Name: Zapis podstawowy: technika analizy reakcji neuronów smaku u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Poznaj technikę zapisu podstawowego do analizy reakcji neuronów smaku u Drosophila melanogaster. Ta metoda elektrofizjologiczna umożliwia badanie odpowiedzi na bodźce hydrofobowe, rozszerzając możliwości tradycyjnych metod.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Zinie Berman za wsparcie, Lisie Baik za komentarze do manuskryptu i innym członkom laboratorium Carlson za dyskusję. Praca ta była wspierana przez NIH grant K01 DC020145 dla H.K.M.D; a NIH przyznaje R01 DC02174, R01 DC04729 i R01 DC011697 dla JRC.

Poniższy protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi Uniwersytetu Yale dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Muchy
<ol>
	<li>Umieść 10-15 nowo wynurzonych much w świeżych standardowych fiolkach z kulturami w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 60% w cyklu 12:12 godzin jasno-ciemnym.</li>
	<li>Używaj much w wieku 3-7 dni.</li>
</ol>
2. Bodźce chemosensoryczne
<ol>
	<li>Pozyskaj bodźce chemosensoryczne o najwyższej dostępnej czystości. Przechowuj je zgodnie z zaleceniami sprzedawcy do czasu użycia.</li>
	<li>Rozpuść bodźce chemosensoryczne i rozcieńcz do pożądanych stężeń w wodzie lub innym pożądanym, nietoksycznym rozpuszczalniku, takim jak olej parafinowy. Przygotowane roztwory mieszać przez minimum 1 godzinę w przypadku rozpuszczonych związków stałych.</li>
</ol>
3. Kapilara stymulująca szkło
<ol>
	<li>Pociągnij szklaną kapilarę, aby zatrzymać bodziec z kapilary ze szkła borokrzemianowego (100 mm długości, 1 mm średnicy zewnętrznej, 0.58 mm średnicy wewnętrznej) za pomocą ściągacza do pipet. Dążyć do osiągnięcia średnicy końcówki od 3 μm do 10 μm.</li>
	<li>Napełnij szklaną kapilarę preferowanym roztworem stymulacyjnym za pomocą końcówki do pipet z mikroładowarką. Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków, które można usunąć poprzez delikatne stukanie.</li>
	<li>Jeśli bodziec krystalizuje na końcu, wyczyść lub wymień szklaną kapilarnę bodźca.</li>
</ol>
4. Elektrody referencyjne i rejestrujące
<ol>
	<li>Użyj prętów wolframowych (o średnicy 127 μm i długości 76,2 mm) zarówno jako elektrody referencyjnej, jak i rejestrującej. Naostrzyć elektrody odniesienia i rejestrującą do średnicy około 1 μm na końcówce (kształty tych elektrod przedstawiono w Delventhal i wsp.36), zanurzając je wielokrotnie przez kilka sekund w roztworze 10% KNO3 (~1 M) lub 10% roztworze KOH (1,8 M). 
	UWAGA: To rozwiązanie wymaga prądu (0,3-3 mA), aby ułatwić ten proces.</li>
</ol>
5. Przygotowanie muchy do podstawowego nagrania
<ol>
	<li>Narysuj pojedynczą muchę z fiolki do aspiratora. Wyjmij aspirator i złap zwierzę w pułapkę, kładąc palec na końcu.</li>
	<li>Wyrzuć muchę do plastikowej końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Trzymając koniec aspiratora w końcówce pipety, użyj końca, aby popchnąć rozporek do przodu, głową do przodu, w kierunku wąskiego końca końcówki pipety.</li>
	<li>Przytnij końcówkę pipety na każdym końcu (tj. z przodu i z tyłu zwierzęcia) za pomocą żyletki.</li>
	<li>Użyj gliny lub małego kawałka bawełny, aby popchnąć muchę dalej do przodu, aż połowa głowy będzie wystawać z końca przyciętej końcówki pipety. Użyj kleszczy, aby delikatnie popchnąć, aż labellum z przodu głowy zostanie odsłonięte.</li>
	<li>Przymocuj przyciętą końcówkę pipety do szklanego szkiełka mikroskopowego za pomocą glinki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym umieść labellum bocznie na szkiełku nakrywkowym, tak aby jeden płat, wraz z jego 31 czułymi zmysłami smakowymi, był odsłonięty (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Szkiełko nakrywkowe utrzymuje etykietę na miejscu.</li>
</ol>
6. Stanowisko do elektrofizjologii
<ol>
	<li>Wybierz pomieszczenie do konfiguracji platformy, które ma stabilną temperaturę i wilgotność względną (<70%) i jest odizolowane od źródeł hałasu elektrycznego i mechanicznego, takich jak lodówki i wirówki.</li>
