Name: Sekwencyjne pobieranie krwi z żyły głównej dolnej, a następnie żyły wrotnej w celu oceny metabolitów drobnoustrojów jelitowych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 9 s
Description: Poznaj metodę sekwencyjnego pobierania krwi z żyły wrotnej i dolnej żyły głównej u myszy w celu oceny metabolitów drobnoustrojów jelitowych, szczególnie kwasów tłuszczowych o krótkim łańcuchu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AP jest finansowany z nagrody R01 od NIH/NHLBI (1R01HL146753). DM jest finansowany przez stypendium T32 z NIH oraz przez Trainee/Staff Pilot Awards z UCSF Benioff Center for Microbiome Medicine.

Wszystkie kroki w tej procedurze nieprzetrwania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Użyto płci i szczepu myszy płci męskiej C57BL/6J (o wadze 25-35 g i w wieku 12-15 tygodni). Można również stosować żeńskie i/lub inne standardowe szczepy myszy.
1. Znieczulenie
<ol>
	<li>Wytrzyj dolną połowę brzucha myszy wacikami z 70% etanolu. Podać znieczulenie, podając dootrzewnowe wstrzyknięcie tribromoetanolu (250-400 mg / kg). Można również zastosować znieczulenie ketaminą/ksylazyną lub izofluranem. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki.</li>
	<li>Wstrzyknąć buprenorfinę (0,05-0,1 mg/kg) dootrzewnowo w celu znieczulenia. 
	UWAGA: Buprenorfina jest wymagana ze względu na ból związany z zabiegiem laparotomii. </li>
</ol>
2. Laparotomia
<ol>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na powierzchni operacyjnej (z poduszką grzewczą pod spodem) w pozycji leżącej. Przymocuj wszystkie kończyny myszy na tablicy operacyjnej za pomocą taśmy. Upewnij się, że odpowiednia głębokość znieczulenia została osiągnięta przez uszczypnięcie palca u nogi bez odruchu wycofania pedału.</li>
	<li>Podnieś skórę i wykonaj podłużne nacięcie nożyczkami preparacyjnymi wzdłuż linii środkowej od pępka do wyrostka mieczykowatego i doogonowo w kierunku podstawy brzucha (zewnętrznego narządu płciowego).</li>
	<li>Wykonaj podobne nacięcie w otrzewnej nożyczkami preparacyjnymi bez perforacji lub uszkodzenia jelit, przepony lub wątroby.</li>
	<li>Rozszerz pole operacyjne, wykonując nacięcie poprzeczne na całej długości (wydłużające szerokość brzucha) nożyczkami po obu stronach pępka.</li>
	<li>Przesuń jelito grube i cienkie na prawą stronę chirurga za pomocą czystej gazy nasączonej ciepłym PBS, aby odsłonić IVC poniżej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie ligatury do PV
<ol>
	<li>Delikatnie manipuluj segmentami jelita w polu operacyjnym za pomocą bawełnianego wacika, aby zlokalizować PV u nasady krezki.</li>
	<li>Używając mikroskopu preparacyjnego do wizualizacji naczyń i innych struktur jamy brzusznej, ostrożnie przełóż szew prolenowy 7-0 za PV w pobliżu wnęki wątroby (między żyłą dwunastnicy a żyłą śledzionową)19, aby był gotowy do podwiązania w kroku 5 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Korzystanie z mikroskopu od tego etapu nie jest obowiązkowe, ale znacznie poprawia ogólny wskaźnik powodzenia zabiegu.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek krwi z IVC
<ol>
	<li>Włóż igłę 28G 1/2 cala hemarynizowanej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml do IVC. Zbierz 0,2-0,3 ml próbki krwi. 
	UWAGA: Jeśli na tym etapie zostanie usunięta zbyt duża ilość krwi, spowoduje to zmniejszenie objętości krwi PV pobranej w kroku 5.</li>
	<li>Pozostawić igłę wewnątrz IVC, aby uniknąć krwawienia, które wystąpiłoby po usunięciu.</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek krwi z PV
<ol>
	<li>Delikatnie zawiąż ligaturę prolenu 7-0 wokół PV; PV powinno rozszerzać się i rozszerzać podczas zasypywania. Włóż igłę 28G 1/2 cala innej heparynizowanej strzykawki insulinowej o pojemności 1 cm3 do PV.</li>
	<li>Odsysaj powoli, aby zebrać do 0,3-0,5 ml krwi z PV. PV może się zapadnąć, ale powinno stopniowo ponownie się rozszerzać wraz z uzupełnianiem krwi z układu żylnego krezki.</li>
</ol>
6. Przechowywanie próbek
<ol>
	<li>Usuń igły z IVC i PV po pobraniu krwi.</li>
	<li>Przenieść próbki krwi ze strzykawek do 1,5 ml heparynizowanych probówek eppendorfa i umieścić je na lodzie w celu późniejszego przetworzenia na osocze w celu przechowywania i analizy w razie potrzeby.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą przedawkowania środka znieczulającego, a następnie zwichnięcia szyjki macicy (zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez UCSF IACUC).</li>
</ol>

