Diagnostyka oparta na CRISPR w miejscu opieki nad pacjentem z wstępnie zmieszanymi i liofilizowanymi odczynnikami
16 sierpnia 2024
Tutaj prezentujemy krok po kroku przygotowanie premiksowanej, liofilizowanej amplifikacji izotermicznej opartej na rekombinazie i reakcji opartych na Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), które mogą być wykorzystane do wykrywania biomarkerów kwasów nukleinowych patogenów chorób zakaźnych lub innych markerów genetycznych.
Pracujemy nad testem przyłóżkowym do wykrywania materiału genetycznego chorób zakaźnych. To wykrywanie wykorzystuje izotermiczną amplifikację kwasów nukleinowych i detekcję opartą na CRISPR. Dzięki wysokiej dokładności osmotycznej, podobnej do PTR, mogą wykrywać niewielkie różnice w sekwencji, w tym polimorfizm pojedynczego nukleotydu, i mogą być wielostronicowe.
CRISPR Reakcje osmotyczne zawierają wiele składników i efektów i są trudne do przeprowadzenia w miejscu opieki, ponieważ osmotyka oparta na CRISPR jest bardzo wrażliwa. Istnieje ryzyko przeniesienia zanieczyszczenia, co może prowadzić do fałszywych wyników. Na szczęście problem ten można załagodzić, jeśli uprościmy procedury reakcji.
Oferujemy łatwą w użyciu metodę wykrywania patogenów chorobowych i markerów genetycznych przy użyciu kombinacji amplifikacji izotermicznej i odczynników na bazie CRISPR. Środki te są proste w przechowywaniu i użyciu. Oferujemy również wskazówki dotyczące rozwiązywania typowych problemów podczas korzystania z tych metod i agentów, ułatwiając ludziom korzystanie z nich.
W protokole zastosowano tutaj odczynniki liofilizowane, które ułatwiają transport i przechowywanie. Liofilizowane odczynniki można łatwo uwodnić w punktach użycia i zachować wysoką skuteczność amplifikacji i wykrywania. Mamy nadzieję, że uda nam się zastosować technologie diagnostyczne CRISPR do wykrywania endemicznych i pojawiających się chorób zakaźnych.
Jeśli ten test może być rutynowo i prawidłowo wykonywany w miejscu opieki, może to dostarczyć informacji na temat opcji leczenia przeciwwirusowego i antybiotykowego, potencjalnie uratować życie, zmniejszyć nadużywanie leków i rozwój oporności. Na początek inkubuj roztwór trójglicyny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wyjmij trzy probówki z granulkami RPA z zamrażarki.
Delikatnie postukaj rurkami paskowymi o stół laboratoryjny, aby usunąć białe granulki. Przenieś wszystkie trzy granulki do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki A.Odpipetuj 25 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, aby przepłukać pozostały proszek RPA w probówkach paskowych. Przenieś roztwór płuczący do nowej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki B. następnie dodaj 10 mikrolitrów 0,57 molowego roztworu triglicyny i 10 mikrolitrów mieszanki startera do głównej probówki B. Po wirowaniu i odwirowaniu probówki umieść ją na lodzie.
Następnie dodaj 28,4 mikrolitra pięciokrotnego buforu RPA do głównej probówki B. Dokładnie wymieszaj, mocno stukając lub potrząsając kilka razy. Przenieś granulki zebrane w probówce A do głównej probówki mieszającej B i odwróć probówkę lub kilkakrotnie postukaj palcem w spód probówki, aby wymieszać. Obserwuj, czy roztwór wydaje się jednorodny i jednofazowy.
Umieść probówkę na lodzie, a następnie dodaj 0,71 mikrolitra odwrotnej transkryptazy i 2,84 mikrolitra RNazy H do głównej probówki mieszającej. Delikatnie postukaj lub odwróć rurkę miksera głównego wiele razy w górę iw dół. Krótko odkręć rurkę przed umieszczeniem jej na lodzie.
Teraz podlej 8,4 mikrolitra roztworu mieszanki głównej do 10 wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 1,5 mililitra i umieść probówki na lodzie. Po porcjowaniu umieść probówki w metalowym stojaku zanurzonym w ciekłym azocie, aby przygotować je do liofilizacji. W liofilizatorze sprawdź temperaturę kolektora i półki.
Teraz przykryj otwarte probówki w metalowym stojaku arkuszem białego papieru do czyszczenia. Umieść metalowy stojak wraz z otwartymi rurkami na półce liofilizatora i zamknij drzwiczki półki. Następnie wybierz żądany program i naciśnij start.
Po 30 minutach drugiego etapu suszenia naciśnij stop. Zwolnij ciśnienie, otwierając zawór spustowy podciśnienia. Po wyjęciu stojaka z półki natychmiast zakryj tuby.
Na początek inkubuj roztwór trójglicyny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wyjmij trzy probówki z granulkami RPA z zamrażarki. Delikatnie postukaj rurkami paskowymi o stół laboratoryjny, aby usunąć białe granulki.
