Name: Wstrzyknięcie dokomorowe u szczurów o niskim ryzyku wystąpienia działań niepożądanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Poznaj technikę wstrzyknięcia dokomorowego u szczurów z minimalnym ryzykiem uszkodzenia tkanek. Metoda zapewnia precyzyjne podawanie substancji do komory przedniej oka, poprawiając powtarzalność wyników w badaniach okulistycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Izraelską Fundację Naukową granty 2670/23 i 1304/20.

Doświadczenia opisane w protokole zostały zatwierdzone przez National Permit Committee - for animal science i są zgodne z deklaracją ARVO dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach nad okulistyką i wzrokiem. W niniejszym badaniu wykorzystano samice szczurów linii Sprague-Dawley w wieku 8-10 tygodni, które przebywały w cyklach światło-ciemność 12/12 h. Zwierzęta pozyskano z komercyjnego źródła (patrz Tabela materiałów).
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Przygotować mieszankę anestetyczną ketaminy (80 mg/kg masy ciała w 0,8 mL) i ksylazyny (4 mg/kg masy ciała w 0,2 mL) i wstrzyknąć ją w jednej dawce doprzewnowo, aby poddać szczury znieczuleniu.</li>
	<li>Wstrzyknąć przeciwbólową buprenorfinę (0,03 mg/kg) w jednej dawce doprzewnowo.</li>
	<li>Zastosować miejscowe znieczulenie okulistyczne 0,4% oksybuprokainy do obu oczu.</li>
</ol>
2. Tworzenie samouszczelniającego się tunelu rogówkowego
<ol>
	<li>Ustabilizuj oko, przytrzymując górną część twardówki w linii środkowej w pionie, obok połączenia rogówkowo-twardówkowego, za pomocą chirurgicznych pęset okulistycznych.</li>
	<li>Pod mikroskopem chirurgicznym wprowadź sterylną igłę z ostrzem typu stiletto o rozmiarze 31 G i średnicy 0,8 mm w paracentralny obszar rogówki w linii środkowej w pionie (powyżej centrum źrenicy), w pozycji płaskiej, pod kątem jak najbliższym poziomowi (Rysunek 2).</li>
	<li>W tej pozycji przebij rogówkę, aby wykonać nacięcie i utworzyć długi tunel (2-3 mm), aż do penetracji centralnego obszaru przedniej komory. Unikaj dotykania soczewki (Rysunek 2). 
	UWAGA: Prawidłowo wykonany tunel nie spowoduje wycieku cieczy wodnistej ani spłycenia przedniej komory.</li>
	<li>Zastosuj miejscowo 0,3% ofloxacin oraz 0,1% dexamethasone w oku poddanym iniekcji.</li>
	<li>Przeprowadź badanie w lampie szczelinowej w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Oceń głębokość przedniej komory oka poddanego iniekcji w porównaniu do oka niepoddanego iniekcji. 
		UWAGA: Głębokość powinna być zbliżona.</li>
		<li>Oceń stan soczewki w oku poddanym iniekcji w porównaniu do oka niepoddanego iniekcji. 
		UWAGA: Soczewka powinna być przejrzysta. Przymglanie może świadczyć o uszkodzeniu soczewki podczas procedury chirurgicznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat operacji oka przedstawiający nacięcie rogówki; etykiety wskazują soczewkę, komorę przednią i położenie ostrza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie kąta i położenia ostrza oraz nacięcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Opcja 1: Wstrzykiwanie błękitu trypanowego do komory przedniej w celu oceny prawidłowości wstrzyknięcia do komory przedniej
<ol>
	<li>Napełnić sterylną szklaną strzykawkę Hamiltona o pojemności 10 µL z tępą igłą 34 G za pomocą 5 µL błękitu trypanu. 
	UWAGA: Wstrzykiwanie błękitu trypanu opisano jako sposób oceny skuteczności iniekcji podczas etapów kalibracji lub przygotowania modelu. W warunkach eksperymentalnych strzykawkę można napełnić roztworem wybranego związku.</li>
	<li>Wprowadzić igłę napełnionej strzykawki przez tunel utworzony w sekcji 2 do komory przedniej.</li>
	<li>Wstrzyknąć ciecz i przytrzymać igłę w miejscu przez 2-3 s po iniekcji, aż cały płyn zostanie podany.</li>
	<li>Wyjąć igłę, wycofując ją powoli i delikatnie, aby uniknąć wycieku z tunelu rogówkowego.</li>
	<li>Zbadać oko za pomocą lampy szczelinowej. Ocenić głębokość komory przedniej, aby wykluczyć jej spłycenie, oraz potwierdzić obecność błękitu trypanu w komorze przedniej.</li>
	<li>Powtórzyć badanie lampą szczelinową po 24 h, 48 h i 72 h.</li>
</ol>
4. Opcja 2: Wtryskiwanie Hoechst do komory przedniej w celu oceny biodostępności wstrzykniętego materiału dla warstwy komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Napiąć 5 µL Hoechst do sterylnej szklanej strzykawki Hamiltona o pojemności 10 µL z tępą igłą 34 G. 
	UWAGA: Iniekcja Hoechst jest opisana jako sposób oceny biodostępności wstrzykniętego materiału poprzez jego pobieranie przez warstwę komórek śródbłonka i jest przydatna podczas etapów kalibracji lub konfiguracji modelu. W ustawieniach eksperymentalnych strzykawka może być napełniona roztworem wybranego związku.</li>
	<li>Wprowadzić igłę napełnionej strzykawki przez tunel utworzony w sekcji 2 do przedniej komory oka.</li>
	<li>Wstrzyknąć preparat i przytrzymać igłę w miejscu przez 2-3 sekundy po iniekcji, aż cały płyn zostanie podany.</li>
	<li>Wyjąć igłę, wyciągając ją delikatnie i powoli, aby uniknąć wycieku z nacięcia tunelu rogówkowego.</li>
	<li>Około 15-20 min po iniekcji uśmiercić szczury poprzez domięśniowy wtrysk 500 mg/kg pentobarbitalu sodowego.</li>
	<li>Wyjąć oba gałki oczne i wyizolować rogówki. Pobrać rogówkę niepoddaną iniekcji jako kontrolę.</li>
	<li>Zbarwić obie rogówki 0,5% Alizarin Red S zgodnie z instrukcjami producenta w celu zidentyfikowania komórek śródbłonka.</li>
	<li>Zbadać pod mikroskopem świetlnym w celu obrazowania barwienia komórek śródbłonka alizaryną czerwoną oraz pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu obserwacji barwienia Hoechst, w porównaniu do kontrolnej rogówki niepoddanej iniekcji.</li>
</ol>

