Name: Przedkliniczny model miopatii wywołanej sepsą z niestosowaniem u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: Poznaj model miopatii wywołanej sepsą z niestosowaniem u myszy, łączący ligaturę i nakłucie ślepej kiszki z zawieszeniem kończyn tylnych. Ta metoda pozwala badać mechanizmy dysfunkcji mięśniowej i testować strategie terapeutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH R21 AG072011 do OL.

Procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Florydy (#202200000227). Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy C57BL/6J w wieku 17 tygodni, o masie ciała od 27 g do 34 g. Procedury eksperymentalne i oś czasu przedstawione w tym protokole są przedstawione na Rysunek 1. Jak wskazano, protokół obejmuje łącznie 11 dni. Zwierzęta przechodzą operację przeżycia (CLP/Sham) w dniu 0, a następnie przez cztery dni otrzymują wsparcie w postaci płynów i środków przeciwbólowych. W dniu 4 zwierzęta rozpoczynają HLS przez okres 7 dni. Eksperymenty terminalne przeprowadza się w dniu 11. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Podwiązanie i punkcja kątnika (CLP)
<ol>
	<li>Po uzyskaniu zwierząt ze źródła komercyjnego, pozwól im zaaklimatyzować się w obiekcie dla zwierząt przez co najmniej 1 tydzień przed przeprowadzeniem operacji CLP (lub pozorowanych). Pomoże to zminimalizować stres związany z transportem.</li>
	<li>Trzymaj myszy w grupie, przestrzegając lokalnych wytycznych IACUC. 
	UWAGA: Zgodnie z ogólnym zaleceniem, zwierzęta są trzymane w maksymalnie 5 myszach w klatce do dnia operacji. Standardowe klatki o wymiarach 7,25 cala szerokości, 11,75 cala długości i 5 cali wysokości, są wykorzystywane i wyposażone w ściółkę z kolb kukurydzy. Utrzymywany jest cykl 12h : 12h jasno-ciemny, ze światłami włączanymi o 7 rano i wyłączanymi o 19 wieczorem. Temperatura obudowy jest utrzymywana na poziomie 20-22 °C, a wilgotność względna (RH) utrzymuje się w zakresie od 30% do 60%. Ad libitum zapewniony jest dostęp do standardowej diety i wody.</li>
	<li>Aby wykonać CLP, należy znieczulić zwierzę izofluranem (2,5%, 500 ml/min) w komorze indukcyjnej. Potwierdź znieczulenie, szczypiąc łapę pęsetą. W znieczuleniu głębokim, co potwierdza brak odruchowego wycofywania się z uszczypnięcia łapy, przenieś zwierzę do dalszego znieczulenia za pomocą stożka nosowego (2,5%, 100-125 ml/min). 
	UWAGA: Podczas całej procedury należy stosować techniki aseptyki.</li>
	<li>Zastosuj weterynaryjną maść z lubrykantem do oczu, aby chronić oczy zwierzęcia przed potencjalnym uszkodzeniem lub urazem spowodowanym przez nos podczas operacji.</li>
	<li>Aby oczyścić miejsce operacji, użyj dostępnego w handlu środka do usuwania włosów. Sierść należy usuwać tylko z dolnej części brzucha, unikając nadmiernego odsłonięcia skóry. 
	UWAGA: Alternatywnie można użyć maszynki do strzyżenia sierści zwierzęcej, ale należy zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia skóry.</li>
	<li>Po odsłonięciu miejsca operowanego oczyść obszar trzema aplikacjami jodu powidonu (lub równoważnego peelingu bakteriobójczego), a następnie spłucz 70% alkoholem między każdą aplikacją.</li>
	<li>Należy podać pojedynczą dawkę 3,25 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu lub jej odpowiednika, zgodnie z leczeniem przeciwbólowym zatwierdzonym przez lokalny IACUC.</li>
	<li>Przenieś mysz na obszar operacyjny. Odizoluj pole operacyjne za pomocą samoprzylepnej obłogi. W głębokim znieczuleniu wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej (~2 cm) w skórze za pomocą ostrza skalpela.
	<ol>
		<li>Użyj nożyczek, aby oddzielić skórę od warstwy mięśniowej. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj mniejsze nacięcie (~1 cm) w warstwie mięśniowej. Po uwidocznieniu jelit, za pomocą kleszczy, zlokalizuj jelito ślepe i wyegzekwuj je.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po eksterioryzacji podwiązać jelito ślepe za pomocą sterylnego szwu wchłanialnego z poliglaktyny 5-0. Weź pod uwagę obszar podwiązanego jelita ślepego, zdefiniowany jako odległość od dystalnego końca jelita ślepego do punktu podwiązania, ponieważ przyczyni się to do nasilenia infekcji. Aby powtórzyć przedstawione tutaj wyniki, zawiąż jelito ślepe 1 cm od jego dystalnego punktu. 
	UWAGA: Podwiązanie większego obszaru jelita ślepego spowoduje zwiększenie nasilenia10.</li>
	<li>Za pomocą igły 27 G przedziurawij jelito ślepe na wskroś, pozwalając na wyciek zawartości kału. Ostrożnie delikatnie ściśnij jelito ślepe, aby uzewnętrznić zawartość kału. Aby wykonać pozorowaną operację, wykonaj te same kroki, odsłaniając jelito ślepe zwierzęcia. Nie należy jednak podwiązywać ani nakłuwać jelita ślepego. 
	UWAGA: Wskaźnik igieł ma bezpośredni wpływ na nasilenie infekcji. Aby wywołać infekcję o niskim stopniu złośliwości, zaleca się stosowanie igieł o długości od 26 G do 28 G. Należy pamiętać, że stosowanie grubszych igieł spowoduje zwiększoną śmiertelność, a zwierzęta mogą nie tolerować kolejnej fazy zawieszenia kończyn tylnych w protokole.</li>
