Name: Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Poznaj szybką detekcję patogenów bakteryjnych dróg oddechowych za pomocą mikroprzepływowych chipów z izotermiczną amplifikacją LAMP. Ta metoda oferuje wysoką czułość i swoistość w diagnostyce klinicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bardzo doceniamy wsparcie finansowe udzielone przez Fundację Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych Guangdong (Grant nr 2022A1515220023) oraz Fundację Badawczą na rzecz Zaawansowanych Talentów Prowincjonalnego Szpitala Ludowego w Guandong (Grant No. KY012023293).

Human Respiratory Bacterial Infection Diagnosis Using Isothermal Amplification

<ol><li>GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+the+global%2C+regional%2C+and+national+morbidity%2C+mortality%2C+and+aetiologies+of+lower+respiratory+infections+in+195+countries%2C+1990-2016%3A+A+systematic+analysis+for+the+global+burden+of+disease+study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016.</a> Lancet Infect Dis. 18 (11), 1191-1210 (2018).</li>
<li>Niederman, M. S., Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+Rev%22%5BJournal%5D)">Respiratory infections.</a> Eur Respir Rev. 31 (166), 220150(2022).</li>
<li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae%3A+Transmission%2C+colonization+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae: Transmission, colonization and invasion.</a> Nat Rev Microbiol. 16 (6), 355-367 (2018).</li>
<li>Watt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Haemophilus+influenzae+type+b+in+children+younger+than+5+years_+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Haemophilus influenzae type b in children younger than 5 years_ global estimates.</a> Lancet. 374 (9693), 903-911 (2009).</li>
<li>Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+streptococcus+pneumoniae+virulence+factors+in+host+respiratory+colonization+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (4), 288-301 (2008).</li>
<li>Popova, G., Boskovska, K., Arnaudova-Danevska, I., Smilevska-Spasova, O., Jakovska, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+quality+assessment+regarding+sputum+culture+for+diagnosing+lower+respiratory+tract+infections+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Access+Maced+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Sputum quality assessment regarding sputum culture for diagnosing lower respiratory tract infections in children.</a> Open Access Maced J Med Sci. 7 (12), 1926-1930 (2019).</li>
<li>Nuyttens, H., Cyncynatus, C., Renaudin, H., Pereyre, S., Identification Bébéar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((expression+and+serological+evaluation+of+the+recombinant+ATP+synthase+beta+subunit+of+mycoplasma+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">expression and serological evaluation of the recombinant ATP synthase beta subunit of mycoplasma pneumoniae.</a> BMC Microbiol. 10 (1), 216(2010).</li>
<li>Noviello, S., Huang, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+and+the+advancements+in+diagnosis+of+bacterial+lower+respiratory+tract+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections.</a> Diagnostics (Basel). 9 (2), 37(2019).</li>
<li>Hanson, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+testing+for+acute+respiratory+tract+infections%3A+Clinical+and+diagnostic+recommendations+from+the+IDSA%27s+diagnostics+committee%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular testing for acute respiratory tract infections: Clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee.</a> Clin Infect Dis. 71 (10), 2744-2751 (2020).</li>
<li>Daniel Reynolds, J. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threat+of+multidrug-resistant%2Fextensively+drug-resistant+gram-negative+respiratory+infections%3A+Another+pandemic%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+Rev%22%5BJournal%5D)">The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: Another pandemic.</a> Eur Respir Rev. 31 (166), 220068(2022).</li>
<li>T Notomi, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), 63(2000).</li>
<li>Soroka, M., Wasowicz, B., Rymaszewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+The+better+sibling+of+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): The better sibling of PCR.</a> Cells. 10 (8), 1931(2021).</li>
<li>Mori, Y., Kitao, M., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+turbidimetry+of+lamp+reaction+for+quantifying+template+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Real-time turbidimetry of lamp reaction for quantifying template DNA.</a> Biophys J. 59 (2), 145-157 (2004).</li>
<li>Parida, M., Sannarangaiah, S., Dash, P. K., Rao, P. V., Morita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop+mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+new+generation+of+innovative+gene+amplification+technique%3A+Perspectives+in+clinical+diagnosis+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Loop mediated isothermal amplification (LAMP): A new generation of innovative gene amplification technique: Perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases.</a> Rev Med Virol. 18 (6), 407-421 (2008).</li>
<li>Chinese Medical Association Respiratory Branch Critical Care Medicine Group, Working Committee on Critical Care Medicine of the Chinese Physicians Association Respiratory Physicians Branch. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+collection%2C+submission%2C+testing%2C+and+interpretation+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+ICU+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Tubere+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Standardization of collection, submission, testing, and interpretation of bronchoalveolar lavage fluid in ICU patients.</a> Chin J Tubere Respir Dis. 43 (9), 744-756 (2020).</li>