Optimized Rat Intracameral Injection Technique for Reduced Tissue Damage

<ol><li>Ramsay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+and+conjunctival+drug+permeability%3A+Systematic+comparison+and+pharmacokinetic+impact+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Corneal and conjunctival drug permeability: Systematic comparison and pharmacokinetic impact in the eye.</a> Eur J Pharm Sci. 119, 83-89 (2018).</li>
<li>Cholkar, K., Dasari, S. R., Pal, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCholkar%2C+K+%22Eye%3A+Anatomy%2C+Physiology+and+Barriers+to+Drug+Delivery.+Ocular+Transporters+and+Receptors%22">Eye: Anatomy, Physiology and Barriers to Drug Delivery. Ocular Transporters and Receptors</a>. , Elsevier, Woodhead Publishing. (2013).</li>
<li>Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+cornea%2C+sclera%2C+and+conjunctiva%3A+A+literature+analysis+for+drug+delivery+to+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Permeability of cornea, sclera, and conjunctiva: A literature analysis for drug delivery to the eye.</a> J Pharm Sci. 87 (12), 1479-1488 (1998).</li>
<li>Varela-Fernández, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+posterior+segment+of+the+Eye%3A+Biopharmaceutic+and+pharmacokinetic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the posterior segment of the Eye: Biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations.</a> Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).</li>
<li>Gautam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracameral+drug+delivery%3A+A+Review+of+agents%2C+indications%2C+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ocul+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intracameral drug delivery: A Review of agents, indications, and outcomes.</a> J Ocul Pharmacol Ther. 39 (2), 102-116 (2023).</li>
<li>Shah, T. J., Conway, M. D., Peyman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracameral+dexamethasone+injection+in+the+treatment+of+cataract+surgery+induced+inflammation%3A+design%2C+development%2C+and+place+in+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Intracameral dexamethasone injection in the treatment of cataract surgery induced inflammation: design, development, and place in therapy.</a> Clin Ophthalmol. 12, 2223-2235 (2018).</li>
<li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+human+disease%3A+An+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Med+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li>
<li>Chawla, S., Jena, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChawla%2C+S+%22The+Anatomy+and+Physiology+of+Laboratory+Rat.Essentials+of+Laboratory+Animal+Science%3A+Principles+and+Practices%22">The Anatomy and Physiology of Laboratory Rat.Essentials of Laboratory Animal Science: Principles and Practices</a>. , Springer. Singapore. (2021).</li>
<li>Lundström, M., Wejde, G., Stenevi, U., Thorburn, W., Montan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophthalmitis+after+cataract+surgery%3A+a+nationwide+prospective+study+evaluating+incidence+in+relation+to+incision+type+and+location%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Endophthalmitis after cataract surgery: a nationwide prospective study evaluating incidence in relation to incision type and location.</a> Ophthalmology. 114 (5), 866-870 (2007).</li>
<li>Fine, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clear+corneal+incisions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Ophthalmol+Clin%22%5BJournal%5D)">Clear corneal incisions.</a> Int Ophthalmol Clin. 34 (2), 59-72 (1994).</li>
<li>Herretes, S., Stark, W. J., Pirouzmanesh, A., Reyes, J. M. G., McDonnell, P. J., Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflow+of+ocular+surface+fluid+into+the+anterior+chamber+after+phacoemulsification+through+sutureless+corneal+cataract+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Inflow of ocular surface fluid into the anterior chamber after phacoemulsification through sutureless corneal cataract wounds.</a> Am J Ophthalmol. 140 (4), 737-740 (2005).</li>
<li>Masket, S., Belani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+wound+construction+to+prevent+short-term+ocular+hypotony+after+clear+corneal+incision+cataract+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cataract+Refract+Surg%22%5BJournal%5D)">Proper wound construction to prevent short-term ocular hypotony after clear corneal incision cataract surgery.</a> J Cataract Refract Surg. 33 (3), 383-386 (2007).</li>
<li>Taban, M., Rao, B., Reznik, J., Zhang, J., Chen, Z., McDonnell, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+morphology+of+sutureless+cataract+wounds+-+Effect+of+incision+angle+and+location%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Dynamic morphology of sutureless cataract wounds - Effect of incision angle and location.</a> Surv Ophthalmol. 49, Suppl 2 S62-S72 (2004).</li>
<li>Belforte, N., Sande, P. H., de Zavalía, N., Dorfman, D., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+benefit+of+radial+optic+neurotomy+in+a+rat+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Therapeutic benefit of radial optic neurotomy in a rat model of glaucoma.</a> PLoS One. 7 (3), e34574(2012).</li>
<li>Moreno, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+experimental+model+of+glaucoma+in+rats+through+intracameral+injections+of+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A new experimental model of glaucoma in rats through intracameral injections of hyaluronic acid.</a> Exp Eye Res. 81 (1), 71-80 (2005).</li>
<li>Belforte, N., Sande, P., de Zavalía, N., Knepper, P., Rosenstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+chondroitin+sulfate+on+intraocular+pressure+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of chondroitin sulfate on intraocular pressure in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (11), 5768-5775 (2010).</li>
<li>Matsumoto, Y., Kanamori, A., Nakamura, M., Negi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+chronic+glaucoma+model+induced+by+intracameral+injection+of+microbeads+suspended+in+sodium+sulfate-sodium+hyaluronate%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Rat chronic glaucoma model induced by intracameral injection of microbeads suspended in sodium sulfate-sodium hyaluronate.</a> Jpn J Ophthalmol. 58 (3), 290-297 (2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+rat+model+of+ocular+hypertension+by+a+single+intracameral+injection+of+cross-linked+hyaluronic+acid+hydrogel+%28Healaflow%C2%AE+%29%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Clin+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">A novel rat model of ocular hypertension by a single intracameral injection of cross-linked hyaluronic acid hydrogel (Healaflow® ).</a> Basic Clin Pharmacol Toxicol. 127 (5), 361-370 (2020).</li>
<li>Bowen, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+safety+and+efficacy+of+intracameral+cefuroxime%2C+moxifloxacin+and+vancomycin+at+the+end+of+cataract+surgery%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the safety and efficacy of intracameral cefuroxime, moxifloxacin and vancomycin at the end of cataract surgery: a meta-analysis.</a> Br J Ophthalmol. 102 (9), 1268-1276 (2018).</li>
<li>Kato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophylactic+antibiotics+for+postcataract+surgery+endophthalmitis%3A+a+systematic+review+and+network+meta-analysis+of+6.8+million+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prophylactic antibiotics for postcataract surgery endophthalmitis: a systematic review and network meta-analysis of 6.8 million eyes.</a> Sci Rep. 12 (1), 17416(2022).</li>
<li>Wang, M., Liu, Y., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cefuroxime+intracameral+injection+antibiotic+prophylactic+on+postoperative+endophthalmitis+wound+post-cataract%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Wound+J%22%5BJournal%5D)">Effect of cefuroxime intracameral injection antibiotic prophylactic on postoperative endophthalmitis wound post-cataract: A meta-analysis.</a> Int Wound J. 20 (5), 1376-1383 (2023).</li>
<li>Katz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracameral+cefuroxime+and+the+incidence+of+post-cataract+endophthalmitis%3A+an+Israeli+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Intracameral cefuroxime and the incidence of post-cataract endophthalmitis: an Israeli experience.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253 (10), 1729-1733 (2015).</li>
<li>Lipnitzki, I., Ben Eliahu, S., Marcovitz, A. L., Ezov, N., Kleinmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+concentration+of+moxifloxacin+after+intracameral+injection+combined+with+presoaked+intraocular+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cataract+Refract+Surg%22%5BJournal%5D)">Intraocular concentration of moxifloxacin after intracameral injection combined with presoaked intraocular lenses.</a> J Cataract Refract Surg. 40 (4), 639-643 (2014).</li>
<li>Colleaux, K. M., Hamilton, W. K., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prophylactic+antibiotics+and+incision+type+on+the+incidence+of+endophthalmitis+after+cataract+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Effect of prophylactic antibiotics and incision type on the incidence of endophthalmitis after cataract surgery.</a> Can J Ophthalmol. 35 (7), 373-378 (2000).</li>
<li>Libre, P. E., Della-Latta, P., Chin, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracameral+antibiotic+agents+for+endophthalmitis+prophylaxis%3A+A+pharmacokinetic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cataract+Refract+Surg%22%5BJournal%5D)">Intracameral antibiotic agents for endophthalmitis prophylaxis: A pharmacokinetic model.</a> J Cataract Refract Surg. 29 (9), 1791-1794 (2003).</li>
<li>Carino, N. S., Slomovic, A. R., Chung, F., Marcovich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+tetracaine+versus+topical+tetracaine+plus+intracameral+lidocaine+for+cataract+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cataract+Refract+Surg%22%5BJournal%5D)">Topical tetracaine versus topical tetracaine plus intracameral lidocaine for cataract surgery.</a> J Cataract Refract Surg. 24 (12), 1602-1608 (1998).</li>
<li>Minakaran, N., Ezra, D. G., Allan, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+anaesthesia+plus+intracameral+lidocaine+versus+topical+anaesthesia+alone+for+phacoemulsification+cataract+surgery+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+Syst+Rev%22%5BJournal%5D)">Topical anaesthesia plus intracameral lidocaine versus topical anaesthesia alone for phacoemulsification cataract surgery in adults.</a> Cochrane Database Syst Rev. 7 (7), CD005276 (2020).</li>
<li>Dan-Ni, W., Li-Dian, H., Zhi-Guo, P., Qiang, W., Lei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracameral+anti-VEGF+injection+for+advanced+neovascular+glaucoma+after+vitrectomy+with+silicone+oil+tamponade%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Intracameral anti-VEGF injection for advanced neovascular glaucoma after vitrectomy with silicone oil tamponade.</a> Int J Ophthalmol. 14 (3), 129-135 (2021).</li>
<li>Bhagat, P. R., Agrawal, K. U., Tandel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+effect+of+injection+bevacizumab+through+various+routes+in+neovascular+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Curr+Glaucoma+Pract%22%5BJournal%5D)">Study of the effect of injection bevacizumab through various routes in neovascular glaucoma.</a> J Curr Glaucoma Pract. 10 (2), 39-48 (2016).</li>
<li>Al-Qaysi, Z. K., Beadham, I. G., Schwikkard, S. L., Bear, J. C., Al-Kinani, A. A., Alany, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+ocular+drug+delivery+systems+for+glaucoma+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Sustained release ocular drug delivery systems for glaucoma therapy.</a> Expert Opin Drug Deliv. 20 (7), 905-919 (2023).</li>
<li>Eghrari, A. O., Gottsch, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuchs%27+corneal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fuchs' corneal dystrophy.</a> Expert Rev Ophthalmol. 5 (2), 147-159 (2010).</li>
</ol>