	<li>Przenieś jelito ślepe do jamy brzusznej. Zamknij warstwę mięśniową sterylnym szwem wchłanialnym 5-0. Zamknij skórę nylonowym, niewchłanialnym szwem 5-0. Po wykonaniu szwu skórnego należy podać sterylną sól fizjologiczną (1 ml dla samców i 0,5 ml dla samic) we wstrzyknięciu podskórnym w plecy zwierzęcia. 
	UWAGA: Do zamykania warstwy mięśniowej zalecana jest technika szwu ciągłego, natomiast w przypadku warstwy skóry zalecana jest technika szwu przerywanego. Skonsultuj się i zastosuj się do lokalnych wytycznych IACUC dotyczących szycia w chirurgii przetrwania.</li>
	<li>Po operacji zwierzęta należy umieścić pojedynczo w czystej klatce na materacu grzewczym lub poduszce grzewczej ustawionej na temperaturę 35 °C. Obserwuj mysz co 15 minut przez pierwszą godzinę po wyzdrowieniu ze znieczulenia, po czym może zostać zwrócona do obiektu inwentarskiego. 
	UWAGA: Zapewnij minimalną ilość karmy na podłodze klatki, aby umożliwić zwierzętom jedzenie ad libitum bez wpływu na miejsce operacji. Po powrocie do zakładu zwierzęta są badane dwa razy dziennie po ocenie septycznej zwierząt (krok 3).</li>
	<li>Zapewnij sterylną sól fizjologiczną i wsparcie przeciwbólowe przez następne cztery dni, aby umożliwić zagojenie się nacięcia chirurgicznego. 
	UWAGA: Codzienne monitorowanie temperatury powierzchni mieczykowatej i masy ciała pomaga w prowadzeniu dokładnych zapisów nasilenia sepsy11.</li>
</ol>
2. Zawieszenie kończyn tylnych (HLS)
<ol>
	<li>Aby wykonać HLS, badacze muszą postępować zgodnie z lokalnymi wytycznymi etycznymi IACUC. Obejmuje to zapewnienie odpowiednich wymiarów klatki i podłogi, które są kluczowymi aspektami dla dostosowania się do nawyków poruszania się, jedzenia i picia zwierząt w warunkach HLS. 
	UWAGA: Do gojenia się ran zaleca się 4 dni rekonwalescencji po CLP.</li>
	<li>Po 4 dniach rekonwalescencji po CLP lub pozorowanej operacji znieczulić zwierzę pod lekkim przepływem izofluranu (2,5%, 100-125 ml/min). Przymocuj ogon myszy do krótkiego metalowego łańcuszka za pomocą taśmy piankowej. Umieść metalowy łańcuszek równolegle do ogona, podczas gdy taśma piankowa mocno obejmuje ogon i łańcuch razem.</li>
	<li>Aby zapewnić zawieszenie kończyn tylnych, przymocuj metalowy łańcuch do haka połączonego z poprzeczką wzdłuż środka klatki. Dodatkowo przymocuj drugi mały pręt, który może poruszać się wzdłuż poprzeczki, aby umożliwić zwierzęciu większą zdolność poruszania się. 
	UWAGA: Zwierzęta muszą być w stanie poruszać się za pomocą kończyn przednich, wykorzystując metalową siatkę na podłodze klatki.</li>
	<li>Dostosuj wysokość zawieszonych kończyn, aby zapobiec kontaktowi łap z granulkami karmy. Monitorować zwierzęta i czyścić ogolone obszary wokół zszytej skóry ręcznie wacikiem nasączonym wodą co najmniej dwa razy dziennie w okresie zawieszenia. 
	UWAGA: Czyszczenie ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć infekcji w miejscu operacji, zwłaszcza z powodu oparzeń moczem spowodowanych uniesioną pozycją ciała.</li>
	<li>Aby odtworzyć wyniki, należy upewnić się, że zwierzęta są poddawane 7-dniowemu zawieszeniu kończyn tylnych. Czas trwania został określony na podstawie wcześniejszych badań czasowych pokazujących minimalny czas potrzebny do zawieszenia kończyn tylnych do wywołania znaczącego wpływu na mięśnie szkieletowe w warunkach nieseptycznych12,13. 
	UWAGA: Przeżywalność, dyskomfort lub stres zwierzęcia będą się zwiększać w zależności od ciężkości infekcji.</li>
</ol>
3. Ocena zwierząt septycznych
UWAGA: Ocena stanu klinicznego zwierzęcia jest kluczowym aspektem śledzenia ciężkości operacji CLP/pozorowanych. Ponadto, zgodnie z wymogami IACUC, należy ustanowić humanitarne punkty końcowe w odniesieniu do dobrostanu zwierząt. Aby rozwiać te obawy i zapewnić standardy codziennej opieki nad zwierzętami, wykorzystano wskazówki dotyczące przeprowadzania oceny zwierząt przy użyciu zmodyfikowanej skali sepsy myszy (MMSS)14.
<ol>
	<li>Użyj MMSS (Plik uzupełniający 1) do oceny zwierzęcia. Należy pamiętać, że dla każdej kategorii wynik 0 oznacza zdrowe zwierzę. Oceniaj zwierzę dwa razy dziennie od 0 do 3 w zależności od ciężkości infekcji.</li>
	<li>Aby zwiększyć dokładność, mierz temperaturę powierzchni mieczykowatej i masę ciała dwa razy dziennie11,15 i zapisuj razem z arkuszem wyników MMSS. 
	UWAGA: Typowe wahania temperatury powierzchni mieczykowatej i masy ciała przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1.</li>
	<li>Skonsultuj się z lokalnym IACUC w sprawie humanitarnych punktów końcowych. 
	UWAGA: Aby odtworzyć wyniki, jako punkty końcowe zastosowano następujące kryteria: (1) Utrata masy ciała >40% w stosunku do wartości wyjściowej. (2) Temperatura <30 °C lub obniżenie o >5 °C w stosunku do poprzedniej wartości. (3) Wynik 3 w następującym zakresie: reakcja na bodziec, poziom świadomości lub jakość oddychania. (4) Łączna dzienna liczba MSSS ≥17. Opisana tutaj ocena jest przeznaczona do wykonania po operacji oraz u zwierząt poddawanych prawidłowemu poruszaniu się. Zaleca się powstrzymanie się od obchodzenia się ze zwierzętami poddawanymi HLS, aby zapobiec kontaktowi ich tylnych kończyn z powierzchnią. Po ostatecznej ocenie zwierzę należy poddać eutanazji zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etyki zwierząt.</li>
</ol>