<li>Koch, A. M., Nilsen, R. M., Eriksen, H. M., Cox, R. J., Harthug, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+related+to+hospital-associated+infections+in+a+tertiary+hospital%3A+Repeated+cross-sectional+studies+between+2004-2011%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Resist+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Mortality related to hospital-associated infections in a tertiary hospital: Repeated cross-sectional studies between 2004-2011.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 4 (1), 57(2015).</li>
<li>Seymour, C. W. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+treatment+and+mortality+during+mandated+emergency+care+for+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis.</a> N Engl J Med. 376 (23), 2235-2244 (2017).</li>
<li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+candidatus+Liberibacter+asiaticus%3A+A+causal+agent+of+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of candidatus Liberibacter asiaticus: A causal agent of citrus huanglongbing.</a> Plant Pathol. 34 (6), 499-505 (2018).</li>
<li>Büscher, P., Njiru, Z. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+technology%3A+Towards+point+of+care+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification technology: Towards point of care diagnostics.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1572(2012).</li>
<li>Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+Principle%2C+features%2C+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Principle, features, and future prospects.</a> J Microbiol. 53 (1), 1-5 (2015).</li>
<li>Ajibola, O., Gulumbe, B., Eze, A., Obishakin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+detection+of+schistosomiasis+in+resource+limited+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tools for detection of schistosomiasis in resource limited settings.</a> Medical Sciences. 6 (2), 39(2018).</li>
<li>Kumar, Y. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+rapid+and+sensitive+tool+for+quality+assessment+of+meat+products%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Rev+Food+Sci+Food+SAF%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products.</a> Compr Rev Food Sci Food SAF. 16 (6), 1359-1378 (2017).</li>
<li>Hongling Ou, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+multiple+pathogens+by+the+combined+loop-mediated+isothermal+amplification+technology+and+microfluidic+chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Palliat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology.</a> Ann Palliat Med. 10 (10), 11053-11066 (2021).</li>
<li>Liang Wang, J. -X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+polymerase+chain+reaction+%28qPCR%29-based+rapid+diagnosis+of+helicobacter+pylori+infection+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based rapid diagnosis of helicobacter pylori infection and antibiotic resistance.</a> J Vis Exp. (197), e65689(2023).</li>
<li>Jing-Wen Lyu, B. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prediction+of+multidrug-resistant+klebsiella+pneumoniae+through+deep+learning+analysis+of+SERS+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Rapid prediction of multidrug-resistant klebsiella pneumoniae through deep learning analysis of SERS spectra.</a> Microbiol Spectr. 11 (2), e0412622(2023).</li>
<li>Wei Liu, J. -W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+between+carbapenem-resistant+and+carbapenem-sensitive+klebsiella+pneumoniae+strains+through+computational+analysis+of+surface-enhanced+Raman+spectra+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Discrimination between carbapenem-resistant and carbapenem-sensitive klebsiella pneumoniae strains through computational analysis of surface-enhanced Raman spectra a pilot study.</a> Microbiol Spectr. 10 (1), e0240921(2022).</li>
<li>Zhang, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+prediction+of+klebsiella+pneumoniae+strains+with+different+MLST+allelic+profiles+via+SERS+spectral+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Peer+J%22%5BJournal%5D)">Classification and prediction of klebsiella pneumoniae strains with different MLST allelic profiles via SERS spectral analysis.</a> Peer J. 11, e16161(2023).</li>
<li>Zhi Liu, Q. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+salmonella+in+chickens+using+loop-mediated+isothermal+amplification+combined+with+a+lateral+flow+dipstick%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of salmonella in chickens using loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick.</a> J Microbiol Biotechnol. 29 (3), 454-464 (2019).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Integrated+microfluidic+platform+for+multiplexed+detection+of+hunov+by+a+dynamic+confined-space-implemented+one-pot+RPA-LAMP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Fully Integrated microfluidic platform for multiplexed detection of hunov by a dynamic confined-space-implemented one-pot RPA-LAMP system.</a> Adv Sci (Weinh). 21, e2306612(2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Infekcje dróg oddechowych są powszechnymi infekcjami szpitalnymi, powodującymi poważne konsekwencje dla pacjentów i zwiększającymi śmiertelność16. Terminowa i dokładna identyfikacja potencjalnych patogenów, a następnie skuteczne antybiotyki jest kluczem do skutecznego leczenia i poprawy rokowania, szczególnie biorąc pod uwagę ograniczenia związane z tradycyjnymi metodami hodowli17. W tym badaniu zastosowaliśmy metodę opartą na LAMP do określenia pojedynczych lub wielokrotnych infekcji w celu szybkiego i precyzyjnego wykrywania infekcji dróg oddechowych. Ten szybki system detekcji powstał dzięki połączeniu technologii LAMP z technologią mikroprzepływową. Kwas nukleinowy z próbek klinicznych, takich jak plwocina, BLF i ALF, można szybko wyekstrahować. Ten wyekstrahowany materiał ułatwia szybkie i precyzyjne wykrywanie patogenów bakteryjnych, ukierunkowując praktyki kliniczne na poprawę kontroli i leczenia infekcji dróg oddechowych.