	<li>Umieść mikroskop na środku stołu antywibracyjnego.</li>
	<li>Przymocuj ręczny mikromanipulator do stołu antywibracyjnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Przymocuj wałek ze stali nierdzewnej, który utrzymuje wolframową elektrodę referencyjną do ręcznego mikromanipulatora (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Podłącz zmotoryzowane manipulatory - jeden z uchwytem na sondę elektrody rejestrującej, a drugi z uchwytem połączonym z trzonkiem ze stali nierdzewnej do szklanej kapilary stymulacyjnej - do tego samego stołu za pomocą podstawek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Podłącz sondę elektrody rejestrującej do systemu inteligentnego kontrolera akwizycji danych (IDAC) lub innego systemu wzmacniacza/digitizera.</li>
	<li>Połącz ten system IDAC z komputerem na stacji roboczej.</li>
	<li>Uziemić manipulatory ręczne i zmotoryzowane w tym samym miejscu na platformie.</li>
	<li>Zainstaluj na komputerze odpowiednie oprogramowanie do akwizycji dla systemu IDAC. Upewnij się, że sterowniki akwizycji cyfrowej są zgodne z systemem operacyjnym (np. Windows XP-7, -8 lub -10) na komputerze.</li>
</ol>
7. Nagrywanie z Taste Sensilla
<ol>
	<li>Umieść szkiełko przygotowawcze na stoliku mikroskopu z obiektywem o małym powiększeniu (np. 10x) w odpowiedniej pozycji. Przesuwaj stolik, aż etykieta będzie ostra w środku pola widzenia zarówno przy małym, jak i dużym powiększeniu (np. 50x).</li>
	<li>Włóż elektrodę referencyjną do oka za pomocą obiektywu o małym powiększeniu. Aby włożyć elektrodę odniesienia, skieruj oko po stronie muchy po przeciwnej stronie do strony z elektrodą rejestrującą, na przykładample, jeśli elektroda rejestrująca zbliża się z prawej strony, umieść elektrodę odniesienia w lewym oku. Wykorzystaj ręczny mikromanipulator do precyzyjnego wprowadzania.</li>
	<li>Ustaw ostrość końcówki szklanej kapilary stymulacyjnej w środku pola widzenia zarówno obiektywów o małym, jak i dużym powiększeniu za pomocą zmotoryzowanego mikromanipulatora (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>W małym powiększeniu zbliż elektrodę rejestrującą do labellum za pomocą drugiego mikromanipulatora z napędem.</li>
	<li>Pod dużym powiększeniem włóż elektrodę rejestrującą do podstawy czujnika smaku za pomocą zmotoryzowanego mikromanipulatora, aż usłyszysz dźwięk aktywności odpalania neuronów z wyjścia audio systemu IDAC.</li>
	<li>Po ustaleniu stabilnego sygnału rozpocznij nagrywanie sygnału za pomocą oprogramowania dołączonego do systemu IDAC (Rysunek 4A-D). Aby rozpocząć nagrywanie, naciśnij przycisk Rozpocznij nagrywanie.</li>
	<li>Przyłóż końcówkę szklanej kapilary bodźcowej do zakrycia końcówki czujnika smaku za pomocą zmotoryzowanego manipulatora.</li>
	<li>Aby zakończyć bodziec, usuń szklaną kapilarę bodźca z sensillum za pomocą zmotoryzowanego manipulatora.</li>
	<li>Zaznacz początek i koniec stymulacji ręcznie za pomocą pedału. Pedał jest podłączony do IDAC, a jego komunikacja z oprogramowaniem jest ułatwiona przez IDAC w celu oznaczenia początku/końca bodźca.</li>
</ol>
8. Analiza
<ol>
	<li>Korzystaj z różnych funkcji oprogramowania dołączonego do systemu IDAC, aby sortować populacje szczytów według amplitudy (jeśli to możliwe) i analizować dynamikę odpowiedzi.
	<ol>
		<li>Aby policzyć skoki, kliknij lewym przyciskiem myszy interesujące Cię nagranie, wyświetlając okno do wyboru. Wybierz opcję Do skoków, inicjując kolejne okno o nazwie Konwertuj fale na kolce. Wprowadź nazwę w polu Nowy i naciśnij przycisk OK.</li>
		<li>Wprowadzenie nazwy w polu Nowy w kroku 8.1.1 prowadzi do wyświetlenia widoku Histogram amplitudy. Wybierz amplitudę do zliczenia, a następnie zamknij ten widok. Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby dodać licznik.</li>
		<li>Zbadaj skoki ręcznie, aby potwierdzić wnioski na podstawie analizy za pomocą oprogramowania. 
		UWAGA: Oprogramowanie umożliwia również eksport danych w różnych formatach w celu dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

