Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych
29 marca 2024
Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.
Badanie to koncentrowało się na szybkiej identyfikacji patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dróg oddechowych za pomocą technologii chipów mikroprzepływowych opartej na amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli oraz skuteczności tego podejścia w leczeniu i kontroli infekcji dróg oddechowych w szpitalach i społecznościach. Głównym wyzwaniem związanym z tą metodą jest ryzyko wystąpienia objawów społecznych o wysokiej czułości, co wymaga ścisłego obchodzenia się z próbkami i stosowania standardowych protokołów operacyjnych w celu zmniejszenia ryzyka wyników fałszywie dodatnich. Ponadto personel laboratoryjny musiał opanować odpowiednie umiejętności, aby skutecznie stosować tę metodę w szpitalach podstawowych.
W porównaniu z tradycyjnymi technikami PCR, technologia chipów mikroprzepływowych oparta na amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli ma wysoką specyficzność i czułość. Może szybko wykryć do niektórych patogenów układu oddechowego o wysokiej częstotliwości i powszechnych genów oporności w ramach jednej powieści. Technika, którą zademonstrowaliśmy w tym badaniu, ma ważne praktyczne implikacje dla kontroli i leczenia infekcji dróg oddechowych, pomagając zapobiegać rozprzestrzenianiu się patogenów bakteryjnych i dostarczając wskazówek dotyczących odpowiedniego leczenia antybiotykami.
Zamierzamy nadal opracowywać nowatorskie metody diagnostyczne, koncentrując się na szybkim i dokładnym wykrywaniu patogenów mikrobiologicznych wywołujących choroby zakaźne. Będziemy również dążyć do opracowania nowatorskich metod testowania chorób zakaźnych, które można łatwo wdrożyć w miejscach o ograniczonych zasobach, takich jak wiejskie Chiny. Aby rozpocząć, oczyść jamę ustną i zęby czystą wodą.
Poproś pacjentów z protezami zębowymi o ich usunięcie. Poinstruuj pacjenta, aby mocno kaszlał, aby wydalić plwocinę z głębokimi drogami oddechowymi do pojemnika na plwocinę. Aby wyekstrahować DNA, dodaj odpowiednią objętość 10% wodorotlenku sodu do próbki w zależności od jej lepkości.
Obracaj zawieszeniem przez 15 sekund. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w celu upłynnienia próbki. Następnie odpipetować jeden mililitr skroplonej próbki do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.
Odwirować próbkę w temperaturze 15 777 G przez pięć minut w temperaturze od dwóch do sześciu stopni Celsjusza. Następnie odpipetować supernatant i go wyrzucić. Teraz dodaj jeden mililitr roztworu myjącego do probówki i wymieszaj go, aby podnieść osad z dna probówki.
Po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu jak poprzednio, odpipetować 100 mikrolitrów roztworu ekstrakcyjnego kwasu nukleinowego do osadu. Za pomocą pipety odessać i dokładnie wymieszać osad z roztworem. Przenieś ciecz i osad razem do probówki do ekstrakcji kwasów nukleinowych.
Umieść rurkę w mieszalniku wirowym ze średnią prędkością na pięć minut. Następnie przenieś rurkę do metalowej kąpieli o stałej temperaturze 100 stopni Celsjusza na pięć minut. Na koniec odwirować próbki w temperaturze 15 777 G przez pięć minut w temperaturze od dwóch do sześciu stopni Celsjusza przed dalszymi eksperymentami.
Na początek delikatnie wstrząśnij rozmrożonym odczynnikiem do amplifikacji izotermicznej. Odwirować odczynnik, aby zebrać go w całości na dnie probówki. Odpipetować 20 mikrolitrów odczynnika do amplifikacji izotermicznej do przygotowanej probówki wirówkowej o pojemności 200 mikrolitrów.
Przykryj probówkę pokrywką i przenieś ją do obszaru przygotowania próbki. Teraz dodaj 34,5 mikrolitra docelowej próbki kwasu nukleinowego do każdej probówki. Wstrząśnij delikatnie, aby dokładnie wymieszać.