Marcovich A. L. posiada patenty w firmach Steba Biotech, Yeda Weizmann, EyeYon Medical i Mor Isum oraz jest konsultantem w firmach EyeYon Medical i Johnson & Johnson. Wszyscy pozostali autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Modele badań przedklinicznych powinny zapewniać kontrolowane i powtarzalne środowisko w celu zapewnienia wiarygodności i możliwości zastosowania wyników. W badaniach okulistycznych modele iniekcji do oczu są powszechnie stosowane w różnych aspektach badawczych, począwszy od tworzenia modeli chorób, testowania nowych metod leczenia oraz oceny reakcji tkanek i potencjalnych skutków ubocznych.
Iniekcje dokomorowe służą jako powszechna technika w okulistyce eksperymentalnej, ułatwiając bezpośrednie dostarczanie związków do cieczy wodnistej, omijając zewnętrzne bariery tkanki oka5. To ukierunkowane podejście polegające na wstrzyknięciu dokomorowym zapewnia, że optymalne stężenie leku dociera do zamierzonego miejsca działania, takiego jak soczewka, siatka beleczkowa lub śródbłonek rogówki, maksymalizując w ten sposób korzyści terapeutyczne.
Wykonywanie iniekcji dokomorowych u małych gryzoni wiąże się z kilkoma wyzwaniami technicznymi, które mogą mieć wpływ na odtwarzalność i powodzenie eksperymentów. Po pierwsze, małe wymiary oka gryzonia stwarzają trudności w dostępie i manipulacji bez powodowania uszkodzenia struktur oka. Szczury, w tym kontekście, mają pewną przewagę nad myszami ze względu na ich większe oczy. Po drugie, umiejscowienie soczewki w ograniczonej komorze przedniej może blokować drogę do miejsca wstrzyknięcia. W porównaniu z innymi ssakami, w tym ludźmi, szczury mają soczewkę, o której wiadomo, że jest wystająca lub wydatna, co przyczynia się do jej stosunkowo dużego rozmiaru w stosunku do oka (ryc. 1). Dodatkowo soczewce szczura brakuje elastyczności widocznej w soczewce ludzkiej. W związku z tym konieczne jest ostrożne manewrowanie igłą iniekcyjną, aby poruszać się po soczewce bez powodowania uszkodzeń.
Uszkodzenie tkanek podczas manipulacji może prowadzić do różnych powikłań, w tym spłycenia przedniej komory, zwiększonego ciśnienia wewnątrzgałkowego, zapalenia lub zapalenia przedniego odcinka błony naczyniowej oka, uszkodzenia komórek śródbłonka, powstawania zaćmy, innych zmian strukturalnych lub deformacji oraz ryzyka infekcji. Wyzwania te podkreślają potrzebę precyzyjnych technik i starannego rozważenia różnic anatomicznych podczas wykonywania iniekcji dokomorowych w małych modelach gryzoni.
Opisana w tym protokole technika iniekcji dokomorowej została opracowana w celu zminimalizowania ryzyka uszkodzenia tkanek oka podczas procesu iniekcji. Metoda polega na ustanowieniu samouszczelniającego się tunelu do komory przedniej, ułatwiającego wejście przy minimalnych oporach tarcia. Dobrze uszczelnione nacięcie ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia ryzyka pooperacyjnej hipotonii i wycieku płynu oraz zapobieżenia infekcji mikroorganizmami z powiek i rzęs. Kąt i długość nacięcia mają kluczowe znaczenie zarówno dla dynamiki rany, rozwoju działań niepożądanych, jak i późniejszej rekonwalescencji. Zbyt duże nacięcia mogą zmętniać oś wzrokową i wywoływać rozstępy lub obrzęki rogówki, podczas gdy krótkie nacięcia mogą destabilizować przednią komorę i indukować wypadanie tęczówki. Wykonanie nacięcia pod kątem zbliżonym do osi płaszczyzny rogówki pozwala na wygenerowanie długiego tunelu jednopłaszczyznowego bez związanego z tym ryzyka. Co ważne, wnikanie igły do przedniej komory przez prowadzony długi tunel poprawia precyzję, zmniejszając prawdopodobieństwo przypadkowego dotknięcia soczewki. Ponadto, w przeciwieństwie do iniekcji u ludzi, gdzie preferowane są nacięcia obwodowe, tunel u szczurów wykonuje się w środkowej rogówce, gdzie przednia komora jest najgłębsza. Walidacja eksperymentalna potwierdziła, że metoda ta pozwala na wstrzykiwanie bez wycieku cieczy wodnistej lub płytkiego nasycania przedniej komory oraz bez dotykania soczewki.
Wcześniejsze badania opisywały różne metody wstrzykiwania do przedniej komory u szczurów. Na przykład grupa Rosensteina opisała w kilku badaniach wstrzyknięcie do komory przedniej przez rąbek rogówki. Wstrzyknięcie 20 μl płynu stopniowo zwiększało głębokość komory, a tym samym oddzielało igłę od tęczówki, co sprzyja unikaniu kontaktu igły z soczewką. Skutki uboczne wstrzyknięcia zgłaszano jako przemijający obrzęk rogówki i około 5% częstość występowania zaćmy 14,15,16. Matsumoto i wsp. opisali technikę wstrzykiwania mikrokulek dokomorowych u szczurów w celu stworzenia modelu jaskry. Autorzy zastosowali jednoetapowe nacięcie, tworząc tunel twardówkowo-rogówkowy za pomocą igły 34 G, którą wprowadzono skośnie do góry do komory przedniej. Autorzy zgłosili unikanie uderzania w rogówkę lub tęczówkę i nie odnotowali żadnych incydentów zapalnych, z zaledwie kilkoma przypadkami (<7% badanych zwierząt) uszkodzenia warstwy śródbłonka podczas zastrzyków. Jednak autorzy opisali, że samo zmodyfikowane wstrzyknięcie nie