 3D mogą być powlekane w warunkach różnicowania, dając początek neuronom, oligodendrocytom i astrocytom, umożliwiając badanie losu komórek.

Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych

Ściany komór bocznych zawierają największy region zarodkowy w dorosłym mózgu ssaków. Tradycyjnie badania nad neurogenezą w tym obszarze opierały się na klasycznych technikach sekcjonowania do analizy histologicznej. Przedstawiamy tutaj alternatywne podejście — technikę preparatów całych (wholemount), która zapewnia kompleksowy widok en-face tego regionu zarodkowego.

Strefa podkomorowa en-face: barwienie całego preparatu i przepływ ependymalny

Niniejszy artykuł przedstawia wiarygodny protokół izolacji i hodowli komórek macierzystych grzebienia neuronalnego z ludzkich mieszków włosowych.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych grzebienia neuronalnego z ludzkich mieszków włosowych

Opisano metodę wprowadzania barwników wskaźnikowych wapnia do komórek strefy podkomorowej (SVZ) w celu rejestracji aktywności wapniowej. Potnatalna SVZ zawiera gęsto upakowane komórki, w tym komórki progenitorowe neuronów oraz neuroblasty. Zamiast ładowania metodą kąpielową, barwnik wstrzykiwano pod ciśnieniem bezpośrednio do tkanki, co pozwoliło na lepszą dyfuzję barwnika.

Przygotowanie ostrych skrawków strefy podkomorowej do obrazowania wapnia

Poznaj metodę izolacji, ekspansji i nukleofekcji nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Technika zapewnia wysoką wydajność dostarczania genów i przeżywalność komórek powyżej 80%.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Przeglądaj więcej filmów