Improved Blood Sampling Technique to Assess Gut Microbial Metabolites in Mice

<ol><li>vander Hee, B., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+regulation+of+host+physiology+by+short-chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial regulation of host physiology by short-chain fatty acids.</a> Trends Microbiol. 29 (8), 700-712 (2021).</li>
<li>Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+dietary+fiber+to+host+physiology%3A+Short-chain+fatty+acids+as+key+bacterial+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites.</a> Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).</li>
<li>Vinolo, M. A. R., Rodrigues, H. G., Nachbar, R. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+inflammation+by+short+chain+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Regulation of inflammation by short chain fatty acids.</a> Nutrients. 3 (10), 858-876 (2011).</li>
<li>Layden, B. T., Angueira, A. R., Brodsky, M., Durai, V., Lowe, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+chain+fatty+acids+and+their+receptors%3A+new+metabolic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Short chain fatty acids and their receptors: new metabolic targets.</a> Transl Res. 161 (3), 131-140 (2013).</li>
<li>den Besten, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+short-chain+fatty+acids+in+the+interplay+between+diet%2C+gut+microbiota%2C+and+host+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism.</a> J Lipid Res. 54 (9), 2325-2340 (2013).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+gut+microbiome-derived+propionate+levels+are+associated+with+reduced+sterile+lung+inflammation+and+bacterial+immunity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice.</a> Front Microbiol. 10, 159(2019).</li>
<li>Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+immune+tone+via+gut-lung+axis%3A+Gut-derived+LPS+and+short-chain+fatty+acids%E2%80%99+immunometabolic+regulation+of+lung+IL-1%CE%B2%2C+FFAR2%2C+and+FFAR3+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids’ immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L65-L78 (2021).</li>
<li>De Vadder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota-generated+metabolites+promote+metabolic+benefits+via+gut-brain+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits.</a> Cell. 156 (1-2), 84-96 (2014).</li>
<li>Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+short-chain+fatty+acids+in+microbiota%E2%80%93gut%E2%80%93brain+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The role of short-chain fatty acids in microbiota–gut–brain communication.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 461-478 (2019).</li>
<li>Sun, M., Wu, W., Liu, Z., Cong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+metabolite+short+chain+fatty+acids%2C+GPCR%2C+and+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Microbiota metabolite short chain fatty acids, GPCR, and inflammatory bowel diseases.</a> J Gastroenterol. 52 (1), 1-8 (2017).</li>
<li>Cummings, J. H., Pomare, E. W., Branch, H. W. J., Naylor, C. P. E., MacFarlane, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+chain+fatty+acids+in+human+large+intestine%2C+portal%2C+hepatic+and+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood.</a> Gut. 28 (10), 1221-1227 (1987).</li>
<li>Macfarlane, G. T., Gibson, G. R., Cummings, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fermentation+reactions+in+different+regions+of+the+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of fermentation reactions in different regions of the human colon.</a> J Appl Bacteriol. 72 (1), 57-64 (1992).</li>
<li>Neis, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+versus+proximal+intestinal+short-chain+fatty+acid+release+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Distal versus proximal intestinal short-chain fatty acid release in man.</a> Gut. 68 (4), 764-765 (2019).</li>
<li>Yamashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetate+on+lipid+metabolism+in+muscles+and+adipose+tissues+of+type+2+diabetic+Otsuka+Long-Evans+Tokushima+Fatty+%28OLETF%29+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effects of acetate on lipid metabolism in muscles and adipose tissues of type 2 diabetic Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) Rats.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 73 (3), 570-576 (2009).</li>
<li>Ríos-Covián, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+short+chain+fatty+acids+and+their+ink+with+diet+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intestinal short chain fatty acids and their ink with diet and human health.</a> Front Microbiol. 7, 185(2016).</li>
<li>Jaworska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+method+for+evaluating+the+gut-blood+barrier+and+liver+metabolism+of+microbiota+products%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An in vivo method for evaluating the gut-blood barrier and liver metabolism of microbiota products.</a> J Vis Exp. (140), e58456(2018).</li>
<li>Ashcroft, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+assess+arteriovenous+differences+across+the+liver+and+hindlimb+muscles+in+mice+following+treadmill+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise.</a> STAR Protoc. 4 (1), 101985(2023).</li>
<li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).</li>
<li>Cheever, A. W., Warren, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+vein+ligation+in+mice%3A+Portal+hypertension%2C+collateral+circulation%2C+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Portal vein ligation in mice: Portal hypertension, collateral circulation, and blood flow.</a> J Appl Physiol. 18, 405-407 (1963).</li>
<li>Bloemen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+chain+fatty+acids+exchange+across+the+gut+and+liver+in+humans+measured+at+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery.</a> Clin Nutr. 28 (6), 657-661 (2009).</li>