wystarczyło, aby zapobiec znacznemu wyciekowi z przedniej komory i refluksowi do przestrzeni podspojówkowej. Aby temu zaradzić, mieszanina mikrogranulek o pojemności 20 μl z dyspersyjnym okulistycznym urządzeniem wiskochirurgicznym (OVD; Viscoat) został wstrzyknięty. Spowodowało to znaczne zwiększenie ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) do 4 tygodni po wstrzyknięciu17. Podobnie Liu i wsp. opisali wstrzyknięcie dokomorowe za pomocą igły 32 G wprowadzonej do przedniej komory równolegle do tęczówki wzdłuż rąbka, tworząc samouszczelniający się tunel rogówki18. Autorzy wstrzyknęli 3 μl hydrożelu kwasu hialuronowego sodu, a do uciśnięcia miejsca wstrzyknięcia użyto bawełnianego wacika, aby zminimalizować wyciek z przedniej komory. Opisano żel o dużej masie cząsteczkowej jako zatrzymywany w komorze przedniej i blokujący odpływ cieczy wodnistej przez siatkę beleczkową18. Warto zauważyć, że opisana tutaj zmodyfikowana metoda iniekcji dokomorowej toleruje wtrysk bez środków lepkosprężystych i dlatego znajduje zastosowanie w szerokim zakresie zastosowań badawczych. Niemniej jednak, ponieważ badanie to ograniczało się do wstrzykiwania płynnych roztworów w objętości nie większej niż 5 μl, należy przeprowadzić dokładne porównanie metod wstrzykiwania i wstrzykiwanych materiałów dla konkretnych celów badawczych w celu określenia najbardziej odpowiedniej techniki.
Kliniczne zastosowanie iniekcji dokomorowych jest zróżnicowane i szerokie. Na przykład dokomorowe podawanie kortykosteroidów i antybiotyków, takich jak cefuroksym i moksyfloksacyna, jest powszechne podczas operacji zaćmy jako środek profilaktyczny zapobiegający infekcji pooperacyjnej i zapaleniu wnętrza gałki ocznej 19,20,21,22,23,24,25. Podawanie wewnątrzgałkowe jest również stosowane do znieczulenia miejscowego i rozszerzenia źrenic podczas rutynowych operacji zaćmy 26,27. Ponadto leczenie jaskry polega na stosowaniu różnych leków podawanych dokomorowo, które obniżają ciśnienie wewnątrzgałkowe, takich jak analogi prostaglandyn lub agoniści muskaryny, które zwiększają odpływ cieczy wodnistej, środki przeciwzwłóknieniowe, takie jak mitomycyna C, aby zapobiec bliznowaceniu i zwłóknieniu, oraz środki przeciwdziałające czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego (anty-VEGF) w jaskrze neowaskularnej 28,29,30 . Ta różnorodna gama zabiegów wewnątrzkomorowych odzwierciedla ich kluczową rolę w leczeniu różnych schorzeń okulistycznych i poprawie wyników leczenia pacjentów.
Opisana tutaj metoda iniekcji dokomorowej będzie korzystna dla różnych badań przedklinicznych mających na celu rozwój szerokich zastosowań klinicznych iniekcji dokomorowych. Na przykład zastosowanie iniekcji dokomorowej w modelach szczurzych w celu określenia skuteczności, optymalnych dawek, czasu i długoterminowych wyników różnych leków jest kluczowym początkowym krokiem przed przejściem do badań klinicznych. W takich badaniach poprawa precyzji i odtwarzalności techniki iniekcji będzie kluczem do pomyślnych osiągnięć i postępów w badaniu.
Ponadto opisana metoda iniekcji dokomorowej może być wykorzystana do generowania eksperymentalnych modeli różnych patologii oka poprzez dostarczanie wektorów lub substancji chemicznych do komory przedniej. Takie modele eksperymentalne mają kluczowe znaczenie dla badania mechanizmów choroby i opracowywania nowych metod leczenia. Na przykład na dystrofię śródbłonka Fuchsa (FED), postępującą chorobę rogówki powodującą stopniową utratę wzroku, niema lekarstwa. Podstawowe postępowanie polega na monitorowaniu i łagodzeniu objawów, często poprzez miejscowe leki w celu tymczasowego złagodzenia obrzęku lub nawilżenia oczu. W przypadku postępu choroby lub poważnego upośledzenia wzroku przeszczep rogówki (keratoplastyka śródbłonka) staje się konieczną interwencją. Badania mające na celu opracowanie nowych opcji leczenia FED, potencjalnie stanowiących alternatywę dla przeszczepu rogówki, są wysoce uzasadnione. Biorąc pod uwagę ograniczoną biodostępność leków dostarczanych przez rogówkę lub spojówkę 1,2,3, podawanie dokomorowe jawi się jako korzystna droga leczenia warstwy śródbłonka. Eksperymentalne modele iniekcji dokomorowej odgrywają kluczową rolę w opracowywaniu nowych podejść terapeutycznych dla FED. Zastosowanie opisanego tutaj podejścia do iniekcji dokomorowej może wywołać wychwyt wstrzykniętego materiału do warstwy śródbłonka rogówki. Implementacja tej metody w iniekcji dokomorowej pozwala na tworzenie eksperymentalnych modeli leczenia FED z dużą precyzją i powtarzalnością. Przyczynia się to nie tylko do pogłębienia naszej wiedzy na temat FED, ale także otwiera możliwości opracowania ukierunkowanych i skutecznych interwencji terapeutycznych.
Podsumowując, opisano tutaj zoptymalizowaną procedurę wstrzykiwania dokomorowego u szczurów o niskim ryzyku wystąpienia działań niepożądanych, która byłaby cenna dla poprawy przedklinicznych badań okulistycznych i przyczynienia się do rozwoju nowych możliwości terapeutycznych patologii oczu.