A Novel Method for Enhanced Analysis of Insect Taste Neuron Activity

<ol><li>Joseph, R. M., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+chemoreceptors%3A+a+molecular+interface+between+the+chemical+world+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain.</a> Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).</li>
<li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+sensory+receptors-a+set+of+molecular+Swiss+Army+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives.</a> Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).</li>
<li>Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+logic+and+evolution+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila.</a> Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).</li>
<li>Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila.</a> Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).</li>
<li>He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+sensilla+of+the+Drosophila+wing+express+a+candidate+ionotropic+pheromone+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor.</a> PLoS Biol. 17 (5), e2006619(2019).</li>
<li>Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+taste+coding+in+the+legs+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila.</a> J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).</li>
<li>Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labellar+taste+organs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Labellar taste organs of Drosophila melanogaster.</a> J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).</li>
<li>Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+antagonistic+gustatory+receptor+neurons+responding+to+sweet-salty+and+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila.</a> J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).</li>
<li>Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+organs+of+Drosophila+melanogaster%3A+fine+structure+and+expression+of+the+putative+odorant-binding+protein+PBPRP2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2.</a> Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).</li>
<li>Siddiqi, O., Rodrigues, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+a+complex+chemoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of a complex chemoreceptor.</a> Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).</li>
<li>Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+taste+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Candidate taste receptors in Drosophila.</a> Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).</li>
<li>Koh, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+IR20a+clade+of+ionotropic+receptors+are+candidate+taste+and+pheromone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors.</a> Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).</li>
<li>Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expression+atlas+of+variant+ionotropic+glutamate+receptors+identifies+a+molecular+basis+of+carbonation+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing.</a> Nat Commun. 9 (1), 4252(2018).</li>
<li>Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+mechanisms+of+taste+coding+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila.</a> Sci Adv. 9 (46), (2023).</li>
<li>Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Gr5a+encodes+a+taste+receptor+tuned+to+trehalose%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 2 14526-14530 (2003).</li>
<li>Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Gr+genes+underlie+sugar+reception+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila.</a> Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).</li>
<li>Delventhal, R., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bitter+taste+receptors+confer+diverse+functions+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons.</a> Elife. 5, e11181(2016).</li>
<li>Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ir56b+is+an+atypical+ionotropic+receptor+that+underlies+appetitive+salt+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila.</a> Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).</li>
<li>Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+response+to+sugars+among+labellar+chemosensilla+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila.</a> Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).</li>
<li>Jeong, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+odorant-binding+protein+required+for+suppression+of+sweet+taste+by+bitter+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals.</a> Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).</li>
<li>Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+gustatory+receptor+required+for+the+responses+to+sucrose%2C+glucose%2C+and+maltose+identified+by+mRNA+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).</li>
<li>Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gr64f+is+required+in+combination+with+other+gustatory+receptors+for+sugar+detection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila.</a> Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).</li>
<li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRPA1+channel+mediates+chemical+avoidance+in+gustatory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).</li>
<li>Lacaille, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+sex+pheromone+tastes+bitter+for+Drosophila+males%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males.</a> PLoS One. 2 (7), e661(2007).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+receptors+required+for+avoiding+the+insecticide+L-canavanine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine.</a> J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).</li>
<li>Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+DEET+through+insect+gustatory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Avoiding DEET through insect gustatory receptors.</a> Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).</li>
<li>Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+gustatory+receptors+required+for+the+caffeine+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).</li>
<li>Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+gustatory+receptor+required+for+strychnine+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation.</a> Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).</li>
<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of bitter taste in Drosophila.</a> J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).</li>
<li>Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taste+receptor+required+for+the+caffeine+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A taste receptor required for the caffeine response in vivo.</a> Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).</li>
<li>Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+gustatory+receptor+essential+for+aversive+taste+and+inhibiting+male-to-male+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship.</a> Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).</li>
<li>Rimal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+acetic+acid+gustatory+repulsion+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila.</a> Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).</li>
<li>Shim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+full+repertoire+of+Drosophila+gustatory+receptors+for+detecting+an+aversive+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound.</a> Nat Commun. 6, 8867(2015).</li>
<li>Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+a+threat+of+the+Anthropocene%3A+Taste+avoidance+of+metal+ions+by+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119(2022).</li>
<li>Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+attractive+salt-taste+coding+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila.</a> Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).</li>
<li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J Vis Exp. (84), e51355(2014).</li>
<li>Marella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior.</a> Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).</li>
<li>Thorne, N., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+expression+of+Drosophila+gustatory+receptor+genes+in+sensory+and+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons.</a> J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+representations+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Taste representations in the Drosophila brain.</a> Cell. 117 (7), 981-991 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W nagraniach z niektórych typów sensilli rozróżnienie kolców różnych neuronów może być trudne. Na przykład neurony cukrowe i neurony mechanosensoryczne sensilli S i I wytwarzają kolce o podobnych amplitudach, co utrudnia ich rozróżnienie 4,14. Odkryliśmy, że użycie bardzo ostrej wolframowej elektrody rejestrującej zmniejsza odpalanie neuronu mechanosensorycznego, podobnie jak rozsądne umieszczenie elektrody rejestrującej. Wprowadzenie elektrody rejestrującej do kołnierza zębodołu sensillum (tj. do podstawy, ale nie głęboko) często powoduje zmniejszenie stymulacji mechanosensorycznej. Ponadto stwierdzamy, że jeśli nagranie ma wysoki poziom wystrzeliwania neuronu mechanosensorycznego, wycofanie elektrody rejestrującej i umieszczenie jej w innej pozycji względem zmysłu często prowadzi do niższego poziomu wypalania.
Kolejną krytyczną kwestią jest zapewnienie stabilności elektrody rejestrującej podczas eksperymentów (patrz rysunek 4E). Zakłócenia mechaniczne lub przesunięcia w położeniu elektrod mogą niekorzystnie wpłynąć na jakość nagrań. Zainwestowanie czasu i wysiłku w dokładne przygotowanie, jak określono w opisanym powyżej protokole, jest kluczem do zapobiegania frustracji, która może wynikać z ruchu labellum.
Zwracamy uwagę na jeszcze jeden problem, który zaobserwowaliśmy w przypadku niektórych związków, które wywołują zarówno odpowiedzi ON, jak i OFF z I sensilla klasyI-a 14. Czasami druga dostawa bodźca wywołuje reakcję OFF, ale nie ON. Przyczyna tego zmniejszenia odpowiedzi ON nie jest znana.
Innym wyzwaniem napotkanym podczas nagrywania podstawowego jest to, że nie wszystkie sensille są łatwo dostępne do nagrywania ze względu na ich położenie na labellum. Spośród 31 sensilli labellar tylko 26 jest wygodnych do nagrywania, co stanowi ograniczenie dla tej techniki, jak pokazano na rysunku 3B. Jednak w zasadzie te sensille (I8, I9, I10, L9 i S10) mogą być dostępne poprzez obracanie mechanicznego stolika XY mikroskopu Olympus.
Na koniec podkreślamy, jak ważne jest inwestowanie wysiłku w przygotowanie much. Dobrze przygotowana mucha ma znacznie większe szanse na uzyskanie wiarygodnych i wysokiej jakości nagrań w trakcie trwania eksperymentu. Dodatkowo sacharoza może być stosowana jako kontrola pozytywna w celu zapewnienia jakości zapisu; Wywołuje to reakcję wszystkich Labellar Sensilla.

