Name: Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Naucz się izolować komórki śródbłonka trzustki myszy przy użyciu delikatnej dysocjacji i sortowania magnetycznego. Ta metoda umożliwia badanie heterogeniczności komórek śródbłonka i ich roli w chorobach trzustki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Brianowi Armstrongowi z City of Hope i Mindy Rodriguez z University of California, Riverside za pomoc techniczną. Badanie to zostało częściowo sfinansowane z grantów NIH (R01 HL145170 do ZBC), Fundacji Elli Fitzgerald (do ZBC), City of Hope (Nagroda za Metabolizm Cukrzycy i Instytut Badawczy im. Arthura Riggsa) oraz grantu Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej EDU4-12772 (dla AT). Badania opisane w tej publikacji obejmowały prace wykonane w mikroskopii świetlnej i obrazowaniu cyfrowym wspierane przez National Cancer Institute of the NIH w ramach nagrody numer P30CA033572. Rysunek 1 i rysunek 2 zostały wykonane za pomocą BioRender.

Izolacja tkanek została przeprowadzona zgodnie z zatwierdzonym protokołem badania #17010 przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Instytutu Badawczego Beckman, City of Hope (Duarte, Kalifornia, USA). Tutaj używamy Tie-2CreERT2; Linia myszy Rosa26-TdTomato w tle C57BL/6 w wieku 8 - 12 tygodni. W tej linii, EC są oznaczone TdTomato po indukcji tamoksyfenem, jak opisano wcześniej34. Jednak protokół ten można dostosować do wszystkich grup wiekowych dorosłych myszy o różnych genotypach i pochodzeniu genetycznym.
1. Pobranie tkanek (szacowany czas: 1-2 h)
UWAGA: Szacowany czas to 15 minut/zwierzę, zalecane maksymalnie 3 zwierzęta w grupie na próbki dysocjacji.
<ol>
	<li>Eutanazja zwierząt przez przedawkowanie dwutlenku węgla (CO2 ), a następnie wtórne potwierdzenie śmierci. Przed sekcją należy spryskać całe ciało 70% etanolem (EtOH), całkowicie dezynfekując obszar operacyjny.</li>
	<li>Rozciągnij i zabezpiecz kończyny za pomocą szpilek. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj małe nacięcie w linii środkowej przez skórę i otrzewną, zaczynając od dolnej części brzucha i rozciągając się w kierunku klatki piersiowej.</li>
	<li>Odsłoń klatkę piersiową, przecinając przeponę i podnieś klatkę piersiową, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Wprowadzić igłę (25G-30G) połączoną ze strzykawką zawierającą lodowato sterylny PBS do lewej komory serca.</li>
	<li>Perfuzję należy rozpocząć od wstrzyknięcia PBS przez serce z szybkością 5 - 10 ml/min. Przerwać po wstrzyknięciu 10 ml lub do momentu, gdy wątroba i nerki ulegną odbarwieniu.</li>
	<li>Po perfuzji zlokalizuj trzustkę (poniżej żołądka i przyczepioną do dwunastnicy)35 (Ryc. 3A) i ostrożnie usuń ją za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy.</li>
	<li>Po wyizolowaniu przenieś trzustkę do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml lodowatego PBS + 0,2 mg/ml inhibitora trypsyny, trzymaj na lodzie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B). 
	UWAGA: Na tym etapie trzustkę od maksymalnie 3 myszy można połączyć i przenieść do 1 probówki. Próbki można przechowywać na lodzie przez maksymalny czas 2 godzin.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kolagenazy (szacowany czas: 15-30 min)
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory i zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Roztwór dysocjacyjny: Dodaj kolagenazę typu I do probówki o pojemności 50 ml do końcowego stężenia 1 mg / ml w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS 1x (Ca2+, Mg2+; patrz tabela materiałów) i 0,001 U / ml DNazy I + 0,2 mg / ml inhibitora trypsyny.</li>
		<li>Roztwór zatrzymujący dysocjację: Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS 1x, bez Ca2+, Mg2+; to samo dla wszystkich pozostałych PBS w tym protokole; patrz Tabela materiałów), 5% albumina surowicy bydlęcej (BSA), 0,001 U/ml DNazy I lub DMEM + 10% FBS + 0,001 MU/ml DNazy I.</li>
		<li>Bufor do przemywania : Dodaj PBS 1x, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,001 U/ml DNazy I + 0,05 mg/ml inhibitora trypsyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Całkowicie rozpuść i przefiltruj przez filtr 0,22 μm. Odłóż na bok i trzymaj na lodzie.</li>
</ol>
3. Trawienie (szacowany czas: 40 min-1 h)
<ol>
	<li>Wyjmij trzustkę z lodowatego PBS i umieść na szalce Petriego na wierzchu lodu. Ostrożnie usuń nadmiar tkanki (np. śledzionę, tłuszcz, zanieczyszczenia) za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). 
	UWAGA: Bardzo ważne jest usunięcie tłuszczu, ponieważ nadmiar lipidów może zakłócać trawienie tkanek.</li>
	<li>Przenieś przyciętą trzustkę myszy do probówki o pojemności 5 ml zawierającej 1 ml roztworu dysocjacyjnego.</li>