Biodostępność związków podawanych miejscowo na powierzchnię oka jest znacznie ograniczona i zazwyczaj wynosi &lt;5%1. Związki podawane w formie kropel do oczu są głównie usuwane poprzez drenaż, indukowane łzawienie, wymianę płynu łzowego oraz wchłanianie przez spojówkę. Dodatkowo przenikanie związków przez powierzchnię oka jest silnie ograniczone przez barierę rogówka-spojówkowka1,2,3. Rogówka składa się z trzech głównych warstw: zewnętrznego nabłonka, środkowej tkanki podrzędnej (stromy) oraz wewnętrznego śródbłonka. Powierzchniowy nabłonek rogówki jest połączony silnymi połączeniami ścisłymi, które tworzą wysoką oporność parakomórkową, stanowiącą główną barierę dla przepuszczalności substancji. Wiele warstw nabłonka dodatkowo ogranicza przenikanie cząsteczek hydrofilowych i dużych cząsteczek przez przestrzenie międzykomórkowe nabłonka rogówki. Po nabłonku następuje stroma, która składa się z włókien kolagenowych i zawiera pory wodne. W przeciwieństwie do nabłonka rogówki, stroma umożliwia przemieszczanie się leków hydrofilowych; jest jednak w dużym stopniu nieprzepuszczalna dla związków lipofilowych1,2,3. Wspólnie nabłonek i warstwy stromy rogówki stanowią główne bariery tkankowe ograniczające wchłanianie leków. Śródbłonek rogówki nie jest uważany za czynnik ograniczający transport leków.
Alternatywą dla drogi podania przez rogówkę jest droga spojączówkowa. Spojąwka to wielowarstwowy nabłonek pokrywający wewnętrzną stronę powiek oraz przednią część twardówki. Spojąwka charakteryzuje się mniejszą liczbą połączeń szczelnych niż nabłonek rogówki, co pozwala na lepszą przepuszczalność leków hydrofilowych. Jednakże unaczynienie spojąwki prowadzi do systemowego wchłaniania znacznej frakcji podanych cząsteczek, co ponownie znacznie ogranicza biodostępność dostarczanych związków w komorze przedniej1,2. Efektywnym sposobem na obejście zewnętrznych barier przepuszczalności oka jest podawanie leku bezpośrednio do obszaru zainteresowania. Na przykład wstrzyknięcia doszkieistne są powszechnie stosowane do dostarczania leków do ciała szklistego4. Podobnie, wstrzyknięcia do komory przedniej są wykorzystywane do dostarczania substancji do komory przedniej5. Osiągnięcie efektywnego stężenia w komorze przedniej ma krytyczne znaczenie w różnych sytuacjach klinicznych, takich jak leczenie infekcji poprzez wstrzyknięcia do komory przedniej antybiotyków czy pooperacyjne leczenie przeciwzapalne w chirurgii zaćmy. Pomimo zalety w postaci poprawionej biodostępności substancji zapewnianej przez wstrzyknięcia do komory przedniej, istnieją poważne obawy dotyczące bezpieczeństwa, które należy wziąć pod uwagę. Na przykład wstrzyknięcie leku do komory przedniej może wywołać wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego, toksyczny zespół przedniego odcinka oka oraz toksyczny zespół zniszczenia komórek śródbłonka5,6. Dlatego niezbędne jest dokładne ocenienie w badaniach przedklinicznych skuteczności i bezpieczeństwa leków dostarczanych poprzez wstrzyknięcia do komory przedniej, aby zmaksymalizować efektywność leczenia i zminimalizować potencjalne działania niepożądane u pacjentów.
Modele zwierzęce są niezastąpione w badaniach przedklinicznych służących do analizy nowych metod leczenia. Małe gryzonie, takie jak myszy i szczury, są najczęściej wykorzystywanymi zwierzętami laboratoryjnymi do tych celów. Zwierzęta te wykazują liczne podobieństwa do ludzkiej anatomii i fizjologii, dostarczając cennych informacji. Ponadto ich stosowanie jest korzystne ekonomicznie ze względu na niewielki rozmiar, łatwość utrzymania, krótki okres ciąży oraz zdolność do wydawania na świat licznego potomstwa7.
Mimo powszechnego wykorzystywania małych gryzoni w modelach chorób oczu, ich specyficzne wymiary oraz anatomia oka stanowią istotne wyzwanie podczas manipulacji eksperymentalnych. Na przykład procedury takie jak zastrzyki do komory przedniej, które u ludzi są stosunkowo proste, stają się technicznie wymagające u myszy i szczurów. Trudności te wynikają z czynników takich jak mała objętość cieczy wodnistej, stosunkowo duża i nieelastyczna soczewka oraz utrudniające dostęp położenie i krzywizna soczewki w oczach gryzoni (Rysunek 1)8. Wyzwania te zwiększają ryzyko uszkodzeń podczas wstrzykiwań do komory przedniej u gryzoni, co prowadzi do potencjalnych skutków niepożądanych i wprowadza zmienność eksperymentalną, która może wpłynąć na ważność wniosków z badania. W naszych badaniach z powodzeniem opracowaliśmy procedurę bezpiecznego wstrzykiwania do komory przedniej u szczurów. Technika ta polega na utworzeniu w rogówce długiego, płaskiego, samouszczelniającego się tunelu prowadzącego do komory przedniej. Metoda ta nie tylko zapewnia precyzję, ale także zwiększa powtarzalność eksperymentalną, rozwiązując problemy związane z technikami wstrzykiwania u małych gryzoni.
<img alt="Schemat porównawczy anatomii oka: szczur vs. człowiek; opisano soczewkę, tęczówkę i rogówkę do celów edukacyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie cech anatomicznych przedniego odcinka oka szczura i człowieka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Alizarin Czerwony&nbsp;</td><td>Alpha Aesar</td><td>042040.5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina&nbsp;</td><td>Richter pharma</td><td>102047</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon 0,1%&nbsp;</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>393102-0413</td><td></td></tr><tr><td>Szklana strzykawka Hamilton 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Hamilton Co.</td><td></td><td></td>721711</tr><tr><td>Hoeschst</td><td>Merck</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Bremer pharma GMBH (medimarket)</td><td>17889</td><td></td></tr><tr><td>Ofloksacyna 0,3% krople do oczu</td><td>Allergan</td><td>E92170</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek oksybuprokainy 0,4%&nbsp;</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>N/A</td> Pentobarbital <td></td></tr><tr><td>sodowy 200 mg/mL</td><td>CTS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop szczelinowy&nbsp;</td><td>Haag-streit bern</td><td>b-90019115</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley Rats</td><td>Envigo</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze szpilkowe 31 G 0,8 mm&nbsp;</td><td>Tecfen medical (skymed)</td><td>QKN2808</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Zeiss</td><td>OPMI-6 CFC</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sartorius</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Eurovet Zdrowie zwierząt&nbsp;</td><td></td><td></td>615648</tr></tbody></table>