<li>Hoyles, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome%E2%80%93host+systems+interactions%3A+Protective+effects+of+propionate+upon+the+blood%E2%80%93brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Microbiome–host systems interactions: Protective effects of propionate upon the blood–brain barrier.</a> Microbiome. 6 (1), 55(2018).</li>
<li>Shimizu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propionate-producing+bacteria+in+the+intestine+may+associate+with+skewed+responses+of+IL10-producing+regulatory+T+cells+in+patients+with+relapsing+polychondritis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Propionate-producing bacteria in the intestine may associate with skewed responses of IL10-producing regulatory T cells in patients with relapsing polychondritis.</a> PLoS One. 13 (9), e0203657(2018).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propionate+protects+against+lipopolysaccharide-induced+mastitis+in+mice+by+restoring+blood%E2%80%93milk+barrier+disruption+and+suppressing+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Propionate protects against lipopolysaccharide-induced mastitis in mice by restoring blood–milk barrier disruption and suppressing inflammatory response.</a> Front Immunol. 8, 1108(2017).</li>
<li>Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+fatty+acids+regulate+systemic+bone+mass+and+protect+from+pathological+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss.</a> Nat Commun. 9 (1), 55(2018).</li>
<li>Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+systemic+and+hepatic+hemodynamic+parameters+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice.</a> J Vis Exp. (92), e51955(2014).</li>
<li>Sänger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+vascular+anatomy+in+rats+and+mice+-+Variations+and+surgical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic vascular anatomy in rats and mice - Variations and surgical implications.</a> PLoS One. 10 (11), e0141798(2015).</li>
<li>Phillips, B. J., Mirzaie, M., Turco, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+Vein+Injuries%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Emerg+Trauma%22%5BJournal%5D)">Portal Vein Injuries: A Review.</a> J Emerg Trauma. 2 (2), 4(2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W artykule opisano innowacyjną metodę in vivo polegającą na niemal równoczesnym sekwencyjnym pobieraniu próbek krwi z IVC i PV u tej samej myszy doświadczalnej. Metoda ta jest przydatna do pomiaru poziomów produktów wytwarzanych przez mikrobiotę jelitową, takich jak SCFA, które przechodzą przez krążenie wrotne. Średnia maksymalna objętość krwi, którą można pobrać podczas procedury terminalnej u myszy (o masie 25-30 g) wynosi około 1 ml / mysz, co z kolei stanowi 50% całkowitej objętości krwi krążącej18. Jednak uzyskanie wystarczającej ilości krwi do pożądanych pomiarów eksperymentalnych z dwóch oddziałujących i sąsiadujących ze sobą układów żylnych może być trudne. Ciśnienie wewnątrznaczyniowe PV u myszy jest tylko o 3-5 mmHg wyższe niż w IVC25, więc spadek ciśnienia w PV może prowadzić do spadku ciśnienia w IVC i odwrotnie. Ponadto układ żyły wrotnej u myszy, który składa się z wielu gałęzi naczyń z krezki i śledziony26, jest stosunkowo mały i delikatny. Z tych powodów użycie mikroskopu preparacyjnego do dokładnej identyfikacji PV i powiązanych z nim gałęzi oraz zapobieganie zapadaniu się PV i IVC ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tej procedury.
Nowatorstwo tego protokołu polega na podwiązaniu PV przed pobraniem krwi. Zablokowanie drenażu PV do wątroby zwiększa ciśnienie w PV, a tym samym rozszerza ją27, co z kolei ułatwia pobieranie krwi, a także zwiększa ilość krwi dostępnej do pobrania w układzie żyły wrotnej. Jednak podwiązanie PV zmniejsza ilość powrotu żylnego, a następnie powoduje szybkie zapadanie się IVC, co bardzo utrudnia wprowadzenie igły do IVC i ogranicza ilość krwi, którą można zebrać. Dlatego nasz protokół zaleca najpierw odsysanie krwi z IVC, a następnie podwiązanie i zamknięcie dystalnej PV. Należy zachować ostrożność, aby nie pobrać zbyt dużej ilości krwi z IVC, ponieważ może to prowadzić do znacznego i nieodwracalnego zapaści PV nawet po podwiązaniu PV. Ponadto podwiązanie PV pomaga również uniknąć mieszania krwi PV z krwią z żył wątrobowych. Warto zauważyć, że objętość próbek krwi pobranych w protokole jest wystarczająca do dalszych badań, takich jak analizy metabolomiczne, testy cytokin i pomiary nieszczelności jelit: 0,2-0,3 ml dla IVC i 0,3-0,5 ml dla PV.
Przedstawiona tutaj metoda pobierania krwi PV/IVC ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, krew pobrana z IVC może nie reprezentować idealnie krwi krążącej ogólnoustrojowo. Może przecenić wkład dolnej części (połowy ogonowej) ciała, a także niedoszacować wkład górnej (głowodowej) części ciała. Po drugie, podwiązanie PV może powodować przekrwienie żył w jelitach i innych narządach jamy brzusznej. Dlatego krew powinna być pobierana natychmiast po podwiązaniu PV, aby uniknąć gromadzenia się niepożądanych produktów ubocznych wynikających z niedrożności odpływu z układu krezkowego i przypadkowych uszkodzeń bariery jelitowej. Po trzecie, nie jest możliwe seryjne pobieranie próbek krwi w różnych punktach czasowych w celu monitorowania biologicznych zmian czasowych, ponieważ jest to procedura niepowodująca przeżycia/terminalna. W przeciwieństwie do nakłucia serca, dobrze znanej i niezawodnej metody pozyskiwania krążącej krwi ogólnoustrojowej, ta metoda zachowuje nienaruszoną przeponę z ciągłym spontanicznym oddychaniem. Z naszego doświadczenia wynika, że utrzymanie przepony w stanie nienaruszonym ma kluczowe znaczenie dla tej metody sekwencyjnego pobierania krwi żylnej z PV i IVC.

Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) to główna klasa metabolitów wytwarzanych przez mikrobiotę jelitową. Ich kluczowa rola w interakcji między mikrobiomem jelitowym a innymi odległymi narządami1 została poparta badaniami opisującymi, w jaki sposób modulują stan zapalny, sygnalizują przez dedykowane receptory i służą jako substraty w metabolizmie komórkowym2,3,4,5. Ostatnie prace naszej grupy sugerują, że SCFA są kluczowymi in vivo regulatorami stanu zapalnego tonu immunologicznego płuc in vivo poprzez oś jelito-płuca6,7. Dodatkowe raporty opisywały ich funkcjonalny wpływ na metabolizm za pośrednictwem osi jelitowo-mózgowej8,9. Ogólnie rzecz biorąc, wpływ SCFA na fizjologię i patologię gospodarza jest aktywnie i intensywnie badany przez liczne grupy badawcze zajmujące się szerokim zakresem procesów chorobowych.
Octan (C2), propionian (C3) i maślan (C4) są głównymi SCFA i są generowane przez mikrobiotę jelitową poprzez fermentację błonnika pokarmowego w jelicie ślepym i jelicie grubym. Wszystkie trzy SCFA mogą być również otrzymywane bezpośrednio z diety, a tylko octan może być również wytwarzany przez komórki ssaków. SCFA są wchłaniane w okrężnicy i są częściowo wykorzystywane przez komórki nabłonka jelitowego (jako źródło energii, do miejscowej modulacji immunologicznej tkanek i do wspierania utrzymania bariery jelitowej). Są one również transportowane do żyły wrotnej przez układ żylny krezki10. Maślan jest spożywany głównie przez nabłonek jelitowy, propionian przez wątrobę11,12, a octan działa na tkanki mięśniowe i tłuszczowe po wejściu do krążenia obwodowego13,14.
Kompleksowa ocena produkcji, absorpcji i aktywności funkcjonalnej SCFA wymaga wiedzy na temat poziomów SCFA w świetle okrężnicy, w krążeniu wrotnym i krwi obwodowej. Można to osiągnąć poprzez pobranie krwi z żyły wrotnej (PV) i krążenie ogólnoustrojowe jednocześnie lub sekwencyjnie u tego samego zwierzęcia. Ponieważ SCFA są niestabilne15, pomiar ich poziomu w wydalonych granulkach kału może nie odzwierciedlać dokładnie poziomów w okrężnicy. Ponadto, w porównaniu z pomiarami zawartości okrężnicy, poziom SCFA obecnych w PV może dokładniej odzwierciedlać sumę netto poziomów w stanie stacjonarnym wchłoniętych przez gospodarza w porównaniu z nierównymi poziomami wytwarzanymi przez mikrobiom jelitowy na całej długości okrężnicy11. Te poziomy PV SCFA mogą być zatem bardziej istotne i odpowiednie do badania wpływu SCFA na fizjologię i patologię gospodarza poza lokalnymi skutkami w jelicie.
Aby przeprowadzić skoordynowane i prawie równoczesne pobieranie PV i krwi krążącej ogólnoustrojowo, przepona powinna pozostać nienaruszona, aby utrzymać prawidłowe krążenie krwi i wspierać spontaniczne oddychanie. Dlatego żyła główna dolna (IVC) stanowi idealne miejsce do uzyskania krwi z krążenia ogólnoustrojowego podczas pobierania krwi PV. Ta krew IVC może być również wykorzystywana do innych celów, takich jak pomiar krążących cytokin w celu oceny ogólnoustrojowego stanu zapalnego.
Obecnie, tylko kilka metod pobierania krwi zarówno z krążenia ogólnoustrojowego, jak i PV zostało zgłoszonych u większych gryzoni16,17. Konwencjonalne metody, które wymagają kaniulacji naczyń krwionośnych u szczurów, są technicznie trudne do wykonania u myszy. Ponadto maksymalna ilość krwi pobrana tymi metodami wynosi zwykle nie więcej niż 0,3 ml18.
W tym artykule prezentujemy nowatorską metodę, która upraszcza proces podwójnego pobierania krwi od mysiego IVC, a następnie PV u tego samego zwierzęcia. Unikalną cechą metody jest podwiązanie PV w pobliżu wnęki wątroby tuż przed pobraniem próbki krwi PV. Takie podejście może rozszerzyć wymiary PV, co znacznie poprawia wskaźnik sukcesu, a także zwiększa maksymalną objętość krwi do zebrania do 0,5 ml.