Owady, w tym muchy drozofilne, są wyposażone w wyrafinowany system smakowy, który pozwala im wydobywać skomplikowane informacje chemiczne z otoczenia. System ten pozwala im rozpoznać skład chemiczny różnych substancji, rozróżniając te, które są odżywcze, i te, które są szkodliwe1,2.
Rdzeniem tego systemu są wyspecjalizowane struktury znane jako włosy smakowe lub sensilla, strategicznie rozmieszczone na różnych częściach ciała. U muszek drosophilidae sensilla ta znajduje się na labellum, który jest głównym narządem smakowym głowy muchy1,2,3,4, a także na nogach i skrzydłach1,2,5,6. Labellum znajduje się na końcu trąbki i zawiera dwa płaty4,7,8. Każdy płat pokryty jest 31 sensylami smakowymi sklasyfikowanymi jako krótkie, długie i pośrednie4,7,8. Każdy z tych sensilli zawiera 2-4 neurony smaku1,2,9,10. Te neurony smakowe wyrażają członków co najmniej czterech różnych rodzin genów, a mianowicie genów receptora smakowego (Gr), receptora jonotropowego (Ir), kieszonkowca (Ppk) i genów potencjału receptora przejściowego (Trp)1,2,11,12,13. Ta różnorodność receptorów i kanałów wyposaża owady w zdolność rozpoznawania szerokiej gamy związków chemicznych, w tym zarówno nieulotnych, jak i lotnych wskazówek1,2,14.
Przez ponad 50 lat naukowcy określali ilościowo reakcję neuronów smaku i ich receptorów za pomocą techniki zwanej nagrywaniem końcówek3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 
29,30,31,32,33,34,35. Ta metoda ma jednak poważne ograniczenia. Po pierwsze, aktywność neuronalną można mierzyć tylko podczas kontaktu z bodźcem, a nie przed lub po kontakcie. To ograniczenie wyklucza pomiar spontanicznej aktywności impulsowej i uniemożliwia pomiar odpowiedzi OFF. Po drugie, badane mogą być tylko degustaty, które są rozpuszczalne w roztworach wodnych.
Te ograniczenia mogą być pokonane przez rzadko stosowaną alternatywną technikę elektrofizjologiczną zwaną "zapisem podstawowym". Tutaj opisujemy tę technikę, którą zaadaptowaliśmy z metody używanej przez Marion-Poll i współpracowników24, i pokazujemy kluczowe cechy kodowania smaku, które teraz może wygodnie mierzyć14.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>wyposażony w obiektyw 50X (LMPLFLN 50X, Olympus) i okulary 10X.</td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny</td><td>TMC</td><td>63-7590E</td><td></td></tr><tr><td>zmotoryzowane mikromanipulatory</td><td>Aparatura Harvarda i M&auml; RZH&AUML; użytkownik</td><td>Mikromanipulatory Mikromanipulator PM 10 Mikromanipulator</td><td></td>piezoelektryczny</tr><tr><td>ręczny Mikromanipulatory</td><td>M&auml; RZH&AUML; użytkownik Mikromanipulatory</td><td>MM33 Mikromanipulator</td><td></td></tr><tr><td>Stojaki magnetyczne</td><td>ENCO</td><td>Model #625-0930</td><td></td></tr><tr><td>Odniesienie&nbsp; i nagrywanie Uchwyt elektrody</td><td>Ockenfels Syntech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt kapilary szklanej stymulacyjnej</td><td>Ockenfels Syntech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna sonda jednostronna</td><td>Ockenfels Syntech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-KANAŁOWY KONTROLER AKWIZYCJI USB, IDAC-4</td><td>Ockenfels Syntech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontrolery bodźców</td><td>Ockenfels Syntech GmbH</td><td>Kontroler stymulacyjny CS 55</td><td></td></tr><tr><td>Komputer osobisty</td><td>Dell</td><td>Vostro</td><td>Sprawdź kompatybilność z cyfrowym systemem akwizycji i oprogramowaniem</td></tr><tr><td>Pręt wolframowy</td><td>Systemy AM</td><td>Cat#716000</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa i/lub klatka Faradaya</td><td></td><td></td><td>Ekranowanie przed szumami elektromagnetycznymi</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Instrument Sutter Model firmy</td><td>P-97 Flaming/Brown Ściągacz</td><td></td>do mikropipet</tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>VMZ 1x-4x</td><td>Do przygotowania muchy</td></tr><tr><td>p200 Końcówki</td><td></td><td></td> do pipet <td>Ogólny</td></tr><tr><td>Wskazówki dotyczące mikroładowarek&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka</td><td></td><td></td><td>Ogólne</td></tr><tr><td>Zaciski</td><td></td><td></td><td></td>krokodylkowe</tr><tr><td>Transformatory mocy</td><td>STACO PRODUKTY ENERGETYCZNE</td><td>STACO 3PN221B</td><td>Składa się z końcówek do pipet P1000, elastycznej rurki z tworzywa sztucznego i siatki</td></tr><tr><td>Plastelina</td><td></td><td></td> do modelowania <td>Ogólne</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td>Ogólne</td></tr><tr><td>Rurki plastikowe</td><td>Saint Gobain</td><td>Tygon S3&trade; E-3603</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe fiolki hodowlane</td><td>Archon Scientific</td><td></td><td>Wąskie 1-uncjowe polistyrenowe pochwy, każda z 10 ml pożywki glukozowej, wstępnie załadowane zatyczkami z octanu celulozy</td></tr><tr><td>Chlorek berberyny (BER)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # Y0001149</td><td></td></tr><tr><td>Benzoesan denatonium (DEN)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # D5765</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dietylo-m-toluamid (DEET)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # Numer katalogowy: 36542</td><td></td></tr></tbody></table>