wstrzyknięcie dokomorowe u szczurów o niskim ryzyku wystąpienia działań niepożądanych

Intracameral Injection in Rats with Low Risk of Adverse Effects

Wstrzyknięcie dokomorowe jest standardowym sposobem podawania w okulistyce. Zastosowanie iniekcji dokomorowej u gryzoni do celów badawczych jest trudne ze względu na ograniczone wymiary i anatomię oka, w tym małą objętość cieczy wodnistej, krzywiznę soczewki i grubość soczewki. Potencjalne uszkodzenia podczas iniekcji dokomorowych wprowadzają działania niepożądane i zmienność eksperymentalną. Protokół ten opisuje procedurę wstrzykiwania dokomorowego u szczurów, zapewniającą precyzję i powtarzalność.
Szczury Sprague-Dawley zostały użyte jako modele eksperymentalne. Ponieważ pozycja soczewki u szczurów wystaje do przedniej komory, wstrzykiwanie z obrzeży, jak to ma miejsce u ludzi, jest niekorzystne. Dlatego w centralnej okolicy rogówki tworzy się nacięcie za pomocą ostrza szpilkowego o rozmiarze 31 0,8 mm, aby utworzyć samouszczelniający się tunel do komory przedniej. Nacięcie pod kątem zbliżonym do mieszkania pozwala na stworzenie długiego tunelu, który minimalizuje utratę cieczy wodnistej i spłycenie komory przedniej. Do tunelu wprowadza się nanoigłę o rozmiarze 34 w celu wstrzyknięcia. Umożliwia to penetrację przy minimalnym oporze tarcia i pozwala uniknąć dotykania soczewki. Wstrzyknięcie błękitu trypanowego umożliwia wizualizację za pomocą mikroskopii szczelinowej obecności barwnika w komorze przedniej i wykluczenie przecieku. Biodostępność do warstwy śródbłonka rogówki wykazuje się przez wstrzyknięcie barwnika Hoechsta, który po wstrzyknięciu zabarwił jądra komórek śródbłonka rogówki.
Podsumowując, ten protokół implementuje procedurę dokładnego wstrzykiwania dokomorowego u szczurów. Procedura ta może być stosowana do dodokomorowego dostarczania różnych leków i związków w eksperymentalnych modelach szczurzych, zwiększając wydajność i powtarzalność badań okulistycznych.