Mouse Model for Studying Sepsis-Induced Myopathy with Hindlimb Suspension

<ol><li>Prescott, H. C., Angus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+recovery+from+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Enhancing recovery from sepsis.</a> JAMA. 319 (1), 62-75 (2018).</li>
<li>Stortz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+clinical+outcomes+and+the+immunocatabolic+phenotype+of+chronic+critical+illness+after+sepsis+in+surgical+intensive+care+unit+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Benchmarking clinical outcomes and the immunocatabolic phenotype of chronic critical illness after sepsis in surgical intensive care unit patients.</a> J Trauma Acute Care Surg. 84 (2), 342-349 (2018).</li>
<li>Laitano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+hindlimb+disuse+on+sepsis-induced+myopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of hindlimb disuse on sepsis-induced myopathy in mice.</a> Physiological Rep. 9 (14), e14979(2021).</li>
<li>Callahan, L. A., Supinski, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis-induced+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Sepsis-induced myopathy.</a> Crit Care Med. 37, 10 Suppl S354-S367 (2009).</li>
<li>Cuthbertson, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+quality+of+life+in+the+five+years+after+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Mortality and quality of life in the five years after severe sepsis.</a> Crit Care. 17 (2), R70(2013).</li>
<li>Schmitt, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells+contribute+to+long-term+tissue+repletion+following+surgical+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cachexia+Sarcopenia+Muscle%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells contribute to long-term tissue repletion following surgical sepsis.</a> J Cachexia Sarcopenia Muscle. 14 (3), 1424-1440 (2023).</li>
<li>Owen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+muscle+weakness+and+mitochondrial+dysfunction+in+the+absence+of+sustained+atrophy+in+a+preclinical+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chronic muscle weakness and mitochondrial dysfunction in the absence of sustained atrophy in a preclinical sepsis model.</a> eLife. 8, e49920(2019).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+implicated+in+sepsis-induced+muscle+weakness+and+ameliorated+with+metformin%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence implicated in sepsis-induced muscle weakness and ameliorated with metformin.</a> Shock. 59 (4), 646(2023).</li>
<li>Granger, J. I., Ratti, P. L., Datta, S. C., Raymond, R. M., Opp, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis-induced+morbidity+in+mice%3A+effects+on+body+temperature%2C+body+weight%2C+cage+activity%2C+social+behavior+and+cytokines+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Sepsis-induced morbidity in mice: effects on body temperature, body weight, cage activity, social behavior and cytokines in brain.</a> Psychoneuroendocrinology. 38 (7), 1047-1057 (2013).</li>
<li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+modeling+in+mice%3A+ligation+length+is+a+major+severity+factor+in+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med+Exp%22%5BJournal%5D)">Sepsis modeling in mice: ligation length is a major severity factor in cecal ligation and puncture.</a> Intensive Care Med Exp. 4 (1), 22(2016).</li>
<li>Laitano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xiphoid+surface+temperature+predicts+mortality+in+a+murine+model+of+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Shock+%28Augusta%2C+Ga%29%22%5BJournal%5D)">Xiphoid surface temperature predicts mortality in a murine model of septic shock.</a> Shock (Augusta, Ga). 50 (2), 226-232 (2018).</li>
<li>Park, S., Brisson, B. K., Liu, M., Spinazzola, J. M., Barton, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+IGF-I+excels+in+promoting+functional+muscle+recovery+from+disuse+atrophy+compared+with+pro-IGF-IA%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature IGF-I excels in promoting functional muscle recovery from disuse atrophy compared with pro-IGF-IA.</a> J App Physiol. 116 (7), 797-806 (2013).</li>
<li>Spradlin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+muscle+Igf1+exacerbates+disuse+atrophy+weakness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deletion of muscle Igf1 exacerbates disuse atrophy weakness in mice.</a> J App Physiol. 131 (3), Bethesda, Md. 881-894 (2021).</li>
<li>Shrum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+scoring+system+to+evaluate+sepsis+severity+in+an+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model.</a> BMC Res Notes. 7 (1), 233(2014).</li>
<li>Mai, S. H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+temperature+and+mouse+scoring+systems+as+surrogate+markers+of+death+in+cecal+ligation+and+puncture+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med+Exp%22%5BJournal%5D)">Body temperature and mouse scoring systems as surrogate markers of death in cecal ligation and puncture sepsis.</a> Intensive Care Med Exp. 6 (1), 20(2018).</li>
<li>Vankrunkelsven, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+muscle+weakness+in+a+mouse+model+of+critical+illness%3A+does+fibroblast+growth+factor+21+play+a+role%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Development of muscle weakness in a mouse model of critical illness: does fibroblast growth factor 21 play a role.</a> Skelet Muscle. 13 (1), 12(2023).</li>
<li>Supinski, G., Stofan, D., Nethery, D., Szweda, L., DiMarco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apocynin+improves+diaphragmatic+function+after+endotoxin+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Apocynin improves diaphragmatic function after endotoxin administration.</a> J Appl Physiol. 87 (2), Bethesda, Md. 776-782 (1999).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+leads+to+impaired+mitochondrial+calcium+uptake+and+skeletal+muscle+weakness+by+reducing+the+micu1%3Amcu+protein+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Shock+%28Augusta%2C+Ga%29%22%5BJournal%5D)">Sepsis leads to impaired mitochondrial calcium uptake and skeletal muscle weakness by reducing the micu1:mcu protein ratio.</a> Shock (Augusta, Ga). 60 (5), 698-706 (2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+NAT10+protects+against+sepsis-induced+skeletal+muscle+atrophy+by+inhibiting+ROS%2FNLRP3%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting NAT10 protects against sepsis-induced skeletal muscle atrophy by inhibiting ROS/NLRP3.</a> Life Sci. 330, 121948(2023).</li>
<li>Mankowski, R. T., Laitano, O., Clanton, T. L., Brakenridge, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+treatment+strategies+of+acute+myopathy+and+muscle+wasting+after+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinical+Med%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and treatment strategies of acute myopathy and muscle wasting after sepsis.</a> J Clinical Med. 10 (9), 1874(2021).</li>
<li>Oliveira, J. R. S., Mohamed, J. S., Myers, M., Brooks, M. J., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hindlimb+suspension+and+reloading+on+gastrocnemius+and+soleus+muscle+mass+and+function+in+geriatric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of hindlimb suspension and reloading on gastrocnemius and soleus muscle mass and function in geriatric mice.</a> Exp Gerontol. 115, 19-31 (2019).</li>
<li>Ashare, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-1+improves+survival+in+sepsis+via+enhanced+hepatic+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-1 improves survival in sepsis via enhanced hepatic bacterial clearance.</a> Am J Respir Crit Care Med. 178 (2), 149-157 (2008).</li>
<li>Starr, M. E., Saito, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+increase+in+food+spilling+by+laboratory+mice+may+lead+to+significant+overestimation+of+actual+food+consumption%3A+implications+for+studies+on+dietary+restriction%2C+metabolism%2C+and+dose+calculations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related increase in food spilling by laboratory mice may lead to significant overestimation of actual food consumption: implications for studies on dietary restriction, metabolism, and dose calculations.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1043-1048 (2012).</li>