Wcześniejsze badania wykazały, że w porównaniu z metodami opartymi na kulturach i reakcji łańcuchowej polimerazy, wyniki LAMP osiągnęły 100% czułość, swoistość i brak reakcji krzyżowej z innymi bakteriami w czystych kulturach i próbkach krwi18. Testy LAMP mogą również wykrywać patogeny bezpośrednio z płynów biologicznych, takich jak krew, płyn opłucnowy i otrzewnowy oraz płyn mózgowo-rdzeniowy19. Wcześniej wykazano, że egzogenne DNA i inhibitory mogą znacznie zmniejszać czułość PCR, a w przypadku testów LAMP oczyszczanie DNA z próbek klinicznych nie jest wymagane20. Technika ta wykorzystuje geny drożdży i startery podczas procesu amplifikacji do oceny normalności amplifikacji, określając w ten sposób kwalifikację kontroli jakości kontroli zewnętrznej. Kontrole wewnętrzne, wykorzystujące startery z ludzkich genów, określają normalność procesów pobierania próbek, ekstrakcji kwasów nukleinowych i amplifikacji. Jednoczesne wykorzystanie kontroli wewnętrznych i zewnętrznych zapewnia wiarygodność wyników. W tym samym czasie ustawianych jest również wiele studni kontroli dodatniej i ujemnej, co znacznie zapewnia dokładność testu. Chip mikroprzepływowy LAMP ma możliwości podobne do qPCR w wykrywaniu próbek klinicznych. Charakteryzuje się wysoką czułością i silną zdolnością wykrywania, zapewniając niezawodną podstawę do szybkiego wykrywania klinicznego i precyzyjnego leczenia21. Hodowla drobnoustrojów trwa 3-5 dni lub nawet dłużej, a niektóre patogeny, takie jak Chlamydia pneumoniae i Legionella pneumophila, nie mogą być hodowane. W przeciwieństwie do tego, LAMP wykrywa wiele patogenów bakteryjnych, nawet tych, których nie da się wyhodować, w czasie krótszym niż 3 godziny, co znacznie zwiększa szybkość wykrywania.
Może również wykonywać wiele detekcji. Chip mikroprzepływowy LAMP jest podzielony na różne jednostki reakcyjne, które wykrywają wiele patogenów równolegle, zapewniając niezależność każdej reakcji i dokładność wyników 22,23. Dane z China Network Antibacterial Surveillance Center wykazały, że rozpowszechnienie K. pneumoniae zajęło pierwsze miejsce wśród izolatów bakteryjnych z próbek oddechowych w 2022 r.15. Wśród próbek oddechowych pobranych przez Prowincjonalny Szpital Ludowy w Guangdong w 2022 r. dodatni wskaźnik K. pneumoniae przebadany przez LAMP wyniósł 18,6%, co jest również jedną z bakterii o największej częstości występowania. We wszystkich próbkach dodatnich pod względem K. pneumoniae 30,6% stanowiły zakażenia wywołane wyłącznie przez K. pneumoniae, a 29,7% to infekcje, w których K. pneumoniae współistniała z innymi gatunkami bakterii. Dodatkowo odnotowano potrójne (23,9%) i poczwórne zakażenia (10,5%) związane z zakażeniem K. pneumoniae, które stanowiły większość w próbkach KP-dodatnich, około 95%. Odnotowano bardzo niewiele przypadków zakażeń pięciokrotnych i sześciokrotnych, a do tej pory nie wykryto zakażeń powyżej sześciokrotki. Wyniki przedstawiają sześć reprezentatywnych scenariuszy, z których każdy reprezentuje wyniki wykrywania infekcji wywołanych przez K. pneumoniae samodzielnie lub współistniejących z 1-5 innymi gatunkami bakterii.
Ponadto technologia chipów LAMP zastosowana w tym badaniu może również wykrywać oporność bakterii. Wykrywa MRSA oporny na metycylinę za pośrednictwem genu mecA . Gdy studzienki reprezentujące Staphylococcus aureus i studzienki dla genu mecA są dodatnie, reprezentują one zakażenie metycyliną-MRSA. Naukowcy nieustannie poszukują metod jednoczesnego szybkiego wykrywania patogenów i cech oporności na antybiotyki. Na przykład szybka metoda diagnostyczna zakażenia Helicobacter pylori i oporności na antybiotyki opiera się na ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR)24. Inne podejście polega na szybkim przewidywaniu wielolekoopornych K. pneumoniae poprzez analizę widm25 wspomaganego rozpraszania Ramana (SERS) w głębokim uczeniu oraz metodę wykrywania genów K. pneumoniae i karbapenemazy przy użyciu widm SERS26. Ponadto istnieje metoda klasyfikacji i przewidywania dla różnych profili typowania sekwencji wielolocus (MLST) szczepów K. pneumoniae w oparciu o analizę widm SERS27. Następnie opracujemy również czułe i dokładne wykrywanie genów K. pneumoniae i karbapenemazy, z wydajnością porównywalną ze złotymi standardami metod klinicznych, które są czasochłonne lub opierają się na drogich specjalistycznych instrumentach. Co więcej, idealne podejście diagnostyczne jest szybkie, dokładne, ekonomiczne i przyjazne dla użytkownika18. Badanie szacujące koszt odczynników do obecnych technologii diagnostycznych wykazało, że badanie próbek w oparciu o technologię PCR kosztuje do 6,4-7,7 USD, w porównaniu z zaledwie 0,71-2 USD w przypadku technologii LAMP28.
Metoda wielokanałowej amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP), oferując znaczące korzyści w zakresie szybkiego wykrywania patogenów bakteryjnych w infekcjach dróg oddechowych, ma swoje ograniczenia. Wysoka czułość LAMP stwarza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego, w którym minimalne zanieczyszczenie DNA może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich29; W związku z tym konieczne jest rygorystyczne postępowanie z próbkami i protokoły proceduralne, aby ograniczyć to ryzyko. Pomimo prostoty metody, interpretacja wyników wymaga specjalistycznej wiedzy i doświadczenia, aby uniknąć błędnej interpretacji lub błędów diagnostycznych, co podkreśla potrzebę dobrze wyszkolonego personelu. Rozpoznanie tych ograniczeń jest niezbędne do skutecznego zastosowania i dalszego rozwoju metody LAMP w dziedzinie diagnostyki klinicznej. Podsumowując, metoda LAMP w połączeniu z chipem mikroprzepływowym może szybko wykrywać różne patogeny bakteryjne równolegle. Ma zalety wysokiej czułości i silnej specyficzności oraz cech niskiego kosztu, szybkości i wygody. Ma ona duże znaczenie praktyczne w zapobieganiu i kontrolowaniu infekcji dróg oddechowych spowodowanych infekcjami patogennymi w warunkach klinicznych. Istotną cechą testu LAMP zaproponowanego w tym badaniu jest to, że jest on łatwy do opanowania przez personel laboratoryjny, co jest bardzo pomocne dla szpitali podstawowych, zapobiegania chorobom, centrów kontroli oraz oddziałów inspekcji i kwarantanny. Podsumowując, mikroprzepływowy system chipowy LAMP jest potężnym narzędziem do wykrywania w laboratoriach klinicznych, które może rozwiązać problemy związane z wysokimi wydatkami i krótkim czasem realizacji w klinicznej diagnostyce zakażeń i ma znaczące wartości zastosowania w warunkach klinicznych.