<table><tbody><tr><td>2,2,2 Tribromoetanol, 97% (Avertin)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>T48402-25G</td><td>Środek znieczulający&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorowodorek buprenorfiny do wstrzykiwań 0,3 mg/ml</td><td>PAR Pharmaceutical&nbsp;</td><td>NDC 42023-179-05</td><td>Środek przeciwbólowy</td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe</td><td>Miltex&nbsp;</td><td>6-100</td><td>Rozwarstwienie&nbsp;</td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe</td><td>Roboz</td><td>RS-5136</td><td>Sekcja zwłok&nbsp;</td></tr><tr><td>Hepatyna sodowa 1000 jednostek USP / ml</td><td>Hikma</td><td>NDC 0641-0391-12</td><td>Strzykawki / probówki do próbek krwi heparynizacja</td></tr><tr><td>Prolene 7-0</td><td>Ethicon</td><td>8696G</td><td>Podwiązanie żyły wrotnej</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>FST</td><td>14058-11</td><td>Rozwarstwienie&nbsp;</td></tr><tr><td>Student Halsted-Mosquito Hemostats</td><td>F.S.T&nbsp;</td><td>91308-12</td><td>Rozwarstwienie&nbsp;</td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna&nbsp;</td><td>3M Transpore</td><td>1527-1</td><td>Unieruchomienie kończyn myszy</td></tr><tr><td>U-100 Strzykawka insulinowa 28G1/2</td><td>EXEL</td><td>26027</td><td>Pobieranie próbek krwi&nbsp;</td></tr></tbody></table>

sekwencyjne pobieranie krwi z żyły głównej dolnej, a następnie żyły wrotnej w celu oceny metabolitów drobnoustrojów jelitowych u myszy

Sequential Blood Collection from Inferior Vena Cava Followed by Portal Vein to Evaluate Gut Microbial Metabolites in Mice

Produkty mikrobiologiczne jelit są znane z tego, że działają zarówno lokalnie w jelicie, jak i są wchłaniane do krążenia, gdzie ich działanie może rozciągać się na wiele odległych układów narządów. Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) to jedna z klas metabolitów wytwarzanych przez drobnoustroje jelitowe podczas fermentacji niestrawnego błonnika pokarmowego. Obecnie uznaje się, że są one ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do tego, jak mikrobiom jelitowy wpływa na układy narządów pozajelitowych poprzez oś jelito-płuca, jelita-mózg i inne osie jelita-narządy w całym organizmie gospodarza. SCFA są wchłaniane z jelita grubego, przez tkankę jelitową, do żyły wrotnej (PV). Następnie przechodzą przez wątrobę i są zużywane w różnych narządach, takich jak mózg, mięśnie, tkanka tłuszczowa i płuca. SCFA najłatwiej jest zmierzyć w wydalanym materiale kałowym, jednak dokładniejsze pomiary uzyskano z zawartości kału wewnątrz okrężnicy. W tym miejscu proponujemy, że pobieranie próbek PV i krążącego ogólnoustrojowo osocza jednego pacjenta może być preferowane do badania absorpcji, transportu i ogólnoustrojowych poziomów SCFA u myszy. Przedstawiamy nową technikę efektywnego pobierania krwi z PV i żyły głównej dolnej (IVC), która pozwala na pobranie stosunkowo dużych ilości krwi z krążenia wrotnego i ogólnoustrojowego. Osiąga się to poprzez podwiązanie PV, co pozwala na rozszerzenie lub powiększenie PV, gdy zasypuje się z żył krezkowych, które do niego spływają. Stosując tę metodę, udało nam się poprawić wskaźnik udanego pobrania, a także całkowitą ilość pobranej krwi (do 0,3 ml z IVC i 0,5 ml z PV).