<li>Crowell, K. T., Soybel, D. I., Lang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restorative+mechanisms+regulating+protein+balance+in+skeletal+muscle+during+recovery+from+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Restorative mechanisms regulating protein balance in skeletal muscle during recovery from sepsis.</a> Shock. 47 (4), 463-473 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Obecny protokół zawiera wytyczne techniczne dotyczące wdrożenia nowego przedklinicznego modelu miopatii wywołanej sepsą. Wszystkie materiały i ważne kroki są szczegółowo opisane w celu odtworzenia modelu. Takie podejście może odtworzyć dysfunkcję mięśni szkieletowych obserwowaną u pacjentów z sepsą, podkreślając rolę niestosowania jako kluczowego składnika w pogarszaniu miopatii. Do tej pory większość badań przedklinicznych dotyczących miopatii wywołanej posocznicą nie obejmowała niestosowania jako aktywnego składnika jej patofizjologii 7,8,16,17. Chociaż protokół ten przede wszystkim szczegółowo opisuje wyniki dotyczące mięśnia płaszczkowatego, całkowicie możliwe jest rozszerzenie ocen ex vivo na inne typy mięśni, na przykład prostownik długi palca (EDL), oraz przeprowadzenie ocen in situ w różnych grupach mięśni.
Pacjenci doświadczający miopatii wywołanej sepsą pozostają przykuci do łóżka przez długi czas, dochodząc do siebie po urazie septycznym1. Ogólnie rzecz biorąc, u 75% osób, które przeżyły, rozwija się miopatia i często są one ponownie przyjmowane na oddział intensywnej terapii z powodu upadków lub problemów związanych z osłabieniem mięśni 1,3. W tym przypadku ta znacząca luka została wypełniona poprzez zaoferowanie alternatywnego narzędzia do badania miopatii wywołanej sepsą.
Model ten można wykorzystać do badania mechanizmów przyczyniających się do miopatii wywołanej sepsą, a także nowych strategii łagodzenia objawów. Potencjalne mechanizmy leżące u podstaw miopatii wywołanej posocznicą obejmują infiltrację komórek szpikowych3, dysfunkcyjne mitochondria18, nadprodukcję reaktywnych form tlenu19 i upośledzoną zdolność regeneracyjną mięśni6. Przyszłe badania muszą zająć się tymi szlakami, w których niestosowanie jest aktywnym składnikiem miopatii, biorąc pod uwagę, że niestosowanie nasila zanik i osłabienie mięśni u pacjentów z septyczną 3,20. Ponadto model pozwala naukowcom na dalsze badanie kluczowych aspektów miopatii, takich jak początek dysfunkcji mięśni. Wreszcie, potencjalne cele terapeutyczne mogą być oceniane przez cały czas trwania modelu w celu zidentyfikowania strategii, które mogą zapobiegać, łagodzić i/lub całkowicie odwracać objawy.
Jedną z trudności w leczeniu miopatii wywołanej sepsą jest brak skutecznych strategii regeneracji mięśni szkieletowych 1,20. Faza przeładowania, w której zwierzę może zostać wypuszczone z HLS, dostarczyłaby cennego modelu pacjentów po wypisaniu z OIOM, który nie został jeszcze zbadany. Chociaż wykazano, że po HLS mięśnie kończyn tylnych odzyskują normalny rozmiar i siłę u zdrowych zwierząt21, w kontekście sepsy zdolność regeneracyjna mięśni szkieletowych jest upośledzona 3,6, co prowadzi do nieskutecznej regeneracji w odpowiedzi na rehabilitację20. Na przykład sepsa wiąże się z niskim poziomem insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 (IGF-1)22, który jest niezbędny do prawidłowej regeneracji mięśni po ponownym załadowaniu z HLS13. Włączenie fazy przeładowania jest proste (tj. polega na wypuszczeniu zwierząt z aparatu zawiesinowego i obserwowaniu powrotu do zdrowia po urazie) i pozwoli naukowcom zbadać potencjalne mechanizmy regeneracji mięśni po septycznym urazu. Co więcej, do modelu można dodać strategie rehabilitacji, co zwiększy potencjał nowych odkryć terapeutycznych.
Nasilenie sepsy jest krytycznym aspektem protokołu, ponieważ wielu badaczy używa grubszych igieł lub szerszego obszaru podwiązania, aby wywołać poważniejszy poziom sepsy. W opisanym tutaj podejściu dostarczyliśmy infekcję o niższym stopniu złośliwości, naśladującą łagodny lub umiarkowany poziom sepsy. Podczas gdy cięższa infekcja może prowadzić do większej atrofii i osłabienia, śmiertelność również wzrasta wykładniczo. Dostarczenie gospodarzowi prawie śmiertelnego poziomu infekcji nie przekłada się na pacjenta, który przeżyje infekcję i jest dotknięty miopatią. Wreszcie, wsparcie antybiotykowe może być stosowane w celu poprawy śmiertelności w ciężkich sepszach. Może to jednak stanowić mechanistyczną ingerencję w podejścia do nauk podstawowych i wymagać dodania kolejnych grup kontrolnych. 
Pomimo tego, że jest to pierwszy protokół łączący stresory septyczne i stresory, model ten nie jest pozbawiony ograniczeń. Mimo że model jest przeznaczony do badania kończyn tylnych, kończyny przednie są nieco przeciążone, ponieważ jest to jedyny sposób poruszania się w klatce. Co więcej, pochylona pozycja ciała modyfikuje reakcje hemodynamiczne, co może ograniczać badania badające ogólnoustrojowe efekty modelu. Dodatkowo, monitorowanie spożycia pokarmu i wody w fazach HLS i/lub CLP może dostarczyć cennych informacji na temat przebiegu dysfunkcji mięśni obserwowanej w tym modelu. Jednak pomiar spożycia pokarmu przez myszy jest trudny, głównie gdy używana jest karma granulowana lub mielona. Zwykle zmiany w wadze karmy są zgłaszane w celu ilościowego określenia spożycia pokarmu. Istnieje jednak kilka kwestii, które należy wziąć pod uwagę w odniesieniu do spożycia pokarmu23. Jeśli używana jest karma granulowana lub mielona, ważne jest, aby wziąć pod uwagę okruchy, które mogą stanowić znaczną część różnicy w wadze przed i po karmieniu. Myszy często zbierają mniejsze granulki lub fragmenty i transportują je do swoich gniazd w klatce. Te drobne okruchy mogą mieszać się ze ściółką, co sprawia, że są trudne do zauważenia. Korzystanie z klatki z dnem z siatki drucianej pozwala na zbieranie okruchów pod spodem. Chociaż mielona karma może zniechęcać do gromadzenia żywności w gniazdach, może prowadzić do większego rozlania. Mokry zacier, powstały przez zmieszanie wody z mieloną karmą, zmniejsza rozlewanie, ale zmienia smak diety, potencjalnie wpływając na spożycie ze względu na zmiany smakowitości. Poprzednie badanie na myszach wykazało, że spożycie pokarmu nie różniło się między CLP (z igłą 25 G) a Sham w 5 dniu po operacji24. Niemniej jednak, jeśli ten wzorzec utrzyma się wraz z wprowadzeniem zawieszenia kończyn tylnych, pozostaje do ustalenia. Kolejnym ograniczeniem tego modelu jest brak antybiotyków i dożylnego leczenia resuscytacją płynów, które naśladowałoby leczenie otrzymywane przez pacjenta na OIOM. Chociaż dodanie tych metod leczenia może rzeczywiście sprawić, że model będzie bardziej odzwierciedlał scenariusze kliniczne, wprowadzają one również dodatkowe zmienne, które należy kontrolować. Obecny model obejmuje już znaczną liczbę zmiennych, a każdy dodany nowy element zwiększa złożoność eksperymentu, liczbę wymaganych myszy i złożoność leczenia statystycznego. Na przykład wprowadzenie antybiotyków, choć ma znaczenie kliniczne, może wpływać na różne aspekty odpowiedzi na sepsę i powrotu do zdrowia, komplikując interpretację konkretnych skutków regeneracji mięśni szkieletowych po sepsie. 
Pomimo tych ograniczeń model ten stanowi znaczne odejście od poprzednich modeli stosowanych w leczeniu miopatii wywołanej sepsą. Na przykład gips, odnerwienie i farmakologiczny paraliż kończyn może powodować nieużywanie kończyn tylnych. Nie naśladują one jednak konfiguracji pacjenta i nie mają możliwości zaoferowania fazy po leczeniu, takiej jak faza ponownego ładowania. 
Podsumowując, protokół przedstawia nowy model przedkliniczny do badania miopatii wywołanej sepsą, uwzględniający kluczowy czynnik często pomijany w poprzednich badaniach: rolę niestosowania w pogarszaniu miopatii. Odtwarzając stan przykucia pacjenta do łóżka poprzez wprowadzenie odciążenia kończyn tylnych, model ten odzwierciedla kluczowe aspekty stanu wywołującego zanik i osłabienie mięśni. Ta innowacja stanowi platformę do badania mechanizmów leżących u podstaw miopatii, włączając niestosowanie jako aktywny element do badania dysfunkcji mięśni i potencjalnych celów terapeutycznych w sepsie.