Infekcje dróg oddechowych (RTIs) wywołane przez patogeny bakteryjne stanowią główną przyczynę zachorowalności i śmiertelności na całym świecie1. Definiuje się je jako wszelkie objawy z górnych lub dolnych dróg oddechowych towarzyszące gorączce trwającej od 2 do 3 dni. Choć infekcje górnych dróg oddechowych występują częściej niż infekcje dolnych dróg oddechowych, przewlekłe i nawracające infekcje dróg oddechowych są również częstymi stanami klinicznymi, stanowiąc duże ryzyko dla pacjentów i znaczące obciążenie dla systemów opieki zdrowotnej2. Do powszechnych bakteryjnych patogenów wywołujących RTIs należą między innymi Streptococcus pneumoniae3, Haemophilus influenzae4, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae oraz Stenotrophomonas maltophilia. Bakterie patogenne te zazwyczaj kolonizują powierzchnie śluzówkowe nosogardła i górnych dróg oddechowych gospodarza, wywołując typowe objawy RTIs, takie jak ból gardła i zapalenie oskrzeli. Powodują one zapalenie płuc, gdy rozprzestrzenią się z górnych dróg oddechowych do sterylnych obszarów dolnych dróg oddechowych; mogą być przenoszone z osoby na osobę drogą oddechową5. W ciężkich przypadkach mogą one prowadzić do inwazyjnych chorób bakteryjnych, w szczególności do bakteryjnego zapalenia płuc z bakteriemią, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i sepsy, które są głównymi przyczynami zachorowalności i śmiertelności osób we wszystkich grupach wiekowych na całym świecie.
Tradycyjne testy w kierunku infekcji dróg oddechowych (RTI) opierają się na hodowlach mikrobiologicznych z wykorzystaniem wymazów z gardła oraz próbek plwociny z dróg oddechowych6. Ponadto testy serologiczne, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA), wykrywają przeciwciała lub antygeny w surowicy, natomiast testy aglutynacyjne pozwalają na obserwację reakcji aglutynacji przeciwciał i antygenów w celu wykrycia infekcji7. Hodowlę drobnoustrojów uznaje się za złoty standard w diagnostyce RTI, jednak niski odsetek pozytywnych wyników hodowli, słaba wiarygodność oraz długi cykl detekcji ograniczają efektywność diagnostyczną8. W rzeczywistości szybka i dokładna diagnoza RTI jest kluczowa dla precyzyjnej eradykacji patogenów bakteryjnych. Szybkie i skuteczne metody detekcji mogą pomóc w zmniejszeniu wskaźnika transmisji patogenów, skróceniu czasu trwania infekcji oraz ograniczeniu nieuzasadnionego stosowania antybiotyków9,10. Metody oparte na biologii molekularnej znacząco przyspieszają detekcję, czego przykładem jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), która amplifikuje sekwencję DNA genu docelowego w celu wykrycia patogenów. Jednak tradycyjny PCR wymaga złożonego sprzętu do cyklicznej zmiany temperatury, co jest uciążliwe i czasochłonne. Co więcej, każda amplifikacja DNA za pomocą PCR (z wyjątkiem PCR w czasie rzeczywistym) kończy się elektroforetycznym rozdzieleniem produktu, co również zajmuje czas. Wizualizacja produktu wymaga zastosowania barwników, z których wiele ma działanie mutagenne lub kancerogenne. W związku z tym konieczne jest ciągłe opracowywanie nowych metod i technologii diagnostyki bakteryjnych patogenów wywołujących RTI.
Izotermiczna amplifikacja zapętlona (LAMP) to nowoczesna i rozwijająca się technologia molekularna, pierwotnie opracowana przez Notomi i wsp. w 2000 roku11. Metoda LAMP umożliwia amplifikację DNA w stabilnych warunkach izotermicznych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu do cyklicznej zmiany temperatury, co czyni ją odpowiednią do szybkiej detekcji oraz zmniejsza złożoność i koszt aparatury12. LAMP pozwala na wykrywanie niskich stężeń docelowego DNA z wysoką czułością13. Wykorzystuje ona wiele specyficznych starterów w celu zwiększenia selektywności wobec sekwencji docelowych i zmniejszenia prawdopodobieństwa wyników fałszywie dodatnich14. Ze względu na prostotę, szybkość i intuicyjną obsługę, metoda LAMP jest stopniowo szeroko wprowadzana do laboratoriów klinicznych, nawet w diagnostyce infekcji dróg oddechowych (RTIs). W niniejszym badaniu oceniono skuteczność metody LAMP w wykrywaniu dolnych RTIs w próbkach klinicznych (plwocinach, płukankach oskrzelowych i płukankach pęcherzykowych), co przedstawiono na Rysunku 1. Wykazano, że w detekcji dolnych RTIs metoda LAMP oferuje takie zalety jak szybkość, czułość i łatwość użycia w porównaniu z tradycyjnymi testami, co czyni ją obiecującym rozwiązaniem aplikacyjnym.
<img alt="Proces analizy DNA z pobieraniem próbek, PCR, schemat amplifikacji izotermicznej, wykres wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66677/66677fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja metody detekcji LAMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66677/66677fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Inkubator kąpielowy (MK2000-2)</td> <td>ALLSHENG</td><td></td><td>Zapewnij środowisko o stałej temperaturze</td></tr><tr><td>Głowica kolektora płynu z płukania oskrzeli</td><td>TIANPINGHUACHANG</td><td>SEDA 20172081375</td><td>Zbieranie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego</td></tr><tr><td>Bronchoskop światłowodowy</td><td>OLYMPUS</td><td>SEDA 20153062703</td><td>Elastyczny bronchoskop wyposażony w światłowodowe źródło światła i kamerę, do wizualnego badania dróg oddechowych i struktur w płucach. Pomoc w zbieraniu płukania oskrzelowo-pęcherzykowego</td></tr><tr><td>HR1500-<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66677/66677eq01v2.jpg" style="margines: auto; ">B2</td><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Haier</td><td>SEDA 20183541642</td></tr><tr><td>NAOH</td><td>MACKLIN</td><td>S817977</td><td>Upłynnić lepką próbkę dolnych dróg oddechowych</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych dla patogenów dróg oddechowych</td><td>Capitalbio Technology</td><td>SEDA 20173401346</td><td>Testy na infekcję bakteryjną</td></tr><tr><td>Odczynnik do ekstrakcji kwasów nukleinowych</td><td>Capitalbio Technology</td><td>SEDA 20160034</td><td>Dla DNA ekstrakcja</td></tr><tr><td>RTisochip-W</td><td>Capitalbio Technology</td><td>SEDA 20193220539</td><td>Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli</td></tr><tr><td>THERMO ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SEDA 20180585</td><td>Odwiruj pozostałą ciecz ze ścianki probówki.</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy VM-5005</td><td>JOANLAB</td><td></td><td>Do mieszania odczynnika</td></tr></tbody></table>

szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Infekcje dróg oddechowych (RTI) są jednymi z najczęstszych problemów w warunkach klinicznych. Szybka i dokładna identyfikacja patogenów bakteryjnych dostarczy praktycznych wskazówek dotyczących postępowania i leczenia infekcji dróg oddechowych. W badaniu opisano metodę szybkiego wykrywania patogenów bakteryjnych, które powodują infekcje dróg oddechowych, za pomocą wielokanałowej amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). LAMP to czułe i specyficzne narzędzie diagnostyczne, które szybko wykrywa bakteryjne kwasy nukleinowe z dużą dokładnością i niezawodnością. Proponowana metoda ma znaczącą przewagę nad tradycyjnymi metodami hodowli bakteryjnej, które są czasochłonne i często wymagają większej czułości w wykrywaniu niskich poziomów bakteryjnych kwasów nukleinowych. W artykule przedstawiono reprezentatywne wyniki badań nad zakażeniem K. pneumoniae i jego wielorakimi koinfekcjami przy użyciu LAMP do wykrywania próbek (plwociny, płynu z płukania oskrzeli i płynu z płukania pęcherzyków płucnych) z dolnych dróg oddechowych. Podsumowując, wielokanałowa metoda LAMP zapewnia szybki i skuteczny sposób identyfikacji pojedynczych i wielu patogenów bakteryjnych w próbkach klinicznych, co może pomóc w zapobieganiu rozprzestrzenianiu się patogenów bakteryjnych i pomóc w odpowiednim leczeniu infekcji dróg oddechowych.