Odwirować probówki na krótko, aby zebrać wszystkie próbki z dna probówek. Następnie napisz numer próbki na etykiecie opakowania chipów. Otwórz chip mikroprzepływowy etykietą na opakowaniu skierowaną do góry.
Umieść chip tak, aby porty wlotowe i wylotowe były skierowane do góry. Następnie za pomocą pipety pobrać 50 mikrolitrów przygotowanego układu reakcji amplifikacji i dodać go do głównego kanału chipa przez port wlotowy. Przestań dodawać, gdy kanał główny zostanie wypełniony.
Wytrzyj nadmiar płynu wokół portów wlotowych i wylotowych niestrzępiącą się chusteczką. Następnie kliknij przycisk otwierania zasobnika na analizatorze kwasów nukleinowych po jego wstępnym podgrzaniu. Umieść wiór przednią stroną do góry na tacy, upewniając się, że mały cylinder ustalający wyłania się ze środkowej szczeliny wióra, aby go zabezpieczyć.
Naciśnij przycisk zamkniętej tacy, aby włożyć chip do analizatora kwasów nukleinowych. Wprowadź informacje o testowaniu próbki w obszarze informacji o próbce w interfejsie wykrywania. Następnie naciśnij przycisk rozpoczęcia wykrywania, aby rozpocząć wykrywanie próbki.
W próbce pierwszej stwierdzono zakażenie zapaleniem płuc Klebsiella, podczas gdy próbki druga i siódma wykazały infekcje wielodrobnoustrojowe. Wskaźnik dodatni był reprezentowany przez krzywą amplifikacji w kształcie litery S, podczas gdy linia pozioma reprezentowała wskaźnik ujemny.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na szybkiej identyfikacji patogenów bakteryjnych wywołujących infekcje dróg oddechowych przy użyciu technologii chipów mikroprzepływowych opartych na izotermicznej amplifikacji zapętlonej. Podejście to jest kluczowe dla skutecznego zarządzania i kontroli infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Diagnostyka kliniczna
- Choroby zakaźne
Wstęp
- Patogeny bakteryjne mogą prowadzić do poważnych infekcji dróg oddechowych.
- Dokładne i szybkie wykrywanie jest niezbędne dla skutecznego leczenia.
- Izotermiczna amplifikacja zapętlona stanowi obiecującą metodę detekcji.
- Wyzwania obejmują kwestie czułości oraz zapobieganie wynikom fałszywie dodatnim.
Cel badania
- Ocena skuteczności technologii chipów mikrofluidycznych w wykrywaniu patogenów.
- Udoskonalenie zarządzania i kontroli infekcji dróg oddechowych.
- Dostarczenie wytycznych dotyczących odpowiedniego leczenia antybiotykami.
Zastosowane metody
- Technologia chipów mikroprzepływowych oparta na izotermicznej amplifikacji zapętlonej (LAMP).
- Wysoka czułość i swoistość w wykrywaniu patogenów układu oddechowego.
- Standardowe protokoły operacyjne w celu zminimalizowania wyników fałszywie dodatnich.
- Szkolenie personelu laboratoryjnego w celu zapewnienia skutecznego zastosowania.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia szybką detekcję często występujących patogenów układu oddechowego.
- Skutecznie identyfikuje powszechne geny oporności.
- Wykazała wysoką swoistość w porównaniu z tradycyjnymi technikami PCR.
- Ma istotne znaczenie dla kontroli rozprzestrzeniania się patogenów bakteryjnych.
Wnioski
- Technologia mikroprzepływowa usprawnia szybką detekcję patogenów.
- Wspiera ona skuteczne zarządzanie infekcjami dróg oddechowych.