Sepsa jest stanem zagrażającym życiu z powodu nadaktywnej odpowiedzi immunologicznej, która niekorzystnie wpływa na wiele układów narządowych, powodując poważne obciążenie dla systemów opieki zdrowotnej na całym świecie1. Ostatnio śmiertelność wewnątrzszpitalna związana z sepsą zmniejszyła się dzięki poprawie zarządzania oddziałem intensywnej terapii (OIOM)1,2. Jednak u około 75% pacjentów, którzy przeżyli początkową urazę septyczną, rozwija się zanik mięśni szkieletowych (np. zmniejszenie pola przekroju) i osłabienie (np. zmniejszenie zdolności wytwarzania siły)<klasa sup = 'xref'>3,<klasa sup = 'xref'>4. Zjawisko to zostało scharakteryzowane jako miopatia wywołana sepsą, silnie związana z upośledzoną aktywnością fizyczną i brakiem niezależności w wykonywaniu codziennych czynności życiowych, prowadząca do ponownej hospitalizacji i śmiertelności w ciągu pięciu lat od początkowego epizodu5.
Z powodu agresywnej i uogólnionej infekcji, pacjenci z sepsą są narażeni na długotrwałe okresy leżenia w łóżku podczas rekonwalescencji na OIOM-ie. W tym kontekście mięsień szkieletowy ulega poważnemu nieużywaniu, co prawdopodobnie zaostrza atrofię i osłabienie mięśni3,4. Obecnie żadne leczenie nie rozwiązało skutecznie problemu miopatii wywołanej sepsą. Dostępne modele przedkliniczne zaprojektowane w celu rozwiązania problemu miopatii wykorzystywały podwiązanie i nakłucie jelita ślepego (CLP)6, zawiesinę jelita ślepego7, lub wstrzyknięcie oczyszczonego lipopolisacharydu (LPS), który jest składnikiem ściany komórkowej u bakterii Gram-ujemnych<klasa sup='xref'>8. Chociaż modele te skutecznie wywołują infekcję, nie odtwarzają prawidłowo nieużywania mięśni obserwowanego u żywicieli septycznych poza naturalnym zmniejszeniem aktywności fizycznej obserwowanym u zwierząt septycznych9. 
Głównym celem tego badania jest dostarczenie szczegółowego opisu, jak prawidłowo przeprowadzić model miopatii wywołanej sepsą przy niestosowaniu u myszy. Pokazujemy możliwość połączenia CLP jako modelu sepsy z zawieszeniem kończyn tylnych (HLS) jako modelu niestosowania do badania miopatii wywołanej sepsą u myszy3. Ponadto przedstawiono reprezentatywne wyniki mechaniki mięśni i typowych zmian morfologicznych w odpowiedzi na model.