W niniejszym eksperymencie zastosowano technologię amplifikacji izotermicznej, przeprowadzając reakcje na mikrofluidycznym chipie dyskowym. Reakcja odbywa się w mikrofluidycznym analizatorze kwasów nukleinowych z wykorzystaniem metody wprowadzania barwnika fluorescencyjnego. Reakcja izotermiczna jest prowadzona w stałej temperaturze 65 °C, a jednocześnie przeprowadzana jest analiza fluorescencji w czasie rzeczywistym. Próbki pozytywne ulegają amplifikacji pod wpływem polimerazy o funkcjonalności wypierania łańcucha, co skutkuje uzyskaniem krzywej amplifikacji w kształcie litery S. Ten jednotapowy proces kończy amplifikację i detekcję genu docelowego. W badaniu wybrano 7 próbek o różnych wynikach eksperymentalnych, aby wykazać niezawodność projektu doświadczalnego. Wielka litera S oznacza próbkę. S1 to próbka zakażona pojedynczym szczepem K. pneumoniae. S2 do S7 to próbki z zakażeniami polimikrobowymi, wszystkie zakażone K. pneumoniae. W celu uzyskania skutecznych wyników detekcji, interpretację można przeprowadzić na podstawie znormalizowanych krzywych fluorescencji przedstawionych na obrazach. Wskaźnikiem pozytywnym jest krzywa amplifikacji o kształcie litery S, natomiast linia pozioma reprezentuje wskaźnik negatywny (Rysunek 3).
<img alt="Intensywność fluorescencji w czasie w analizie qPCR; wykresy przedstawiają krzywe amplifikacji DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66677/66677fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki amplifikacji kwasów nukleinowych za pomocą LAMP. Wielka litera S oznacza próbkę. S1 to próbka zainfekowana pojedynczym szczepem kpn. S2 do S7 to próbki z infekcjami polimikrobowymi, wszystkie zainfekowane kpn. S2 reprezentuje próbkę zainfekowaną kpn oraz sma. S3 oznacza próbkę współzainfekowaną kpn, sau oraz MRSA. S4 oznacza próbkę współzainfekowaną kpn, sau, MRSA oraz aba. S5 wskazuje próbkę współzainfekowaną kpn, sma, sau, MRSA oraz aba. S6 oznacza próbkę współzainfekowaną kpn, sma, pae, sau, MRSA oraz aba. S7 reprezentuje próbkę współzainfekowaną kpn, sma, pae, sau, MRSA, aba oraz E. coli. Szczegóły dotyczące próbek znajdują się w Tabeli 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66677/66677fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Ten zestaw odczynników wykorzystuje metodę ROC do obliczenia wartości progowych dodatnich dla ośmiu wskaźników testowych. Gdy wartość TP wskaźnika detekcji jest mniejsza lub równa odpowiadającej mu wartości progowej dodatniej, interpretuje się wynik jako dodatni. I odwrotnie, gdy wartość TP wskaźnika detekcji jest większa od jego wartości progowej dodatniej, interpretuje się wynik jako ujemny. Wartości progowe dodatnie dla każdego wskaźnika szczegółowo opisano w Tabeli 5. Prawdziwe dodatnie wartości TP, które wykryto dla 7 próbek o różnych wynikach eksperymentalnych, przedstawiono w Tabeli 6.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">PRÓBKA</td>
			<td>kpn</td>
			<td>rdzeniowy zanik mięśni (SMA)</td>
			<td>PAE</td>
			<td>sau</td>
			<td>MRSA (gronkowiec złocisty oporny na metycylinę)</td>
			<td>hin</td>
			<td>aba</td>
			<td>ekologia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TP (+/-)</td>
			<td>TP (+/-)</td>
			<td>TP (+/-)</td>
			<td>TP (+/-)</td>
			<td>TP (+/-)</td>
			<td>TP (+/-)</td>
			<td>TP (+/-)</td>
			<td>TP (+/-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1</td>
			<td>19.68 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S2</td>
			<td>17.73 (+)</td>
			<td>18.30 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S3</td>
			<td>16.73 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>18.05 (+)</td>
			<td>12.18 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S4</td>
			<td>21.66 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>27.07 (+)</td>
			<td>19.61 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>18.29 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S5</td>
			<td>16.16 (+)</td>
			<td>20.85 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>23.80 (+)</td>
			<td>17.13 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>15.22 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6</td>
			<td>11.20 (+)</td>
			<td>16.79(+)</td>
			<td>17.18(+)</td>
			<td>23.09 (+)</td>
			<td>16.14 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
			<td>14.28 (+)</td>
			<td>U (-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7</td>
			<td>14.69 (+)</td>
			<td>24.84(+)</td>
			<td>19.70(+)</td>
			<td>24.07(+)</td>
			<td>14.16 (+)</td>
			<td>- (+)</td>
			<td>15.23 (+)</td>
			<td>20.12 (+)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="9">Każda próbka +/- wynik jakościowy; 
			 +, wynik dodatni; -, wynik ujemny. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: Tabela wartości TP dla detekcji po infekcji.
Tabela uzupełniająca 1: Lista skrótów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66677/Supplementary%20table.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Instrukcje zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych patogenów układu oddechowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66677/Supplementary%20file.%20Kit%20Instructions.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