	<li>Trzymaj probówkę na lodzie i zmiel tkanki trzustki nożyczkami do preparowania na drobne kawałki nadające się do pipetowania, np. 0,5 mm lub 1 mm. Przenieś lizat do probówki o pojemności 50 ml i trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Dodaj dodatkową trzustkę do probówki o pojemności 5 ml używanej do wstępnego mielenia tkanki trzustki i dodaj dodatkowy 1 ml kolagenazy. Powtórz w razie potrzeby dla wielu preparatów trzustkowych.</li>
	<li>Dodać 2 ml roztworu kolagenazy do probówki o pojemności 5 ml w celu usunięcia resztek tkanki trzustki i przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Całkowita objętość kolagenazy powinna wynosić 5 ml dla 3 trzustki lub 3 ml dla pojedynczej trzustki.</li>
	<li>Gdy wszystkie próbki zostaną poddane mechanicznej dysocjacji, przenieść probówki o pojemności 50 ml zawierające homogenizowane lizaty tkankowe do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 10 minut 
	UWAGA: Podczas tego procesu nie należy energicznie mieszać ani wirować mieszaniny tkankowej, ponieważ może to spowodować pęknięcie tkanek groniastych i uwolnienie obfitych endogennych enzymów i DNA.</li>
	<li>Wyjmij probówki z łaźni wodnej i delikatnie zamieszaj, aby dobrze wymieszać, a następnie pozostaw w łaźni wodnej na kolejne 10 minut. (Całkowity czas: 20 min). 
	UWAGA: Nie przekraczać 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby uniknąć nadmiernego trawienia.</li>
	<li>Umieść probówki na lodzie i pozwól homogenatowi osiąść grawitacyjnie. Po ustabilizowaniu przenieść supernatant przez filtr 70 μm i dodać 5 ml roztworu zatrzymującego dysocjację.</li>
	<li>Dodać dodatkowy 1 ml roztworu dysocjacyjnego do pozostałego osadu i rozcierać za pomocą igły 18G.</li>
	<li>Przepuścić pozostały homogenat przez filtr i przemyć dodatkowymi 5 ml roztworu zatrzymującego dysocjację.</li>
	<li>Zawiesinę komórek wirować w temperaturze 300 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć supernatant przez aspirację i utrzymać osad komórkowy na lodzie.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy z 1 ml buforu płuczącego i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Pobrać małą porcję z zawieszonego osadu komórkowego (10 μl) i wymieszać z błękitem trypanowym w stosunku 1:1, aby policzyć komórki za pomocą licznika komórek i zmierzyć żywotność.</li>
</ol>
4. Wzbogacanie komórek śródbłonka (EC) (szacowany czas: 2-3 godziny)
<ol>
	<li>Dodać 1 μl przeciwciała anty-CD31-biotyny na każde 1 x 107 zliczonych komórek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze (około 5 μl na 3 trzustki).</li>
	<li>Dodać 20 μl mikrogranulek antybiotyny i inkubować przez 40 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze probówkowym.</li>
	<li>Ustaw stojak magnetyczny z uchwytem separatora kolumn i przyłóż kolumnę. Wyrównać kolumnę z 3 ml buforu do przemywania się.</li>
	<li>Dodać próbkę do kolumny i przepłukać łącznie 9 ml buforu do przemywania . 
	UWAGA: Jeśli stężenie komórek jest wysokie, rozcieńczyć komórki dodatkowymi 2 ml buforu do przemywania w osobnej probówce. Dodawać jednorazowo 1 ml próbki do kolumny, aby zapobiec jej zatkaniu.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę z uchwytu kolumny i umieść w probówce o pojemności 15 ml. Dodać 5 ml buforu do przemywania do kolumny. Za pomocą tłoka wepchnąć komórki w kolumnie i zebrać elucję (która zawiera wzbogacone EC).</li>
	<li>Odwirować frakcję przepływową i elucję/EC przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Policz komórki i zmierz żywotność, jak w kroku 3.13.</li>
	<li>Walidacja wzbogacenia EC za pomocą qPCR frakcji przepływowych i EC. Użyj NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) jako ogólnego markera dla komórek endokrynnych oraz cząsteczki adhezji płytek krwi i komórek śródbłonka (Pecam1) jako markera dla EC33. Użyj 36B4 (Rplp0, kwaśna fosfoproteina rybosomalna p0) jako wewnętrzna kontrola normalizacji ekspresji genów. 
	UWAGA: Na tym etapie pobrane próbki można wykorzystać do analiz białek lub RNA.</li>
</ol>
5. Hodowla PEC
<ol>
	<li>Przygotować podłoże M199. Suplement M199 o średnim do końcowego stężeniu 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,1% penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Pokryj 60 mm płytkę do hodowli komórkowej kolagenem typu I (1 mg/ml w 0,1 M kwasie octowym) i pozostaw na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń kolagen typu I i dwukrotnie przepłucz płytkę 1X PBS. Dodać 2 ml przygotowanej pożywki M199 i umieścić płytkę do hodowli komórkowych w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2, 37 °C) na 5 minut.</li>
	<li>Po wyizolowaniu komórek dodaj izolowane komórki do wstępnie podgrzanej płytki do hodowli komórkowej M199. Utrzymuj komórki w warunkach hodowlanych przez około 14 dni i zmieniaj pożywkę co 2-3 dni.</li>
</ol>