<table><tbody><tr><td>4-0 Ethicon Coated Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>D5792</td><td>Wchłanialny szew stosowany do zamykania warstwy mięśniowej i do podwiązania jelita ślepego.</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon 18"&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>662G</td><td>Niewchłanialny szew do zamykania warstwy skóry.</td></tr><tr><td>BD&nbsp; Igła PrecisionGlide 26-28 G</td><td>BD</td><td>305136 do igły 27g</td><td>Igła do nakłuwania jelita ślepego.</td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6J&nbsp;</td><td>Laboratorium Jacksona&nbsp;</td><td>szczep #000664</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan</td><td>S-18991</td><td>Waciki do miejscowego stosowania jodu.</td></tr><tr><td>Kriostat</td> <td>(Leica CM1950)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Dynarex Povidone Jod Przygotowawczy Roztwór</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td>Miejscowy płyn antyseptyczny do skóry i błon śluzowych</td></tr><tr><td>Etanol 200 Proof (100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Aby uzyskać 70% etanolu do czyszczenia skóry.</td></tr><tr><td>Klatki zawieszenia kończyn tylnych</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>Nie</td> dotyczy <td>Te wykonane na zamówienie klatki zostaną wyróżnione w nagraniach wideo MS.</td></tr><tr><td>Optixcare Eye Lube</td><td>Optixcare</td><td></td><td>Lubrykant do oczu do ochrony podczas operacji przetrwania.</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela #11</td><td>Fine Science</td><td></td><td>Blade służy do wykonywania nacięć na skórze i mięśniach.</td></tr><tr><td>Skin-Trac</td><td>Zimmer</td><td>736579</td><td>Taśma piankowa do mocowania ogona do aparatu nośnego.</td></tr><tr><td>Cyfrowy waporyzator SomnoSuite o niskim przepływie</td> Kent <td>Scientific Corporation</td><td>SS-01</td><td>Waporyzator do znieczulenia izofluranem</td></tr><tr><td>Aparat do kąpieli tkankowej&nbsp;</td><td>Aurora</td><td>Scientific Model 800A, dźwignia mięśniowa w dwóch trybach 300C</td><td></td></tr></tbody></table>

przedkliniczny model miopatii wywołanej sepsą z niestosowaniem u myszy

A Preclinical Model of Sepsis-Induced Myopathy with Disuse in Mice

Sepsa jest główną przyczyną zgonów wewnątrzszpitalnych. Poprawa leczenia skutkuje większą liczbą osób, które przeżyły sepsę. U około 75% osób, które przeżyły, rozwija się osłabienie i atrofia mięśni, co zwiększa częstość ponownych przyjęć do szpitala i śmiertelność. Jednak dostępne modele przedkliniczne sepsy nie odnoszą się do nieużywania mięśni szkieletowych, kluczowego składnika rozwoju miopatii wywołanej sepsą. Naszym celem w tym protokole jest dostarczenie krok po kroku wytycznych dla modelu mysiego, który odtwarza warunki kliniczne doświadczane przez przykutego do łóżka pacjenta z sepsą. Do opracowania tego modelu wykorzystano samce myszy C57Bl/6. Myszy poddano podwiązaniu i nakłuciu jelita ślepego (CLP) w celu wywołania sepsy. Cztery dni po CLP myszy poddano zawiesinie kończyn tylnych (HLS) przez siedem dni. Wyniki porównano z pozorowanymi operacjami i/lub zwierzętami z normalnym poruszaniem się (NA). Mięśnie poddano sekcji w celu przeprowadzenia in vitro mechaniki mięśni i oceny morfologicznej. Model ten powoduje wyraźny zanik i osłabienie mięśni, podobny fenotyp obserwowany u pacjentów z sepsą. Model ten stanowi platformę do testowania potencjalnych strategii terapeutycznych w celu złagodzenia miopatii wywołanej sepsą.