Przenieś wszystkie trzy granulki do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki A.Odpipetuj 25 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, aby przepłukać pozostały proszek RPA w probówkach paskowych. Przenieś roztwór płuczący do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki B, a następnie dodaj 10 mikrolitrów 0,57 molowego roztworu triglicyny i 10 mikrolitrów mieszanki starterów do głównej probówki B. Po wirowaniu i odwirowaniu probówki umieść ją na lodzie. Następnie dodaj 28,4 mikrolitra pięciokrotnego buforu RPA do głównej probówki B. Dokładnie wymieszaj, mocno stukając lub potrząsając kilka razy.
Przenieś granulki zebrane w probówce A do głównej probówki mieszającej B i odwróć probówkę lub kilkakrotnie postukaj palcem w spód probówki, aby wymieszać. Obserwuj, czy roztwór wydaje się jednorodny i jednofazowy. Umieść probówkę na lodzie, a następnie dodaj 0,71 mikrolitra odwrotnej transkryptazy i 2,84 mikrolitra RNazy H do głównej probówki mieszającej.
Delikatnie postukaj lub odwróć rurkę miksera głównego wiele razy w górę iw dół. Krótko odkręć rurkę przed umieszczeniem jej na lodzie. Teraz podlej 8,4 mikrolitra roztworu mieszanki głównej do 10 wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 1,5 mililitra i umieść probówki na lodzie.
Po porcjowaniu umieść probówki w metalowym stojaku zanurzonym w ciekłym azocie, aby przygotować je do liofilizacji. W liofilizatorze sprawdź temperaturę kolektora i półki. Teraz przykryj otwarte probówki w metalowym stojaku arkuszem białego papieru do czyszczenia.
Umieść metalowy stojak wraz z otwartymi probówkami na półce liofilizatora i zamknij drzwiczki półki, a następnie wybierz żądany program i naciśnij start. Po 30 minutach drugiego etapu suszenia naciśnij stop. Zwolnij ciśnienie, otwierając zawór spustowy podciśnienia Po wyjęciu stojaka z półki natychmiast zakryj rurki.
Na początek podgrzej inkubator termiczny w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Dodaj jeden mikrolitr mieszaniny octanu magnezu i roztworu octanu potasu na bok probówki zawierającej liofilizowany, wstępnie zmieszany granulat RT-RPA. Zawiesić osad w 12,4 mikrolitrach próbki RNA.
Aby zainicjować reakcję RT-RPA, należy krótko odwirować dodany roztwór za pomocą mini wirówki z odwirowaniem w temperaturze pokojowej przez trzy sekundy. Ostrożnie postukaj w tubkę, aby dokładnie wymieszać zawartość i ponownie odwirować. Inkubować reakcję w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 60 minut w podgrzewanym inkubatorze z wytrząsaniem termicznym
.Po zakończeniu reakcji wyjmij probówki reakcyjne i umieść je na lodzie przed przystąpieniem do wykrywania CRISPR/Cas. W celu wykrycia kwasów nukleinowych włącz czytnik mikropłytek fluorescencyjnych. Ustaw i rozgrzej czytnik mikropłytek do 37 stopni Celsjusza i wybierz program, a następnie umieść 384-dołkową płytkę na lodzie.
Aby ponownie zawiesić liofilizowaną wstępnie zmieszaną reakcję wykrywania CRISPR/Cas, dodaj 17 mikrolitrów ośmiomilimolowego roztworu chlorku magnezu. Wymieszaj, ostrożnie stukając w rurkę. Krótko odkręć przez trzy sekundy przed umieszczeniem rurki na lodzie.
Przenieść 18 mikrolitrów ponownie zawieszonej mieszaniny reakcyjnej do każdej studzienki wstępnie schłodzonej 384-dołkowej płytki na lodzie. Do każdej reakcji dobrze dodać dwa mikrolitry przygotowanego produktu RPA. Zdejmij talerz z lodu.
Szybko umieść go w nagrzanym czytniku mikropłytek fluorescencyjnych i naciśnij start. W przypadku liofilizowanych, wstępnie zmieszanych reakcji na bazie Cas13a, 6% trehalozy lub 2% sacharozy, dobrze zachowuje wydajność reakcji po liofilizacji. Liofilizowane wstępnie zmieszane odczynniki do reakcji na bazie RT-RPA i Cas13 są stabilne w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej osiem miesięcy.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę opracowywania testów w punkcie opieki (point-of-care), które wykorzystują izotermiczną amplifikację kwasów nukleinowych oraz detekcję opartą na systemie CRISPR do identyfikacji materiału genetycznego chorób zakaźnych. Podejście to ma na celu zwiększenie czułości i dokładności, przy jednoczesnym rozwiązaniu problemów takich jak ryzyko kontaminacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Diagnostyka chorób zakaźnych
- Techniki amplifikacji kwasów nukleinowych
- Technologia CRISPR
Wstęp
- Diagnostyka w punkcie opieki (point-of-care) ma kluczowe znaczenie dla szybkiego rozpoznawania chorób zakaźnych.
- Amplifikacja izotermiczna umożliwia efektywną detekcję kwasów nukleinowych.
- Technologia CRISPR zapewnia wysoką czułość w identyfikacji materiału genetycznego.