Streamlining Mouse Pancreatic Endothelial Cell Extraction for Disease Studies

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym artykule przedstawiono protokół wzbogacania i izolacji pEC. Podobnie jak poprzednie protokoły izolacji EC z innych tkanek lub narządów, protokół ten składa się z trzech głównych procesów, a mianowicie dysocjacji fizycznej, trawienia enzymatycznego i wzbogacania EC w oparciu o przeciwciała. Aby sprostać wyjątkowym wyzwaniom związanym z przetwarzaniem trzustki, wprowadziliśmy kilka kluczowych adaptacji i krytycznych kroków w naszym protokole: 1) delikatne jednoetapowe trawienie kolagenazy z krótkim czasem inkubacji, 2) suplementacja wyższym stężeniem DNazy i inhibitora trypsyny w celu zminimalizowania zanieczyszczenia DNA i trawienia enzymów endogennych, które mogą zakłócać wiązanie przeciwciał, a tym samym zmniejszać wzbogacenie i żywotność EC oraz 3) zliczanie komórek po etapie trawienia w celu dostosowania do próbki dodaje się dużo przeciwciał w celu optymalizacji wzbogacenia EC. W procesie optymalizacji tego protokołu przetestowaliśmy inne enzymy stosowane w poprzednich badaniach, np. trypsynę28, kolagenazę typu IV31 oraz inne temperatury trawienia, np. 4°C, a także różne czasy inkubacji (tab. 1). Stwierdziliśmy, że kolagenaza typu I, 20 minut, w temperaturze 37 °C jest optymalnym warunkiem izolacji pEC myszy i użyliśmy jej tutaj. Podczas gdy dodanie antykoagulantu podczas perfuzji może poprawić ogólną żywotność komórek, typowy środek przeciwzakrzepowy, np. EDTA lub heparyna, może zakłócać aktywność niektórych enzymów, np. kolagenazy do dysocjacji komórek i odwrotnej transkryptazy stosowanej w qPCR. Aby zapobiec nieoczekiwanemu/niepożądanemu działaniu tych antykoagulantów, stosuje się PBS (bez Ca2+ i Mg2 +) do perfuzji.
Skupiliśmy się na opracowaniu protokołu wzbogacania populacji EC z całej trzustki myszy, który obejmowałby zarówno EC wewnątrz wysp trzustkowych, jak i EC w tkankach zewnątrzwydzielniczych, co skutkowałoby wyższą wydajnością. W obecnym protokole połączyliśmy razem 3 zwierzęta na etapie dysocjacji i średnio uzyskaliśmy zawiesinę jednokomórkową z około 2,0 x 106 żywotnymi komórkami. Przetestowaliśmy również próbki z pojedynczej trzustki myszy i udało nam się uzyskać około 750 000 komórek. Warto zauważyć, że przy dostosowywaniu się do przetwarzania pojedynczego zwierzęcia należy użyć mniej roztworu dysocjacyjnego (3 ml dysocjacji na trzustkę). Kluczowym krokiem w protokole jest całkowite przycięcie i usunięcie wszelkich resztek tłuszczu, które są przyczepione do trzustki (ryc. 3B). Zanieczyszczenie tkanki tłuszczowej podczas trawienia kolagenazy będzie zakłócać etap dysocjacji pojedynczej komórki trzustki, zmniejszając żywotność komórek w kolejnych etapach wzbogacania38. Ponadto, aby wzbogacić pEC, użyliśmy markera powierzchniowego pan-EC, PECAM1/CD31. Stosując przeciwciało PECAM1/CD31, byliśmy w stanie znacznie wzbogacić frakcje EC, co widać w analizie ekspresji genów. Opracowując ten protokół, przetestowaliśmy również użyteczność przeciwciała CD144, które jest również powszechnie stosowane do izolowania EC13. Nie udało nam się jednak wzbogacić wskaźników pEC (dane nie pokazane). Co ciekawe, barwienie immunofluorescencyjne ujawniło, że podczas gdy CD31 ulega ekspresji we wszystkich EC w tkance trzustki, przeciwciało CD144 wydaje się barwić tylko EC wewnątrz wysp trzustkowych (Figura 5A). Ponadto przeanalizowaliśmy publicznie dostępne dane sekwencyjne RNA pojedynczej komórki z wysepek wyizolowanych od myszy C57BL / 6 (GSE128565)37 i stwierdziliśmy, że około 50% EC wysepek wykazuje ekspresję zarówno Cdh5 (VE-Cad), jak i Pecam1, ale reszta EC wysepek wyraża tylko Cdh5 lub Pecam1 (Figura 5B). W związku z tym spekulujemy, że przeciwciała CD31 są bardziej odpowiednie do izolacji pEC, a użyteczność przeciwciała CD144 w tym celu uzasadnia przyszłe badania. Ponadto dostępne na rynku są anty-CD31 sprzężone z kulkami magnetycznymi, które mogą uprościć dwuetapowy etap wiązania przeciwciała do pojedynczego etapu.
Jak wykazano, przeprowadziliśmy qPCR, immunoblotting, cytometrię przepływową i barwienie immunofluorescencyjne w celu walidacji wyizolowanej frakcji EC. Można sobie wyobrazić, że frakcje te można poddać innym testom, takim jak sekwencja (sc)RNA i spektrometria mas. Ograniczeniem tego protokołu jest to, że nie byliśmy w stanie osiągnąć solidnej subkultury i przeprowadzić testów funkcjonalnych. Biorąc pod uwagę, że subkultura izolowanych EC myszy okazała się wyzwaniem, jest to obszar wymagający przyszłych wysiłków. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu może być wprowadzenie dużego antygenu T, który został wykorzystany do unieśmiertelnienia komórek pierwotnych39.
Ostatnie postępy i zastosowanie sekwencjonowania scRNA umożliwiły profilowanie komórek trzustki w wysokiej rozdzielczości40 , a zwłaszcza komórek wysp trzustkowych41. Jednak większość istniejących badań koncentrowała się na populacjach komórek endokrynnych i wykorzystywała protokoły dysocjacji tkanek, które nie zatrzymują skutecznie EC. W rezultacie frakcje EC często stają się rzadkie, stanowiąc zaledwie 3%-5% w całych przechwyconych populacjach komórek 42,43,44. Niedawny protokół wykorzystuje dwuetapowe trawienie i dezaktywację enzymatyczną oraz etap sortowania komórek aktywowany fluorescencyjnie i pobiera EC u 12% całej populacji komórek trzustki45. Uzupełnienie tego protokołu, nasz protokół zapewnia uproszczony przepływ pracy, który może być bardziej opłacalny i mniej wymagający technicznie, jeśli ECs są przedmiotem badania. Chociaż protokół ten został przetestowany tylko na trzustce myszy, można go zwiększyć i dostosować do izolowania EC od innych organizmów, w tym trzustki ludzkiej.