Stosując opisaną powyżej metodę, możemy sekwencyjnie pobierać próbki krwi z IVC oraz PV od tej samej myszy ze skutecznością przekraczającą 95%. Średnie objętości pobranych próbek krwi wynoszą 0.25 mL dla IVC i 0.35 mL dla PV.
Wykorzystując chromatografię gazową sprzężoną z spektrometrią mas (GC-MS), zmierzyliśmy stężenie SCFA w kałach, krwi z żyły wrotnej (PV) oraz krwi z żyły głównej dolnej (IVC), co pozwoliło nam prześledzić wchłanianie i transport octanu (C2), propionianu (C3) i maślanu (C4) z odcinka okrężniczego, w którym są one produkowane przez fermentujące bakterie jelitowe, do krążenia systemowego.
W szczególności w niniejszych eksperymentach badaliśmy wpływ spożycia błonnika pokarmowego na produkcję SCFAs u myszy. Myszy otrzymywały dietę wysokobłonnikową (35% błonnika) przez 1 tydzień lub 2 tygodnie, a następnie porównano je z grupami karmionymi dietą bezbłonnikową. Oczekiwaliśmy i zaobserwowaliśmy wzrost liczebności taksonów bakterii fermentujących błonnik w grupach z dietą wysokobłonnikową (dane nie zostały przedstawione). Następnie zbadaliśmy zawartość jelita grubego, krew z żyły wrotnej (PV) oraz krew z krążenia systemowego (IVC) pod kątem poziomu SCFAs (ilościowo określonego metodą GC-MS w Metabolomics Core Facility na University of Michigan)3 (Rysunek 2). Chociaż w próbkach PV udało nam się wykryć spójny wzrost poziomu SCFAs po podaniu błonnika w diecie, pomiary SCFAs w próbkach treści kałowej z jelita grubego były znacznie bardziej zmienne między poszczególnymi myszami w porównaniu do pomiarów we krwi PV i IVC (treść kałowa z jelita grubego w zestawieniu z krwią PV/IVC dla octanu, propionianu i maślanu na Rysunku 2). Zmienność ta może wynikać z niehomogenicznego rozkładu SCFAs w masie kałowej lub może odzwierciedlać zmienne wchłanianie SCFAs przez nabłonek jelitowy. Niemniej jednak, w celu zbadania wpływu SCFAs na pozajelitową fizjologię gospodarza, poziomy w PV i w krążeniu obwodowym są prawdopodobnie bardziej istotne do analizy.
Porównując poziomy SCFA w żyle wrotnej (PV) z poziomami w krwi systemowej w żyle głównej dolnej (IVC), byliśmy również w stanie zaobserwować stopień absorpcji octanu i propionianu przez wątrobę (Rycina 2A,B). Udział octanu pozostającego we krwi systemowej (w porównaniu z PV) po przejściu przez wątrobę jest wyższy niż w przypadku propionianu (do krążenia obwodowego przedostało się ponad 50% octanu z PV, w porównaniu z mniej niż 30% w przypadku propionianu). Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, według których propionian jest absorbowany lub wykorzystywany przez wątrobę, przez co niższe jego poziomy przedostają się do krążenia systemowego, podczas gdy octan może być absorbowany lub wykorzystywany w innych tkankach obwodowych, takich jak tkanka mięśniowa13,20 (Rycina 2A,B). Niemniej jednak, wcześniejsze prace kilku grup badawczych wykazały, że poziomy propionianu wchłanianego do krążenia systemowego są w stanie znacząco wpływać na fizjologię i patologię w odległych organach21,22,23,24.
Ponadto stwierdzono, że stężenia maślanu zarówno w żyle wrotnej, jak i we krwi systemowej były znacznie niższe niż stężenia propionianu, mimo że stężenia maślanu i propionianu w kale były do siebie zbliżone. Wyniki te potwierdziły wcześniejsze doniesienia, zgodnie z którymi maślan wytwarzany w jelitach w obrębie okrężnicy jest w dużej mierze wchłaniany i wykorzystywany lokalnie przez nabłonek jelitowy.11 (Rycina 2C).
Zazwyczaj podczas sekcji jamy brzusznej obserwuje się, że wymiary żyły wrotnej (PV) są mniejsze niż żyły głównej dolnej (IVC) (Rycina 3A). Jednak po zawiązaniu szwu wokół PV (około 4 mm poniżej wnęki wątroby) i podwiązaniu naczynia, PV zwiększa swój rozmiar i osiąga średnicę niemal równą pierwotnej średnicy IVC przed podwiązaniem PV (Rycina 3B). Jak widać na rysunku, po podwiązaniu PV następuje lekkie zapadnięcie się IVC (Rycina 3B). Ogólnie podejście to ułatwia maksymalne pobranie krwi z PV u myszy. W naszym doświadczeniu pobieranie najpierw krwi z PV, a następnie z IVC dawało mniej optymalne wyniki. Wynikało to z zaobserwowanego przez nas znacznego zapadnięcia się IVC po pobraniu krwi z PV.
<img alt="Schemat podwiązania żyły wątrobowej przedstawiający anatomię wrotna i drogi przepływu krwi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66673/66673fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Podwiązanie PV. Szew zostaje przeprowadzony za PV pomiędzy żyłą dwunastniczą a żyłą śledzionową. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66673/66673fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres pudełkowy porównujący poziomy C2, C3, C4 w kale, krwi wrotnej i osoczu; analiza wpływu diety bogatobłonnikowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66673/66673fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Stężenie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) w kale, krwi z żyły wrotnej (PV) i krwi żylnej systemowej. Poziomy SCFA zmierzono dla trzech różnych eksperymentalnych grup myszy, w tym grupy z dietą bezbłonnikową przez 2 tygodnie (n=10 myszy), dietą wysokobłonnikową przez 1 tydzień (n=9 myszy) oraz dietą wysokobłonnikową przez 2 tygodnie (n=7 myszy). (A) Octan (C2), (B) Propionian (C3) i (C) Maślan (C4). Poziomy SCFA w kale podano w nM/mg (lewa oś Y) materiału kałowego, a w osoczu z żyły wrotnej (PV) i żyły głównej dolnej (IVC) w µM (prawa oś Y). Dane na wykresach przedstawiono jako średnia ± SD. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu dwustronnych nieparametrycznych testów Mann-Whitneya. Wartości p < 0,05 uznano za istotne. Wartości p reprezentowane są następująco: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66673/66673fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Podwiązanie żyły wrotnej wątroby u myszy; schemat z etykietami przedstawiający procedurę chirurgiczną i anatomię." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66673/66673fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Żyła wrotna (PV) myszy rozszerza się i powiększa po zawiązaniu ligatury 4 mm poniżej wnęki wątroby. (A) PV i żyła główna dolna (IVC) przed podwiązaniem PV; (B) PV i IVC po podwiązaniu PV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66673/66673fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Protokół demonstruje metodę sekwencyjnego pobierania krwi z żył wrotnych i żyły głównej dolnej od myszy w celu oceny produkcji i absorpcji metabolitów mikrobiologicznych jelit.

