Sekwencyjne pobieranie krwi z żyły głównej dolnej, a następnie żyły wrotnej w celu oceny metabolitów drobnoustrojów jelitowych u myszy
21 czerwca 2024
Protokół demonstruje metodę sekwencyjnego pobierania krwi z żył wrotnych i żyły głównej dolnej od myszy w celu oceny produkcji i absorpcji metabolitów mikrobiologicznych jelit.
Zakres naszych badań laboratoryjnych ma na celu zrozumienie komunikacji między mikrobiomem jelitowym a tkankami płuc oraz tego, w jaki sposób składniki mikrobiomu jelitowego mogą bezpośrednio wpływać na reakcje immunologiczne i zapalne płuc. Skupiamy się na działaniu konkretnych metabolitów, a mianowicie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Uważa się, że krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, takie jak octan, propionian i maślan, odgrywają rolę w wpływaniu na różne procesy chorobowe u myszy eksperymentalnych.
Należą do nich metabolizm lipidów w cukrzycy typu 2, zapalenie chonstrząstek, patologiczny ubytek kości, astma alergiczna i przepuszczalność bariery krew-mózg. Pomiar stężeń krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych jest najwygodniejszy w granulkach kałowych wydalanych z myszy. Jednak te poziomy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w kale nie odpowiadają niezawodnie temu, co jest obecne in vivo, w okrężnicy, a co ważniejsze, co jest przekazywane do krążenia gospodarza.
Uważamy, że poziomy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i innych metabolitów mierzone we krwi wrotnej będą dokładniej odzwierciedlać stężenia w stanie stacjonarnym in vivo w porównaniu z tymi mierzonymi z próbek kału. Podwiązanie żyły wrotnej w pobliżu wnęki wątroby może rozszerzyć wymiary żyły wrotnej, a tym samym znacznie poprawić wskaźnik sukcesu, a także zwiększyć maksymalną objętość krwi, którą można zebrać. Po znieczuleniu myszy ułóż ją w pozycji leżącej na rozgrzanej powierzchni operacyjnej.
Nałóż maść do oczu i wykonaj szczypanie opuszki palców, aby upewnić się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone. Podnieś skórę brzucha. Za pomocą nożyczek wykonaj podłużne nacięcie na linii środkowej od pępka do wyrostka mieczykowatego i doogonowo w kierunku podstawy brzucha.
Wykonaj podobne nacięcie w otrzewnej bez perforacji lub uszkodzenia jelit, przepony lub wątroby. Następnie wykonaj nacięcie poprzeczne na całej długości po obu stronach pępka, aby rozszerzyć pole operacyjne. Następnie użyj czystej gazy nasączonej ciepłym PBS, aby przesunąć jelito grube i cienkie w prawo i odsłonić IVC poniżej.
Za pomocą bawełnianego wacika delikatnie manipuluj segmentami jelita w polu operacyjnym, aby zlokalizować żyłę wrotną u nasady krezki. Następnie użyj mikroskopu preparacyjnego, aby ostrożnie przejść przez szew prolinowy 7-0 za żyłą wrotną w pobliżu wnęki wątroby. Następnie włóż półcalową igłę o rozmiarze 28 rozmiarów heparynizowanej strzykawki insulinowej o średnicy jednego centymetra sześciennego do IVC.
Zbierz od 0,2 do 0,3 mililitra próbki krwi. Pozostawić igłę wewnątrz IVC, aby uniknąć krwawienia, które wystąpiłoby po usunięciu. Teraz delikatnie zawiąż ligaturę proliny 7-0 wokół żyły wrotnej.
Włóż półcalową igłę o rozmiarze 28 z innej strzykawki insulinowej z heparyną do żyły wrotnej. Aspirować, aby powoli zebrać do 0,5 mililitra krwi z żyły wrotnej. Po zakończeniu pobierania krwi usuń igły z IVC i żyły wrotnej.
Przenieś próbki krwi ze strzykawek do 1,5 mililitrowych probówek heparynizowanych. Umieść probówki na lodzie do przyszłego przetwarzania.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę sekwencyjnego pobierania krwi z żył wrotnych oraz z żyły głównej dolnej u myszy. Celem jest ocena produkcji i wchłaniania metabolitów mikrobiomu jelitowego, ze szczególnym uwzględnieniem krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Mikrobiologia
- Immunologia
Wprowadzenie
- Mikrobiom jelitowy komunikuje się z tkankami płuc.
- Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe wpływają na odpowiedzi immunologiczne i zapalne.
- Metabolity te są powiązane z różnymi procesami chorobowymi u myszy.