Badanie to koncentrowało się na szybkiej identyfikacji patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dróg oddechowych za pomocą technologii chipów mikroprzepływowych opartej na amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli oraz skuteczności tego podejścia w leczeniu i kontroli infekcji dróg oddechowych w szpitalach i społecznościach. Głównym wyzwaniem związanym z tą metodą jest ryzyko wystąpienia objawów społecznych o wysokiej czułości, co wymaga ścisłego obchodzenia się z próbkami i stosowania standardowych protokołów operacyjnych w celu zmniejszenia ryzyka wyników fałszywie dodatnich. Ponadto personel laboratoryjny musiał opanować odpowiednie umiejętności, aby skutecznie stosować tę metodę w szpitalach podstawowych.W porównaniu z tradycyjnymi technikami PCR, technologia chipów mikroprzepływowych oparta na amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli ma wysoką specyficzność i czułość. Może szybko wykryć do niektórych patogenów układu oddechowego o wysokiej częstotliwości i powszechnych genów oporności w ramach jednej powieści. Technika, którą zademonstrowaliśmy w tym badaniu, ma ważne praktyczne implikacje dla kontroli i leczenia infekcji dróg oddechowych, pomagając zapobiegać rozprzestrzenianiu się patogenów bakteryjnych i dostarczając wskazówek dotyczących odpowiedniego leczenia antybiotykami.Zamierzamy nadal opracowywać nowatorskie metody diagnostyczne, koncentrując się na szybkim i dokładnym wykrywaniu patogenów mikrobiologicznych wywołujących choroby zakaźne. Będziemy również dążyć do opracowania nowatorskich metod testowania chorób zakaźnych, które można łatwo wdrożyć w miejscach o ograniczonych zasobach, takich jak wiejskie Chiny. Aby rozpocząć, oczyść jamę ustną i zęby czystą wodą.Poproś pacjentów z protezami zębowymi o ich usunięcie. Poinstruuj pacjenta, aby mocno kaszlał, aby wydalić plwocinę z głębokimi drogami oddechowymi do pojemnika na plwocinę. Aby wyekstrahować DNA, dodaj odpowiednią objętość 10% wodorotlenku sodu do próbki w zależności od jej lepkości.Obracaj zawieszeniem przez 15 sekund. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w celu upłynnienia próbki. Następnie odpipetować jeden mililitr skroplonej próbki do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.Odwirować próbkę w temperaturze 15 777 G przez pięć minut w temperaturze od dwóch do sześciu stopni Celsjusza. Następnie odpipetować supernatant i go wyrzucić. Teraz dodaj jeden mililitr roztworu myjącego do probówki i wymieszaj go, aby podnieść osad z dna probówki.Po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu jak poprzednio, odpipetować 100 mikrolitrów roztworu ekstrakcyjnego kwasu nukleinowego do osadu. Za pomocą pipety odessać i dokładnie wymieszać osad z roztworem. Przenieś ciecz i osad razem do probówki do ekstrakcji kwasów nukleinowych.Umieść rurkę w mieszalniku wirowym ze średnią prędkością na pięć minut. Następnie przenieś rurkę do metalowej kąpieli o stałej temperaturze 100 stopni Celsjusza na pięć minut. Na koniec odwirować próbki w temperaturze 15 777 G przez pięć minut w temperaturze od dwóch do sześciu stopni Celsjusza przed dalszymi eksperymentami.Na początek delikatnie wstrząśnij rozmrożonym odczynnikiem do amplifikacji izotermicznej. Odwirować odczynnik, aby zebrać go w całości na dnie probówki. Odpipetować 20 mikrolitrów odczynnika do amplifikacji izotermicznej do przygotowanej probówki wirówkowej o pojemności 200 mikrolitrów.Przykryj probówkę pokrywką i przenieś ją do obszaru przygotowania próbki. Teraz dodaj 34,5 mikrolitra docelowej próbki kwasu nukleinowego do każdej probówki. Wstrząśnij delikatnie, aby dokładnie wymieszać.Odwirować probówki na krótko, aby zebrać wszystkie próbki z dna probówek. Następnie napisz numer próbki na etykiecie opakowania chipów. Otwórz chip mikroprzepływowy etykietą na opakowaniu skierowaną do góry.Umieść chip tak, aby porty wlotowe i wylotowe były skierowane do góry. Następnie za pomocą pipety pobrać 50 mikrolitrów przygotowanego układu reakcji amplifikacji i dodać go do głównego kanału chipa przez port wlotowy. Przestań dodawać, gdy kanał główny zostanie wypełniony.Wytrzyj nadmiar płynu wokół portów wlotowych i wylotowych niestrzępiącą się chusteczką. Następnie kliknij przycisk otwierania zasobnika na analizatorze kwasów nukleinowych po jego wstępnym podgrzaniu. Umieść wiór przednią stroną do góry na tacy, upewniając się, że mały cylinder ustalający wyłania się ze środkowej szczeliny wióra, aby go zabezpieczyć.Naciśnij przycisk zamkniętej tacy, aby włożyć chip do analizatora kwasów nukleinowych. Wprowadź informacje o testowaniu próbki w obszarze informacji o próbce w interfejsie wykrywania. Następnie naciśnij przycisk rozpoczęcia wykrywania, aby rozpocząć wykrywanie próbki.W próbce pierwszej stwierdzono zakażenie zapaleniem płuc Klebsiella, podczas gdy próbki druga i siódma wykazały infekcje wielodrobnoustrojowe. Wskaźnik dodatni był reprezentowany przez krzywą amplifikacji w kształcie litery S, podczas gdy linia pozioma reprezentowała wskaźnik ujemny.