- Kieruje odpowiednią antybiotykoterapią w celu zapobiegania rozprzestrzenianiu się infekcji.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka, multipleksowa detekcja patogenów bakteryjnych w próbkach z dolnych dróg oddechowych rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w diagnostyce chorób zakaźnych, umożliwiając wcześniejszą interwencję i lepsze zarządzanie opieką nad pacjentem. Izotermiczna amplifikacja zapętlona (LAMP) oparta na chipach mikroprzepływowych oferuje wysoką czułość i swoistość, wspierając pewną identyfikację patogenów oraz detekcję genów oporności. Zdolność ta zwiększa pewność prognostyczną w punkcie zwrotnym diagnostyki, bezpośrednio wpływając na podejmowanie decyzji terapeutycznych oraz priorytetyzację portfela w rozwoju leków przeciwdrobnoustrojowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę obecności patogenów oraz statusu koinfekcji w próbkach istotnych klinicznie.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnianie infekcji pojedynczych od polimikrobowych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów diagnostycznych oraz markerów oporności.
- Zwiększa pewność predykcyjną w późniejszym przesiewie przeciwzakaźnym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane próbki kwasów nukleinowych do opracowywania wysokoprzepustowych testów diagnostycznych.
- Standaryzuje procesy detekcji dzięki ilościowym i powtarzalnym odczytom LAMP.
- Umożliwia szybkie przesiewowe badanie izolatów klinicznych w kierunku zarówno patogenów, jak i genów oporności.
- Wspiera skalowalne platformy testowe do multipleksowej detekcji patogenów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia wyniki diagnostyczne z klinicznymi próbkami istotnymi dla choroby, wspierając translacyjne strategie poszukiwania biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość procesu, od identyfikacji patogenów na etapie odkryć po przedkliniczną walidację narzędzi diagnostycznych.
- Minimalizuje ryzyko związane z wdrażaniem kandydatów na testy diagnostyczne poprzez wykazanie ich swoistości i czułości w rzeczywistych matrycach biologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta mikrofluidyczna metoda LAMP integruje się na styku odkrycia diagnostycznego i walidacji, łącząc wczesne wykrywanie z badaniami translacyjnymi oraz opracowywaniem testów przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących rozpowszechnienia patogenów i dystrybucji genów oporności w infekcjach dróg oddechowych.
- Przesiew: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki w celu standaryzacji testów i porównywania ich w różnych warunkach.
- Analityka: Zapewnia przejrzyste odczyty krzywych amplifikacji w celu obiektywnej interpretacji wyników i analizy statystycznej.
- Badania translacyjne: Zapewnia istotność diagnostyczną dzięki wykorzystaniu próbek plwociny i płuczyn klinicznych.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy platformę technologiczną możliwą do adaptacji w odniesieniu do innych celów chorób zakaźnych i rodzajów próbek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w detekcji patogenów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i przyspiesza procesy diagnostyczne dzięki wysokiej powtarzalności i możliwości multipleksowania.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji typu go/no-go w rozwoju diagnostyki i terapii, poprawiając efektywność kapitałową.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na leki przeciwinfekcyjne i testy diagnostyczne z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o solidne dane detekcyjne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagany jest personel laboratoryjny przeszkolony w zakresie protokołów mikroprzepływowego LAMP oraz obchodzenia się z próbkami.
- Wymagany jest dostęp do analizatorów kwasów nukleinowych i infrastruktury chipów mikroprzepływowych.
- Wymagane jest ścisłe przestrzeganie protokołów operacyjnych w celu zminimalizowania liczby wyników fałszywie dodatnich ze względu na wysoką czułość testu.
- Metoda musi zostać dostosowana do różnych macierzy próbek i paneli patogenów w zależności od potrzeb.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjał do kontaminacji oraz konieczność ciągłej optymalizacji protokołu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:18
Extraction of DNA from Human Sputum Samples for the Rapid Detection of Bacterial Pathogens Using a Microfluidic Chip
4:03
Bacterial Detection of Human Sputum Samples from the Lower Respiratory Tract Using a Microfluidic Chip