W przedstawionych w wynikach reprezentatywnych danych wykorzystano samce myszy C57BL/6J w wieku 17 tygodni, o masie ciała od 27 do 34 g. Cały protokół trwa jedenaście dni i składa się z interwencji chirurgicznej (CLP lub zabieg pozorowany), podawania soli fizjologicznej i leków przeciwbólowych (dni 0–4) oraz unieruchomienia kończyn tylnych w zawieszeniu (HLS) (dni 4–11). Eksperymenty końcowe mogą być przeprowadzane w dowolnym momencie podczas fazy zawieszenia. Aby lepiej zrozumieć wpływ modelu na funkcję mięśni szkieletowych, wyniki zostały zestawione z kilku eksperymentów przeprowadzonych w naszym laboratorium. Wyniki protokołu porównano z grupami zwierząt poddanymi zabiegom CLP i/lub pozorowanym, HLS i/lub NA w 11. dniu po początkowej operacji, z wyjątkiem populacji komórek odpornościowych, gdzie eksperymenty przeprowadzono w 7. dniu po CLP. Przedstawione dane to średnia ± błąd standardowy.
Typowa krzywa przeżywalności przedstawiona jest na Rysunku 2. Młode zwierzęta stosunkowo dobrze tolerują ten protokół. Współczynnik przeżywalności przy infekcji o niskim stopniu nasilenia wynosi około 80% do 85%. Należy podkreślić, że silniejszy bodziec uszkadzający spowoduje wyższy poziom śmiertelności. Aby wykazać skuteczność zabiegu CLP w indukowaniu infekcji, Rysunek 3 pokazuje, że CLP prowadzi do zwiększenia populacji komórek odpornościowych w płukankach otrzewnowych zwierząt w porównaniu z grupą kontrolną (sham). Próbki z płukania otrzewnej pobrano przy użyciu sterylnego PBS w 7. dniu po zabiegu CLP i niezwłocznie przeanalizowano za pomocą analizatora Heska Element HT5, który wykorzystuje metody impedancji laserowej i kolorymetrycznej do różnicowego liczenia komórek.
Masa ciała służy jako wskaźnik ciężkości modelu, a połączenie CLP i HLS zazwyczaj prowadzi do utraty 11,8% ± 1,4 % masy ciała3. Co istotne, model ten prowadzi do wyraźnego zmniejszenia masy mięśnia trzelowatego, gdy HLS jest nałożony na CLP (Rysunek 4).
Model ten sprzyja zmniejszeniu pola przekroju poprzecznego mięśnia płaszczowatego3, co objawia się przesunięciem w lewo rozkładu skumulowanego pola powierzchni włókien, wskazując, że mniejsze włókna stanowią główną część przekroju mięśnia. Na przykład w przypadku połączenia CLP i HLS 62% wszystkich włókien mieści się w zakresie od 600 µm2 do 1600 µm2, podczas gdy u zwierząt z grupy sham poddanych HLS w tym samym zakresie znajduje się 34% włókien. Średnie CSA w grupie Sham HLS wynosiło 1359 µm2 ± 41 µm2, natomiast w grupie CLP HLS średnie CSA wynosiło 1233 µm2 ± 67 µm2. Wyniki te są zgodne z obrazem zaniku mięśni. Reprezentatywne obrazy morfologii mięśnia płaszczowatego w odpowiedzi na zastosowany model przedstawiono na Rysunku 5. Aby ocenić pole przekroju poprzecznego (CSA), mięśnie płaszczowate zamrożono w dostępnym handlowo medium do zatapiania (OCT), zanurzono w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem i przechowywano w temperaturze -80 °C. Mięśnie zatopione w OCT pocięto na sekcje o grubości 10 µm przy użyciu kriotomatu i zabarwiono hematoksyliną i eozyną. CSA włókien mierzono poprzez analizę około 1000 włókien na zwierzę i obliczenie wartości mediany pola powierzchni. Granice błon wszystkich widocznych włókien w każdym przekroju mięśnia obrysowano przy użyciu oprogramowania ImageJ z National Institutes of Health.
Słabość mięśni, jako główna cecha miopatii indukowanej sepsą, odgrywa krytyczną rolę w ponownych hospitalizacjach pacjentów z sepsą. Model ten wykazuje, że brak aktywności przyczynia się do rozwoju miopatii, co przedstawiono na Rysunku 6. Słabość mięśni u zwierząt z sepsą poddanych HLS można zaobserwować poprzez pomiar siły mięśnia płaszczowatego ex vivo. Podczas gdy zwierzęta kontrolne (Sham NA) wykazują szczytową siłę bezwzględną wynoszącą 310 ± 14, myszy poddane CLP + NA wykazały szczytową siłę bezwzględną na poziomie 275,3 mN ± 41,1 mN. Jednak po dodaniu HLS siła ta spada do 172,2 mN ± 19,11 mN, co oznacza znaczący, około 40% spadek funkcji skurczowej mięśnia płaszczowatego. W celu pomiaru sił ex vivo wypreparowano mięsień płaszczowaty. Mięsień umieszczono w hydrofobowej czarce Petriego, zakapano roztworem Ringera i związano niewchłanialnymi szwami jedwabnymi. Następnie przeniesiono go do urządzenia z kąpielą tkankową i stymulowano z różnymi częstotliwościami (5 Hz, 15 Hz, 30 Hz, 50 Hz, 80 Hz, 120 Hz, 150 Hz i 200 Hz).
<img alt="Schemat osi czasu eksperymentu na myszach; zabiegi CLP, HLS, NA; wyniki: funkcja mięśni, morfologia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Plan eksperymentu. Oś czasu przedstawiająca etapy opisane w protokole. Dzień 0: zwierzę przechodzi operację przeżywalności (CLP lub Sham); Dzień 4: zwierzę zostaje poddane procedurze HLS lub pozostaje w grupie NA; Dzień 11: przeprowadzane są eksperymenty końcowe. CLP: podwiązanie i nakłucie kątnicy (cecal ligation and puncture). HLS: zawieszenie kończyn tylnych (hindlimb suspension). NA: normalna lokomoja (normal ambulation). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres prawdopodobieństwa przeżycia w czasie; metoda Kaplana-Meiera; wyniki CLP NA vs. CLP HLS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki typowej krzywej przeżycia samców myszy C57Bl6 w wieku 17 tygodni w odpowiedzi na model. HLS nie zwiększa śmiertelności przy tym łagodnym stopniu infekcji. CLP NA (n=5), CLP HLS (n=5). CLP: podwiązanie i nakłucie kątnicy. HLS: podwieszenie kończyn tylnych. NA: normalna lokomocja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig02large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza składu komórek krwi; wykresy kropkowe, wykresy słupkowe; liczba leukocytów, eozynofilów, neutrofili." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki populacji komórek odpornościowych w płukaniu otrzewnej u zwierząt z sepsą oraz grupy kontrolnej (sham), wykonane 7 dni po CLP.Kluczowa populacja komórek odpornościowych jest wysoka u zwierząt po CLP, co wykazuje, że podejście z łagodnym do umiarkowanego CLP jest skuteczne w indukowaniu sepsy. Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy. WBC: leukocyty. NEU: neutrofile. LYM: limfocyty. MONO: monocyty. EOS: eozynofile. BAS: bazofile. CLP: podwiązanie i nakłucie kątnicy (zastosowano nieparzysty t-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównawczy masy mięśnia płaszczowatego, CLP NA vs CLP HLS, p=0.0005, wykres słupkowy, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Zmiany masy mięśnia płaszczowatego. CLP HLS indukuje większy zanik mięśni płaszczowatych. CLP NA (n = 7), CLP HLS (n = 4). Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy. Reprezentatywne wyniki masy mięśnia płaszczowatego w odpowiedzi na model. CLP: podwiązanie i nakłucie kąbnicy. HLS: zawieszenie kończyn dolnych. Zastosowano nieparametryczny t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres skumulowanego pola powierzchni włókien i histologia tkanki mięśniowej porównująca wyniki eksperymentalne grupy Sham i CLP HLS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne wyniki przekroju pola powierzchni mięśni w odpowiedzi na model. (A) CLP HLS indukuje atrofię mięśni, co objawia się przesunięciem pola powierzchni włókien w lewo. Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy. Skumulowane pole powierzchni włókien mięśnia płaszczowatego u zwierząt z grupy sham i septycznych w odpowiedzi na model. Sham HLS (n = 3), CLP HLS (n = 4). (B) Barwienie hematoksyliną i eozyną mięśnia płaszczowatego zwierząt z grupy sham i septycznych. CLP: podwiązanie i nakłucie kątnicy. HLS: zawieszenie kończyn tylnych. Paski skali = 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres siły-częstotliwości mięśnia i wykres słupkowy przedstawiający dane o sile szczytowej dla grup SHAM NA, CLP NA, CLP HLS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki krzywej siła-częstotliwość mięśnia soleus w odpowiedzi na model. (A) Bezwzględna krzywa siła-częstotliwość. CLP HLS prowadzi do znacznego upośledzenia bezwzględnej i szczytowej siły mięśnia soleus. Sham NA n = 3, CLP NA n = 3, CLP HLS n = 3. (B) Szczytowa siła bezwzględna w odpowiedzi na model. Sham NA (n = 3), CLP NA (n = 3), CLP HLS (n = 3). Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy. CLP: podwiązanie i nakłucie kątnicy. HLS: zawieszenie kończyn tylnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Typowe wahania temperatury powierzchni wyrostka miecza oraz masy ciała. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Zmodyfikowana skala sepsy mysiej (Modified Murine Sepsis Score – MMSS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten mysi model łączy w sobie zniewagę septyczną z nieużywaniem mięśni kończyn tylnych, aby podsumować cechę typowego pacjenta z sepsą, która jest przykuta do łóżka. Model ten stanowi znaczące odejście od poprzednich modeli do badania dysfunkcji mięśni w sepsie i jest powtarzalnym podejściem do strategii terapeutycznych w leczeniu tego schorzenia.