zapis podstawowy: technika analizy reakcji neuronów smaku u drosophila

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Owady smakują świat zewnętrzny poprzez włoski smakowe, czyli sensillę, które mają pory na końcach. Kiedy sensillum wchodzi w kontakt z potencjalnym źródłem pożywienia, związki ze źródła pożywienia dostają się przez pory i aktywują neurony w środku. Przez ponad 50 lat odpowiedzi te były rejestrowane przy użyciu techniki zwanej nagrywaniem końcówek. Metoda ta ma jednak poważne ograniczenia, w tym brak możliwości pomiaru aktywności neuronalnej przed lub po kontakcie z bodźcem oraz wymóg, aby degustatory były rozpuszczalne w roztworach wodnych. Opisujemy tutaj technikę, którą nazywamy nagrywaniem podstawowym, która pokonuje te ograniczenia. Zapis podstawowy umożliwia pomiar aktywności neuronów smakowych przed, w trakcie i po bodźcu. W ten sposób pozwala na obszerną analizę reakcji OFF, które występują po bodźcu smakowym. Może być stosowany do badania związków hydrofobowych, takich jak feromony długołańcuchowe, które mają bardzo niską rozpuszczalność w wodzie. Podsumowując, zapis podstawowy oferuje zalety elektrofizjologii jednozmysłowej jako sposobu pomiaru aktywności neuronalnej - wysoka rozdzielczość przestrzenna i czasowa, bez potrzeby stosowania narzędzi genetycznych - i pokonuje kluczowe ograniczenia tradycyjnej techniki zapisu końcówek.