Trzustka, klucz do kontroli metabolicznej i homeostazy, jest wysoce unaczynionym organem. Trzustka pełni zarówno funkcje hormonalne, jak i zewnątrzwydzielnicze, kontrolując odpowiednio regulację poziomu glukozy we krwi i enzymów trawiennych. Te dwa przedziały są połączone ze sobą rozległą siecią naczyń krwionośnych trzustki, ułatwiając wymianę i transport tlenu, hormonów i enzymów. Co najważniejsze, ta gęsta sieć naczyń włosowatych przenika do wysepki Langerhansa, skupiska komórek regulujących hormony w trzustce odpowiedzialnych za jej funkcję endokrynną, składającej się z komórek alfa (α) wydzielających glukagon, komórek beta (β) wydzielających insulinę i komórek delta (δ) wydzielających somatostatynę1,2. Chociaż wysepki stanowią tylko 1-2% masy trzustki, otrzymują 20% całkowitego przepływu krwi3, co podkreśla znaczenie unaczynienia wysp trzustkowych. Naczynia włosowate trzustki składają się głównie z wysoce fenestrowanych komórek śródbłonka (EC), które są otoczone perycytami ściennymi. Te kapilarne EC odgrywają istotną rolę w rozwoju, dojrzewaniu i (dys)funkcji wysp trzustkowych oraz tworzą intymne połączenia z różnymi komórkami endo- i zewnątrzwydzielniczymi4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Dysfunkcję śródbłonka zaobserwowano zarówno w cukrzycy typu 1, jak i typu 2, najczęstszych stanach spowodowanych dysfunkcją wysp trzustkowych5,6. Zarówno gęstość mikronaczyniowa wysp trzustkowych, jak i morfologia mogą być zmienione w diabetes7. Co więcej, rak trzustki, wysoce agresywny nowotwór, który może również objawiać się cukrzycą, charakteryzuje się dużą gęstością mikronaczyniową ze słabą perfuzją8. Biorąc pod uwagę kluczowe strukturalne i funkcjonalne role EC zarówno w normalnej, jak i chorej tkance trzustki, istnieje istotna potrzeba zbadania PEC w rozwoju, fizjologii i patologii, aby odkryć mechanizmy, które napędzają zdrowie lub choroby.
Opracowano liczne protokoły do izolacji EC z różnych mysich (np. brain9,10, lung11, heart12, wątroba13, mięśnie szkieletowe14, oraz tkanki tłuszczowe15) i ludzkie (np. brain16, trzewna tkanka tłuszczowa17,18, nerwy obwodowe19, lung20,21,22, oraz tkanki tętnicy krezkowej23). Protokoły te zazwyczaj obejmują stosowanie trawienia enzymatycznego (np. przez kolagenazę, trypsinę24, dispase24,25 i liberase26), po którym następuje etap wzbogacania oparty na przeciwciałach. Co więcej, protokoły te zwykle opierają się na wydłużonym czasie trawienia w wysokich stężeniach enzymów z energicznym mieszaniem w temperaturze 37 °C (Tabela 1). Ze względu na unikalne cechy trzustki, w tym to, że znajduje się w niej mnóstwo endogennych enzymów trawiennych, te istniejące protokoły nie mogą być bezpośrednio stosowane do izolowania pEC. Po pierwsze, skład macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) trzustki różni się od składu innych tkanek. Chociaż kolagenaza jest powszechnie stosowana do izolacji EC, istnieje wiele podtypów o różnych zdolnościach dysocjacji specyficznych dla tkanki, co wymaga optymalizacji. Po drugie, co ma kluczowe znaczenie dla izolacji pEC, uwalnianie i aktywacja endogennych enzymów trzustkowych może znacznie utrudnić proces izolacji. W tym celu należy zachować ostrożność, aby zminimalizować pękanie zewnątrzwydzielniczych komórek groniastych (główne źródło zymogenów, proteaz i RNazy27), które mogą wywołać dalsze uszkodzenia komórek i skutkować niską żywotnością komórek oraz ogólnie wpływać na regenerację27,28,29.