Przedkliniczny model miopatii wywołanej sepsą z niestosowaniem u myszy

Sepsis is a major cause of in-hospital deaths. Improvements in treatment result in a greater number of sepsis survivors. Approximately 75% of the ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu mechanizmów stojących za miopatią wywołaną sepsą. Obecne modele pomijają komponent nieużywania, który ma kluczowe znaczenie dla pacjentów ze złym odczytem septycznym. Naszym celem jest zintegrowanie tego aspektu w celu uzyskania dokładniejszego modelu choroby.Znacznie posunęliśmy się naprzód w tej dziedzinie, łącząc model podwiązania i nakłucia jelita ślepego z wysokim zawieszeniem kończyny. To zintegrowane podejście pozwoliło nam zbadać systematyczny wpływ sepsy i wpływ nieużywania mięśni na miopatię wywołaną sepsą, zapewniając bardziej realistyczny model do zrozumienia postępu choroby i potencjalnych interwencji. Nasz protokół łączy podwiązanie i nakłucie jelita ślepego z zawieszeniem kończyn wysokich, aby dokładniej odtworzyć scenariusz kliniczny sepsy u ludzi.Symulując zanik i osłabienie mięśni obserwowane u pacjentów z sepsą, nasze podejście zapewnia kompleksowy model do badania zależności między sepsą a funkcją mięśni, co pozwala na bardziej ukierunkowane badania interwencji terapeutycznych.

a-preclinical-model-of-sepsis-induced-myopathy-with-disuse-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano mysi model przezskórnej elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej (NMES), bezpiecznej i niedrogiej metody klinicznej, zastosowany do mięśni przedziału przedniego. Model ten ma tę zaletę, że wykorzystuje zmodyfikowane, powszechnie dostępne urządzenie kliniczne w celu wywołania ukierunkowanych i specyficznych skurczów mięśni u myszy.

Mysi model treningu mięśniowego za pomocą neuromuskularnej stymulacji elektrycznej

Sepsis to zespół ogólnoustrojowej reakcji zapalnej wynikający z infekcji mikrobiologicznej, który można symulować za pomocą techniki chirurgicznej zwanej podwiązaniem i nakłuciem kątnicy (CLP). W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę wykorzystania modelu zwierzęcego indukowanego CLP do przesiewowego badania ziół leczniczych w celu poszukiwania czynników terapeutycznych.

Wykorzystanie modelu zwierzęcego sepsy do oceny nowych terapii ziołowych

Pomiary funkcji mięśni przyczyniają się do oceny potencjalnych metod leczenia patologii mięśni, jak również do określenia mechanizmów leżących u podstaw fizjologii tej tkanki.   Zademonstrujemy przygotowanie mięśni prostownika długiego palca i przepony do testów funkcjonalnych. Pokazane zostaną protokoły skurczów izometrycznych i ekscentrycznych, a także różnice w wynikach między mięśniami dystroficznymi, reprezentującymi stan patologiczny, a mięśniami typu dzikiego.

Izometryczna i ekscentryczna ocena generowania sił mięśni szkieletowych wyizolowanych z mysich modeli dystrofii mięśniowych

Model przecięcia nerwu piszczelowego jest dobrze tolerowanym, sprawdzonym i powtarzalnym modelem zaniku mięśni szkieletowych. Modelowy protokół chirurgiczny został opisany i zademonstrowany na myszach C57Black6.

Przecięcie nerwu piszczelowego - standaryzowany model atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją u myszy

Podstawową miarą wyników w badaniach klinicznych dotyczących zaburzeń nerwowo-mięśniowych jest ogólna poprawa funkcji mięśni. Dlatego ocena wpływu potencjalnych związków terapeutycznych na wydajność mięśni przed klinicznym badaniem w modelach mysich ma ogromne znaczenie. Poniżej opisujemy kilka testów funkcjonalnych, aby rozwiązać ten problem.

Ocena wydajności funkcjonalnej w modelu myszy Mdx

Ten protokół opisuje centralnie cewnikowany mysi model przedłużającej się choroby krytycznej. Łączymy metodę podwiązania jelita ślepego i nakłucia w celu wywołania sepsy z wykorzystaniem centralnej linii żylnej do podawania płynów, leków i składników odżywczych, aby naśladować warunki kliniczne człowieka.

Zastosowanie centralnej linii żylnej do podawania płynów, leków i składników odżywczych w mysim modelu choroby krytycznej

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Ten protokół dostarcza niezbędnych kroków do ustalenia i oceny sepsy noworodków u 7-dniowych myszy.

Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

Pomiar funkcji kurczliwości mięśni szkieletowych gryzoni jest użytecznym narzędziem, które może być używane do śledzenia postępu choroby, jak również skuteczności interwencji terapeutycznej. Opisujemy tutaj nieinwazyjną ocenę in vivo mięśni zginaczy grzbietowych, która może być powtarzana w czasie u tej samej myszy.

Nieinwazyjna ocena funkcji mięśni zginacza grzbietowego u myszy

Ten protokół przedstawia szczegóły operacyjne podwiązania i nakłucia jelita ślepego (CLP) w mysim modelu sepsy. CLP jest jedną z najczęściej stosowanych technik tworzenia zwierzęcego modelu sepsy. W związku z tym do uzyskania wiarygodnych wyników badań wymagany jest ustandaryzowany protokół CLP.

Ocena wiarygodnego biomarkera w mysim modelu sepsy wywołanym podwiązaniem i nakłuciem jelita ślepego

Ten protokół opisuje indukcję monobakteryjnej sepsy Gram-ujemnej w systemie mysim. Model jest przydatny w badaniu zapalnych i śmiertelnych reakcji gospodarza podczas sepsy.

Charakterystyka septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy

Poznaj model miopatii wywołanej sepsą z niestosowaniem u myszy, łączący ligaturę i nakłucie ślepej kiszki z zawieszeniem kończyn tylnych. Ta metoda pozwala badać mechanizmy dysfunkcji mięśniowej i testować strategie terapeutyczne.

Przedkliniczny model miopatii wywołanej sepsą z niestosowaniem u myszy

Przeglądaj więcej filmów