Sekwencyjne pobieranie krwi z żyły głównej dolnej, a następnie żyły wrotnej w celu oceny metabolitów drobnoustrojów jelitowych u myszy

Gut microbial products are known to act both locally within the intestine and get absorbed into circulation, where their effects can extend to numerous ...

Zakres naszych badań laboratoryjnych ma na celu zrozumienie komunikacji między mikrobiomem jelitowym a tkankami płuc oraz tego, w jaki sposób składniki mikrobiomu jelitowego mogą bezpośrednio wpływać na reakcje immunologiczne i zapalne płuc. Skupiamy się na działaniu konkretnych metabolitów, a mianowicie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Uważa się, że krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, takie jak octan, propionian i maślan, odgrywają rolę w wpływaniu na różne procesy chorobowe u myszy eksperymentalnych.Należą do nich metabolizm lipidów w cukrzycy typu 2, zapalenie chonstrząstek, patologiczny ubytek kości, astma alergiczna i przepuszczalność bariery krew-mózg. Pomiar stężeń krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych jest najwygodniejszy w granulkach kałowych wydalanych z myszy. Jednak te poziomy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w kale nie odpowiadają niezawodnie temu, co jest obecne in vivo, w okrężnicy, a co ważniejsze, co jest przekazywane do krążenia gospodarza.Uważamy, że poziomy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i innych metabolitów mierzone we krwi wrotnej będą dokładniej odzwierciedlać stężenia w stanie stacjonarnym in vivo w porównaniu z tymi mierzonymi z próbek kału. Podwiązanie żyły wrotnej w pobliżu wnęki wątroby może rozszerzyć wymiary żyły wrotnej, a tym samym znacznie poprawić wskaźnik sukcesu, a także zwiększyć maksymalną objętość krwi, którą można zebrać. Po znieczuleniu myszy ułóż ją w pozycji leżącej na rozgrzanej powierzchni operacyjnej.Nałóż maść do oczu i wykonaj szczypanie opuszki palców, aby upewnić się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone. Podnieś skórę brzucha. Za pomocą nożyczek wykonaj podłużne nacięcie na linii środkowej od pępka do wyrostka mieczykowatego i doogonowo w kierunku podstawy brzucha.Wykonaj podobne nacięcie w otrzewnej bez perforacji lub uszkodzenia jelit, przepony lub wątroby. Następnie wykonaj nacięcie poprzeczne na całej długości po obu stronach pępka, aby rozszerzyć pole operacyjne. Następnie użyj czystej gazy nasączonej ciepłym PBS, aby przesunąć jelito grube i cienkie w prawo i odsłonić IVC poniżej.Za pomocą bawełnianego wacika delikatnie manipuluj segmentami jelita w polu operacyjnym, aby zlokalizować żyłę wrotną u nasady krezki. Następnie użyj mikroskopu preparacyjnego, aby ostrożnie przejść przez szew prolinowy 7-0 za żyłą wrotną w pobliżu wnęki wątroby. Następnie włóż półcalową igłę o rozmiarze 28 rozmiarów heparynizowanej strzykawki insulinowej o średnicy jednego centymetra sześciennego do IVC.Zbierz od 0,2 do 0,3 mililitra próbki krwi. Pozostawić igłę wewnątrz IVC, aby uniknąć krwawienia, które wystąpiłoby po usunięciu. Teraz delikatnie zawiąż ligaturę proliny 7-0 wokół żyły wrotnej.Włóż półcalową igłę o rozmiarze 28 z innej strzykawki insulinowej z heparyną do żyły wrotnej. Aspirować, aby powoli zebrać do 0,5 mililitra krwi z żyły wrotnej. Po zakończeniu pobierania krwi usuń igły z IVC i żyły wrotnej.Przenieś próbki krwi ze strzykawek do 1,5 mililitrowych probówek heparynizowanych. Umieść probówki na lodzie do przyszłego przetwarzania.