- Poziomy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w kałach nie odzwierciedlają dokładnie stężeń in vivo.
Cel badania
- Zrozumienie roli metabolitów mikrobioty jelitowej w zdrowiu płuc.
- Ocena produkcji i wchłaniania tych metabolitów in vivo.
- Zbadanie wpływu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych na procesy chorobowe.
Zastosowane Metody
- Sekwencyjne pobieranie krwi z żył wrotnych i żyły głównej dolnej.
- Pomiar stężeń krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych.
- Analiza oddziaływań mikrobiomu jelitowego z tkankami płuc.
- Ocena efektów metabolicznych u myszy doświadczalnych.
Główne wyniki
- Identyfikacja konkretnych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w krążeniu.
- Wykazanie zależności między metabolitami jelitowymi a odpowiedziami płucnymi.
- Wgląd w szlaki metaboliczne pod wpływem mikrobiomu jelitowego.
- Potencjalne implikacje dla zrozumienia mechanizmów chorobowych.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodny sposób oceny metabolitów mikroflory jelitowej.
- Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe odgrywają istotną rolę w odpowiedziach odpornościowych płuc.
- Konieczne są dalsze badania w celu zbadania ich wpływu na różne jednostki chorobowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładne ilościowe oznaczenie metabolitów mikrobioty jelitowej w krążeniu systemowym i wrotnym jest kluczowe dla zrozumienia ich mechanistycznego wpływu na odległe układy narządowe oraz szlaki chorobowe. Ta metoda sekwencyjnego pobierania krwi umożliwia bezpośredni pomiar krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) w kluczowych punktach zwrotnych krążenia, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych i badaniach translacyjnych. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji w zakresie rozwoju portfela projektów poprzez wyjaśnienie biologicznego znaczenia metabolitów pochodzenia jelitowego w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę mechanistyczną osi jelito-wątroba-organ poprzez ilościowe określenie transportu i wchłaniania SCFA.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez rozróżnienie lokalnych od systemowych efektów metabolitów.
- Zwiększa wiarygodność prognostyczną w walidacji celów dla interwencji modulujących mikrobiom.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych próbek osocza do późniejszych analiz ilościowych metabolitów.
- Zwiększa powtarzalność analiz poprzez standaryzację pobierania krwi zarówno z krążenia wrotnego, jak i systemowego.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na profile metabolitów mikrobiomu jelitowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie pomiaru metabolitów do systemowej ekspozycji istotnej dla choroby w modelach przedklinicznych.
- Wspiera ciągłość translacyjną poprzez powiązanie aktywności mikrobiomu jelitowego z odpowiedziami organów pozajelitowych.
- Stanowi podstawę do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju terapeutyków celowanych w mikrobiom, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoków i przepływu pracy
Ten protokół sekwencyjnego pobierania krwi integruje się z continuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając bezpośredni pomiar metabolitów pochodzących z jelit w celu weryfikacji hipotez i ograniczania ryzyka mechanistycznego.
- Biologia odkrywcza: dostarcza danych ilościowych na temat wchłaniania SCFA i ich dystrybucji systemowej w celu wyjaśnienia szlaków metabolicznych.
- Przesiew: standaryzuje pobieranie próbek w celu zapewnienia powtarzalności analiz metabolitów w różnych badaniach.
- Analityka: umożliwia zestawienie odczytów z wrotnej i systemowej krwi w celu porównania gradientów metabolitów i wydajności transportu.
- Badania translacyjne: wiąże aktywność mikrobioty jelitowej z dopasowaniem biomarkerów systemowych w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: ustanawia powtarzalny schemat postępowania w celu oceny interwencji w obrębie osi jelito-organ w różnych programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad mikrobiomem.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność pobierania krwi do analizy metabolitów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go i redukuje późne ryzyko biologiczne w przypadku aktywów celowanych w mikrobiom.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowaną do ryzyka priorytetyzację i rozwój programów celujących w metabolity pochodzenia jelitowego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach mikrochirurgicznych oraz w znieczulaniu gryzoni.
- Niezbędny jest dostęp do strzykawek heparynowanych, mikroskopów stereoskopowych oraz infrastruktury analitycznej do oznaczania ilości metabolitów.
- Wymagana jest standaryzacja czasu pobierania krwi oraz protokołów postępowania z próbkami pomiędzy zespołami.
- Możliwa jest konieczność adaptacji metody dla różnych szczepów myszy lub modeli chorobowych.
- W celu uzyskania spójnych wyników należy zarządzać ograniczeniami dotyczącymi objętości krwi oraz zmiennością techniczną.