- Ryzyko kontaminacji może prowadzić do błędnych wyników w czułych testach.
Cel badania
- Opracowanie uproszczonej procedury dla reakcji opartych na systemie CRISPR.
- Poprawa dokładności wykrywania niewielkich wariantów genetycznych.
- Ograniczenie ryzyka zanieczyszczeń w warunkach badań w miejscu opieki nad pacjentem (point-of-care).
Zastosowane metody
- Przygotowanie gotowych mieszanek liofilizowanych odczynników do amplifikacji izotermicznej.
- Wdrażanie metod detekcji opartych na systemie CRISPR.
- Ocena czułości i swoistości w wykrywaniu biomarkerów kwasów nukleinowych.
- Optymalizacja warunków reakcji w celu zmniejszenia ryzyka kontaminacji.
Główne wyniki
- Opracowana metoda wykazała wysoką czułość w wykrywaniu markerów genetycznych.
- Ryzyko kontaminacji zostało znacznie zredukowane dzięki uproszczeniu procedury.
- Wyniki były porównywalne z tradycyjnymi metodami PCR.
- Podejście to jest odpowiednie do zastosowań w ramach diagnostyki przy łóżku pacjenta (point-of-care).
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia wykonalną metodę szybkiego wykrywania patogenów chorób zakaźnych.
- Testy oparte na systemie CRISPR mogą zostać skutecznie uproszczone do celów praktycznych.
- Przyszłe prace mogą skupić się na dalszym zwiększaniu odporności tych testów.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wstępnie zmieszane i liofilizowane odczynniki diagnostyczne oparte na systemie CRISPR umożliwiają szybkie i dokładne wykrywanie markerów genetycznych chorób zakaźnych w punkcie opieki, eliminując wąskie gardła operacyjne w zdecentralizowanym testowaniu. Podejście to zmniejsza złożoność ręcznej obsługi oraz ryzyko kontaminacji, wspierając skalowalne wdrożenie w warunkach terenowych i miejscach o ograniczonych zasobach. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w zakresie wczesnej interwencji i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji terapeutycznych w czasie rzeczywistym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybką analizę markerów genetycznych patogenów w celu walidacji celów w badaniach nad chorobami zakaźnymi.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zapewnienie wysokiej czułości detekcji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu.
- Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez rozróżnianie blisko spokrewnionych szczepów patogenów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia gotowe do użycia, zwalidowane systemy odczynnikowe w celu usprawnienia procesów opracowywania analiz.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację analiz dzięki zastosowaniu formatów liofilizowanych i wymieszanych.
- Umożliwia skalowalne przesiewanie próbek klinicznych lub środowiskowych przy minimalnym zapleczu instrumentacyjnym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami w zakresie biomarkerów translacyjnych, umożliwiając wykrywanie sygnatur kwasów nukleinowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki dostarczeniu solidnych narzędzi diagnostycznych możliwych do zastosowania w terenie.
- Zmniejsza ryzyko związane z wdrażaniem kandydatów na testy diagnostyczne poprzez wykazanie stabilności i wydajności odczynników.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania translacyjne, wspierając przepływy pracy od identyfikacji celu po walidację przedkliniczną platform diagnostycznych.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia wysoką wiarygodność detekcji celów genetycznych do testowania hipotez i badań mechanistycznych.
- Screening: Oferuje zestandaryzowane, ilościowe wyniki do porównywania warunków próbek i wydajności testu.
- Analityka: Umożliwia czułe odczyty oparte na fluorescencji dla rzetelnej analizy danych i wsparcia decyzji.
- Badania translacyjne: Łączy zastosowania laboratoryjne i terenowe, wspierając rozwój diagnostyki opartej na biomarkerach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę odczynników wielokrotnego użytku, którą można dostosować do różnych celów patogenów i typów próbek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność w detekcji patogenów.
- Wartość operacyjna: Upraszcza procesy robocze, zwiększa powtarzalność i wspiera logistykę niezależną od łańcucha chłodniczego.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) nad kandydatami na testy diagnostyczne i redukuje ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację zasobów diagnostycznych dla chorób wyłaniających się i endemicznych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie amplifikacji kwasów nukleinowych i projektowania testów opartych na systemie CRISPR.
- Wymaga dostępu do sprzętu do liofilizacji oraz mikroczytników fluorescencyjnych do pełnej realizacji procedury.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowywania i obchodzenia się z odczynnikami pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych typów próbek, jednak może być wymagana optymalizacja dla konkretnych patogenów.
- Stabilność i wydajność zwalidowane przez co najmniej osiem miesięcy w temperaturze -20°C, co umożliwia długotrwałe wdrożenie.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:19
Preparation of Lyophilized Reverse Transcriptase‐Recombinase Polymerase Amplification (RT‐RPA) Reactions
5:02
Preparation of Lyophilized CRISPR‐Cas13a Premixed Detection Reagents for Nucleic Acid Biomarkers Detection
7:45
RT‐RPA Nucleic Acid Amplification and CRISPR‐Cas13 Nucleic Acid Detection
