Diagnostyka oparta na CRISPR w miejscu opieki nad pacjentem z wstępnie zmieszanymi i liofilizowanymi odczynnikami

Pracujemy nad testem przyłóżkowym do wykrywania materiału genetycznego chorób zakaźnych. To wykrywanie wykorzystuje izotermiczną amplifikację kwasów nukleinowych i detekcję opartą na CRISPR. Dzięki wysokiej dokładności osmotycznej, podobnej do PTR, mogą wykrywać niewielkie różnice w sekwencji, w tym polimorfizm pojedynczego nukleotydu, i mogą być wielostronicowe.

CRISPR Reakcje osmotyczne zawierają wiele składników i efektów i są trudne do przeprowadzenia w miejscu opieki, ponieważ osmotyka oparta na CRISPR jest bardzo wrażliwa. Istnieje ryzyko przeniesienia zanieczyszczenia, co może prowadzić do fałszywych wyników. Na szczęście problem ten można załagodzić, jeśli uprościmy procedury reakcji.

Oferujemy łatwą w użyciu metodę wykrywania patogenów chorobowych i markerów genetycznych przy użyciu kombinacji amplifikacji izotermicznej i odczynników na bazie CRISPR. Środki te są proste w przechowywaniu i użyciu. Oferujemy również wskazówki dotyczące rozwiązywania typowych problemów podczas korzystania z tych metod i agentów, ułatwiając ludziom korzystanie z nich.

W protokole zastosowano tutaj odczynniki liofilizowane, które ułatwiają transport i przechowywanie. Liofilizowane odczynniki można łatwo uwodnić w punktach użycia i zachować wysoką skuteczność amplifikacji i wykrywania. Mamy nadzieję, że uda nam się zastosować technologie diagnostyczne CRISPR do wykrywania endemicznych i pojawiających się chorób zakaźnych.

Jeśli ten test może być rutynowo i prawidłowo wykonywany w miejscu opieki, może to dostarczyć informacji na temat opcji leczenia przeciwwirusowego i antybiotykowego, potencjalnie uratować życie, zmniejszyć nadużywanie leków i rozwój oporności. Na początek inkubuj roztwór trójglicyny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wyjmij trzy probówki z granulkami RPA z zamrażarki.

Delikatnie postukaj rurkami paskowymi o stół laboratoryjny, aby usunąć białe granulki. Przenieś wszystkie trzy granulki do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki A.Odpipetuj 25 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, aby przepłukać pozostały proszek RPA w probówkach paskowych. Przenieś roztwór płuczący do nowej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki B. następnie dodaj 10 mikrolitrów 0,57 molowego roztworu triglicyny i 10 mikrolitrów mieszanki startera do głównej probówki B. Po wirowaniu i odwirowaniu probówki umieść ją na lodzie.

Następnie dodaj 28,4 mikrolitra pięciokrotnego buforu RPA do głównej probówki B. Dokładnie wymieszaj, mocno stukając lub potrząsając kilka razy. Przenieś granulki zebrane w probówce A do głównej probówki mieszającej B i odwróć probówkę lub kilkakrotnie postukaj palcem w spód probówki, aby wymieszać. Obserwuj, czy roztwór wydaje się jednorodny i jednofazowy.

Umieść probówkę na lodzie, a następnie dodaj 0,71 mikrolitra odwrotnej transkryptazy i 2,84 mikrolitra RNazy H do głównej probówki mieszającej. Delikatnie postukaj lub odwróć rurkę miksera głównego wiele razy w górę iw dół. Krótko odkręć rurkę przed umieszczeniem jej na lodzie.

Teraz podlej 8,4 mikrolitra roztworu mieszanki głównej do 10 wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 1,5 mililitra i umieść probówki na lodzie. Po porcjowaniu umieść probówki w metalowym stojaku zanurzonym w ciekłym azocie, aby przygotować je do liofilizacji. W liofilizatorze sprawdź temperaturę kolektora i półki.

Teraz przykryj otwarte probówki w metalowym stojaku arkuszem białego papieru do czyszczenia. Umieść metalowy stojak wraz z otwartymi rurkami na półce liofilizatora i zamknij drzwiczki półki. Następnie wybierz żądany program i naciśnij start.

Po 30 minutach drugiego etapu suszenia naciśnij stop. Zwolnij ciśnienie, otwierając zawór spustowy podciśnienia. Po wyjęciu stojaka z półki natychmiast zakryj tuby.