Aby sprostać tym wyzwaniom, dostosowaliśmy metody z istniejących protokołów izolacji EC i stworzyliśmy nowy protokół odpowiedni do izolacji EC od trzustki myszy. W szczególności opisujemy tutaj przepływ pracy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) z wykorzystaniem kolagenazy typu I (zwykle wdrażanej do izolacji EC płuc), niższych temperatur trawienia i braku pobudzenia (w celu zapobiegania aktywacji zymogenów trzustkowych) oraz DNase30,31,32 (w celu zapobiegania apoptozie wywołanej przez DNA i poprawie żywotności komórek oraz przeciwciała dla CD3133 (PECAM1, marker pan-EC). Opisany protokół tworzy populacje EC wyizolowane z trzustki myszy, które można wykorzystać do profilowania ekspresji genów i testów białek.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml eppendorf</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm naczynie</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>25G igły</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q712-03-AA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL eppendorf</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14282300</tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m sitko</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD31-biotyna</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>REA784</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca albumina poddawana szokowi cieplnemu</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu 1, ze skóry cielęcej</td><td>Sigma Aldrich& nbsp;</td><td>C9791</td><td>Odczynnik przyłączeniowy w protokole</td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ 1&nbsp;</td><td>Worthington Bio</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>D1306</td><td>immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>jednorazowe bezpieczne skalpele</td><td>Myco Instrumentation</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>260913&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Ca2+,Mg2+)</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14080055</tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Inkubator</td><td></td> Fisher 10437028 <td></td></tr><tr><td></td> utrzymywany w temperaturze 37 stopni Celsjusza;<td></td><td></td><td> C 5% CO2</td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand z separatorem QuadroMACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Średni 199</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki anty-biotyna</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Do oceny morfologii komórek</td></tr><tr><td>Woda klasy molekularnej</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Wytrząsarka orbitalna&nbsp;</td><td>Przeciwciało Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31)</td><td>Abcam</td><td>ab56299</td><td>immunofluorescencja</td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31)</td><td>Przeciwciało R& D Systems</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X) (bez Ca2+, bez Mg2+)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507-XB</td><td></td></tr><tr><td>Primer 36B4 Mysz do przodu</td><td>IDT</td><td></td><td>AGATTCGGGATATGCTGTTGGC</td></tr><tr><td>Primer 36B4 Mysz Revese&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Mysz do przodu&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCAGAATCCTCTTCCATGC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Odwrócona mysz</td><td>IDT</td><td></td><td>AAACCTCCTGCAAGCAAATG</td></tr><tr><td>Primer Nkx6.1 Odwrócona mysz&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>CACGGCGGACTCTGCATCACTC</td></tr><tr><td>Primer Nxk6.1 Mysz do przodu</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCTACTTTAGCCCCAGCG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Mysz do przodu</td><td>IDT</td><td></td><td>ACGCTGGTGCTCTATGCAAG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Mysz odwrócona IDT</td><td></td><td></td><td>TCAGTTGCTGCCCATTCATCA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 12" długie kleszcze</td><td>FST</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne drobne kleszczyki</td><td>FST</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne drobne nożyczki</td><td>FST</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych 2cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109886001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin Przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>immunofluorescencja</td></tr><tr>Kąpiel <td></td><td></td><td></td><td>wodna</td></tr></tbody></table>

izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

Trzustka jest ważnym organem do utrzymania równowagi metabolicznej w organizmie, częściowo ze względu na produkcję hormonów metabolicznych, takich jak insulina i glukagon, a także enzymów trawiennych. Trzustka jest również silnie unaczynionym narządem, co ułatwia skomplikowana sieć naczyń włosowatych trzustki. Ta rozległa sieć naczyń włosowatych składa się z wysoce fenestrowanych komórek śródbłonka (EC), ważnych dla rozwoju i funkcji trzustki. W związku z tym dysfunkcja EC może przyczyniać się do dysfunkcji trzustki w chorobach takich jak cukrzyca i rak. W związku z tym badania nad funkcją EC trzustki (pEC) są ważne nie tylko dla zrozumienia biologii trzustki, ale także dla rozwoju jej patologii. Modele mysie są cennymi narzędziami do badania chorób metabolicznych i sercowo-naczyniowych. Nie ustalono jednak protokołu, który opisywałby wystarczająco szczegółowo izolację mysich PEC ze względu na stosunkowo małą populację EC i obfitość enzymów trawiennych potencjalnie uwalnianych z tkanki groniastej, które mogą prowadzić do uszkodzenia komórek, a tym samym do niskiej wydajności. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy protokół wzbogacania i odzyskiwania mysich pEC, łączący delikatną dysocjację fizyczną i chemiczną oraz selekcję za pośrednictwem przeciwciał. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia solidną metodę ekstrakcji nienaruszonych i żywotnych EC z całej trzustki myszy. Protokół ten jest odpowiedni dla wielu dalszych testów i może być stosowany do różnych modeli myszy.

Postępując zgodnie z tym protokołem, otrzymuje się około 2 x 106 żywe komórki można uzyskać poprzez połączenie tkanek z 3 trzustek mysich, a z pojedynczej trzustki mysiej uzyskuje się 750 000 komórek. Aby potwierdzić wzbogacenie frakcji komórek śródbłonka (EC), przeprowadzono następujące analizy: 1) ilościową PCR: w porównaniu z próbkami z przelywu (FT) (tj. frakcjami niezmieszanymi z przeciwciałami anty-CD31), frakcje EC wykazywały znacznie wyższe poziomy Pecam1 (kodujące CD31) i Kdr (kodujące VEGFR2), dwa geny markerowe EC33, a niższy poziom homeoboksu NK6.1 (Nkx6.1), czynnik transkrypcyjny w komórkach endokrynnych trzustki (Rysunek 4A); 2) western blotting: próbki wzbogacone w EC z trzech preparacji (pEC-1-3) wykazały silne sygnały CD31 o oczekiwanej wielkości (~130 kDa). W porównaniu z nimi, próbki wejściowe (input) oraz frakcje przepływowe (FT) wykazały minimalny sygnał CD31. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano lizaty komórek MS1, linii komórkowej pEC, które również wykazały silny sygnał CD31 (Rycina 4B); 3) barwienie błękitem trypanu: stwierdziliśmy, że żywotność wyizolowanych komórek wynosiła około 50% (Rysunek 4C); 4) cytometria przepływowa zgodnie z opublikowanym protokołem15 poprzez bramkowanie populacji żywych komórek (Rycina 4D), stwierdzono, że odsetek komórek CD31+ wynosił 88%, a odsetek komórek TdTomato+ wynosił 76%. Należy zauważyć, że większość wyizolowanych komórek wykazuje koekspresję CD31 i TdTomato (Rycina 4E). Jako kontrole negatywne, niebarwione komórki MS1 oraz komórki MS1 inkubowane z IgG nie wykazały obecności żywych komórek znakowanych CD31. Jako kontrola pozytywna, tj. komórki MS1 barwione pod kątem CD31, wykazały blisko 100% żywych komórek CD31+ (Rycina 4F). Hodowaliśmy również wyizolowane komórki, a następnie przeprowadziliśmy barwienie immunofluorescencyjne białka PECAM1 zgodnie z opublikowanym protokołem36i obrazowano TdTomato, co wykazało silne sygnały obu markerów w wyizolowanych komórkach, sugerując obecność komórek śródbłonka (Rycina 4G).
<img alt="Schemat komórek śródbłonka trzustki przedstawiający strukturę i połączenia komórek śródbłonka wewnątrz wysepek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ilustracja unaczynienia trzustki i wysepek trzustkowych. Przedstawienie graficzne komórek śródbłonka (ECs) trzustki oraz komórek śródbłonka wewnątrz wysepek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat przygotowania próbek z trzustki do analizy pojedynczych komórek; wirowanie, CD31-biotyna, liczenie komórek, analiza RNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przegląd schematu postępowania. 