Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Nasze badania koncentrują się na zbadaniu, w jaki sposób populacja nerwowych komórek macierzystych jest regulowana w mózgu dorosłego ssaka. Zrozumienie wewnętrznych i zewnętrznych mechanizmów molekularnych, które regulują neuronalne komórki macierzyste w niszach neurogennych, jest ważne dla zrozumienia biologii i opracowania przyszłych potencjalnych zastosowań terapeutycznych. Do badania zachowań neurosensorycznych szeroko stosuje się zarówno podejścia in vivo, jak i in vitro, hodowle nerwowych komórek macierzystych in vitro w ich kontrolowanym środowisku oraz możliwość łatwego manipulowania i monitorowania tej populacji komórek.

Techniki perturbacji ekspresji genów in vitro są wszechstronnym podejściem do badania mechanizmów molekularnych podczas nauki biologii komórki. Jednak skuteczna i powtarzalna metoda nadekspresji i niszczenia genów kandydujących w nerwowych komórkach macierzystych nadal stanowi wyzwanie w tej dziedzinie. Tradycyjne metody transfekcji w celu dostarczania genów okazały się skuteczne w komórkach ośrodkowego układu nerwowego.

Co więcej, metody te wpływają na żywotność i funkcjonalność komórek. W związku z tym udoskonalenie alternatywnych podejść ma kluczowe znaczenie dla manipulowania ekspresją genów w nerwowych komórkach macierzystych. Dzięki temu protokołowi przedstawiamy ulepszony system nukleofekcji, który osiąga wysoką skuteczność dostarczania genów w hodowlach nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej, wraz ze wskaźnikami przeżycia wyższymi niż 80%Aby rozpocząć ekstrakcję mózgu z prawidłowo uśpionej myszy, po oddzieleniu głowy od reszty ciała, Odsłoń mózg, początkowo przecinając czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego.

Za pomocą cienkiej pęsety usuń kości. Uważaj, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej pod czaszką podczas tego kroku. Za pomocą szpatułki ostrożnie wyjmij mózg z czaszki.

Umieść go w 12-dołkowej płytce zawierającej zimną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco lub DPBS. Następnie przenieś cały mózg na podkładkę silikonową, gdzie odbędzie się sekcja. Użyj skalpela, aby usunąć opuszkę węchową znajdującą się na rostralnym końcu mózgu i móżdżek znajdujący się w części ogonowej, zachowując centralną część mózgu zawierającą obie boczne komory.

Następnie podziel mózg wzdłuż podłużnej szczeliny na dwie półkule, zanim przystąpisz do sekcji obu półkul osobno. Pracując z jedną półkulą, zmień jej orientację tak, aby obszar przyśrodkowy był skierowany do góry. Otwórz mózg wzdłuż linii ciała modzelowatego, oddzielając korę i prążkowie od hipokampa, przegrody i międzymózgowia, odsłaniając w ten sposób komory boczne.

Usuń hipokamp, przegrodę i międzymózgowie zgodnie z brzuszną granicą komór. Następnie usuń tkankę poza rostralne i ogoniaste końce strefy podkomorowej lub SVZ i kory podążającej za ciałem modzelowatym. Przechyl tkankę tak, aby SVZ był skierowany na boki.

Usuń tkankę prążkowia pod SVZ, aby uzyskać cienki kawałek tkanki zawierający nerwowe komórki macierzyste. Przechowuj oba wypreparowane SVZ od myszy na 12-dołkowej płytce zawierającej zimny DPBS do czasu przetworzenia tkanek. Aby wyizolować nerwowe komórki macierzyste lub NSC z wypreparowanych mysich stref podkomorowych lub SVZ, należy pociąć każdy SVZ na cztery do pięciu małych kawałków, aby ułatwić dezagregację tkanki.

Za pomocą sterylnej plastikowej pipety Pasteura przenieś posiekane SVZ do 15-mililitrowej probówki wirówkowej, upewniając się, że na płytce nie pozostały żadne fragmenty. Pozwól, aby tkanka osiadła na dnie probówki przed usunięciem pozostałego DPBS. Dodaj 500 mikrolitrów przefiltrowanej mieszanki enzymatycznej zawierającej papainę dla dwóch SVZ na mózg i inkubuj probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po inkubacji do każdej próbki dodać pięć mililitrów pożywki kontrolnej podgrzanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odwirować próbkę o masie 300 g przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety lub pompy próżniowej.