rapid-detection-bacterial-pathogens-causing-lower-respiratory-tract

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przedstawiona jako niedroga alternatywa dla detekcji fluorescencyjnej w macierzach mikroukładów. W oparciu o fotopolimeryzację, ampliPHOX wytwarza stałe polimerowe plamki widoczne gołym okiem w zaledwie kilka minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, a zarazem wydajnego pakietu oprogramowania.

Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

Źródło: Domesle, K. J. i in. Pętlowane wzmacnianie izotermiczne do wykrywania salmonelli w karmach zwierzęcych i potwierdzania izolacji salmonelli w hodowli kulturowej.  J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje technikę amplifikacji izotermicznej z pętlą (LAMP) do wykrywania docelowego genu bakteryjnego poprzez amplifikację DNA w stałej temperaturze. Mieszanina reakcyjna przygotowuje się poprzez dodanie izotermicznej mieszanki głównej, specyficznych starterów dla docelowego genu oraz próbek...

Pętlowa amplifikacja izotermiczna do wykrywania genów bakteryjnych

Zintegrowany mikroprzepływowy układ termoplastyczny został opracowany do użytku jako diagnostyka molekularna. Chip wykonuje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkryptazę i PCR. Opisano metody wytwarzania i uruchamiania chipa.

Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

Opisaliśmy tutaj prostą metodę amplifikacji izotermicznej (LAMP) za pośrednictwem pętli, wykorzystującą liofilizowane odczynniki do wykrywania C. burnetii w próbkach pobranych od pacjentów.

Opracowanie liofilizowanych odczynników do amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli do wykrywania Coxiella burnetii

Opisujemy szybki, molekularny test na grypę A i B. Test grypy wykrywa każdy cel w ciągu 15 minut, stosując amplifikację izotermiczną za pomocą starterów specyficznych dla grypy, a następnie wykrywanie celu za pomocą molekularnych sond ostrzegawczych. Test na grypę A i B jest przyjazny dla użytkownika i wymaga minimalnego czasu na wykonanie.

Szybkie wykrywanie molekularne i różnicowanie wirusów grypy A i B

Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.

Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Szczegółowe instrukcje są dostarczone do budowy otwartego, modułowego fluorymetru, który jest kompatybilny z wieloma tanimi grzejnikami, aby przeprowadzać w czasie rzeczywistym, ilościowe izotermiczne amplifikacje kwasów nukleinowych.

Miniaturowy fluorymetr typu open source do monitorowania reakcji amplifikacji izotermicznych kwasów nukleinowych w czasie rzeczywistym w warunkach ograniczonych zasobów

Ten protokół opisuje, jak zbudować system łańcucha polimerazy o ciągłym przepływie oparty na mikroprzepływowym chipie i jak zbudować system elektroforezy kapilarnej w laboratorium. Przedstawiono w nim prostą metodę analizy kwasów nukleinowych w laboratorium.

Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

Tutaj udostępniamy kompletny protokół do standaryzacji i implementacji metody wykrywania wirusa SARS-CoV-2 w próbkach ludzkich za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda, wykonana w ciągu 60 minut, może być dostosowana do każdego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu.

Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji

Aby ułatwić szybkie i precyzyjne wykrywanie Acinetobacter baumannii, przedstawiamy protokół, który wykorzystuje amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) w połączeniu z endonukleazą LbaCas12a do identyfikacji infekcji A. baumannii.

Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a

Poznaj szybką detekcję patogenów bakteryjnych dróg oddechowych za pomocą mikroprzepływowych chipów z izotermiczną amplifikacją LAMP. Ta metoda oferuje wysoką czułość i swoistość w diagnostyce klinicznej.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych (Wideo) | JoVE Journal

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Przeglądaj więcej filmów