Szczury rasy Sprague Dawley otrzymały do przedniej komory wstrzyknięte 5 µL błękitu trypanowego zgodnie z powyższym protokołem. Badanie w lampie szczelinowej bezpośrednio po iniekcji wykazało zabarwienie komory błękitem trypanowym, co wskazuje, że wstrzyknięty materiał dotarł do przedniej komory (Rycina 3). Ponadto głębokość przedniej komory pozostała niezmieniona, co sugeruje, że iniekcja nie spowodowała wycieku cieczy wodistej ani spłycenia komory.
<img alt="Anatomia oka pod mikroskopem; struktura gałki ocznej, szczegóły naczyń włosowatych, badanie komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Nienaruszona komora przednia po wstrzyknięciu do wnętrza komory przedniej. Błękit trypanu wstrzyknięto do komory przedniej oka szczura. Badanie za pomocą lampy szczelinowej wykazuje obecność błękitu trypanu bez wycieku lub spłycenia komory przedniej. Pasek skali = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Następnie wstrzyknięto Hoechst, przenikający przez błony komórkowe barwnik fluorescencyjny wiążący DNA i barwiący jądra komórkowe, aby ocenić biodostępność leków dostarczanych opisaną drogą wstrzyknięcia do przedniej komory oka. Pobieranie Hoechst przez komórki śródbłonka oceniano 15 min po wstrzyknięciu poprzez izolację rogówek i obserwację pod mikroskopem fluorescencyjnym. W celu identyfikacji komórek śródbłonka rogówki zabarwiono Alizariną Czerwoną S, która barwi granice międzykomórkowe warstwy komórek śródbłonka. Jako kontrolę zbadano niezakłute oko tego samego szczura. Nasze wyniki wykazują, że warstwa komórek śródbłonka pozostała nienaruszona po wstrzyknięciu, co potwierdza, że opisana procedura nie powoduje uszkodzenia śródbłonka. Co więcej, komórki śródbłonka wykazały pozytywne barwienie jąder barwnikiem Hoechst, co dowodzi pobierania wstrzykniętego Hoechst po iniekcji do przedniej komory oka (Rycina 4).
<img alt="Porównanie barwienia komórek Alizaryną Czerwoną, Hoechst oraz obrazy złożone; technika mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Biodostępność materiału wstrzykniętego do komory przedniej dla warstwy komórek śródbłonka. Hoechst wstrzyknięto do komory przedniej szczura. Rogówkę wyizolowano 15 min po wstrzyknięciu, zbarwiono Alizaryną Czerwoną S w celu uwidocznienia komórek śródbłonka, a następnie wykonano obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby zaobserwować barwienie Hoechst. Obrazy nałożone wykazują jądrowe barwienie Hoechst w komórkach śródbłonka rogówki. Paski skali = 50 µM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje technikę wstrzykiwania dokomorowego u szczurów za pomocą centralnego nacięcia rogówki i długiego tunelu do przedniej komory. Ta metoda iniekcji minimalizuje ryzyko wywołania niezamierzonego uszkodzenia tkanki, a tym samym poprawia precyzję i odtwarzalność.

Wstrzyknięcie dokomorowe u szczurów o niskim ryzyku wystąpienia działań niepożądanych

Intracameral injection is a standard administration routine in ophthalmology. The application of intracameral injection in rodents for research is ...

Iniekcje dokomorowe pozwalają ominąć zewnętrzną barierę oczną i bezpośrednio dostarczyć związki do cieczy wodnistej. Jednak przeprowadzenie iniekcji dokomorowej u gryzoni wiąże się z wyzwaniami technicznymi, które mogą skutkować niekorzystnym skutkiem i wpłynąć na wynik eksperymentu. Dlatego opracowujemy protokół z uwzględnieniem anatomii oka szczura, aby umożliwić wstrzyknięcie dokomorowe przy minimalnym ryzyku wystąpienia działań niepożądanych.Iniekcje dokomorowe u gryzoni wiążą się z ryzykiem uszkodzenia tkanek ze względu na małe wymiary gałki ocznej, ograniczoną objętość cieczy wodnistej i umiejscowienie soczewki. Uszkodzenie tkanek podczas manipulacji może prowadzić do powikłań, takich jak płytkie sąsiedztwo przedniej komory, uszkodzenie soczewki oraz uszkodzenie komórek przednich i stan zapalny. Wszystko to powoduje zmienność eksperymentalną i wpływa na wyniki.Długość i kąt nacięcia mają kluczowe znaczenie. Wykonujemy nacięcie w centralnej części rogówki, gdzie przednia komora jest najgłębsza, pod kątem zbliżonym do płaskiego. W ten sposób powstaje długi tunel, który pomaga w zmniejszeniu utraty cieczy wodnistej.Wstrzykiwanie przez tunel poprawia precyzję i zmniejsza prawdopodobieństwo dotknięcia soczewki. Opisana metoda wstrzykiwania interkomu może być wykorzystywana w różnych warunkach eksperymentalnych do generowania modeli chorób lub oceny różnych metod leczenia. Oczekujemy, że precyzja i powtarzalność tej techniki iniekcji będzie cennym narzędziem w okulistyce eksperymentalnej.Na początek przygotuj zwierzę do operacji i nałóż 0,3% ofloksacyny i 0,1% deksametazonu na oko zwierzęcia. Za pomocą chirurgicznych kleszczy okulistycznych przytrzymaj górną twardówkę w pionowej linii środkowej obok połączenia rogówkowo-twardówkowego, aby ustabilizować oko. Pod mikroskopem chirurgicznym umieść sterylne ostrze szpilki o rozmiarze 0,8 milimetra i rozmiarze 31 w paracentralnym obszarze rogówki na pionowej linii środkowej.W tej pozycji nakłuj rogówkę, aby wykonać nacięcie i utwórz długi tunel, aż wniknie w centralną część przedniej komory. Następnie należy zastosować miejscowo 0,3% ofloksacynę i 0,1% deksametazon do oka. Następnie pod mikroskopem szczelinowym obserwuj głębokość przedniej komory oka, w które wykonano iniekcję w porównaniu z okiem bez iniekcji.Należy również obserwować soczewkę oka, w które wykonano iniekcję w porównaniu z soczewką oka bez wstrzyknięcia. Zacznij od załadowania pięciu mikrolitrów błękitu trypanowego do sterylnej szklanej strzykawki Hamilton o pojemności 10 mikrolitrów, wyposażonej w igłę o rozmiarze 34. Następnie wprowadzić załadowaną igłę strzykawki przez samouszczelniający się tunel rogówki do komory przedniej.Wstrzyknąć roztwór do oka i przytrzymać igłę na miejscu przez dwie do trzech sekund, aż cały płyn zniknie. Delikatnie wyciągnąć igłę. Zbadaj pod mikroskopią szczelinową.Oceń głębokość komory przedniej, aby wykluczyć spłycenie i sprawdź obecność błękitu trypanowego w komorze przedniej. Korzystając z tego protokołu, rogówkom szczurów Sprague Dawley wstrzyknięto błękit trypanowy. Natychmiastowe badanie lampą szczelinową po wstrzyknięciu wykazało, że przednia komora była widocznie zabarwiona błękitem trypanowym, co potwierdzało pomyślne dostarczenie substancji do obszaru docelowego.Na początek załaduj pięć mikrolitrów roztworu hoechst do sterylnej szklanej strzykawki Hamilton o pojemności 10 mikrolitrów przymocowanej do igły o rozmiarze 34. Wprowadzić igłę strzykawki do przedniej komory przez samouszczelniający się tunel rogówki i wstrzyknąć roztwór. Przytrzymaj igłę na miejscu przez dwie do trzech sekund, aż cały płyn zniknie.Powoli wyciągnąć igłę, aby ją usunąć, unikając wycieku. Następnie wyłuszczenie obu oczu. Aby wyizolować rogówkę, przetnij twardówkę wokół nerwu wzrokowego i wykonaj cztery dodatkowe nacięcia od nerwu wzrokowego w kierunku rogówki.Spuść nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej whatman. Rozłóż przeciętą twardówkę i oddziel siatkówkę od twardówki. Wyciągnij i wyrzuć soczewkę i siatkówkę.Następnie usuń tęczówkę. Wytnij i wyrzuć twardówkę wokół rogówki i ostrożnie podnieś rogówkę. Umieszczając rogówki na szkiełku podstawowym, zabarwić je 0,5% czerwienią alizarynową, aby zidentyfikować komórki śródbłonka.Po usunięciu nadmiaru plamy umyj rogówkę trzy razy i nałóż na nią szkiełko nakrywkowe. Zbadaj rogówki pod mikroskopem świetlnym, aby zobrazować czerwone zabarwienie komórek śródbłonka. Oceń również rogówki pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zaobserwować barwienie hoechst i porównaj je z rogówką bez wstrzyknięcia jako kontrola.Barwnik Hoechsta, przepuszczalny dla komórek DNA marker fluorescencyjny, wykorzystano do oceny biodostępności leku poprzez wstrzyknięcie dokomorowe. Wychwyt komórek śródbłonka rogówki hoechst badano 15 po wstrzyknięciu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Barwienie czerwienią alizaryny uwydatniło międzykomórkowe granice warstwy śródbłonka.Również dodatnie barwienie hoechst w jądrach komórek śródbłonka rogówki potwierdziło pomyślne dostarczenie barwnika tą metodą.