Za pomocą wypolerowanej ogniowo szklanej pipety Pasteura dodaj jeden mililitr pożywki kontrolnej do granulki. Ostrożnie rozdrobnić mechanicznie granulki, pipetując w górę i w dół 10 do 20 razy, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki kontrolnej i wymieszaj przez odwrócenie, aby umyć komórki.

Po odwirowaniu w stężeniu 300 g przez pięć minut, jednorodnie ponownie zawiesić powstały osad w jednym mililitrze kompletnego podłoża, pipetując w górę iw dół 10 razy. Po rozcieńczeniu jednej części podwielokrotności zawiesiny komórek jedną częścią błękitu trypanowego, należy policzyć komórki za pomocą komory Neubauera pod mikroskopem. Zapewnić dezagregację komórkową na poziomie pojedynczej komórki przed równomiernym wysiewem komórek w ośmiu dołkach 48-dołkowej płytki w końcowej objętości 500 mikrolitrów kompletnej pożywki.

Inkubuj komórki przez pięć do siedmiu dni, aby mogły się uformować pierwotne neurosfery. Aby przeprowadzić przejście neurosfer uzyskanych z nerwowych komórek macierzystych wyizolowanych z mysiej strefy podkomorowej, należy pobrać pożywkę zawierającą neurosfery z płytek wielodołkowych i przenieść je do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Wirować neurosfery przez pięć minut w temperaturze 300g.

Po usunięciu supernatantu dodaj 200 mikrolitrów roztworu enzymatycznego do osadu i delikatnie postukaj w dno probówki, aby ją usunąć. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby ułatwić dysocjację neurosfery. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki kontrolnej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.

Mechanicznie dysocjuj neurosfery za pomocą mikropipety P-1000, pipetując w górę i w dół od 10 do 20 razy. Dodać dodatkową objętość czterech mililitrów pożywki kontrolnej i wymieszać przez odwrócenie, aby umyć komórki. Odwirowywać komórki przez pięć minut w temperaturze 300 g przed usunięciem supernatantu.

Dodać jeden mililitr kompletnej pożywki i ponownie zawiesić osad w celu homogenizacji zawiesiny komórkowej, pipetując w górę iw dół 10 razy. Po rozcieńczeniu jednej części podwielokrotności zawiesiny komórek jedną częścią błękitu trypanowego, należy policzyć zawiesinę komórek przy użyciu komory Neubauera. Aby rozszerzyć hodowlę, należy zasiać komórki o gęstości 10 000 komórek na centymetr kwadratowy przy użyciu kompletnego podłoża w odpowiedniej płytce hodowlanej lub kolbie.

Korzystając z zalecanego zestawu, przystąp do przygotowania 95 mikrolitrów roztworu nukleofekcji w 1,5-mililitrowej probówce dla każdego pożądanego stanu nukleofekcji. Przygotuj również kolbę T25 wypełnioną czterema mililitrami wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki na każdy warunek i trzymaj ją w inkubatorze do czasu użycia. Aby przeprowadzić nukleofekcję, odwiruj żądaną liczbę komórek przez pięć minut przy 300 g przed usunięciem supernatantu.

Dodać jeden mililitr DPBS i równomiernie zawiesić granulkę, pipetując w górę i w dół 10 razy. Po powtórzeniu wirowania ponownie zawiesić osad w 95 mikrolitrach roztworu nukleofekcji. Połącz 95 mikrolitrów komórek z wstępnie zmieszanym roztworem zawierającym pięć mikrolitrów każdego plazmidu wybranego do nukleofekcji.

Po przeniesieniu tego roztworu do kuwety, umieść go w urządzeniu Nucleofector w celu nukleekcji komórek z plazmidami za pomocą zoptymalizowanego programu nerwowych komórek macierzystych systemu Nucleofector. Po zakończeniu elektroporacji, za pomocą pipety Pasteura dołączonej do zestawu, ostrożnie wprowadź ciepłe, kompletne podłoże do kuwety. Przenieść zawartość kuwety do uprzednio przygotowanej kolby T25 zawierającej wstępnie podgrzane kompletne podłoże.

Inkubuj komórki nukleofektyczne w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy do pięciu dni i wizualizuj neurosfery nukleofekcji.