1) Wycięcie trzustki, 2) trawienie mechaniczne, 3) inkubacja z enzymem, 4) wirowanie, 5a) usunięcie nadsączu i 5b) wtórne trawienie osadu komórkowego kolagenazą z tryturacją w celu filtracji w punkcie 6), 7) i 8) resuspensja osadu i wiązanie przeciwciał, 9) inkubacja z mikrokulkami, 10) wzbogacanie na kolumnie MACS, 11) liczenie komórek w celu oceny żywotności oraz 12) analiza końcowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces pobierania i izolacji trzustki; przygotowanie tkanki do badań, krok po kroku wyniki eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Etapy obróbki tkanki. Obrazy (A) jamy brzusznej, (B) wyizolowanej trzustki myszy oraz (C) przyciętej trzustki myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza ekspresji genów, cytometria przepływowa i detekcja białek w komórkach śródbłonka; wykresy i mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Walidacja wyizolowanych frakcji EC z trzustki myszy. (A) qPCR próbek FT i wzbogaconej frakcji EC z CD31 w celu oceny stopnia wzbogacenia. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) oraz Nkx6.1 (czynnik transkrypcyjny specyficzny dla komórek β trzustki)33. * oznacza p &lt;0.05 w porównaniu do FT na podstawie testów t . n = 3-4 połączone próbki, każda składająca się z 3 myszy. (B) Western blotting CD31. pEC-1-3 oznaczają wzbogacone EC z 3 oddzielnych połączonych próbek mysich. Na każdą ścieżkę naniesiono lizaty komórkowe o masie 30 mg, a następnie wykonano barwienie Ponceau S. (C) Liczenie komórek i barwienie błękitem trypanu wzbogaconych pEC w celu oceny żywotności. (D) Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej dla mysich pEC barwionych 4', 6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) i przeciwciałem CD31. (E) Histogramy cytometrii przepływowej dla niebarwionych MS1 (lewa góra), MS1 barwionych wtórnym przeciwciałem AlexaFluor-488 (kontrola IgG; prawa góra), MS1 barwionych CD31 (lewa dół) oraz wyizolowanych mysich pEC barwionych CD31 (prawa dół). (F) Procent żywych komórek określony za pomocą cytometrii przepływowej. (G) Immunofluorescencja ekspresji CD31 (zielony) z przeciwbarwieniem DAPI (niebieski) i endogennym fluorescencyjnym reporterem TdTomato (czerwony). Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja komórek wykazujących CD31, CD144, DAPI; wykresy UMAP dla analizy Cdh5, Pecam1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Specyficzność CD31 i CD144 w trzustce myszy. (A) Immunofluorescencja trzustki myszy z CD31 (magenta) i CD144 (cyjan) oraz przeciwbarwieniem DAPI. Obraz zarejestrowany przy użyciu obiektywu 10x pod szerokopolowym odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Pasek skali = 100 µm. Linie przerywane wyznaczają obszar wysepki. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) przedstawiający ekspresję Cdh5 i Pecam1 w komórkach śródbłonka (EC) wysepek myszy C57BL6 wykrytą za pomocą scRNA-seq (GSE128565)37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Enzym</td>
			<td>Zastosowanie</td>
			<td>Temperatura i czas</td>
			<td>Bibliografia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagenaza I</td>
			<td>Dysocjacja pojedynczych komórek, wzbogacanie frakcji komórek śródbłonkowych całej trzustki</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>Niniejszy protokół</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kollagenaza IV</td>
			<td>Izolacja wysepek oraz dysocjacja nieenzymatyczna</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagenaza + trypsyna</td>
			<td>Badanie komórek przewodowych w trzustce myszy</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagenaza B</td>
			<td>Zawiesina pojedynczych komórek trzustki</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagenaza NBI</td>
			<td>Izolacja wysepek trzustkowych</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kollagenaza P</td>
			<td>Żywa zawiesina komórek acynarnych</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagenaza XI</td>
			<td>Izolacja wysepek trzustkowych</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyspaza</td>
			<td>zawiesina pojedynczych komórek</td>
			<td>37 °C, 45 min</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>zawiesina pojedynczych komórek</td>
			<td>37 °C, 10 min</td>
			<td>25, 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsyna</td>
			<td>Dysocjacja pojedynczych komórek, cała trzustka</td>
			<td>4 °C, przez noc</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Podsumowanie różnych protokołów stosowanych do obróbki próbek trzustki myszy.