Rysunek 4A przedstawia spontaniczne impulsy (spike'i) pochodzące z sensilla. Dzielą się one na dwie klasy ze względu na amplitudę, przy czym większe impulsy pochodzą z neuronu wrażliwego na związki gorzkie, a mniejsze z neuronu reagującego na cukry. Zależność między amplitudą impulsu a specyficznością funkcjonalną została potwierdzona w badaniach genetycznych4,14,37,38,39.
Rysunek 4B przedstawia odpowiedź neuronu wrażliwego na gorycz w sensillum S5 na zapach DEET; odpowiedź ta wystąpiła bez żadnego kontaktu roztworu DEET z sensillum. Jeden impuls wydaje się mieć średnią amplitudę i może być wynikiem nałożenia się dwóch mniejszych impulsów, jeden z neuronu cukrowego, a drugi z neuronu mechanoreceptorowego.
Rysunek 4C przedstawia odpowiedź typu ON, która występuje po kontakcie bodźca gorzkiego z sensillum I1, a następnie odpowiedź typu OFF, pojawiającą się po przerwaniu kontaktu. Należy zauważyć, że amplituda odpowiedzi OFF, mierzona w spikes/s, jest większa niż amplituda odpowiedzi ON.
Rysunek 4D przedstawia odpowiedź typu ON i OFF na gorzki związek – berberynę, zarejestrowaną z sensilla I1 innego gatunku muszki, Drosophila virilis. Jedną z zalet tej techniki jest możliwość jej zastosowania u innych gatunków, w tym u komarów, bez konieczności wprowadzania do nich transgenów.
Rysunek 4E ilustruje dwa problemy, które mogą wystąpić podczas rejestracji. Po pierwsze, jeśli labellum nie jest odpowiednio zabezpieczone, może ono przesuwać się, co powoduje powstawanie impulsów (spike'ów) z neuronu mechanosensorycznego sensillum. Po drugie, elektroda rejestrująca może zostać wysunięta z sensillum, często w wyniku ruchu labellum. W takim przypadku następuje utrata kontaktu i elektrodę należy ponownie wprowadzić, aby zarejestrować impulsy.
<img alt="Układ unieruchamiania muchy z wykorzystaniem gliny i szkiełka nakrywkowego, przedstawiony na schemacie eksperymentu mikroskopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66665/66665fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przygotowanie muchy do rejestracji podstawowej. Przycięta końcówka pipety zawierająca samicę muchy z labellum bezpiecznie umieszczoną na szkiełku nakrywkowym. (A) Zarówno końcówka pipety, jak i szkiełko nakrywkowe są stabilnie zamocowane na kopcach gliny. (B) Powiększenie labellum spoczywającego na szkiełku nakrywkowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66665/66665fig01largev2.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ mikromanipulatorów do pozycjonowania elektrod w elektrofizjologii, przedstawiony na opisanym schemacie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66665/66665fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Konfiguracja stanowiska elektrofizjologicznego. (A) Przegląd przedstawiający położenie manualnego mikromanipulatora dla elektrody referencyjnej, zmotoryzowanego mikromanipulatora dla szklanej kapilary stymulującej oraz zmotoryzowanego mikromanipulatora dla elektrody rejestrującej. (B) Przegląd przedstawiający uchwyty dla elektrody referencyjnej, szklanej kapilary stymulującej i elektrody rejestrującej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66665/66665fig02largev2.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ elektrofizjologiczny do rejestracji z sensilli owadziej z użyciem szklanej kapilary stymulującej i elektrody." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66665/66665fig03v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Labellum i sensilla. (A) Labellum pod mikroskopem odwróconym. Powiększenie labellum przedstawiające sensilla smakowe jednego płata labellum. Widoczna jest również szklana kapilara stymulująca znajdująca się blisko jednej z dużych sensilli znanych jako L2 (typ 2 dużego rozmiaru) oraz elektroda rejestrująca w podstawie tej sensilli. (B) Dostępność sensilli labellarne. Labellum z zaznaczonymi sensillami, które są łatwo dostępne do rejestracji z podstawy, oraz sensillami mniej dostępnymi ze względu na ich położenie w stosowanej zazwyczaj preparacji. Skróty: A = przednia; M = przyśrodkowa; P = tylna; L = boczna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66665/66665fig03largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zapisy elektrofizjologiczne impulsów; potencjały czynnościowe; rejestracje neuronów sensilli; schemat; odpowiedź na bodziec." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66665/66665fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przykładowe zapisy impulsów spontanicznych, odpowiedzi neuronów gorzkich oraz suboptimalnego zapisu. (A) Przykładowy zapis impulsów spontanicznych. Impulsy pochodzą z neuronu wrażliwego na smak gorzki (czerwone kropki) oraz neuronu wrażliwego na cukier (zielone kropki) w sensilli I1. Na rysunku sensilli neurony wrażliwe na smak gorzki, cukier i mechanosensoryczne są odpowiednio zaznaczone kolorami czerwonym, zielonym i czarnym. (B) Przykładowy zapis odpowiedzi neuronu gorzkiego (czerwone kropki) w sensilli S5 na opary 1 mM DEET. Należy zauważyć, że impulsy o małej amplitudzie pochodzą z neuronu cukrowego i neuronów mechanosensorycznych, które w tym zapisie są trudne do rozróżnienia ze względu na amplitudę. Skrót: DEET = N,N-dietylometatoluamid. (C) Przykładowy zapis odpowiedzi ON i OFF neuronu gorzkiego w sensilli I1 na 1 mM benzozan denatonium. Impulsy obserwuje się przed (wyładowania spontaniczne), w trakcie (odpowiedź ON) i po (odpowiedź OFF) kontaktu z bodźcem. Skrót: DEN = benzozan denatonium. (D) Przykładowy zapis odpowiedzi ON i OFF neuronu gorzkiego w sensilli I1 D. virilis na 0,5 mM chlorku berberyny. Impulsy obserwuje się przed, w trakcie i po kontakcie. Skrót: BER = chlorek berberyny. (E) Przykładowy zapis suboptimalny. Kontakt został utracony w połowie eksperymentu z powodu ruchu labellum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66665/66665fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Rzadko stosowana metoda zapisu elektrofizjologicznego, zapis podstawowy, pozwala na analizę cech kodowania smaku, które nie mogą być zbadane konwencjonalnymi metodami zapisu. Zapis bazowy pozwala również na analizę reakcji smakowych na bodźce hydrofobowe, których nie można zbadać tradycyjnymi metodami elektrofizjologicznymi.