Na początek inkubuj roztwór trójglicyny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wyjmij trzy probówki z granulkami RPA z zamrażarki. Delikatnie postukaj rurkami paskowymi o stół laboratoryjny, aby usunąć białe granulki.

Przenieś wszystkie trzy granulki do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki A.Odpipetuj 25 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, aby przepłukać pozostały proszek RPA w probówkach paskowych. Przenieś roztwór płuczący do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki B, a następnie dodaj 10 mikrolitrów 0,57 molowego roztworu triglicyny i 10 mikrolitrów mieszanki starterów do głównej probówki B. Po wirowaniu i odwirowaniu probówki umieść ją na lodzie. Następnie dodaj 28,4 mikrolitra pięciokrotnego buforu RPA do głównej probówki B. Dokładnie wymieszaj, mocno stukając lub potrząsając kilka razy.

Przenieś granulki zebrane w probówce A do głównej probówki mieszającej B i odwróć probówkę lub kilkakrotnie postukaj palcem w spód probówki, aby wymieszać. Obserwuj, czy roztwór wydaje się jednorodny i jednofazowy. Umieść probówkę na lodzie, a następnie dodaj 0,71 mikrolitra odwrotnej transkryptazy i 2,84 mikrolitra RNazy H do głównej probówki mieszającej.

Delikatnie postukaj lub odwróć rurkę miksera głównego wiele razy w górę iw dół. Krótko odkręć rurkę przed umieszczeniem jej na lodzie. Teraz podlej 8,4 mikrolitra roztworu mieszanki głównej do 10 wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 1,5 mililitra i umieść probówki na lodzie.

Po porcjowaniu umieść probówki w metalowym stojaku zanurzonym w ciekłym azocie, aby przygotować je do liofilizacji. W liofilizatorze sprawdź temperaturę kolektora i półki. Teraz przykryj otwarte probówki w metalowym stojaku arkuszem białego papieru do czyszczenia.

Umieść metalowy stojak wraz z otwartymi probówkami na półce liofilizatora i zamknij drzwiczki półki, a następnie wybierz żądany program i naciśnij start. Po 30 minutach drugiego etapu suszenia naciśnij stop. Zwolnij ciśnienie, otwierając zawór spustowy podciśnienia Po wyjęciu stojaka z półki natychmiast zakryj rurki.

Na początek podgrzej inkubator termiczny w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Dodaj jeden mikrolitr mieszaniny octanu magnezu i roztworu octanu potasu na bok probówki zawierającej liofilizowany, wstępnie zmieszany granulat RT-RPA. Zawiesić osad w 12,4 mikrolitrach próbki RNA.

Aby zainicjować reakcję RT-RPA, należy krótko odwirować dodany roztwór za pomocą mini wirówki z odwirowaniem w temperaturze pokojowej przez trzy sekundy. Ostrożnie postukaj w tubkę, aby dokładnie wymieszać zawartość i ponownie odwirować. Inkubować reakcję w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 60 minut w podgrzewanym inkubatorze z wytrząsaniem termicznym

Po zakończeniu reakcji wyjmij probówki reakcyjne i umieść je na lodzie przed przystąpieniem do wykrywania CRISPR/Cas. W celu wykrycia kwasów nukleinowych włącz czytnik mikropłytek fluorescencyjnych. Ustaw i rozgrzej czytnik mikropłytek do 37 stopni Celsjusza i wybierz program, a następnie umieść 384-dołkową płytkę na lodzie.

Aby ponownie zawiesić liofilizowaną wstępnie zmieszaną reakcję wykrywania CRISPR/Cas, dodaj 17 mikrolitrów ośmiomilimolowego roztworu chlorku magnezu. Wymieszaj, ostrożnie stukając w rurkę. Krótko odkręć przez trzy sekundy przed umieszczeniem rurki na lodzie.

Przenieść 18 mikrolitrów ponownie zawieszonej mieszaniny reakcyjnej do każdej studzienki wstępnie schłodzonej 384-dołkowej płytki na lodzie. Do każdej reakcji dobrze dodać dwa mikrolitry przygotowanego produktu RPA. Zdejmij talerz z lodu.

Szybko umieść go w nagrzanym czytniku mikropłytek fluorescencyjnych i naciśnij start. W przypadku liofilizowanych, wstępnie zmieszanych reakcji na bazie Cas13a, 6% trehalozy lub 2% sacharozy, dobrze zachowuje wydajność reakcji po liofilizacji. Liofilizowane wstępnie zmieszane odczynniki do reakcji na bazie RT-RPA i Cas13 są stabilne w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej osiem miesięcy.