Ten protokół opisuje izolację komórek śródbłonka myszy z całej trzustki.

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and ...

Celem tych badań jest pogłębienie naszej wiedzy na temat roli unaczynienia trzustki zarówno w prawidłowej biologii trzustki, jak i w rozwoju choroby. Poprzez skuteczne wzbogacenie frakcji śródbłonka, staramy się zidentyfikować specyficzne szlaki w układzie naczyniowym, które regulują funkcje trzustki, które mogą być potencjalnie ukierunkowane na przywrócenie i poprawę funkcji trzustki w warunkach chorobowych. W ostatnim czasie coraz większy nacisk kładzie się na rolę dysfunkcji komórek śródbłonka w patologiach trzustki.Identyfikacja heterogeniczności populacji komórek śródbłonka w trzustce pozwoliła zrozumieć, w jaki sposób interakcje między śródbłonkiem trzustki dążą do chorób lub chronią przed nimi. Podejścia omiczne, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki lub pojedynczego jądra, proteomika i genomika, są wykorzystywane do badania trzustki na poziomie komórkowym. Aby uzyskać wgląd na poziomie tkankowym lub przestrzennym, wdrażane są nowe platformy wykorzystujące bezstronne i oparte na sondach podejścia, takie jak Visium i Xenium.W tym protokole opisujemy technikę łagodnej dysocjacji, która minimalizuje endogenne enzymy trzustkowe przed zmniejszeniem żywotności komórek oraz procedurę magnetycznego sortowania komórek w celu selektywnego wzbogacenia komórek śródbłonka. Strategia dysocjacji i wzbogacania zawarta w naszym protokole umożliwi dalsze zrozumienie zarówno markerów powierzchniowych komórek, jak i transkryptomu komórek śródbłonka trzustki, który był wcześniej badany ze względu na ograniczenia techniczne. Aby rozpocząć, umieść uśpioną mysz na stole operacyjnym.Rozciągnij kończyny myszy i zabezpiecz je szpilkami. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj małe nacięcie w linii środkowej przez skórę i otrzewną od dolnej części brzucha i rozciągnij się w kierunku klatki piersiowej. Przetnij przeponę i podnieś klatkę piersiową, aby odsłonić serce.Wprowadzić igłę o rozmiarze od 25 do 30 G podłączoną do strzykawki zawierającej lodowato zimny sterylny PBS do lewej komory serca. Wykonaj perfuzję serca w tempie od pięciu do 10 mililitrów na minutę i zatrzymaj się po wstrzyknięciu 10 mililitrów. Następnie za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy ostrożnie usuń trzustkę.Przenieś trzustkę do 50-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów lodowatego PBS wraz z inhibitorem trypsyny i umieść rurkę na lodzie. Na początek uzyskaj mysią trzustkę na szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety ostrożnie usuń nadmiar tkanki.Przenieś przyciętą trzustkę do pięciomililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr roztworu dysocjacyjnego. Nożyczkami do preparowania zmiel tkanki trzustki na drobne kawałki, trzymając rurkę na lodzie. Przenieś lizat do 50-mililitrowej probówki umieszczonej na lodzie.Dodaj dwa mililitry roztworu kolagenazy do pięciomililitrowej probówki, aby usunąć resztki tkanki trzustki i przenieś ją do 50-mililitrowej probówki. Inkubować probówkę w łaźni wodnej zahartowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Umieść probówkę z homogenatem tkankowym na lodzie i pozwól jej osiąść grawitacyjnie.Następnie przepuść supernatant przez filtr o średnicy 70 mikrometrów i dodaj pięć mililitrów roztworu zatrzymującego dysocjację. Za pomocą igły o rozmiarze 27 rozetrzyj pozostały granulat dodatkowym mililitrem roztworu dysocjacyjnego i przepuść go przez filtr jak poprzednio. Wirować zawiesinę komórkową o sile 300 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do płukania.Inkubować jeden razy 10 do mocy siedmiu komórek z jednym mikrolitrem przeciwciała anty-CD31 biotyny na rotatorze. Dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek antybiotyny i inkubuj jeszcze przez 40 minut. Następnie ustaw stojak magnetyczny z uchwytem separatora kolumn i przyłóż kolumnę.Po wyrównaniu kolumny dodać do niej próbkę i przemyć łącznie dziewięcioma mililitrami buforu do przemywania wodą. Wyjmij kolumnę z uchwytu i umieść ją w 15-mililitrowej tubie. Dodaj pięć mililitrów buforu do płukania do kolumny.Za pomocą tłoka dociśnij komórki w kolumnie, aby zebrać elucję zawierającą komórki śródbłonka. Na koniec odwirować frakcje przepływowe i elucyjne. Po ponownym zawieszeniu policz komórki i zmierz żywotność.Ilościowa analiza PCR w celu walidacji wzbogacenia komórek śródbłonka wykazała, że wzbogacone frakcje miały znacznie wyższe poziomy genów markerowych, Pecam1 i Kdr w porównaniu z próbkami przepływowymi. We wzbogaconych frakcjach zaobserwowano niższy poziom NK6 homeobox 1, czynnika transkrypcyjnego w komórkach endokrynnych trzustki. Western blot wykazał silne sygnały CD31 w oczekiwanej wielkości, co dodatkowo potwierdza wzbogacenie komórek śródbłonka we frakcje.

isolation-of-mouse-pancreatic-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

W tej publikacji opisujemy szybką i wygodną procedurę izolacji i hodowli pierwotnych komórek groniastych trzustki z mysiej trzustki. Metoda ta stanowi cenne podejście do badania fizjologii świeżych, pierwotnych, normalnych/nieprzekształconych zewnątrzwydzielniczych komórek trzustki.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek groniastych trzustki myszy

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek wysp trzustkowych myszy w celu badania indukcji ROS przez ksenobiotyki w celu zidentyfikowania potencjalnych cukrzycopochodnych ksenobiotycznych substancji chemicznych.

Badania przesiewowe oparte na komórkach wysp trzustkowych trzustki pod kątem cukrzycopochodnych substancji chemicznych

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Naucz się izolować komórki śródbłonka trzustki myszy przy użyciu delikatnej dysocjacji i sortowania magnetycznego. Ta metoda umożliwia badanie heterogeniczności komórek śródbłonka i ich roli w chorobach trzustki.

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

Przeglądaj więcej filmów