intracameral-injection-in-rats-with-low-risk-of-adverse-effects

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Iniekcja doszklistkowa jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach nad naukami o widzeniu w kontekście chorób oczu lub jako metoda bezpośredniego zastosowania miejscowego leczenia. W tym filmie zaprezentowano protokół iniekcji doszklistkowej z użyciem strzykawki o pojemności 1ml z szklaną pipetą. Przedstawiono praktyczne wskazówki dotyczące unikania masywnych krwawień oraz uszkodzeń soczewki.

Iniekcja doplastycznej w głąb ciała szklistego w celu ustanowienia modelu chorób oczu

Bezpieczna i humanitarna praca z gryzoniami laboratoryjnymi wymaga podstawowych kompetencji w zakresie metod chwytania i unieruchamiania. Niniejszy artykuł przedstawi podstawowe zasady niezbędne do bezpiecznego obchodzenia się z myszami i szczurami oraz efektywnego podawania im związków chemicznych.

Manualne unieruchamianie i powszechne drogi podawania związków u myszy i szczurów

Zastrzyki podsiatkówkowe są najczęstszą techniką dostarczania dużych środków terapeutycznych, takich jak białka i wektory wirusowe, do fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki. Alternatywna metoda u myszy, która z powodzeniem celuje w przestrzeń podsiatkówkową z minimalnymi uszkodzeniami ubocznymi i krótkim czasem rekonwalescencji, jest opisana tutaj.

Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

Ten protokół ma na celu zademonstrowanie powtarzalnej drogi podawania dożylnego, która może być stosowana u szczurów i myszy przez cały okres noworodkowy. Procedura ta jest ważna dla przedklinicznych badań na gryzoniach, które mają na celu odzwierciedlenie podawania leków na oddziałach opieki neonatologicznej, głównie przy użyciu podawania dożylnego.

Model iniekcji żyły zaoczodołowej u noworodków gryzoni

Opisano procedurę chirurgiczną polegającą na wykonaniu zastrzyków do spłuczki lędźwiowej młodego szczura. Podejście to zostało wykorzystane do dokanałowego dostarczania wektorów terapii genowej, ale przewiduje się, że podejście to może być stosowane w różnych terapiach, w tym komórkach i lekach.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Ten artykuł opisuje metody iniekcji podsiatkówkowej u szczurów, wykorzystując śródoperacyjną wizualizację do kontrolowania zarówno miejsca wstrzyknięcia, jak i obszaru odwarstwienia siatkówki.

Śródoperacyjna wizualizacja wstrzyknięcia podsiatkówkowego i odwarstwienia siatkówki u szczurów

Ten protokół opisuje unikalną technikę wykorzystującą podejście przezspojówkowe do dostępu do nerwu wzrokowego szczura w celu wykonania zastrzyków.

Podejście przezspojówkowe do wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego szczura

To badanie przedstawia metodologię dostarczania leków do siatkówki i nerwów wzrokowych dorosłego szczura. Dodatkowo wprowadzono unikalną metodę pobierania tkanek w celu odgórnego pobrania en bloc nerwu wzrokowego i siatkówki u dorosłego szczura.

Terapeutyczne dostarczanie do oczu i zaawansowane pobieranie tkanek u dorosłych szczurów

W tym filmie demonstrujemy, jak izolować komórki mononuklearne z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego.

Izolacja komórek mononuklearnych z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z EAE

W niniejszym materiale przedstawiamy sposób wykonywania iniekcji do zatoki nadoczodołowej u dorosłych rybek zebrafish.

Iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych

Poznaj technikę wstrzyknięcia dokomorowego u szczurów z minimalnym ryzykiem uszkodzenia tkanek. Metoda zapewnia precyzyjne podawanie substancji do komory przedniej oka, poprawiając powtarzalność wyników w badaniach okulistycznych.

Wstrzyknięcie dokomorowe u szczurów o niskim ryzyku wystąpienia działań niepożądanych

Przeglądaj więcej filmów