Zapis podstawowy: technika analizy reakcji neuronów smaku u Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

Nasze laboratorium bada, w jaki sposób zwierzęta wykrywają i reagują na zapachy, smak i niektóre feromony. Poczyniliśmy znaczące postępy w zrozumieniu molekularnych podstaw chemorecepcji. Poczyniliśmy kilka postępów w tej dziedzinie, w tym odkryliśmy pierwsze receptory zapachowe owadów, odkryliśmy pierwsze receptory smakowe owadów.Oraz wyjaśnienie podstawowych zasad logiki kodowania zapachów i smaków. Technika ta pozwala na pomiar aktywności neuronów testowych przed, w trakcie i po bodźcu. W ten sposób pozwala na obszerną analizę reakcji, które pojawiają się po bodźcu testowym.Pozwala również na pomiar badania aktywności neuronów do rzeki związków lotnych. Klasyczna technika elektrofizjologii testowej nie była w stanie zmierzyć reakcji testu na związki hydrofobowe, takie jak feromony długołańcuchowe, które mają bardzo luźną ruchliwość w wodzie. Jednak za pomocą tej techniki możemy przezwyciężyć to ograniczenie, oddzielając elektrodę rejestrującą od szklanej kapilary stymulacyjnej.Nasze badania dotyczą funkcjonowania systemów chemosensorycznych u zwierząt, koncentrując się na ich roli w wyborach żywieniowych i godowych. Obecnie badamy niepowlekające RNA i mikropeptydy oraz systemy węchowe muszek owocowych, a także sposób, w jaki komary i muchy tse-tse wykorzystują te systemy do znajdowania ludzkich gospodarzy. Zacznij od umieszczenia od 10 do 15 nowo powstałych much Drosophila w świeżych standardowych fiolkach z kulturami.Utrzymuj te fiolki w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 60% w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności. Aby przygotować szklaną kapilarnę do utrzymywania bodźca, wybierz kapilarnę ze szkła krzemianowego bora. I użyj ściągacza do pipet, aby pociągnąć szklaną kapilarę.Następnie weź pręty wolframowe zarówno jako elektrody referencyjne, jak i rejestrujące. Zanurz te elektrody kilkakrotnie na kilka sekund w 10% roztworze azotanu potasu lub roztworze wodorotlenku potasu, aby naostrzyć je do średnicy końcówki jednego mikrometra. Aby narysować pojedynczą muchę z fiolki do aspiratora, ostrożnie wyjmij aspirator i umieść palec na końcu aspiratora, aby złapać muchę.Teraz trzymaj koniec aspiratora w końcówce pipety o pojemności 200 mikrolitrów i użyj końca, aby popchnąć muchę do przodu głową w kierunku wąskiego końca końcówki pipety. Za pomocą żyletki przytnij oba końce końcówki pipety z przodu i z tyłu rozmuchu. Za pomocą gliny lub małego kawałka bawełny dalej popchnij muchę do przodu, aż połowa jej głowy wystaje z końca przyciętej końcówki pipety.Za pomocą kleszczy delikatnie odsłonić labellum z przodu głowy. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść labellum bocznie na szkiełku nakrywkowym, upewniając się, że jeden płat z 31 czułościami smakowymi jest odsłonięty. Na początek umieść szkiełko zawierające drosophila labellum na stoliku mikroskopowym pod małym powiększeniem.Za pomocą ręcznego mikromanipulatora włóż elektrodę odniesienia do oka przeciwległego do oka z elektrodą rejestrującą. Teraz użyj zmotoryzowanego mikromanipulatora, aby ustawić ostrość końcówki szklanej kapilary stymulacyjnej na końcu pola widzenia zarówno przy obiektywach o małym, jak i dużym powiększeniu. Następnie użyj drugiego zmotoryzowanego mikromanipulatora pod małym powiększeniem i zbliż elektrodę rejestrującą do labellum.W dużym powiększeniu włóż elektrodę rejestrującą do podstawy czujnika smaku. Kontynuuj wprowadzanie, aż z wyjścia audio systemu IDAC usłyszysz dźwięk aktywności odpalania neuronów. Po wykryciu stabilnego sygnału naciśnij przycisk rozpoczęcia nagrywania, aby rozpocząć nagrywanie sygnału za pomocą oprogramowania powiązanego z systemem IDAC.Za pomocą zmotoryzowanego manipulatora wyreguluj końcówkę szklanej kapilary stymulacyjnej tak, aby zakrywała końcówkę czujnika smaku. Aby zakończyć bodziec, wycofaj szklaną kapilarę bodźca z czujnika za pomocą zmotoryzowanego manipulatora. Kolce Sensillum są podzielone na dwie klasy w zależności od amplitudy.Większe kolce są przypisywane neuronowi wrażliwemu na gorycz, podczas gdy mniejsze kolce pochodzą z neuronu reagującego na cukier. Gorzki, wrażliwy neuron w czubku S-5 zareagował na zapach DEET, wskazując na aktywację sensoryczną bez kontaktu fizycznego. A po reakcji obserwowano w czubku I-1 podczas kontaktu z gorzkim bodźcem, po którym następowała silniejsza reakcja wyłączenia po zakończeniu kontaktu.