sequential-blood-collection-from-inferior-vena-cava-followed-portal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje, jak nabyć hemodynamikę układu i wątroby u myszy. Całe monitorowanie obejmuje rejestrację parametrów życiowych, ogólnoustrojowego ciśnienia krwi, centralnego ciśnienia żylnego, szybkości przepływu w tętnicy wątrobowej wspólnej i ciśnienia w żyle wrotnej, a także szybkości przepływu wrotnego u myszy.

Monitorowanie parametrów hemodynamicznych układu układowego i wątroby u myszy

Dostęp składników odżywczych, metabolitów mikrobioty i leków do krążenia jest kontrolowany przez barierę jelitowo-krwionośną (GBB). Opisujemy bezpośrednią metodę pomiaru przepuszczalności GBB in vivo, na którą, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metod pośrednich, praktycznie nie ma wpływu na funkcje wątroby i nerek.

Metoda in vivo do oceny bariery jelitowo-krwionośnej i metabolizmu wątrobowego produktów mikrobioty

To badanie informuje o próbkach krwi z żyły ogonowej u myszy przy użyciu systemu probówek do ekstrakcji próżniowej z lupą okularową. Nasza metoda jest łatwa do przećwiczenia i może być stosowana do powtórnego pobierania próbek krwi u myszy.

Zmodyfikowane pobieranie krwi z żył ogonowych myszy nieznieczulonych za pomocą próżniowego systemu pobierania krwi i lupy okularowej

Tutaj prezentujemy protokół pobierania próbek krwi z żyły podobojczykowej myszy.

Pobieranie krwi przez nakłucie żyły podobojczykowej u myszy

Opisujemy nowatorską metodę generowania podwójnie humanizowanych myszy BLT, które posiadają funkcjonalny ludzki układ odpornościowy i stabilny, wszczepiony ludzki mikrobiom jelitowy. Protokół ten może być stosowany bez konieczności stosowania myszy wolnych od zarazków lub urządzeń gnotobiotycznych.

Podwójnie humanizowany model myszy BLT ze stabilnym mikrobiomem jelitowym podobnym do ludzkiego i ludzkim układem odpornościowym

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Protokół opisuje prostą metodę resekcji nienaruszonej wątroby myszy do badań metabolicznych poprzez perfuzję żyły wrotnej.

Ex vivo Perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy

Celem jest tutaj nakreślenie protokołu do badania mechanizmów dysbiozy w chorobach sercowo-naczyniowych. W artykule omówiono, jak aseptycznie pobierać i przeszczepiać próbki kału myszy, izolować jelita i stosować metodę "Swiss-roll", a następnie techniki barwienia immunologicznego w celu zbadania zmian w przewodzie pokarmowym.

Izolacja kału myszy i przeszczep mikrobioty

W tym protokole przedstawiono metody istotne dla metabolomiki tętniczo-żylnej zoptymalizowanej pod kątem BAT przy użyciu GC-MS w modelu mysim. Metody te pozwalają na uzyskanie cennych informacji na temat wymiany metabolitów na poziomie organizmu, w której pośredniczy BAT.

Metabolomika tętniczo-żylna do pomiaru wymiany metabolitów in vivo w brunatnej tkance tłuszczowej

Przedstawiamy protokół optymalizowanej techniki pobierania krwi u myszych osób poprzez nakłucie żył twarzy za pomocą lanceta. Stosujemy tę technikę wraz z oceną cytometryczną przepływową do charakteryzowania fenotypów komórkowych szczepów transgenicznych, kongenicznych i raportowych. Nadaje się także do analizy cytokiny w surowicy oraz badań nad cukrzycą.

Nakłucie żył twarzy do pobierania krwi myszy

Nakłucie serca podobojczykowego to prosta i niezawodna metoda pobierania krwi terminalnej u myszy. Jest łatwy w obsłudze i zapewnia próbki o wysokiej czystości.

Pobieranie krwi sercowej przez nakłucie podobojczykowe u myszy

Poznaj metodę sekwencyjnego pobierania krwi z żyły wrotnej i dolnej żyły głównej u myszy w celu oceny metabolitów drobnoustrojów jelitowych, szczególnie kwasów tłuszczowych o krótkim łańcuchu.

Sekwencyjne pobieranie krwi z żyły głównej dolnej, a następnie żyły wrotnej w celu oceny metabolitów drobnoustrojów jelitowych u myszy (Wideo) | JoVE Journal

Sekwencyjne pobieranie krwi z żyły głównej dolnej, a następnie żyły wrotnej w celu oceny metabolitów drobnoustrojów jelitowych u myszy

Przeglądaj więcej filmów