base-recording-technique-for-analyzing-responses-taste-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Reakcje elektrofizjologiczne neuronów sensorycznych węchu na odoranty u owadów można mierzyć za pomocą rejestracji z pojedynczych sensyli. W tym artykule wideo zademonstrujemy, jak przeprowadzić rejestrację z pojedynczych sensyli w czułkach muszki owocowej (Drosophila melanogaster) oraz w palpach szczękowych komara malarycznego (Anopheles gambiae).

Rejestracja z pojedynczych sensyli u owadów Drosophila melanogaster oraz Anopheles gambiae

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

W tym filmie żywa mucha Drosophila jest zamontowana w tubie do badań elektrofizjologicznych. Elektrody są umieszczone u podstawy czułki, aby rejestrować specyficzne odpowiedzi neuronalne na feromony za pomocą neuronów receptorów węchowych muchy.

Zapisy elektrofizjologiczne z Drosophila sensilla w odpowiedzi na lotne substancje zapachowe

Ten protokół opisuje zewnątrzkomórkowy zapis odpowiedzi potencjału czynnościowego wyzwalanych przez neurony smaku etykietowego u Drosophila.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila labellar Taste Sensilla

Przednie nogi i trąbka Drosophila zawierają bogaty repertuar smakowych neuronów czuciowych. W tym artykule przedstawiono metodę wykorzystującą obrazowanie wapnia do pomiaru fizjologicznych odpowiedzi neuronów czuciowych w przedniej nodze i trąbce żywych much po egzogennym zastosowaniu feromonu smakowego.

Pomiar fizjologicznych reakcji neuronów czuciowych Drosophila na feromony lipidowe za pomocą obrazowania wapnia na żywo

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak prezentować substancje zapachowe o niskiej lotności do rejestracji pojedynczej sensyllum z neuronów receptora węchowego Drosophila, które reagują na długołańcuchowe feromony kutykularne.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Podejście do obrazowania wapnia umożliwia rejestrowanie reakcji wywołanych smakiem w mózgach obudzonych muszek, podczas gdy roztwór jest nakładany na labellum. Jako przykład podano pierwotne reakcje smakowe u Drosophila melanogaster, ale protokół ten można dostosować do badania neuronów w dół rzeki lub innych gatunków.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia reakcji neuronalnych wywołanych smakiem u dorosłych Drosophila

Rejestracja elektroolfaktogramu (EOG) jest informacyjną, łatwą do przeprowadzenia i niezawodną metodą oceny funkcji węchowych na poziomie nabłonka węchowego. Niniejszy protokół opisuje konfigurację układu rejestracyjnego, przygotowanie tkanek mysich, gromadzenie danych oraz podstawową analizę danych.

Analiza odpowiedzi neuronów sensorycznych węchu myszy z wykorzystaniem zapisu elektroolfaktogramu w fazie gazowej

Opracowaliśmy dwie metody badania wpływu bodźców wzrokowych na zachowanie w warunkach braku bodźców dotykowych i chemicznych. Pierwsza metoda polega na filmowaniu reakcji raków na odbijające światło ścianki akwarium; druga bada wpływ bodźców wzrokowych dostarczanych przez żywego raka znajdującego się za przezroczystą przegrodą.

Rejestracja reakcji behawioralnych na odbicie u raków

Poznaj technikę zapisu podstawowego do analizy reakcji neuronów smaku u Drosophila melanogaster. Ta metoda elektrofizjologiczna umożliwia badanie odpowiedzi na bodźce hydrofobowe, rozszerzając możliwości tradycyjnych metod.

Zapis podstawowy: technika analizy reakcji neuronów smaku u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów